CN102038640B - 一种含有胆固醇的peg修饰物的脂质体药物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种脂质体药物，含有作为活性成分的药物和脂质体的双分子层，脂质体双分子层中包含磷脂、胆固醇和胆固醇的PEG修饰物，药物为长春碱类衍生物。所属脂质体实现了药物的高包封率，延长了体内滞留时间。

Description

一种含有胆固醇的PEG修饰物的脂质体药物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种脂质体药物，具体地说，涉及一种含有胆固醇的PEG修饰物的脂质体药物及其制备方法，及其在制备治疗肿瘤疾病的药物中的用途。

背景技术

脂质体可以作为许多药物的载体。作为抗肿瘤药物(尤其是化疗药物)的载体，它可以减少药物在正常组织的分布，增加药物在肿瘤组织的蓄积量，从而改善药物的治疗指数。

传统的脂质体在体内很容易被免疫系统识别和吞噬，因此脂质体可能还没有到达靶区，就已经被机体清除掉了而无法发挥其靶向作用。长循环脂质体又称隐形脂质体，能够阻止巨噬细胞对脂质体的识别和摄取，从而延长脂质体在血中的循环时间，进而借助EPR效应富集到肿瘤组织中，最终实现肿瘤的被动靶向。此外，长循环脂质体由于表面覆盖了聚乙二醇亲水保护层，能够避免脂质体聚集，可以提高其在储存期内的稳定性。所以长循环脂质体技术一经发明，即成为国际抗肿瘤脂质体制剂研究的热点和化疗药物剂型的最佳选择。

制备长循环脂质体常用的长循环材料为亲水聚合物修饰的磷脂，如：聚乙二醇修饰的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG)、聚乙二醇修饰的二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG-PEG)、聚乙二醇修饰的胆固醇(chol-PEG)、聚维酮修饰的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PVP)、聚维酮修饰的二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG-PVP)、聚维酮修饰的胆固醇(chol-PVP)。其中甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇铵(mPEG2000-DSPE)的应用最为广泛。

传统的mPEG-DSPE加入方式是在脂质体形成初期将其与磷脂和胆固醇一起加入，这种操作的结果就是在磷脂双分子层形成后，mPEG-DSPE均匀分布在磷脂双层膜的内、外表面。该方法适用于大多数药物，如盐酸多柔比星，以此技术制备的长循环脂质体已于1995年在美国成功上市，商品名为楷莱。

但是我们在制备长春瑞滨长循环脂质体的过程中发现，mPEG-DSPE的加入，会阻碍长春瑞滨的装载，当药脂比较高时，mPEG-DSPE对长春瑞滨载药影响更为显著，包封率不足10％。分析认为有两个原因：①在传统的主动载药技术中，药物通过与内水相阴离子(如硫酸根、柠檬酸根)结合形成沉淀，获得较高的包封率，而弱碱性药物分子，如长春碱类和拓扑异构酶抑制剂类化合物，与脂质体内水相阴离子形成沉淀能力差，因而药物在内水相中的滞留能力差，影响药物的装载；②带正电荷的长春瑞滨在阴离子梯度及pH梯度等载药动力驱使下进行跨膜载药时，与嵌在磷脂双层膜外表面上大量的带负电荷的mPEG-DSPE优先结合，载药初期时，载药动力足以克服药物与mPEG-DSPE的结合力，使其能够跨膜进入脂质体内水相；但是随着药物的装载，载药动力逐渐减弱，剩余的药物便结合在mPEG-DSPE上，不能进入脂质体内水相，从而降低了载药的效率。并且，分布在磷脂双层膜内表面的mPEG-DSPE会通过电荷引力与已经载入内水相的药物结合，进而促使药物从脂质体中渗漏出来，而达不到缓释、靶向的目的。

由以上分析可知，mPEG-DSPE的加入既影响了药物的装载，还促进了药物在体内的渗漏，其作用弊大于利。但是若不加又无法延长脂质体在血液中的循环时间，无法达到缓释增效的目的。所以如何消除由mPEG-DSPE的加入带来的负面作用成为研究的难点和重点。经过分析发现，mPEG-DSPE之所以影响药物的装载是因为其带有负电荷，所以解决问题的关键是寻找一种不带电荷的长循环材料。

发明内容

本发明使用Poly(oxy-1，2-ethanediol)，Alpha-(3，beta)cholest-5-en-3-yl-omega-hydroxy，(简称胆固醇-PEG)来制备上述药物的脂质体，能够很好的解决这一问题。

发明人在试验中发现，胆固醇-PEG同样可以插入磷脂膜，覆盖在脂质体表面，形成空间位阻和亲水保护层，能阻止巨噬细胞对脂质体的识别和摄取，延长脂质体的血循环时间，最终实现肿瘤的被动靶向。胆固醇-PEG不同于mPEG2000-DSPE之处在于其表面不带电荷，所以可以实现对长春碱类抗肿瘤药脂质体的高效包封，并且延长了药物在体内的滞留时间。

为了得到具有上述特征的脂质体制剂，需要采用合适的方法制备脂质体。本申请采用的方法包括如下步骤：将所用的脂类辅料溶解于有机溶剂中，冻干除去有机溶剂，得到疏松的脂质粉末，之后使用含有反离子的溶液水化脂相粉末以形成空白脂质体。所述含有反离子的溶液指溶液中的离子带有与药物相反的电荷。空白脂质体用微射流设备或者高压挤出设备降低脂质体的粒度，之后采用透析、或者柱层析等手段除去脂质体外的反离子。从而使脂膜内外形成反离子梯度。然后再将药物和脂质体孵育，得到脂质体药物。

具体实施方式

下面所述实施例的目的是为了更好的说明本发明，但不应对本发明的范围构成限定。

下文中所述“药脂比”指药物与氢化大豆卵磷脂的质量比，“mPEG2000-DSPE的含量”或“胆固醇-PEG的含量”指其在脂质体双分子层中磷脂成分总摩尔数的百分率。

实施例1脂质体制备方法

将磷脂，如氢化大豆卵磷脂(或双软脂酸卵磷脂或双肉豆蔻酸卵磷脂)、胆固醇按重量比3∶1，和适量的胆固醇的PEG修饰物混匀，溶解于95％叔丁醇中，冻干除去有机溶剂，得到疏松的脂质粉末，之后使用含有反离子的内相溶液水化脂质粉末以形成空白脂质体。用高压挤出设备或微射流设备降低空白脂质体的粒度，之后采用柱层析或透析手段以蔗糖/组氨酸溶液替换脂质体外的反离子，从而使脂膜内外形成离子梯度。将药物水溶液与脂质体混悬液混合孵育，既得。

实施例2磺基水杨酸三乙胺内相，不同长循环材料，不同药脂比长春瑞滨载药包封率比较

内相：300mM磺基水杨酸三乙胺溶液

脂相：mPEG2000-DSPE或胆固醇-PEG的含量：8.3％。

制备方法与实施例1相同。

表1不同脂药比，不同长循环材料长春瑞滨脂质体的包封率

结论：当处方中含有8.3％DSPE-mPEG2000时，即使是用对药物滞留能力很强的磺基水杨酸三乙胺盐做内相，当药脂比达到3∶9.58及以上时，包封率也逐渐下降。而无DSPE-mPEG2000存在的条件下，药脂比达到6∶9.58时仍能保持较高的包封率。这一现象说明8.3％DSPE-mPEG2000的存在影响了药物的装载。而用胆固醇-PEG代替DSPE-mPEG2000后，则能够解决这一问题，当药脂比达到6∶9.58时仍有97.6％的包封率。这是因为胆固醇-PEG属电中性，与药物之间不存在电荷吸引力，所以不会对药物装载产生影响。

实施例3磺基水杨酸三乙胺内相，不同长循环材料，不同药脂比长春新碱载药包封率比较

内相：300mM磺基水杨酸三乙胺溶液

脂相：mPEG2000-DSPE或胆固醇-PEG的含量：8.3％。

制备方法与实施例1相同。

表2不同药脂比不同长循环磷脂长春新碱脂质体的包封率

结论：8.3％DSPE-MPEG的存在会影响磺基水杨酸三乙胺盐内相长春新碱脂质体的装载，当药脂比增高时影响更加显著，药物几乎无法装载。但用胆固醇-PEG2000替代DSPE-mPEG2000后，药脂比增加到6∶9.58时药物仍有很好的装载，包封率高达96％以上。

实施例4胆固醇的加入量对长春瑞滨脂质体包封率的影响

内相：300mM磺基水杨酸三乙胺溶液

脂相：HSPC与胆固醇的质量比：6∶1，4∶1，3∶1，胆固醇-PEG2000的含量：3％

药脂比：3∶9.58

制备方法与实施例1相同

表3不同胆固醇加入量的长春瑞滨脂质体的包封率

结论：在其他因素固定的条件下，胆固醇加入量的改变能显著影响长春瑞滨载药，HSPC与胆固醇的质量比为3∶1时，药物达到最高包封率。

实施例5不同胆固醇量、不同胆固醇-PEG2000含量对长春瑞滨脂质体包封率的影响

内相：300mM磺基水杨酸三乙胺溶液

脂相：HSPC与胆固醇质量比：4∶1，3∶1，胆固醇-PEG2000的含量：1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％。

药脂比：3∶9.58

制备方法同实施例1。

表4不同胆固醇、胆固醇-PEG2000加入量长春瑞滨脂质体包封率

结论：固定药脂比为3∶9.58的条件下，HSPC与胆固醇质量比为4∶1时，随着胆固醇-PEG2000加入量的增加包封率逐渐下降；而当HSPC与胆固醇质量比为3∶1时，包封率可一直保持在99％以上。以上结果说明，当采用胆固醇-PEG2000时，胆固醇的加入量会影响载药效率，当其加入量与HSPC的质量比为1∶3时，包封率最好。

实施例6不同胆固醇-PEG2000含量长春瑞滨脂质体与游离药体内药代比较

1.样品制备

水相：300mM磺基水杨酸三乙胺溶液。

脂相：胆固醇-PEG2000含量：0.5％，2.9％，8.3％

药脂比：3∶9.58

制备方法同实施例1。

表5长春瑞滨脂质体的包封率

2、试验条件：KM鼠，给药剂量：10mg/kg。

3、药代结果

表6不同胆固醇-PEG2000含量长春瑞滨脂质体药代结果

结论：胆固醇-PEG2000修饰的隐形脂质体能够显著延长半衰期，但随着胆固醇-PEG2000加入量的增加，半衰期有所下降，这可能是因为大量胆固醇-PEG2000掺入磷脂双层时导致了膜通透性增加，进而促进了药物的渗漏，因此为了稳定药物在脂质体中的滞留，需要筛选最优的胆固醇-PEG2000加入量。

实施例7不同胆固醇-PEG2000含量长春瑞滨脂质体体内药代比较

1、样品制备

水相：300mM磺基水杨酸三乙胺溶液。

脂相：胆固醇-PEG2000含量：2％，3％，4％，5％，6％，7％

药脂比：3∶9.58

制备方法同实施例1。

表7长春瑞滨脂质体包封率

2、试验条件：KM鼠，给药剂量：10mg/kg。

3、药代结果

表8不同胆固醇-PEG2000加入量长春瑞滨脂质体药代比较

结论：优选胆固醇-PEG2000加入量为3％和4％时，半衰期最长。

实施例8不同胆固醇，不同胆固醇-PEG加入量长春瑞滨脂质体体内药代比较

1、样品制备

水相：300mM磺基水杨酸三乙胺溶液。

脂相：HSPC与胆固醇质量比为3∶1，4∶1，胆固醇-PEG2000含量：0％，1％，3％，5％

药脂比：3∶9.58制备方法同实施例1。

表9长春瑞滨脂质体包封率

2、试验条件：KM鼠，给药剂量：10mg/kg。

3、药代结果

表10不同胆固醇、胆固醇-PEG2000加入量药代血样测定结果

结论：胆固醇-PEG2000的加入能够显著延长脂质体半衰期，另外处方中胆固醇的加入量也能显著影响药物滞留，由以上结果可见，当胆固醇-PEG2000加入量同样为3％时，胆固醇加入量的改变导致了半衰期的显著变化，胆固醇加入量为1∶3时半衰期较为理想。

实施例9胆固醇-PEG2000修饰的长春瑞滨脂质体在接种S180KM小鼠模型上的药效

1、脂质体样品信息

磺基水杨酸三乙胺溶液为内相，胆固醇-PEG2000含量是2.9％，药脂比：3∶9.58。

2、试验方法

收集S180瘤细胞，以RPMI 1640培养基稀释并计数2.5*10⁶个/ml，于无菌条件下接种于KM雄性小鼠前肢腋下皮下组织，接种体积为0.2ml，含瘤细胞约5×10⁵个。接种4天后，按肿瘤体积大小将动物分组，其中空白对照组13只，脂质体组10只、游离药组10只，分别按组单次静脉给药，给药剂量为10mg/kg。

给药后动物正常饲养，使用测量瘤径的方法，动态观察受试药的抗肿瘤作用。肿瘤体积(tumor volume，TV)的计算公式为：V＝1/2×a×b2。其中a和b分别表示肿瘤长和宽。根据测量结果计算出肿瘤体积。实验结果采用SPSS 11.5统计软件，Repeated Measure过程分析随时间变化多次测量间肿瘤体积及鼠重的变化，One-wayANOVA比较各次测量时组间肿瘤体积及鼠重差异。

3、药效结果

表11长春瑞滨脂质体药效试验肿瘤体积及SD值

结论：由药效试验结果可见，与空白组和游离药组相比，脂质体有明显抑瘤作用。

Claims (2)

1.一种脂质体药物，含有作为活性成分的药物和脂质体的双分子层，其特征在于脂质体双分子层中包含磷脂、胆固醇和胆固醇的PEG修饰物，药物为长春瑞滨或长春新碱，其中胆固醇的PEG修饰物为

Poly(oxy-1,2-ethanediol),Alpha-(3,beta)cholest-5-en- 3-yl-omega-hydroxy，胆固醇的PEG修饰物的含量为脂质体双分子层中磷脂成分含量的0.1-20mol/mol％。 

2.根据权利要求1所述的脂质体药物，其中胆固醇的PEG修饰物的含量为脂质体双分子层中磷脂成分含量的0.3-18mol/mol％。

3.根据权利要求1所述的脂质体药物，其中胆固醇的PEG修饰物的含量为脂质体双分子层中磷脂成分含量的0.5-15mol/mol％。

4.根据权利要求1所述的脂质体药物，其中胆固醇的PEG修饰物的含量为脂质体双分子层中磷脂成分含量的0.8-12mol/mol％。

5.根据权利要求1所述的脂质体药物，其中胆固醇的PEG修饰物的含量为脂质体双分子层中磷脂成分含量的1-10mol/mol％。

6.根据权利要求1所述的脂质体药物，其中胆固醇的PEG修饰物的含量为脂质体双分子层中磷脂成分含量的2-8mol/mol％。

7.根据权利要求1所述的脂质体药物，其中胆固醇的PEG修饰物的含量为脂质体双分子层中磷脂成分含量的2.5-7mol/mol％。

8.根据权利要求1所述的脂质体药物，其中胆固醇的PEG修饰物的含量为脂质体双分子层中磷脂成分含量的3-6mol/mol％。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的脂质体药物的制备方法，其包括如下步骤：(1)利用磷脂、胆固醇和胆固醇的PEG修饰物为脂质体双分子层材料，制备空白脂质体；和(2)将作为活性成分的药物包封在脂质体内。

10.一种脂质体药物制剂，其中含有根据权利要求1-8中任一项所述的脂质体药物，和药学上可接受的载体和/或赋型剂。

11.根据权利要求10所述的脂质体药物制剂，其中还含有改变渗透压的盐、缓冲物质和/或抗氧剂。

12.权利要求1-8中任一项所述的脂质体药物在制备用于治疗肿瘤患者的药物中的用途。