CN107837234A - 一种改善药物释放的脂质体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种脂质体及其制备方法，所述脂质体包含脂质双分子层和内水相，其中内水相中含有羧甲基环糊精和活性化合物。所述羧甲基环糊精是羧甲基‑α‑环糊精、羧甲基‑β‑环糊精、羧甲基‑γ‑环糊精。本发明可改善脂质体中活性化合物的释药速率。

Description

一种改善药物释放的脂质体及其制备方法

技术领域

本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种具有羧甲基环糊精盐内水相的脂质体及其制备方法，该脂质体组合物可改善药物在脂质体中的释放速度。

背景技术

脂质体是由脂质双分子层排列而成的类生物膜结构的封闭囊状结构。脂质体作为药物载体，具有提高药物疗效、减轻药物不良反应及靶向、缓释等特点，尤其是作为抗肿瘤药物的载体时可以使药物靶向肿瘤区而起到减毒、增效作用。

根据药物装载的机制不同，可以将脂质体药物的制备方法分为被动载药法与主动载药法两大类。对于脂溶性的、与磷脂膜亲和力高的药物，被动载药法较为适用。而对于一些两亲性药物，其油水分配系数受介质的pH值和离子强度的影响较大，采用被动载药法包封率较低。对于这类水溶性药物多采用主动载药法。目前常用的主动载药技术主要有pH值梯度法、硫酸铵梯度法以及醋酸钙梯度法等，对于弱碱性药物而言，较多采用硫酸铵梯度法及pH梯度法制备。由于伊立替康、拓扑替康、长春新碱等抗肿瘤药物均为水溶性弱碱性药物，所以选择主动载药法来制备脂质体，以获得较高的包封率和载药量。

将药物经脂质体包载后，药物从脂质体中的释放速度将对治疗效果产生明显影响。若药物从脂质体中释放过快则会导致部分药物在到达肿瘤部位之前即从脂质体中释放出来，接着在血液中被快速清除，而不能进入肿瘤部位；这样药物对肿瘤细胞的暴露大大减少，不利于药效的发挥，同时过快的药物释放会对正常组织细胞产生一定的毒副作用。通常使用主动载药法包载药物，(例如采用蔗糖八硫酸酯三乙胺梯度法制备盐酸伊立替康脂质体，采用硫酸铵梯度法制备盐酸多柔比星脂质体)，药物在脂质体内水相是以胶态沉淀的方式存在的，不具有生物活性。只有药物从沉淀中解离并从脂质体释放出来，才可以转变为有生物活性的药物。因此，如果药物的释放过于缓慢，即使被有效的靶向到肿瘤部位，其治疗效果也会大打折扣。

对于喜树碱类药物，如伊立替康、拓扑替康等，其药物结构中存在的内酯环部分在生理条件下易水解转变为羧酸盐结构而失去活性；对于长春碱类药物，如长春新碱，药物更易于从脂质体中泄露；因此，对于上述药物而言，减缓其从脂质体中的释放速度有利于提高药物的治疗效果，降低毒性。对于蒽醌类药物，如多柔比星等，采用硫酸铵梯度法制备成脂质体后，虽然其心脏毒性明显降低，但同时由于硫酸根与多柔比星在内水相中形成溶解度较低的沉淀，使得药物释放速度明显减慢，导致治疗效果明显降低。因此对于后者，提高药物在脂质体中的释放速度有利于改善其治疗效果。

环糊精是一种呈环状的低聚葡萄糖。在通常情况下，环糊精是由6、7或8个葡萄糖单元通过α，1-4键环状相互连接的结晶体，分别称α-、β-或γ-环糊精，其中尤以β-环糊精应用最为广泛。由于β-CD溶解度很小，毒性大，而限制了其在药学领域的广泛应用，对β-CD进行化学修饰，得到一系类环糊精衍生物，例如甲基环糊精、羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)、羧甲基-β-环糊精(CM-β-CD)、磺丁基醚-β-环糊精(SBE-β-CD)等。其中HP-β-CD、SBE-β-CD 已被美国药典收载为注射用辅料。有研究报道CM-β-CD比HP-β-CD的溶血作用更小，因此其在在药学领域将具有极大的潜在应用价值。

CM-β-CD作为一种环糊精衍生物，同时也是一种多阴离子衍生物，利用其结构中的多羧基的酸性，与胺类如三乙胺成盐。将其包裹在脂质体中，利用三乙胺形成的内外水相的pH 梯度促进药物的载入。另外，由于其结构中的多阴离子结构的络合及环糊精结构的包合作用，药物载入脂质体后可与其发生络合及包合作用，药物在CM-β-CD的作用下以非沉淀的的形式存在于脂质体内水相中。一方面，与药物单纯以游离状态存在于脂质体内水相相比，可减缓药物的释放，改善药物在脂质体内部的滞留；另一方面，与药物以溶解度较低的胶体沉淀状态存在于内水相相比，能够加快药物的释放速度，改善药物的治疗效果。

发明内容

本发明的一个方面提供一种可改善药物释放的脂质体，其特征在于，双分子层含有磷脂、胆固醇，内水相含有羧甲基环糊精盐及活性化合物。所述内水相的羧甲基环糊精是羧甲基-α- 环糊精、羧甲基-β-环糊精、羧甲基-γ-环糊精。与硫酸铵梯度法相比，采用CM-β-CD/TEA作内水相，可改善喜树碱类药物及长春碱类药物在脂质体中的滞留效果，降低毒性；另一方面，与药物以溶解度较低的胶体沉淀状态存在于内水相相比，能够加快药物的释放速度，改善药物的治疗效果。例如，与硫酸铵梯度法相比，采用CM-β-CD/TEA作内水相，可明显改善多柔比星从脂质体中的释放速度，提高治疗效果。

根据本发明的脂质体的一些实施方式，其中羧甲基环糊精的盐是羧甲基环糊精与氨或胺中的一种或更多种形成的盐。

根据本发明的脂质体的一些实施方式，其中羧甲基环糊精的盐是羧甲基环糊精与氨、二甲胺、二乙胺、三乙胺、三乙醇胺中的一种或更多种形成的盐。

根据本发明的脂质体的一些实施方式，其中脂质体中的磷脂包括天然卵磷脂、氢化卵磷脂、合成的卵磷脂、1，2-二硬脂酰基卵磷脂、二棕榈酰基卵磷脂、二肉豆蔻酰基卵磷脂、二油酰基卵磷脂、1-硬脂酰基-2-油酰基卵磷脂、1-棕榈酰基-2-油酰基卵磷脂或亲水性聚合物修饰的脂类物质的一种或多种。所述亲水性聚合物修饰的脂类物质包括聚乙二醇-脂类衍生物如聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇-二酰基丙三醇或聚乙二醇-神经酰胺衍生物的一种或多种。

根据本发明的脂质体的一些实施方式，其中所述胆固醇与磷脂的重量比例为1∶2-1∶50。所述磷脂中亲水性聚合物修饰的脂类物质占总磷脂重量比例的0-30％。所述活性化合物与磷脂的重量比例为1∶1-1∶30。

根据本发明的脂质体的一些实施方式，其中所述活性化合物是弱碱性的化合物，所述活性化合物优选为伊立替康、拓扑替康、长春新碱、长春瑞滨、多柔比星、表柔比星、米托蒽醌中的一种或多种。

本发明另一方面提供一种制备上述脂质体的方法，包括如下步骤：

(1)制备羧甲基环糊精铵(胺)盐

称取处方量的羧甲基环糊精钠盐溶于水中，经强酸型阳离子交换树脂转化为游离酸，以氨水或胺滴定制备羧甲基环糊精铵(胺)盐；

(2)制备空白脂质体粗品

称取处方量的磷脂，胆固醇溶于乙醇得到脂质乙醇溶液。在55-60℃下加入至羧甲基环糊精盐的水溶液中，并高速搅拌5-10min；将所得脂质体悬浮液经旋转蒸发，除去乙醇，得空白脂质体粗品；

(3)粒径控制

将步骤(2)中的空白脂质体粗品在55-60℃下依次通过0.8μm，0.4μm，0.2μm，0.1μm的聚碳酸酯膜整粒，得到粒径均一的空白脂质体；

(4)除去外水相的羧甲基环糊精盐

采用透析或柱层析除去步骤(3)中空白脂质体外水相中的羧甲基环糊精盐，外水相以 pH6.5的磷酸盐缓冲液替换，以形成内外水相阴离子梯度；

(5)载药

将步骤(4)中的空白脂质体与活性化合物水溶液于55-60℃下孵育20-40min以将活性化合物包封在脂质体内。

本发明还提供上述任意一项根据本发明制备的脂质体在用于肿瘤治疗中的用途，其中脂质体中的活性化合物是伊立替康、拓扑替康、长春新碱、长春瑞滨、多柔比星和表柔比星中的一种或多种。

附图说明

图1为以硫酸铵梯度法制备的盐酸伊立替康脂质体的透射电镜图片；

图2为以硫酸铵梯度法制备的盐酸伊立替康脂质体的粒径测定结果；

图3为以羧甲基环糊精三乙胺梯度法制备的盐酸伊立替康脂质体的透射电镜图片；

图4为以羧甲基环糊精三乙胺梯度法制备的盐酸伊立替康脂质体的粒径测定结果。

具体实施方式

实施例1：硫酸铵梯度法制备载药脂质体

a.制备空白脂质体

采用乙醇注入法制备空白脂质体，称取氢化大豆磷脂(HSPC)420mg、胆固醇(Chol)140mg、聚乙二醇2000-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(PEG₂₀₀₀-DSPE)10mg以适量无水乙醇溶解，得到脂质乙醇溶液，注入浓度为0.3mol/L 60℃的硫酸铵溶液中，高速搅拌5min，经60℃水浴条件下旋转蒸发除去乙醇。于60℃保温状态下依次通过0.8、0.4、0.2、0.1μm的聚碳酸酯膜以减小粒径及粒度分布，以pH6.5磷酸盐缓冲液作为透析介质，经超滤装置透析10倍体积以除去外水相的硫酸铵，即得到空白脂质体。

b.载药

将药物水溶液与步骤a所得空白脂质体以合适的药脂比混合，60℃水浴条件下孵育 30min，即得载药脂质体。其中制备的盐酸伊立替康脂质体的透射电镜图片及粒径测定结果分别见附图1和2。

实施例2：羧甲基环糊精三乙胺梯度法制备载药脂质体

a.制备羧甲基-β-环糊精三乙胺盐

采用离子交换法制备羧甲基环糊精三乙胺盐，称取9g羧甲基-β-环糊精钠溶于适量纯化水中，通过阳离子交换树脂柱上样，纯化水洗脱，将钠盐置换为游离羧酸。测定洗脱液电导率或检测洗脱过程中洗脱液的pH，收集pH＜5的组分。将收集的洗脱液以三乙胺滴定，以pH 计监测溶液pH，滴定至溶液pH5.5-6.0，准确记录三乙胺体积，以纯化水稀释。制得浓度约 0.1mol/l的羧甲基环糊精三乙胺。

b.制备空白脂质体

采用乙醇注入法制备空白脂质体，称取氢化大豆磷脂(HSPC)420mg、胆固醇(Chol)140mg、聚乙二醇2000-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(PEG2000-DSPE)10mg以适量无水乙醇溶解，得到脂质乙醇溶液，注入浓度为0.1mol/L60℃的羧甲基环糊精三乙胺盐溶液中，高速搅拌5min。经60℃水浴条件下旋转蒸发除去乙醇。于60℃保温状态下依次通过0.8、0.4、 0.2、0.1μm的聚碳酸酯膜以减小粒径，以pH6.5磷酸盐缓冲液作为透析介质，经超滤装置透析10倍体积以除去外水相的盐，即得到空白脂质体。

c.载药

将药物水溶液与步骤b所得空白脂质体以合适的药脂比混合，60℃水浴条件下孵育 30min，即得载药脂质体。其中制备的盐酸伊立替康脂质体的透射电镜图片及粒径测定结果分别见附图3和4。

实施例3：不同梯度法制备的载药脂质体包封率

分别按照实施例1、2中所述的方法制备包载不同药物的脂质体，并分别测定两种梯度法制备的盐酸伊立替康脂质体、硫酸长春新碱脂质体及盐酸多柔比星脂质体的包封率，结果见下表1。

表1以不同制备方法包载不同药物制备的载药脂质体的包封率

结果表明，以羧甲基环糊精三乙胺梯度法制备的上述三种载药脂质体均可达到较高的包封率。

实施例4：不同梯度法制得的盐酸伊立替康脂质体体外释放比较

以实施例1和2中的方法制备的盐酸伊立替康脂质体作为供试品，比较分别以两种梯度法制备的盐酸伊立替康脂质体的体外释放行为。

1.测定方法

分别取两份伊立替康脂质体混悬液以含20mM氯化铵的pH7.4的磷酸盐缓冲液稀释20 倍，每份1ml分装于密闭的小瓶中，分别置于水浴恒温振荡器中(37±0.5℃，100转/分钟) 振摇孵育，分别于1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h取出一份样品，分离脂质体和游离药物。测定此时脂质体中包裹的药物含量。另取相同体积的样品，稀释相同倍数，测定总药物含量。按下式计算各取样时间点药物的释放百分比。

释放度＝(总药物含量-包封药物含量)/总药物含量*100％

2.测定结果

两种梯度法制备的盐酸伊立替康脂质体体外释放结果见下表2。

表2不同梯度法制备的盐酸伊立替康脂质体的体外释放(％)

结果表明，与硫酸铵梯度法相比，采用CM-β-CD/TEA梯度法制备的盐酸伊立替康脂质体体外释放明显变慢，改善了药物在脂质体内部的保留效果。

实施例5：不同梯度法制得的盐酸伊立替康脂质体在大鼠血浆中的释放比较

以实施例1和2中的方法制备的盐酸伊立替康脂质体作为供试品，比较分别以硫酸铵梯度法及羧甲基环糊精三乙胺梯度法制备的盐酸伊立替康脂质体在大鼠血浆中的释放行为。

1.测定方法

分别取两份伊立替康脂质体混悬液以大鼠血浆稀释20倍，每份1ml分装于密闭的小瓶中，分别置于水浴恒温振荡器中(37±0.5℃，100转/分钟)振摇孵育，分别于2h、4h、8h、12h、 24h、48h、72h、96h取出一份样品，分离脂质体和游离药物。测定此时脂质体中包裹的药物含量。另取相同体积的样品，稀释相同倍数，测定总药物含量。按下式计算各取样时间点药物的释放百分比。

释放度＝(总药物含量-包封药物含量)/总药物含量*100％

2.测定结果

两种梯度法制备的盐酸伊立替康脂质体大鼠血浆释放结果见下表3。

表3不同梯度法制备的盐酸伊立替康脂质体的血浆释放(％)

结果表明，与以含氯化铵的pH7.4PBS中的释放结果相似，两者的释放在血浆中也存在明显差别，采用CM-β-CD/TEA梯度法制备的伊立替康脂质体在血浆中的释放明显变慢。

实施例6：不同梯度法制备的多柔比星脂质体体外释放比较

以实施例1和2中的方法制备的盐酸多柔比星脂质体作为供试品，比较分别以硫酸铵梯度法及羧甲基环糊精三乙胺梯度法制备的盐酸多柔比星脂质体的体外释放行为。

1.测定方法

分别取两份多柔比星脂质体混悬液以含30mM氯化铵的pH7.4的磷酸盐缓冲液稀释20 倍，每份1ml分装于密闭的小瓶中，分别置于水浴恒温振荡器中(37±0.5℃，100转/分钟) 振摇孵育，分别于1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h取出一份样品，分离脂质体和游离药物。测定此时脂质体中包裹的药物含量。另取相同体积的样品，稀释相同倍数，测定总药物含量。按下式计算各取样时间点药物的释放百分比。

释放度＝(总药物含量-包封药物含量)/总药物含量*100％

2.测定结果

两种梯度法制备的盐酸多柔比星脂质体体外释放结果见下表4。

表4不同梯度法制备的盐酸多柔比星脂质体的体外释放(％)

结果表明，采用硫酸铵梯度法制备的盐酸多柔比星脂质体体外释放明显较慢，由于多柔比星与硫酸根在内水相形成溶解度较低的沉淀，因此释放较为缓慢，采用CM-β-CD/TEA梯度法载药，由于CM-β-CD与多柔比星形成的络合物较易解离，因此药物释放速度较硫酸铵梯度法有明显加快。

所应理解的是，以上所述仅仅是为清楚说明本发明所作的的具体举例说明而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改及改进，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种改善药物释放的脂质体，其特征在于脂质双分子层含有磷脂、胆固醇，内水相含有羧甲基环糊精的盐及活性化合物；其制备方法采用羧甲基环糊精盐梯度法。

2.根据权利要求1的脂质体，其特征在于所述羧甲基环糊精是羧甲基-α-环糊精、羧甲基-β-环糊精、羧甲基-γ-环糊精。

3.根据权利要求1的脂质体，其特征在于所述羧甲基环糊精的盐是羧甲基环糊精与氨或胺中的一种或多种形成的盐。

4.根据权利要求1的脂质体，其特征在于所述羧甲基环糊精的盐是羧甲基环糊精与氨水、二甲胺、二乙胺、三乙胺、三乙醇胺中的一种或多种形成的盐。

5.根据权利要求1的脂质体，其中所述的磷脂选自天然卵磷脂、氢化卵磷脂、合成的卵磷脂、1，2-二硬脂酰基卵磷脂、二棕榈酰基卵磷脂、二肉豆蔻酰基卵磷脂、二油酰基卵磷脂、1-硬脂酰基-2-油酰基卵磷脂、1-棕榈酰基-2-油酰基卵磷脂或亲水性聚合物修饰的脂类物质中的一种或多种；所述亲水性聚合物修饰的脂类物质选自聚乙二醇-脂类衍生物如聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇-二酰基丙三醇或聚乙二醇-神经酰胺衍生物中的一种或多种。

6.根据权利要求1的脂质体，所述胆固醇与磷脂的重量比例为1∶2-1∶50，所述磷脂中亲水性聚合物修饰的脂类物质占总磷脂重量比例的0-30％，所述活性化合物与磷脂的重量比例为1∶1-1∶30。

7.根据权利要求1的脂质体，所述胆固醇与磷脂的重量比例为1∶2-1∶10，所述磷脂中亲水性聚合物修饰的脂类物质占总磷脂重量比例的0.1-10％，所述活性化合物与磷脂的重量比例为1∶1-1∶10。

8.根据权利要求1的脂质体，其中所述活性化合物包括喜树碱类(如伊立替康、拓扑替康、7-乙基-10-羟基喜树碱)、长春碱类(如长春新碱、长春瑞滨)、蒽环类(如多柔比星、表柔比星、米托蒽醌)中的一种或多种。

9.根据权利要求1的脂质体制备方法，其中所述羧甲基环糊精盐的浓度为0.05-0.4mol/L。

10.根据权利要求1-8中任意一项的脂质体，其制备方法包括如下步骤：

(1)制备羧甲基环糊精铵(胺)盐

称取处方量的羧甲基环糊精钠盐溶于水中，经强酸型阳离子交换树脂转化为游离酸，以氨水或胺滴定制备羧甲基环糊精铵(胺)盐；

(2)制备空白脂质体粗品

称取处方量的磷脂，胆固醇溶于乙醇，与含羧甲基环糊精盐的水溶液在55-60℃下混合并继续搅拌5-10min；将所得脂质体悬浮液经旋转蒸发，除去乙醇，得空白脂质体粗品；

(3)粒径控制

将步骤(2)中的空白脂质体粗品依次通过0.8μm，0.4μm，0.2μm，0.1μm的聚碳酸酯膜整粒，得到粒径均一的空白脂质体；

(4)除去外水相的羧甲基环糊精盐

采用透析或柱层析除去步骤(3)中空白脂质体外水相中的羧甲基环糊精盐，以形成内外水相盐离子梯度；

(5)载药

将步骤(4)中的空白脂质体与活性化合物水溶液于55-60℃下孵育20-40min以将活性化合物包封在脂质体内。