CN103768024B - 人参皂苷Rh2白蛋白复合纳米粒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人参皂苷Rh2的白蛋白复合纳米粒及其制备方法。本发明利用白蛋白包裹人参皂苷Rh2制成可溶性白蛋白纳米粒给药系统。这种纳米粒的分散性良好，并具有缓释效果，使更多药物能聚集在肿瘤组织附近，提高抗肿瘤效果，并能减轻药物对正常组织的毒副作用，提高患者耐受性。

Description

人参皂苷Rh2白蛋白复合纳米粒及其制备方法

技术领域

本发明属于药物制剂学技术领域，具体而言，涉及一种抗肿瘤药物人参皂苷Rh2的白蛋白复合纳米粒及其制备方法。

背景技术

人参皂苷Rh2属于人参次级苷元，含量极低，抗肿瘤活性强，现多利用含量较高的人参皂苷经降解、转化等方法获得。众多研究表明人参皂苷Rh2可以通过干扰肿瘤细胞的细胞周期，从而使肿瘤细胞增殖速率减慢或诱导细胞死亡。大量基础和临床研究表明含人参皂苷的药物在肿瘤治疗方面有广阔的应用前景，但传统制剂目前仍存在不少问题，如颗粒偏大、不溶于水，生物利用度较低等，限制了其临床应用。如果能通过改进传统制剂工艺、采用现代技术制备新型含人参皂苷中药，从而提高其生物利用度、减少药物用量、降低毒副作用并提高疗效，将具有重要的临床意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种人参皂苷Rh2的纳米颗粒，为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案

本发明一方面涉及一种人参皂苷Rh2的纳米颗粒，所述的纳米颗粒由人参皂苷Rh2与白蛋白制成。本发明所使用的白蛋白包括但不限于牛血清白蛋白、人血清白蛋白、羊血清白蛋白等其他种类白蛋白，其中优选以人血清白蛋白和牛血清白蛋白；优选的，所述的人参皂苷Rh2的纳米颗粒的平均粒径介于150-200nm之间。

在本发明的一个优选实施方式中，人参皂苷Rh2与白蛋白的质量比为1：20到1：8。

在本发明的另一个优选实施方式中，所述的白蛋白和人参皂苷Rh2通过戊二醛交联进行结合。

本发明另一方面还涉及上述人参皂苷Rh2的纳米颗粒的制备方法，所述的制备方法为去溶剂法。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的去溶剂法包括如下步骤：人参皂苷Rh2，溶解于无水乙醇中；白蛋白溶于去离子水中，完全溶解后加入人参皂苷Rh2无水乙醇溶液，于磁力搅拌器上混匀，调节pH值微碱性(pH8.5-9.5)，缓慢加入适量无水乙醇，搅拌半小时待溶液出现混浊后再缓缓加入戊二醛溶液，继续搅拌固化10-15h，将反应液于离心管中离心，用水反复洗三次后，经0.22um的滤膜滤过后真空干燥，4℃以下保存备用。

本发明另一方面还涉及上述人参皂苷Rh2纳米颗粒在对离体肿瘤细胞或组织的杀伤中的应用。

本发明的人参皂苷Rh2纳米颗粒可作为活性成分与药学上可接受的赋型剂一起用于制备药物组合物，该药物组合物可以采用制剂领域的常规方法制备成各种剂型，如注射液、片剂、粉剂、粒剂、丸剂、胶囊、酊剂、口服液、膏剂、霜剂、乳剂或敷贴剂等。根据剂型的不同，该药物组合物使用的赋型剂也不同，常用赋型剂包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、乳化剂、渗透压调节剂。

本发明的人参皂苷Rh2纳米颗粒用于肿瘤的治疗及预防。

本发明利用白蛋白包裹人参皂苷Rh2制成可溶性白蛋白纳米粒给药系统。这种纳米粒的分散性良好，并具有缓释效果，使更多药物能聚集在肿瘤组织附近，提高抗肿瘤效果，并能减轻药物对正常组织的毒副作用，提高患者耐受性。

附图说明

图1为白蛋白药物释放率示意图

图2为人参皂苷白蛋白纳米球的TEM照片

图3为不同浓度人参皂苷白蛋白纳米球对Hela细胞作用的MTT结果示意图

图4为人参皂苷白蛋白纳米球和人参皂苷Rh2对Hela细胞作用的流式细胞结果图

具体实施方式

以下结合具体实施例及附图对本发明的技术方案进一步说明，但不作对其的限定：

本发明利用改良的去溶剂法成功制备了人参皂苷白蛋白纳米球，并且对其制备条件进行优化，获得粒径较为均一、包封率载药量较高的白蛋白纳米球。我们主要通过TEM验证了这一材料的表征，并通过粒径仪进行相关粒径分析，经条件优化获得粒径为160nm-200nm较为均一的白蛋白纳米求。通过研究其对Hela细胞的影响而探讨其在肿瘤治疗中的作用。MTT细胞毒性试验表明包封率为60%左右的本品作用48小时的IC50值为91μg/mL，而流式细胞术的结果表明本品和游离的人参皂苷Rh2一样具有杀伤Hela细胞的功能。以上实验表明本品具有杀伤宫颈癌细胞的作用，相对人参皂苷Rh2，本品具有缓释，毒性低，在肿瘤位置聚集的效果，具有良好的市场应用价值。

实施例1：

本发明涉及的人参皂苷Rh2的白蛋白复合纳米粒制备通过如下步骤：

人参皂苷Rh2的白蛋白复合纳米粒的制备：将人参皂苷Rh2，溶解于少量无水乙醇中，并称取白蛋白250mg溶于25ml去离子水中，完全溶解后加入人参皂苷Rh2，于磁力搅拌器上混匀，调节pH值微碱性(pH9.0)，缓慢（逐滴约1ml/1min）加入适量无水乙醇，搅拌半小时待溶液出现混浊后再缓缓加入戊二醛溶液约50ul，继续搅拌固化12h，将反应液于离心管（21000rpm）中离心半小时，用水反复洗三次后，经220um滤过后真空干燥4℃下保存备用。

通过加入的人参皂苷和白蛋白的比例、无水乙醇量和水相的比例、溶液pH值、使用戊二醛的浓度等各项条件来探讨最佳条件。

优选条件如下：

分别改变标记条件中的某一项参数，而其它参数不变，测定在不同条件下的包封率、载药量以及粒径大小以获取最佳条件。

(1)人参皂苷与白蛋白的质量比由1：20到1：8；

(2)无水乙醇和水相的体积比由10：1到3：1；

(3)缓冲液pH值从4.0至9.0；

(4)使用戊二醛浓度由0.5%-0.05%

人参皂苷和白蛋白的比例对人参皂苷Rh2的白蛋白复合纳米粒稳定性影响

准确称取人参皂苷Rh220mg，溶解于100ul无水乙醇中，并称取白蛋白250mg溶于25ml去离子水中，制备人参皂苷Rh2的白蛋白复合纳米粒，其包封率为58.2%，较加入10mg的要低，但载药量较高。

实施例2：无水乙醇量和水相的比例pH对人参皂苷Rh2的白蛋白复合纳米粒稳定性影响

称取白蛋白250mg溶于25ml去离子水中，完全溶解后加入人参皂苷Rh2，于磁力搅拌器上混匀，缓慢（逐滴约1ml/1min）加入无水乙醇约150ml，制备人参皂苷Rh2的白蛋白复合纳米粒相较加入100ml和200ml无水乙醇的纳米颗粒，粒径较均一，大小适中，适合进行相关动物实验与临床使用，且包封率和载药量较高。

实施例3：缓冲液pH对人参皂苷Rh2的白蛋白复合纳米粒稳定性影响

使用pH9.0的去离子水溶液复溶本品，在包封率以及粒径大小方面，相对pH7.0以及5.0无显著差异。但在4℃保存数月后，释药率较pH7.0以及5.0的具有显著性差异。采用pH5.0复溶的本品较易沉降，不适宜长久保存。

实施例4：戊二醛浓度对人参皂苷Rh2的白蛋白复合纳米粒稳定性影响

使用0.2%戊二醛浓度进行白蛋白纳米颗粒的固定，在其他优化的条件下，测得本品的粒径分布在173nm-183nm间，粒径较均一，相较0.1%的戊二醛固定的粒径小，载药量高。

(1).人参皂苷Rh2的白蛋白复合纳米粒包封率的测定：

使用香草醛-高氯酸法进行人参皂苷Rh2浓度测试，绘制标准曲线。取白蛋白上清液5ml（总体积150ml），测得OD值，计算出150ml上清中人参皂苷Rh2的含量，计算包封率。

(2)白蛋白纳米球释放率测试

将30mg纳米球加入到5ml磷酸缓冲液中，以透析袋封好，放入装有25ml磷酸缓冲液的烧杯中，37oC恒温振荡，定时取出2ml测定药物浓度，并补充2ml缓冲液，结果显示本发明的人参皂苷Rh2在0-50h内基本上以线性的速度释放人参皂苷Rh2。

不同浓度人参皂苷白蛋白纳米球对Hela细胞的细胞毒性测试

将Hela细胞细胞培养在DMEM培养液中(培养液含10％小牛血清，100U/mL青霉素和链霉素)，置于37℃、CO2体积分数为5％、饱和湿度的培养箱中培养。

MTT法测试细胞毒性

将Hela细胞接种至接种至96孔板中，每孔1×10⁴个细胞，设置3个复孔。过夜培养，待细胞贴壁后，将一系列浓度的人参皂苷白蛋白纳米球悬液(人参皂苷终浓度分别为20、40、80、100、120μg/mL)加入细胞培养孔,设置溶剂对照和空白参比孔。给药细胞于细胞培养箱中孵育48h后吸取培养液,用PBS清洗,每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS配制，pH=7.4)20ul，继续孵育4h，终止培养。弃去上清后，每孔加150ulDMSO，振荡10min，使结晶物充分融解。选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

流式细胞术测定细胞凋亡

将Hela细胞接种至接种至6孔板中，每孔4×105个细胞。过夜培养，待细胞贴壁后，将人参皂苷白蛋白纳米球悬液(终浓度分别为80μg/mL)和80μg/mL游离人参皂苷Rh2分别加入细胞培养孔,并设置相应空白对照。72小时后，消化细胞并加入FITC-AnnexinV和PI进行细胞凋亡染色，设置阴性对照组以及FITC单染组。进行流式细胞上机分析。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

Claims (5)

1.一种人参皂苷Rh2的纳米颗粒，所述的纳米颗粒由人参皂苷Rh2与白蛋白制成；所述的白蛋白选自牛血清白蛋白、人血清白蛋白、羊血清白蛋白；所述的人参皂苷Rh2的纳米颗粒的平均粒径介于150-200nm之间；人参皂苷Rh2与白蛋白的质量比为1：20到1：8；所述的白蛋白和人参皂苷Rh2通过戊二醛交联进行结合。

2.权利要求1所述的人参皂苷Rh2的纳米颗粒的制备方法，所述的制备方法为去溶剂法；所述的去溶剂法包括如下步骤：人参皂苷Rh2，溶解于无水乙醇中；白蛋白溶于去离子水中，完全溶解后加入人参皂苷Rh2无水乙醇溶液，于磁力搅拌器上混匀，调节pH值微碱性，pH8.5-9.5，缓慢加入适量无水乙醇，搅拌半小时待溶液出现混浊后再缓缓加入戊二醛溶液，继续搅拌固化10-15h，将反应液于离心管中离心，用水反复洗三次后，经0.22μm 的滤膜滤过后真空干燥，4℃以下保存备用。

3.权利要求1所述的人参皂苷Rh2纳米颗粒在对离体肿瘤细胞或组织的杀伤中的应用。

4.药物组合物，其含有权利要求1所述的人参皂苷Rh2纳米颗粒作为活性成分以及药学上接受的赋形剂。

5.根据权利要求4所述的药物组合物，所述的药物组合物为注射液、片剂、粉剂、丸剂、胶囊、酊剂、口服液、膏剂、霜剂、乳剂或敷贴剂。