CN102048693B - 具有苯磺酸衍生物内水相的脂质体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种具有苯磺酸衍生物盐内水相的脂质体及其制备方法，及其在制备用于治疗肿瘤疾病的药物中的用途。

Description

具有苯磺酸衍生物内水相的脂质体
技术领域
本发明涉及一种具有苯磺酸衍生物盐内水相的脂质体及其制备方法，及其在制备用于治疗肿瘤疾病的药物中的用途。
背景技术
脂质体作为药物载体，具有提高药物疗效、减轻药物不良反应及靶向、缓释等特点，尤其是作为抗肿瘤药物的载体时可以使药物靶向肿瘤区而起到减毒、增效作用。
目前临床上应用的抗肿瘤药物众多，大致可分为细胞毒类、激素类、生物反应调节剂、单克隆抗体以及其他抗肿瘤药物这五类。其中细胞毒类药物占市场份额最大，其按照作用机制可以分为以下五类：(1)作用于DNA化学结构的药物，如：烷化剂和铂类；(2)影响核酸合成的药物，如：甲氨蝶呤、氟尿嘧啶等；(3)作用于核酸转录的药物，如：阿霉素、表阿霉素等；(4)作用于微管蛋白合成的药物，如：紫杉类、长春碱类；作用于拓扑异构酶的药物，如：喜树碱类；(5)其他细胞毒药。其中第二、四类药物具有细胞周期特异性，它们只对恶性肿瘤细胞增殖周期的某一间期细胞有杀灭作用，本发明重点研究的长春瑞滨和拓扑替康即为此类药物。
将细胞周期特异性抗肿瘤药物制备成脂质体，从而达到减毒增效的作用，需要控制脂质体中药物的释放速度。若药物从脂质体中释放过快则会导致如下结果：(1)一部分药物在到达瘤区之前即从脂质体中释放出来，接着在血液中被快速清除，而不能进入肿瘤区；(2)由于同一时间肿瘤细胞所处的生长周期各不相同，因此即使进入瘤区的药物也无法对处于非特定周期的肿瘤细胞产生杀伤作用，这样药物对肿瘤细胞的暴露大大减少，不利于药效的发挥，反而引起对正常组织细胞的毒性反应。所以，对于细胞周期特异性药物来说，控制药物从脂质体中的释放就显得尤为重要。
脂质体药物的释放受到多种因素的影响，包括粒度、脂膜组成、内水相以及载药方法等。脂质体的载药方法分为主动载药和被动载药两种，脂溶性药物一般选择被动载药技术，水溶性药物采用主动载药技术。由于长春瑞滨和拓扑替康均为水溶性弱碱性药物，所以选择主动载药技术来制备脂质体。目前常用的主动载药技术主要有三种，pH值梯度法、硫酸铵梯度法以及络合梯度法：
(1)pH值梯度法
该方法在19世纪80年代由加拿大学者发明，他们通过实验发现阿霉素等生物碱类药物由于pH值梯度的存在，可以实现主动转运，特异性的向脂质体内聚集。其制备过程为首先根据药物的性质选择内水相缓冲液和外相缓冲液，这一步骤非常关键，因为它直接决定了药物在储存期内的稳定性和药物在体内的释放行为。然后使用内水相缓冲液水化制备空白脂质体，将制得的空白脂质体经过进一步处理使其粒度降低到所需的范围后，则可以使用交叉流透析、柱层析以及pH值调整等手段置换脂质体的外相，造成磷脂膜内外的pH梯度。形成跨膜梯度后，可以在适宜的温度完成药物的装载。
也可以使用离子载体制造跨膜pH梯度。在制备空白脂质体的过程中，将2价离子盐，如硫酸锰包封在脂质体中，之后用含有离子载体如A23187和EDTA的缓冲液置换脂质体的外相。离子载体可以特异性的向膜外转运2价离子，同时将H+转移到脂质体内部。使用上述方法，同样可以制造膜内外的pH值梯度。
对于pH梯度法载药的机理，已经进行了较系统的研究。目前上市的3个蒽环类抗生素脂质体制剂中，有2个产品使用了pH值梯度法载药技术。
(2)硫酸铵梯度法
硫酸铵梯度法在20世纪90年代初期由以色列学者发明。该方法的制备过程和传统的pH值梯度法有相似之处。首先使用硫酸铵缓冲液制备空白脂质体，之后采用交叉流透析等手段除去脂质体外相的硫酸铵，造成脂膜内外的硫酸铵梯度，然后在加热的条件下完成药物的装载。起初的研究表明，硫酸铵梯度法之所以能够实现药物的装载，可能和游离的氨跨膜扩散，造成磷脂膜内外的pH值的差异有关。但是严谨的理论推导表明，使用硫酸铵梯度法完成药物的装载，可能是一个比较复杂的双向扩散的过程，pH值梯度的形成可能只是其中的一个影响因素。
硫酸铵梯度法的优势在于制备空白脂质体的过程中，接近中性的硫酸铵水溶液不会引起过多的磷脂分子水解。因为如果使用饱和磷脂制备脂质体，需要在较高的温度下完成。使用传统的pH值梯度法，可能使得磷脂更容易发生水解。此外，使用硫酸铵梯度法制备的脂质体，其在体内释放药物的行为可能也有所不同。
(3)络合梯度法
该方法使用过渡态金属离子的盐，如硫酸铜、硫酸镍作为内水相缓冲液制备空白脂质体，之后采用交叉流透析等手段除去脂质体外相的金属离子，造成脂膜内外的金属离子梯度，然后在加热的条件下完成药物的装载。其载药原理为药物在脂质体内水相中与过渡态金属离子结合生成稳定的络合物从而滞留在脂质体中。
长春瑞滨和拓扑替康作为抗肿瘤领域的一线药物，其脂质体制剂的研究一直是国际上的热点，目前已经有许多国家的研究小组对长春瑞滨和拓扑替康脂质体的载药技术进行了多种研究，但大都存在一些问题，下面详述。
加拿大的Inex公司使用鞘磷脂和胆固醇以摩尔比55∶45作为脂膜，以硫酸镁溶液为内水相制备空白脂质体，然后利用离子载体A23187向膜外转运镁离子，同时将H+转移到脂质体内部，形成pH梯度，从而实现药物的装载。用该方法制备得到的长春瑞滨脂质体包封率大于90％，2-8℃条件下可稳定储存一年。(Optimization and characterizationof a sphingomyelin/cholesterol liposome formulation ofvinorelbine with promising antitumor activity.Journal ofpharmaceutical sciences，2005 Vol.94 No.5.)
加拿大哥伦比亚大学的Igor V.Zhigaltsev等人同样以鞘磷脂和胆固醇以摩尔比55∶45作为磷脂双层制备大单室脂质体，使用苯磺酸和羟基苯磺酸的钠盐、钙盐作为内向，同样采用离子载体A23187创造脂质体内外pH梯度，再进行长春瑞滨装载。用该方法制备得到的长春瑞滨脂质体包封率为90-99％。体外释放实验显示与硫酸镁为内相的长春瑞滨脂质体比，羟基苯磺酸内相能够显著延长药物的滞留时间；小鼠药代动力学实验同样显示羟基苯磺酸内相的半衰期显著长于硫酸镁内相的处方。(Formation of drug-arylsulfonate complexes insideliposomes：A novel approach to improve drug retention.Journal ofControlled Release 2006，Vol 110)。但该方法也存在很多缺陷：1.该方法工艺复杂不利于放大，处方中使用的A23187必须除去，否则在体内将会将血钙与药物反转加速药物释放，并且A23187本身具有一定毒性；2.该方法使用羟基苯磺酸的钙盐作为内相，为了避免钙盐出现沉淀，内相pH值需要调节到3.5-4.0，普通磷脂在此环境下很快水解，因此只能使用价格昂贵的鞘磷脂；3.由于羟基苯磺酸与药物作用不够强，长春碱类药物与普通的长循环材料有作用从而导致药物装载不稳定，因此必须使用价格昂贵的PEG-CerC14。
美国的研究者使用双硬脂酸卵磷脂(DSPC)、胆固醇和甲氧基聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-mPEG)作为脂膜，以蔗糖八硫酸酯的三乙胺(TA)盐为内水相制备空白脂质体。之后采用交叉流透析等手段除去脂质体外相的蔗糖八硫酸酯TA，造成脂膜内外的蔗糖八硫酸酯TA梯度，然后完成药物的装载。原理与硫酸铵梯度法基本相同，但由于蔗糖八硫酸酯每一个分子携带8个酸根所以能够与长春瑞滨形成致密的结合，达到更好的滞留作用。该方法制备的长春瑞滨脂质体血浆半衰期能达到9.2小时。不过其缺陷在于蔗糖八硫酸酯价格昂贵，不易获得；且其三乙胺盐没有市售，需使用其钠盐通过离子交换树脂制得酸型，再用三乙胺中和得到铵盐，步骤繁琐、收率低。(Improvedpharmacokinetics and efficacy of a highly stable nanoliposomalvinorelbine.The journal of pharmacology and experimentaltherapeutics.2009 Vol.328 No.1.)
加拿大以Bally为核心的研究小组则使用了两种方法制备得到了高包封率的拓扑替康脂质体。方法一以DSPC和胆固醇作为脂膜，以硫酸锰溶液为内水相制备空白脂质体，然后利用离子载体A23187形成pH梯度，实现药物装载。该法与Inex公司的方法机理相同。方法二以DSPC和胆固醇作为脂膜，以硫酸铜溶液为内水相制备空白脂质体，但是不需要加入A23187即可实现拓扑替康的装载，这是由于铜离子与拓扑替康形成了稳定的络合物，该原理即为上述络合梯度法。该方法的缺陷在于制剂中残留的金属离子在血液中可能会产生毒性。(An evaluation oftransmembrane ion gradient-mediated encapsulation of topotecanwithin liposomes.Journal of controlled release.96(2004)；Copper-topotecan complexation mediates drug accumulation intoliposomes.Journal of controlled release 114(2006).)
美国的Alza公司使用氢化卵磷脂(HSPC)、胆固醇和DSPE-mPEG作为脂膜，以多阴离子聚物为内水相，如：硫酸葡聚糖、硫酸蛋白聚糖、硫酸纤维素等等。之后采用交叉流透析置换外相形成多聚物梯度，完成载药。其原理与硫酸铵梯度法类似，目的是利用多价阴离子聚合物与拓扑替康更紧密的结合从而稳定滞留。该方法的缺陷也是所述多阴离子聚合物均不常用，价格昂贵且不易获得。(Liposome-entrappedtopoisomerase inhibitors.US6465008B1)。
由以上研究实例分析可知目前研究的方向主要是广义硫酸铵梯度法和络合梯度法，但都只是实验室阶段，均不适应大生产和我国的国情。原因如下：(1)以上研究者使用的多阴离子盐有蔗糖八硫酸酯三乙胺盐、硫酸多聚物等，这些化学物质国内无法获得，即便国外也只是小批量生产，根本无法供给大生产；且价格十分昂贵，与我国用药国情不相符。(2)以上络合梯度法使用铜离子、镍离子、锰离子等，均为重金属离子，残留在制剂中均对人体有不同程度的损害，且由于肿瘤不易治愈，用药周期通常很长，重金属离子在体内的不断蓄积必然导致患者无法耐受。因此，以上研究成果均不够理想，有必要发展新的载药方法。
发明内容
本发明的一个方面提供一种脂质体，包含双分子层和内水相，其中所述内水相含有苯磺酸衍生物的盐和活性化合物。
根据本发明的脂质体的一些实施方式，其中苯磺酸衍生物是5-磺基水杨酸或间苯二磺酸。
根据本发明的脂质体的一些实施方式，其中苯磺酸衍生物的盐是苯磺酸衍生物与胺和铵离子中的一种或更多种形成的盐。
根据本发明的脂质体的一些实施方式，其中苯磺酸衍生物的盐是苯磺酸衍生物与氨水、三乙胺、三乙醇胺中的一种或更多种形成的盐。
根据本发明的脂质体的一些实施方式，其中所述活性化合物是弱碱性化合物，优选为长春瑞滨、长春新碱、拓扑替康和伊立替康中的一种或更多种。
根据本发明的脂质体的一些实施方式，其中所述双分子层含有磷脂、胆固醇和亲水性聚合物修饰的脂类物质。
本发明的另一方面提供一种制备上市任意一项根据本发明的脂质体的方法，包括如下步骤：
(1)用苯磺酸衍生物的盐的水溶液水化脂相粉末以形成含有苯磺酸衍生物的盐的水溶液作为内水相的空白脂质体；
(2)除去步骤(1)的空白脂质体的外相中的苯磺酸衍生物的盐以形成阴离子梯度；
(3)将步骤(2)的空白脂质体与活性化合物的水溶液一起孵育以将活性化合物包封在脂质体内。
本发明的再另一方面提供一种脂质体药物制剂，含有根据本发明的任意的脂质体和药学上可接受的载体和/或赋型剂。
根据本发明的脂质体药物制剂的一些实施方式，其中所述载体和/或赋型剂中含有渗透压调节剂和/或抗氧剂。
本发明的再另一方面提供上述任意一项根据本发明的脂质体在制备用于治疗肿瘤患者的药物中的用途，其中脂质体中的活性化合物是长春瑞滨、长春新碱、拓扑替康和伊立替康中的一种或更多种。
实验证明本发明能够实现弱碱性药物，如长春瑞滨、拓扑替康的高效、稳定包封，并且能够有效降低成本，简化制备工艺；体外释放和药代试验结果表明与传统硫酸铵内水相处方相比，能够显著延缓药物的释放速率。长春新碱、伊立替康等抗肿瘤药物，具有与长春瑞滨和拓扑替康分子类似的苯环结构，也适用于本发明的技术方案。
新方法的发现依赖于对传统载药技术机理的探讨。首先分析硫酸铵梯度法，其包括如下过程：脂质体外相中高浓度药物在浓度差和pH差驱使下，首先克服脂膜(即磷脂双分子层)阻力进入脂质体内水相，进入内水相的药物质子化并与SO4 2-形成沉淀，药物以沉淀形式得以在脂质体内稳定的滞留。而药物的释放则需要首先从沉淀上解离下来，然后跨膜扩散出来，因此，沉淀的微观结构和溶解能力决定了药物从脂质体中释放的速度，进而决定了处方的安全性和有效性。
药物和SO4 2-形成沉淀的微观结构和复杂程度与药物分子的空间结构及其碱性强弱有关。有些药物例如盐酸多柔比星，由于碱性较强，易与SO4 2-结合形成沉淀，并且其分子空间结构近平面，分子间能够相互堆垒，微观结构显示在脂质体内部能够形成致密的长条状沉淀，所以盐酸多柔比星在脂质体中能达到很好滞留，其脂质体处方在KM小鼠体内的半衰期t1/2大于15小时。而有些药物例如长春瑞滨和拓扑替康，由于碱性较弱，与SO4 2-结合形成沉淀能力差，且分子结构非平面，分子间不能堆垒，所以当采用与上述盐酸多柔比星同样的脂类组成和制备方法得到的脂质体在KM小鼠体内t1/2小于5小时。而如此短的半衰期使得脂质体在血液循环的过程中，药物已有大部分渗漏，不能进入瘤区；即便是少量进入瘤区的脂质体药物，也很快释放，极其不利于细胞周期特异性抗肿瘤药物疗效的发挥。可见，药物与阴离子形成沉淀的复杂程度是影响药物释放的关键因素。
长春瑞滨和拓扑替康等药物的弱碱性无法改变，所以寻找能与其结合并堆垒形成致密沉淀的阴离子成为解决问题的关键。长春瑞滨和拓扑替康分子均含有苯环，所以考虑含有芳香环的多阴离子化合物在疏水作用力下可能与其产生稳定沉淀。
苯磺酸衍生物的盐与硫酸铵的不同之处在于苯磺酸衍生物的分子中存在一个苯环，它能够与长春瑞滨或拓扑替康分子结构中的苯环结合，促进药物分子和苯磺酸衍生物分子之间的相互堆垒而形成结构复杂的沉淀结构，同时药物分子和苯磺酸衍生物分子结构中的疏水部分存在亲和力，也会促进分子间堆垒。
为了得到具有优良性质的脂质体制剂，首先需要制备苯磺酸衍生物的盐然后采用合适的方法制备脂质体。本发明采用的方法包括：
苯磺酸衍生物的盐的制备：配制苯磺酸衍生物的水溶液，与三乙胺、三乙醇胺、氨成盐；
脂质体的制备：将所用的脂类辅料溶解于有机溶剂中，冻干除去有机溶剂，得到疏松的脂质粉末，之后使用苯磺酸衍生物的盐溶液水化脂相粉末，形成空白脂质体。然后用微射流设备或者高压挤出设备降低空白脂质体的粒度，之后采用透析或者柱层析等手段除去脂质体外相的苯磺酸衍生物的盐，从而使脂膜内外形成阴离子梯度。然后再将药物溶液和脂质体混悬液孵育，即得到脂质体药物。
本发明所使用的苯磺酸衍生物主要是5-磺基水杨酸(下文中简称磺基水杨酸)、间苯二磺酸等，该系列化合物价格低廉，国内即可购买得到。
综上所述，本专利涉及到的苯磺酸衍生物作为脂质体内水相无论从药物包封、滞留效果上还是经济实用方面是完全可行的。
具体实施方式
下面所述实施例的目的是为了更好的说明本发明，但不应对本发明的范围构成限定。
下文中所述“药脂比”指药物与磷脂的重量比，“DSPE-mPEG的含量”指其在脂质体双分子层中磷脂成分总摩尔数的百分率。
实施例1：以苯磺酸衍生物铵盐为内水相的脂质体制备的一般方案
这里的“苯磺酸衍生物铵盐”指苯磺酸衍生物与TA、TEA或NH3形成的盐。
将磷脂(氢化大豆卵磷脂)、胆固醇按重量比3∶1混合，溶解于95％叔丁醇中，冻干除去有机溶剂，得到疏松的脂质粉末，之后使用苯磺酸衍生物铵盐溶液水化脂相粉末以得到不均匀的多室脂质体。之后采用高压挤出或微射流设备进行整粒。整粒后得到的脂质体用柱层析或透析方式以蔗糖/组氨酸溶液替换脂质体外相的苯磺酸衍生物铵盐。按照适宜的药脂比，在空白脂质体中加入药物溶液，孵育载药。
实施例2：不同内水相长春瑞滨脂质体载药的比较
内水相：处方1：苯磺酸/NH3。
处方2：对羟基苯磺酸/NH3
处方3：磺基水杨酸/NH3。
药脂比均为2∶9.58，无DSPE-mPEG2000修饰。
按照实施例1的方法将“苯磺酸衍生物铵盐”替换为苯磺酸/NH3、对羟基苯磺酸/NH3或磺基水杨酸/NH3，分别制备脂质体。
包封率的测定方法：量取100μl脂质体使用一次性纤维素GF-5脱盐色谱柱分离脂质体和游离药部分，0.9％氯化钠为洗脱液，在线紫外分光光度计监测分离情况，使用液相色谱法分别测定游离药和脂质体部分的含量，按照公式“包封率(％)＝脂质体部分/(脂质体部分+游离药部分)×100％”计算包封率。
表1：不同内水相长春瑞滨脂质体包封率结果
Figure BSA00000329411900091
结论：药脂比为2∶9.58无长循环修饰时，对羟基苯磺酸/NH3或磺基水杨酸/NH3做内水相时，均可以获得较高的包封率，而苯磺酸/NH3在初始出现高包封率后药物迅速泄露至较低包封率，说明苯磺酸与长春瑞滨在脂质体内的作用较弱，不能使其有效滞留。
实施例3：不同内水相长春瑞滨脂质体载药的比较
内水相：处方1：硫酸铵。
处方2：对羟基苯磺酸/NH3
处方3：磺基水杨酸/NH3。
药脂比均为2∶9.58，DSPE-mPEG2000含量均为8.3％。
按照实施例1的方法将“苯磺酸衍生物铵盐”替换为硫酸铵、对羟基苯磺酸/NH3或磺基水杨酸/NH3，分别制备处方1、2和3的脂质体。
表2：不同内水相长春瑞滨脂质体包封率结果
Figure BSA00000329411900101
结论：药脂比为2∶9.58时，硫酸铵或磺基水杨酸/NH3做内水相时，均可以获得较高的包封率，而对羟基苯磺酸/NH3在初始出现高包封率后药物迅速泄露至几乎无包封。结合实施例2分析可知对羟基苯磺酸与长春瑞滨在脂质体内有一定作用，但是在进行DSPE-mPEG2000修饰后两者作用力减弱导致药物释放，说明DSPE-mPEG2000与长春瑞滨有作用从而减弱了苯磺酸的做用。
实施例4：磺基水杨酸铵盐为内水相的长春瑞滨脂质体载药的比较
1.内水相：300mM磺基水杨酸/600mM TEA。
300mM磺基水杨酸/600mM NH3。
300mM磺基水杨酸/600mM TA。
脂相：DSPE-mPEG2000含量分别为0.5％，2.9％，8.3％。
药脂比分别为2∶9.58、3∶9.58、4∶9.58、5∶9.58、6∶9.58，按照实施例1的方法制备脂质体。
表3：不同铵盐、不同药脂比对脂质体包封率影响
Figure BSA00000329411900111
结论：当药脂比为2∶9.58时，磺基水杨酸不同铵盐、不同DSPE-mPEG2000含量的处方，均可以获得满意的包封率。但当药脂比高于2∶9.58时，DSPE-mPEG2000加入量越高则对药物包封率影响越显著，使包封率显著降低。此影响对不同铵盐内水相脂质体显示出的程度不同，对TEA铵盐内水相影响最小。
实施例5：以磺基水杨酸金属离子盐为内水相的拓扑替康脂质体载药的比较
内水相：处方1：300mM磺基水杨酸溶液，加氢氧化钾调节pH。
处方2：300mM磺基水杨酸溶液，加氢氧化钙溶液调节pH。
脂相中DSPE-mPEG2000含量均为0.5％。
药脂比均为2∶9.58。
离子载体加入量：100ng/1mg HSPC(内水相为钾盐时，离子载体为尼可霉素，内水相为钙盐时，离子载体为卡西霉素。)
按照实施例2的方法，将“苯磺酸衍生物金属离子盐”替换为KOH或Ca(OH)2分别制备处方1和2的脂质体。
表4：不同内水相拓扑替康脂质体包封率结果
Figure BSA00000329411900121
结论：在加入离子载体的量为100ng/1mg HSPC的情况下，内水相为磺基水杨酸钾盐或钙盐，均有很好包封。
实施例6：离子载体加入量变化对拓扑替康包封率的影响
内水相：300mM磺基水杨酸溶液，加氢氧化钾调节pH。
300mM磺基水杨酸溶液，加氢氧化钙溶液调节pH。
DSPE-mPEG2000含量均为0.5％，药脂比均为2∶9.58。
内水相为钾盐时，离子载体为尼可霉素，内水相为钙盐时，离子载体为卡西霉素。
按照实施例2的方法，将“苯磺酸衍生物金属离子盐”替换为KOH或Ca(OH)2分别制备各处方的制备脂质体。
表5：不同内水相、不同离子载体加入量对拓扑替康脂质体包封率影响
Figure BSA00000329411900122
Figure BSA00000329411900131
结论：拓扑替康脂质体的包封率随离子载体加入量的减少先出现平台然后逐渐降低，其中尼可霉素加入量为0.2ng/1mg HSPC时为临界值；卡西霉素加入量为1ng/1mg HSPC时为临界值。
实施例7：药脂比对间苯二磺酸/TA内水相的拓扑替康脂质体载药的比较
内水相：200mM间苯二磺酸/TA
DSPE-mPEG2000含量为0.5％
药脂比分别为1∶9.58、3∶9.58、5∶9.58
按照实施例1的方法，将“苯磺酸衍生物铵盐”替换为间苯二磺酸/TA，分别制备各处方的制备脂质体。
表6：不同药脂比对拓扑替康脂质体包封率影响
Figure BSA00000329411900132
结论：以间苯二磺酸/TA为内水相时，不同药脂比的拓扑替康均有较好包封。
实施例8：间苯二磺酸/Na为内水相的脂质体载药的比较
内水相：300mM间苯二磺酸/Na
DSPE-mPEG2000含量为0.5％
尼克霉素加入量分别为20、10、2、1ng/1mg HSPC
药脂比分别为1∶9.58、3∶9.58、5∶9.58
按照实施例2的方法，将“苯磺酸衍生物金属离子盐”替换为间苯二磺酸/Na，制备各处方的脂质体。
表7：离子载体不同用量对脂质体包封率的影响
Figure BSA00000329411900141
结论：利用间苯二磺酸/Na为内水相，药脂比1-5∶9.58，离子载体加入量1-20ng，得到长春瑞滨脂质体的包封率均为100％；得到的拓扑替康包封率随药脂比增加略有降低，随离子载体加入量减小也略有降低。
实施例9：长春瑞滨磺基水杨酸铵和硫酸铵内水相脂质体体外释放比较
释放条件：2M NH4Cl/200mM组氨酸(pH 7.5)作为释放液，将1.5ml样品与1ml释放液混合，置试管中，试管浸入52±1℃水浴中，分别在0.5h、3h取样，测定释放率。
表8：不同内水相脂质体体外释放率测定结果：
Figure BSA00000329411900142
结论：4个处方中，前2个磺基水杨酸/NH3内水相处方比后2个硫酸铵内水相处方体外释放显著减慢。0.5h时，磺基水杨酸处方释放约50％时，硫酸铵处方已经几乎全部释放，说明磺基水杨酸/NH3与长春瑞滨的结合能力强于硫酸铵。
实施例10：无DSPE-mPEG2000加入条件下，长春瑞滨磺基水杨酸不同铵盐和硫酸铵内水相脂质体体外释放比较
释放条件：
2mM NH4Cl/10mM组氨酸/260mM葡萄糖(pH7.5)作为释放外液，样品用释放液稀释10倍移入透析袋中，装有药物的透析袋浸入盛有透析液的溶出杯中，溶出杯中透析液体积是透析袋中体积的200倍，37℃，75rpm条件下进行释放试验，分别在1、2、4、6、24h从透析袋中取样，测定。
表9：不同内水相脂质体体外释放率测定结果
Figure BSA00000329411900151
结论：由结果可见24h时，硫酸铵内水相脂质体药物已经完全释放出来，而磺基水杨酸内水相脂质体仍有约30％药物滞留，与传统的硫酸铵内水相脂质体相比，无DSPE-mPEG2000加入条件下磺基水杨酸内水相脂质体能够非常显著的延长药物在脂质体内水相的滞留。
实施例11：无DSPE-mPEG2000加入条件下，不同药脂比，磺基水杨酸不同铵盐内水相，长春瑞滨脂质体体外释放比较
释放条件同实施例10。
表10：不同药脂比，不同内水相对长春瑞滨脂质体体外释放影响
Figure BSA00000329411900152
结论：由体外释放结果可见，不同铵盐磺基水杨酸内水相释放速率不同，其中TA和NH3盐释放较慢，同样铵盐不同药脂比释放速率也不相同，其中TA盐药脂比为4∶9.58时释放最慢。
实施例12
0.5％DSPE-mPEG2000加入条件下，长春瑞滨的磺基水杨酸/TA和硫酸铵内水相脂质体体外释放比较
释放条件：5mM NH4Cl/10mM组氨酸/260mM葡萄糖(pH7.5)作为释放外液，样品用释放液稀释10倍移入透析袋中，装有药物的透析袋浸入盛有透析液的溶出杯中，溶出杯中透析液体积是透析袋中体积的200倍，37℃，75rpm条件下进行释放试验，分别在1、2、4、6、8、22、24h从透析袋中取样，测定。
表11：不同内水相对长春瑞滨脂质体体外释放影响
Figure BSA00000329411900162
结论：由结果可见在此释放条件下，1h时硫酸铵内水相脂质体已经有多于90％的药物释放，而磺基水杨酸/TA内水相脂质体释放少于20％，与传统的硫酸铵内水相脂质体相比，0.5％DSPE-mPEG2000加入条件下磺基水杨酸内水相脂质体能够非常显著的延长药物在脂质体内水相的滞留。
实施例13：不同内水相长春瑞滨脂质体药代试验
1.脂质体处方：
内水相：300mM磺基水杨酸/TA
280mM间苯二磺酸/TA
300mM硫酸铵水溶液。
DSPE-mPEG2000含量为0.5％，药脂比为3∶9.58。
2.样品测定结果：
表12：不同内水相长春瑞滨脂质体包封率
Figure BSA00000329411900171
3.药代试验条件：使用BDF1雌性鼠，给药量均为10mg/kg
4、血样测定结果：
表13：不同内水相长春瑞滨脂质体药代测定结果
Figure BSA00000329411900172
结论：在脂质体内水相不同，其它处方条件相同时，磺基水杨酸/TA和间苯二磺酸/TA均比硫酸铵内水相脂质体半衰期显著延长，此结果与体外释放结果一致，表明磺基水杨酸或间苯二磺酸能够与长春瑞滨较紧密的结合，使其释放减慢。
实施例14：不同内水相拓扑替康脂质体药代试验
1、脂质体处方：
内水相：300mM间苯二磺酸/Na，10ng尼可霉素/1mg HSPC；
300mM磺基水杨酸/TA
280mM间苯二磺酸/TA
2、样品测定结果：
表14：不同内水相拓扑替康脂质体处方
Figure BSA00000329411900181
3、药代实验条件：昆明雄性鼠，给药剂量10mg/kg。
4、血样测定结果：
表15：不同内水相拓扑替康脂质体药代实验结果
Figure BSA00000329411900191
结论：A-F六份脂质体的半衰期都明显长于游离药物，。
实施例15：不同磺基水杨酸铵盐长春瑞滨脂质体药代试验
1、脂质体：
内水相：300mM磺基水杨酸/NH3
300mM磺基水杨酸/TA
300mM磺基水杨酸/TEA
药脂比均为3∶9.58。
2、样品测定结果：
表16：不同内水相长春瑞滨脂质体处方
Figure BSA00000329411900192
3、药代试验条件：BDF1雄性鼠，给药剂量10mg/kg。
4、血样测定结果：
表17：不同内水相长春瑞滨脂质体药代实验结果
Figure BSA00000329411900193
Figure BSA00000329411900201
结论：以磺基水杨酸不同铵盐为内水相的长春瑞滨脂质体的半衰期为TEA＞TA＞NH3。
实施例16：不同内水相长春瑞滨脂质体对接种前列腺癌细胞RM-1小鼠的药效比较
1、处方：
内水相：处方1：磺基水杨酸/TA。
处方2：硫酸铵。
药脂比均为3∶9.58，DSPE-mPEG2000含量均为0.5％。
2、试验方法：
收集RM-1瘤细胞，以1640培养基稀释并计数4×106个/ml，于无菌条件下接种于C57雌性小鼠前肢腋下皮下组织，接种体积为0.2ml，含瘤细胞约4×105个。接种14天后，按肿瘤体积大小将动物分组，分别按组单次静脉给药，给药剂量为10mg/kg。
给药后动物正常饲养，使用测量瘤径的方法，动态观察受试药的抗肿瘤作用。肿瘤体积(tumor volume，TV)的计算公式为：
TV＝1/2×a×b2。其中a和b分别表示肿瘤长和宽。根据测量结果计算出肿瘤体积。实验结果采用SPSS 11.5统计软件，Repeated Measure过程分析随时间变化多次测量间肿瘤体积及鼠重的变化，One-wayANOVA比较各次测量时组间肿瘤体积及鼠重差异。
3、药效试验结果
表18：不同内水相长春瑞滨脂质体对接种RM-1小鼠的药效比较
Figure BSA00000329411900211
结论：由药效试验结果可见，与空白组相比，处方1、2均有抑瘤作用，磺基水杨酸/TA内水相脂质体比硫酸铵内水相脂质体对肿瘤生长的抑制更强。
实施例17：磺基水杨酸内水相拓扑替康脂质体与游离药对L1210腹水瘤药效比较
1、处方
处方1：磺基水杨酸/TA内水相，0.8％DSPE-mPEG2000，外相pH5.8，药脂比为2.5∶9.58。
处方2：1mg/ml游离药
2、药效方法
接种L1210腹水瘤小鼠断颈处死，于无菌条件下取腹水稀释，腹水接种BDF1小鼠，接种细胞数为5×105，接种后24小时给药。试验结果以动物平均生存时间、中位生存时间(即median survival time，MST)和生命延长率ILS来评价药物的治疗效果，生命延长率公式为ILS＝(给药组MST/对照组MST-1)×100％。实验观察至接种后60天。数据采用SPSS11.5统计软件Survival的Kaplan-Meier过程进行生存分析。
3、生存分析统计结果
表19：生存分析统计结果
Nb：观察期60天结束时少数动物死亡，不能计算中位生存时间。
结论：从药效结果可见，与游离药相比，脂质体组对L1210腹水瘤的治疗效果显著提高，其中给药剂量为10mg/ml组效果最佳。
实施例18：磺基水杨酸内水相拓扑替康脂质体与游离药对RM-1药效比较1、处方：
处方1：300mM磺基水杨酸/TA，2.9％DSPE-mPEG2000，药脂比为5∶9.58
处方2：1mg/ml游离药
2、试验方法
收集RM-1瘤细胞，以1640培养基稀释并计数4×106个/ml，于无菌条件下接种于BDF1雄性小鼠前肢腋下皮下组织，接种体积为0.2ml，含瘤细胞约8×105个。接种11天后，按肿瘤体积大小将动物分组，分别按组单次静脉给药，给药容积为10ml/kg。
给药后动物正常饲养，使用测量瘤径的方法，动态观察受试药的抗肿瘤作用。肿瘤体积(tumor volume，TV)的计算公式为：TV＝1/2×a×b2。其中a和b分别表示肿瘤长和宽。根据测量结果计算出肿瘤体积。根据公式计算肿瘤抑制率(％)，肿瘤抑制率＝(1-给药组平均肿瘤体积/对照组平均肿瘤体积)×100％。实验结果采用SPSS 11.5统计软件，RepeatedMeasure过程分析随时间变化多次测量间肿瘤体积及鼠重的变化，使用Multivariate过程比较各次测量时组间肿瘤体积差异。
3、药效试验结果
表20：肿瘤抑制率试验结果
Figure BSA00000329411900231
结论：根据抗肿瘤药物指导原则药物对肿瘤的生长抑制率≥40％，并经统计学处理P＜0.05为有效。实验结果显示，游离药在给药后5至17天都无效，脂质体三个给药剂量组5至17天都有效，并且肿瘤抑制率远大于40％。RM-1实体瘤药效模型结果说明脂质体处方对肿瘤的抑制效果显著优于游离药。
实施例19：不同内水相长春瑞滨脂质体对接种肺癌细胞LLC小鼠的药效比较
1、处方：
处方1：磺基水杨酸/TA内水相。
处方2：硫酸铵内水相。
药脂比均为3∶9.58，DSPE-mPEG2000含量均为0.5％。
2、试验方法：
收集LLC肺癌细胞，以DMEM培养基稀释并计数2.0×106个/ml，于无菌条件下接种于C57雌性小鼠前肢腋下皮下组织，接种体积为0.2ml，含瘤细胞约4×105个。接种14天后，按肿瘤体积大小将动物分组，分别按组单次静脉给药，给药剂量为10mg/kg。
给药后动物正常饲养，使用测量瘤径的方法，动态观察受试药的抗肿瘤作用。肿瘤体积(TV)的计算公式为：
TV＝1/2×a×b2。其中a和b分别表示肿瘤长和宽。
根据测量结果计算出肿瘤体积。实验结果采用SPSS 11.5统计软件，实验结果采用SPSS 11.5统计软件进行统计分析。
3、药效试验结果
表21：不同内水相长春瑞滨脂质体对LLC小鼠的药效比较(n＝10，
Figure BSA00000329411900241
)
Figure BSA00000329411900242
＊＊P＜0.01，＊P＜0.05，与5％葡萄糖注射液对照组比较。
与5％葡萄糖注射液对照组比较，硫酸铵内水相和磺基水杨酸内水相脂质体自给药后第4天起均显著抑制肿瘤的生长。
计算相对肿瘤增殖率T/C(％)：T/C％＝TRTV/CRTV×100％。(TRTV：治疗组RTV；CRTV：阴性对照组RTV)。相对肿瘤体积(RTV)：RTV＝Vt/Vo。Vo为分笼给药时(即do)测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积。)硫酸铵内水相、磺基水杨酸内水相脂质体的相对肿瘤体积增殖率T/C％最低点分别是51.8％、24.5％，即磺基水杨酸内水相脂质体对LLC肺癌的抗肿瘤疗效大于硫酸铵内水相脂质体。
实施例20：不同内水相拓扑替康脂质体对接种前列腺癌细胞RM-1小鼠的药效比较
1、处方：
处方1：磺基水杨酸/TA内水相。
处方2：硫酸铵内水相。
药脂比均为3∶9.58，DSPE-mPEG2000含量均为0.5％。
2、试验方法：
收集RM-1肺癌细胞，以1640培养基稀释并计数2.0×106个/ml，于无菌条件下接种于C57雌性小鼠前肢腋下皮下组织，接种体积为0.2ml，含瘤细胞约4×105个。接种12天后，按肿瘤体积大小将动物分组，分别按组单次静脉给药，给药剂量为10mg/kg。
给药后动物正常饲养，使用测量瘤径的方法，动态观察受试药的抗肿瘤作用。肿瘤体积(tumor volume，TV)的计算公式为：TV＝1/2×a×b2。其中a和b分别表示肿瘤长和宽。根据测量结果计算出肿瘤体积。实验结果采用SPSS 11.5统计软件进行统计分析。
3、药效试验结果
表22：不同内水相拓扑替康脂质体对RM-1小鼠的药效比较(n＝10，
Figure BSA00000329411900251
)
Figure BSA00000329411900252
＊＊P＜0.01，＊P＜0.05，与5％葡萄糖注射液对照组比较。
与5％葡萄糖注射液对照组比较，游离药无明显抑制肿瘤生长作用(P＞0.05)。与5％葡萄糖注射液对照组和游离药比较，二种不同内水相脂质体均显著抑制肿瘤的生长。硫酸铵内水相、磺基水杨酸内水相脂质体的相对肿瘤体积增殖率T/C％最低点分别是31.3％、25.3％，即磺基水杨酸内水相脂质体对RM-1肿瘤的抑瘤疗效大于硫酸铵内水相脂质体。

Claims (8)

1.一种脂质体，包含双分子层和内水相，其中所述内水相含有苯磺酸衍生物的盐和含有芳香环的弱碱性活性化合物，其中所述苯磺酸衍生物是5-磺基水杨酸或间苯二磺酸，所述活性化合物是长春瑞滨和拓扑替康中的一种或两种。
2.根据权利要求1的脂质体，其中苯磺酸衍生物的盐是苯磺酸衍生物与胺和铵离子中的一种或更多种形成的盐。
3.根据权利要求1的脂质体，其中苯磺酸衍生物的盐是苯磺酸衍生物与氨水、三乙胺、三乙醇胺中的一种或更多种形成的盐。
4.根据权利要求1的脂质体，其中所述双分子层含有磷脂、胆固醇和亲水性聚合物修饰的脂类物质。
5.一种制备根据权利要求1-4中任意一项的脂质体的方法，包括如下步骤：
(1)用苯磺酸衍生物的盐的水溶液水化脂相粉末以形成含有苯磺酸衍生物的盐的水溶液作为内水相的空白脂质体；
(2)除去步骤(1)的空白脂质体的外相中的苯磺酸衍生物的盐以形成阴离子梯度；
(3)将步骤(2)的空白脂质体与弱碱性活性化合物的水溶液一起孵育以将所述弱碱性活性化合物包封在脂质体内。
6.一种脂质体药物制剂，含有根据权利要求1-4中任意一项的脂质体和药学上可接受的载体和/或赋型剂。
7.根据权利要求6的脂质体药物制剂，其中所述载体和/或赋型剂中含有渗透压调节剂和/或抗氧剂。
8.根据权利要求1-4中任意一项的脂质体在制备用于治疗肿瘤患者的药物中的用途。
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