CN104490786A - 一种靶向多功能双载药脂质体的制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于脂质体的制备及应用技术领域，具体公开了一种靶向多功能双载药脂质体的制备方法和应用。本发明的靶向多功能双载药脂质体的原料组成包括基本膜材磷脂、延长脂质体药物血液半衰期的聚乙二醇修饰的磷脂、可进行荧光成像的磷脂、具靶向作用的磷脂、治疗肿瘤的脂溶性药物和水溶性药物、可增强核磁成像信号的造影剂。上述药物通过脂质体的包裹很好地解决了水溶性差的药物的临床使用缺陷，且与水溶性药物组合后改变了传统化疗药物的给药方式，靶向作用于肿瘤组织，有效抑制肿瘤生长，同时减少副反应的产生；另外通过MRI可实时观测药物作用效果及肿瘤变化情况，具极大的临床应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及脂质体的制备及应用技术领域，更具体涉及一种靶向多功能双载药脂质体的制备方法和应用。
背景技术
由磷脂组成的脂质体与生物体细胞膜组成和结构相似，具有良好的生物相容性。脂质体包含一个磷脂双分子层和一个亲水核区，可携带水溶性及脂溶性物质，改善很多药物应用时的不足。作为药物载体，脂质体已被成功应用于各类药物的携载。包括多柔比星、组织蛋白酶抑制剂、伊立替康、长春瑞宾和欧苷菊、双氯酚酸钠等。
铂类药物，包括顺铂、卡铂、奥沙利铂等，可与DNA结合并阻碍DNA复制及RNA翻译，进而促进肿瘤细胞死亡。常被用于各种癌症治疗。但铂类药物可引起很多副反应，如骨髓抑制，肾毒性等。
紫杉醇和多西紫杉醇是一类应用广泛的抗癌药物。它们可以稳定细胞微管，抑制细胞有丝分裂，从而调控细胞生长。它们水溶性差，在使用时，往往要将其溶于氢化蓖麻油和甲醇。该制剂可引起很多副反应，比如过敏反应，肾毒性和神经毒性等。
临床常联合使用紫杉醇类和铂类药物治疗非小细胞肺癌，由于其制剂本身无靶向性，且需较大剂量依次进行静脉注射，同时会引起很多副反应。因此发展一种低剂量且有效的双载药体系具有极大应用价值。
发明内容
针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是改善紫杉醇及铂类药物应用时的缺陷，改变其体内代谢途径，提供一种对肿瘤疗效好、副作用小、同时还可对肿瘤发展进行实时监测的靶向多功能双载药脂质体及其制备方法和应用。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种靶向多功能双载药脂质体，由以下原料制备而成：
基本膜材磷脂、PEG修饰磷脂、靶向磷脂、脂溶性药物和水溶性药物；
所述原料中，基本膜材磷脂：PEG修饰磷脂：靶向磷脂摩尔比＝9：1：0.5；
所述原料中，基本膜材磷脂：脂溶性药物摩尔比＝(30-33)：1。
所述原料中，基本膜材磷脂：水溶性药物摩尔比＝2：1。
所述原料中，基本膜材磷脂为卵磷脂、氢化卵磷脂或人工合成卵磷脂中的一种或两种以上的任意比例混合物，其中，人工合成卵磷脂为二硬脂酰磷脂酰胆碱和二硬脂磷脂酰甘油组合磷脂；
优选的，所述基本膜材为为二硬脂酰磷脂酰胆碱和二硬脂磷脂酰甘油组合磷脂，两者摩尔比为二硬脂酰磷脂酰胆碱：二硬脂酰磷脂酰甘油＝7:2。
所述原料中，PEG修饰磷脂为甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺。
所述原料中，靶向磷脂是含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)多肽修饰的磷脂或是其他具靶向作用基团修饰的磷脂。
所述原料中，脂溶性药物为紫杉醇或多西紫杉醇。
所述原料中，水溶性药物为顺铂、卡铂或奈达铂。
优选的，所述脂溶性药物为紫杉醇，所述水溶性药物为卡铂。
进一步，所述原料中还可包括荧光基团修饰磷脂和/或水溶性造影剂。
当原料中含有荧光基团修饰磷脂时，基本膜材磷脂：PEG修饰磷脂：靶向磷脂：荧光基团修饰磷脂摩尔比＝9：1：0.5：0.2。
当原料中含有水溶性造影剂时，基本膜材磷脂：水溶性造影剂＝1：5000。
所述荧光基团修饰磷脂为诺丹明-双肉豆蔻磷脂酰乙醇胺(Rhod-DMPE)或其他荧光基团修饰磷脂。
所述水溶性造影剂是T1或T2造影剂。其中，T1造影剂为钆特酸葡胺(Gd-DOTA)、钆喷酸葡胺(Gd-DTPA)、钆双胺(Gd-DTPA-BMA)；T2造影剂为氧化铁纳米粒子。
一种所述靶向多功能双载药脂质体的制备方法，其步骤如下：
(1)将基本膜材磷脂、PEG修饰磷脂、靶向磷脂、荧光基团修饰磷脂(原料中不含则不加)及脂溶性药物溶于有机溶剂中，用旋转蒸发仪真空干燥成脂质膜。
所述有机溶剂选自氯仿或氯仿、甲醇、水的混合溶液，所述基本膜材磷脂与有机溶剂的质量体积比为(10-20)mg：1mL。
(2)将水溶性药物及水溶性造影剂(原料中不含则不加)溶液加入到步骤(1)所得脂质膜中，75-85℃下超声10分钟，然后用孔径为0.22μm水系滤膜挤制10次，得到粒径130nm左右的大单室双载药脂质体溶液。
所述水溶性药物溶液为将水溶性药物按照质量体积比(1-10)mg：1mL溶于水中而得；水溶性造影剂溶液为将水溶性造影剂按照质量体积比(20-50)mg：1mL溶于水中而得。
(3)将步骤(2)所得溶液在2000rpm下离心10分钟除去未包裹的脂溶性药物，然后用截留分子量为10KD的透析袋透析该脂质体溶液4小时除去未包裹的水溶性药物并置换脂质体外液。
所述透析过程中所用透析液为生理盐水、葡萄糖溶液或蔗糖溶液，其中，葡萄糖溶液浓度为1wt％-9wt％，蔗糖溶液浓度为1wt％-9wt％。
(4)将步骤(3)所得透析袋内液体冷冻干燥24-48小时，得到靶向多功能双载药脂质体粉末。所得产品在使用时，直接将其溶于去离子水。
本发明的其他一些特点是，水溶性药物除了卡铂外，还可以是其他一些水溶性药物，包括顺铂，奈达铂等；脂溶性药物除了紫杉醇外，也可以是多西紫杉醇等。脂溶性及水溶性药物的组合特点是没有严重配伍禁忌，可共同作用于某种肿瘤的治疗，且治疗效果优于单一药物的使用效果；或是临床常用组合。
本发明中，由于使用了甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，可避免体内免疫系统对脂质体的清除作用，延长药物体内作用时间。加之纳米制剂本身具有的实体瘤的高通透性和滞留效应(EPR效应)，可进一步增强药物对肿瘤组织的作用效果，进而可减少药物使用剂量，减少副作用，提高药效。
本发明中，靶向磷脂的使用可使脂质体在体内靶向作用于肿瘤组织。主要作用机制为靶向基团可与肿瘤细胞表面过表达的相应受体特异性识别，并通过受体介导的内吞作用使脂质体进入肿瘤细胞，进一步释放药物和造影剂，从而达到杀灭肿瘤细胞和同时进行核磁成像的目的。
本发明提供的由上述方法制得的靶向多功能双载药脂质体不仅适合于非小细胞肺癌的诊断和治疗，也适合于其他固体肿瘤的诊断治疗及其诊断治疗试剂的设计。
附图说明
附图是用来对本发明的进一步理解，与下面的具体实施方式共同用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。附图中：
图1是测试例1所得靶向多功能双载药脂质体的透射电镜图，其中标尺为200nm；
图2是测试例1中靶向多功能双载药脂质体的粒径分析结果图；
图3是测试例2中靶向多功能双载药脂质体处理A549、H1299和WI-38细胞后的激光共聚焦显微镜荧光图；
图4是测试例3中靶向多功能双载药脂质体处理A549细胞后的结果；
图5是测试例3中靶向多功能双载药脂质体处理H1299细胞后的结果；
图6是测试例3中靶向多功能双载药脂质体处理WI-38细胞后的结果；
图7是测试例4中靶向多功能双载药脂质体及生理盐水分别处理3只肺腺癌移植裸鼠后，其中靶向组和生理盐水组各一只肺腺癌移植裸鼠肿瘤T1加权成像变化结果；
图8是测试例4中靶向多功能双载药脂质体及生理盐水处理肺腺癌移植裸鼠后肿瘤变化结果，其中靶向组和生理盐水组分别包括3只肿瘤裸鼠。
具体实施方式
为了更清楚地阐述本发明，以下申请人将依照本发明技术方案的实施例对本发明作更进一步的详细说明。
在本发明技术方案的具体实施方式中，所采用的主要试剂及材料介绍如下：
二硬脂酰磷脂酰胆碱1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DSPC)、二硬脂酰磷脂酰甘油(钠盐)1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol sodiumsalt(DSPG,Na)和甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺N-(Carbonyl-methoxypolyethyleneglycol-2000)-1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine,sodium salt(MPEG-2000-DSPE)均购自Corden Pharma，货号分别为LP-R4-076、LP-R4-017和LP-R4-039，CAS号分别为816-94-4、124011-52-5和147867-65-0。
羧基-聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺N-(carboxy-polyethyleneglycol-2000)-1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine,ammonium salt(COOH-PEG2000-DSPE)购自NANOCS，货号为PG2-CADS-2k。
诺丹明-双肉豆蔻磷脂酰乙醇胺1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine Bsulfonyl,ammonium salt(Rhod-DMPE)购自Avanti Polar lipids，货号为810157P，CAS号为474942-83-1。
环肽c(RGDyK)购自吉尔生化有限公司，商品号为RK-5。
所用靶向磷脂RGD环肽-聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(c(RGDyK)-PEG2000-DSPE)按照如下方法合成：靶向磷脂RGD环肽-聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺
将羧基-聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(COOH-PEG2000-DSPE)溶于水中，加入碳二亚胺(EDC)和羟基琥珀酰亚胺脂(NHS)，EDC、NHS和COOH-PEG2000-DSPE摩尔比为10：10：1，室温反应30分钟。然后加入与COOH-PEG2000-DSPE等摩尔量的环肽c(RGDyK)，室温反应10小时。用截留分子量为2000的透析袋在水中透析24小时除去未反应的环肽及其他物质。将透析袋内液体冷冻干燥24小时即得靶向磷脂。
所用水均为去离子水，其他原料均为常规试剂。
非小细胞肺癌细胞A549、H1299和正常肺纤维细胞WI-38均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。
实施例1：靶向多功能双载药脂质体的制备(RGD-CPGd-L)
原料组分包括：基本膜材磷脂(二硬脂酰磷脂酰胆碱和二硬脂酰磷脂酰甘油)，PEG修饰磷脂MPEG-2000-DSPE，靶向磷脂RGD环肽-聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，紫杉醇，卡铂，钆双胺。
各组分的摩尔比例如下：
二硬脂酰磷脂酰胆碱：二硬脂酰磷脂酰甘油：MPEG-2000-DSPE：RGD环肽-聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺＝7:2:1:0.5。
基本膜材磷脂：紫杉醇＝30:1。
基本膜材磷脂：卡铂＝2:1。
基本膜材磷脂：钆双胺＝1:5000。
所述基本膜材磷脂的摩尔量指二硬脂酰磷脂酰胆碱和二硬脂酰磷脂酰甘油摩尔量之和。
制法：将15mg基本膜材磷脂(由二硬脂酰磷脂酰胆碱和二硬脂酰磷脂酰甘油以摩尔比7:2组成的混合物)、各种磷脂衍生物(PEG修饰磷脂和靶向磷脂)及紫杉醇加入到1mL氯仿/甲醇/水(氯仿、甲醇和水以体积比1:1:0.3混合而得)中，用旋转蒸发仪真空干燥成脂质膜。将100mM钆双胺溶液和0.01mM卡铂溶液(原料配方中的钆双胺和卡铂事先用水分别溶解成溶液待用)加入到脂质膜中，用超声水化10分钟，温度为80℃。用孔径为0.22μm水系滤膜挤制10次。2000转每分钟离心10分钟除去未包裹的紫杉醇。用1wt％葡萄糖透析(10KD)4h除去未反应的杂质并交换脂质体外部介质。将透析袋内液体冷冻干燥24小时后于-20℃保存备用。
重新溶解后得到粒径约为128nm的双载药脂质体药物溶液。
实施例2：
参照实施例1的方法制备荧光靶向多功能双载药脂质体(Rh-RGD-CPGd-L)，与实施例1不同的是，原料中加入了诺丹明-双肉豆蔻磷脂酰乙醇胺(Rhod-DMPE)，该成分与其他磷脂摩尔比为：二硬脂酰磷脂酰胆碱：二硬脂酰磷脂酰甘油：MPEG-2000-DSPE：RGD环肽-聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺：Rhod-DMPE＝7:2:1:0.5:0.2。制备过程中，Rhod-DMPE、PEG修饰磷脂和靶向磷脂一并加入。
对比例1：
参照实施例1的方法制备双载药脂质体(CPGd-L)，不同之处仅在于：不加入靶向磷脂RGD环肽-聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺。
对比例2：
参照实施例1的方法制备单载药脂质体(CGd-L)，不同之处仅在于：不加入靶向磷脂RGD环肽-聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和紫杉醇。
对比例3：
参照实施例1的方法制备单载药脂质体(PGd-L)，不同之处仅在于：不加入靶向磷脂RGD环肽-聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和卡铂。
对比例4：
参照实施例1的方法制备空白脂质体(Blank-L)，不同之处仅在于：不加入靶向磷脂RGD环肽-聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、两种药物和钆双胺。
对比例5：
参照实施例1的方法制备靶向含钆脂质体(RGD-Gd-L)，不同之处仅在于：不加入两种药物。
测试例1：
用透射电镜(型号为JEM2010)对实施例1制备的RGD-CPGd-L进行检测，结果如图1所示，由图1可以看出该靶向多功能双载药脂质体形成了较为圆整均匀的颗粒。
用纳米粒度仪(型号为Zetasizer Nano ZS)对实施例1制备的RGD-CPGd-L水溶液粒径进行检测，结果如图2所示，由图2可以看出，该靶向多功能双载药脂质体粒径为约为128nm。
测试例2：
本测试例利用激光共聚焦显微镜(型号为A1R/A1)检测本发明靶向多功能双载药脂质体靶向作用于肿瘤细胞情况。
将盖玻片置于六孔板中，加入A549、H1299和WI-38细胞进行培养。培养条件为37℃，5％CO2。A549和H1299使用IMEM培养基；WI-38使用MEM培养基；培养基中均加入10％牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素。细胞覆盖率达到30-40％时，每孔加入2ml 0.1mg/ml荧光靶向多功能双载药脂质体(实施例2制备的Rh-RGD-CPGd-L)。孵育4小时后除去培养基，4％多聚甲醛固定10分钟，PBS清洗5次。取出盖玻片置于载玻片上，进行荧光成像。
实验结果如图3所示，由图3可以看出，A549和H1299红色荧光强度明显高于WI-38(更真实的结果请见申请人随本申请一并提交的实质审查参考资料)，说明该靶向多功能双载药脂质体可靶向作用于肿瘤细胞A549和H1299，对正常细胞WI-38作用较小。
测试例3：
本测试例利用酶标仪(型号为spectra MAX 190)在细胞水平上检测本发明靶向多功能双载药脂质体的活性。
在96孔板中接种A549、H1299和WI-38细胞，培养24小时后分别加入200μl浓度为1、3、6、9、12mg/ml脂质体，总有五种脂质体，分别是靶向多功能双载药脂质体(实施例1制备的RGD-CPGd-L)；双载药脂质体(对比例1制备的CPGd-L)；单载药脂质体(对比例2制备的CGd-L)；单载药脂质体(对比例3制备的PGd-L)和空白脂质体(对比例4制备的Blank-L)。加药48小时后除去脂质体溶液，加入终浓度为0.5mg/ml的MTT溶液，4小时后除去反应液，加入200μl DMSO，检测各组细胞OD值。
实验结果如图4-6所示(每组3个平行实验)。由图4-6可以看出，该靶向多功能双载药脂质体对肿瘤细胞A549(图4)和H1299(图5)作用效果显著，且明显高于其他各组脂质体；对正常细胞WI-38作用较小(图6)。空白脂质体对各组细胞活力影响均较小。说明本发明靶向多功能双载药脂质体对肿瘤细胞具靶向作用，且对肿瘤细胞有明显杀伤作用，毒性作用效果与浓度呈明显依赖性；对正常细胞影响较小。
测试例4：
本测试例利用7T核磁成像仪(型号为BioSpec 70/20USR)在动物水平上检测本发明靶向多功能双载药脂质体对肺腺癌A549移植肿瘤的抑制作用。裸鼠购自武汉大学中南医院动物实验中心。
鼠龄5-6周BALB/c雄性裸鼠(20g)大腿皮下种植A549细胞，饲养1周后进行核磁检测及药物治疗实验。肿瘤裸鼠俯卧位固定，先用3％异氟烷麻醉，后用1％异氟烷麻醉，并通过气体控制器给裸鼠提供氧气。用一个气动垫检测裸鼠呼吸频率。实验裸鼠分为两组，包括实施例1制备的靶向多功能双载药脂质体给药组和生理盐水对照组。尾静脉注射，给药剂量为500mg/kg。对照组使用相同体积生理盐水。对照组进行成像时，需注射同等剂量靶向含钆脂质体(对比例5制备RGD-Gd-L)。在给药前和给药后进行核磁T1加权成像检测。T1加权成像使用自旋回波序列，回波时间为11ms，重复时间为400ms，层厚为1mm，加速因子为1，矩阵为256×256，视野为4×4cm2，平均次数为4。使用ParaVision 5.0进行数据分析。在第0、2、4、7、10、14和16天给裸鼠注射脂质体或生理盐水。在第0和第23天进行核磁成像。三周经核磁成像检测后取出肿瘤照相。
结果如图7和8所示(每组3个平行实验)。由图7可以看出，与对照组相比，本发明的靶向多功能双载药脂质体可显著抑制肺腺癌的生长；且可明显增强肿瘤部位的T1加权成像信号。由图8可看出给药组可明显抑制肺腺癌的生长。
本发明的双载药脂质体制剂可通过脂质体包裹解决水溶性差的药物的临床使用缺陷，且与水溶性药物组合改变传统化疗药物给药方式，增强药物作用效果，可有效抑制肿瘤生长；另可通过核磁对肿瘤发展进行无创实时的监测。该发明制备过程简单，还可应于其他组合药物及功能物质的携载及其他类型肿瘤的诊断治疗，具极大应用前景。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种靶向多功能双载药脂质体，由以下原料制备而成：
基本膜材磷脂、PEG修饰磷脂、靶向磷脂、脂溶性药物和水溶性药物；
所述原料中，基本膜材磷脂：PEG修饰磷脂：靶向磷脂摩尔比=9：1：0.5；
所述原料中，基本膜材磷脂：脂溶性药物摩尔比=（30-33）：1；
所述原料中，基本膜材磷脂：水溶性药物摩尔比=2：1；
所述原料中，基本膜材磷脂为卵磷脂、氢化卵磷脂或人工合成卵磷脂中的一种或两种以上的任意比例混合物；
所述原料中，PEG修饰磷脂为甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺；
所述原料中，靶向磷脂是含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）多肽修饰的磷脂或是其他具靶向作用基团修饰的磷脂；
所述原料中，脂溶性药物为紫杉醇或多西紫杉醇；
所述原料中，水溶性药物为顺铂、卡铂或奈达铂。
2.根据权利要求1所述的靶向多功能双载药脂质体，其特征在于：所述基本膜材为人工合成卵磷脂。
3.根据权利要求2所述的靶向多功能双载药脂质体，其特征在于：所述人工合成卵磷脂为二硬脂酰磷脂酰胆碱和二硬脂磷脂酰甘油组合磷脂，两者摩尔比为二硬脂酰磷脂酰胆碱：二硬脂酰磷脂酰甘油=7:2。
4.根据权利要求3所述的靶向多功能双载药脂质体，其特征在于：所述脂溶性药物为紫杉醇，所述水溶性药物为卡铂。
5.根据权利要求1-4中任一所述的靶向多功能双载药脂质体，其特征在于：所述原料中还包括荧光基团修饰磷脂和/或水溶性造影剂；
当原料中包括荧光基团修饰磷脂时，基本膜材磷脂：PEG修饰磷脂：靶向磷脂：荧光基团修饰磷脂摩尔比=9：1：0.5：0.2；
当原料中包括水溶性造影剂时，基本膜材磷脂：水溶性造影剂摩尔比=1：5000；
所述荧光基团修饰磷脂为诺丹明-双肉豆蔻磷脂酰乙醇胺或其他荧光基团修饰磷脂；
所述水溶性造影剂是T1或T2造影剂，其中，T1造影剂为钆特酸葡胺、钆喷酸葡胺、钆双胺；T2造影剂为氧化铁纳米粒子。
6.根据权利要求5所述的靶向多功能双载药脂质体，其特征在于：所述荧光基团修饰磷脂为诺丹明-双肉豆蔻磷脂酰乙醇胺；所述水溶性造影剂是钆双胺。
7.一种权利要求1-6中任一所述的靶向多功能双载药脂质体的制备方法，其步骤如下：
（1）将基本膜材磷脂、PEG修饰磷脂、靶向磷脂及脂溶性药物溶于有机溶剂中，用旋转蒸发仪真空干燥成脂质膜；
所述有机溶剂选自氯仿或氯仿、甲醇、水的混合溶液；
（2）将水溶性药物溶液加入到步骤（1）所得脂质膜中，75-85℃下超声10分钟，然后用孔径为0.22μm水系滤膜挤制10次；
所述水溶性药物溶液为将水溶性药物按照质量体积比（1-10）mg：1mL溶于水中而得；
（3） 将步骤（2）所得溶液在2000rpm下离心10分钟除去未包裹的脂溶性药物，然后将所得脂质体溶液用截留分子量为10KD的透析袋透析4小时；
所述透析过程中所用透析液为生理盐水、葡萄糖溶液或蔗糖溶液，其中，葡萄糖溶液浓度为1wt%-9wt%，蔗糖溶液浓度为1wt%-9wt%；
（4）将步骤（3）所得透析袋内液体冷冻干燥24-48小时，得到靶向多功能双载药脂质体粉末；
当所述原料中包括荧光基团修饰磷脂时，所述荧光基团修饰磷脂在步骤（1）中随基本膜材磷脂、PEG修饰磷脂、靶向磷脂及脂溶性药物一起溶于有机溶剂中；
当所述原料中包括水溶性造影剂时，在步骤（2）中将所述水溶性造影剂先处理成水溶性造影剂溶液，随水溶性药物溶液一起加入到步骤（1）所得脂质膜中，水溶性造影剂溶液为将水溶性造影剂按照质量体积比（20-50）mg：1mL溶于水中而得。
8.权利要求1-6中任一所述的靶向多功能双载药脂质体在制备治疗或预防非小细胞肺癌药物中的应用。
9.根据权利要求7所述制备方法制得的靶向多功能双载药脂质体在制备治疗或预防非小细胞肺癌药物中的应用。
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