CN116196279B - 一种蟾酥提取物无胆固醇脂质体及其制备方法和应用 - Google Patents

一种蟾酥提取物无胆固醇脂质体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及中医药制剂技术领域，具体公开了一种蟾酥提取物无胆固醇脂质体及其制备方法和应用。脂质体不含胆固醇，包括以下组分：磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇衍生物和蟾酥提取物，其中，磷脂酰胆碱与磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇衍生物的质量比为21～32:20～31。利用蟾蜍内酯结构与胆固醇的相似性，采用蟾蜍内酯替代胆固醇，药辅合一，无胆固醇脂质体制剂处方增大了载药空间，该新型无胆固醇脂质体与普通脂质体相比包封率、载药量、稳定性均更高，贮存过程中渗漏率更低；同时，利用脂质体中水相内核，实现对水溶性药效成分蟾毒色胺类化合物的共载，充分发挥蟾酥中有效成分蟾蜍内酯类化合物抗肿瘤作用，蟾毒色胺类化合物的镇痛作用。

Description

一种蟾酥提取物无胆固醇脂质体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及中医药制剂技术领域，尤其涉及一种蟾酥提取物脂质体及其制备方法和应用。
背景技术
目前蟾酥已被研制成多种剂型应用于临床，主要包括蟾酥注射液、麝香保心丸、蟾麝救心丸等制剂。但蟾酥有效成分本身存在较大的毒副作用，如易导致心跳加速、抽搐、恶心呕吐等不良反应，在滴注的过程中容易出现疼痛、过敏反应等，因此在使用过程中受到多种因素的限制。近年来，为了减少其在使用过程中出现的毒副作用和不良反应，使其更好的应用于临床，研制了纳米粒、脂质体、自微乳、凝胶剂等多种新型制剂。
其中，脂质体是由一层或多层脂质体双分子膜包封而成的超微型球状药物载体制剂，其结构类似于生物膜，可包封水溶性和脂溶性药物。脂质体进入人体后，能增加药物在靶区的聚集，并能延长其在血液中的半衰期。作为靶向给药系统中第4代给药体系，脂质体具有无可比拟的优越性：一方面可以靶向性延缓释放药物，提高药效，降低体内消除速度；另一方面可以降低药物体内毒性，减轻变态反应和免疫反应。脂质体一般是由磷脂和胆固醇构成，其中胆固醇可提高脂质体双分子膜的力学稳定性，调节脂质体的流动性和通透性，并保持较高的药物包封率。
申请号为200510030639.5的中国专利申请公开了一种蟾酥提取物脂质体及其制备方法，该专利公开了将磷脂、胆固醇等溶解于甲醇、氯仿、乙醇、乙醚或其中两者的混合物中，通过薄膜分散法得到膜，将乳化剂泊洛沙姆188或吐温80溶于缓冲液中，再将蟾酥提取物溶于该溶液中，然后将制得的溶液加入上述膜中，涡旋振荡，制备得到蟾酥提取物脂质体。
申请号为200810202734.2的中国专利申请公开了一种蟾酥纳米长循环脂质体及其制备方法，该专利公开了将磷脂、胆固醇、膜修饰材料和蟾酥提取物溶于甲醇、乙醇、乙醚、氯仿中的一种或多种，将表面活性剂泊洛沙姆188或吐温80溶于缓冲液中，将上述有机溶液逐滴注入通氮气搅拌的溶有表面活性剂的缓冲液中，充分搅拌，旋转蒸发除去有机溶媒，然后经高压乳匀，制备得到蟾酥纳米长循环脂质体。
申请号为201410544846.1的中国专利申请公开了一种蟾酥靶向脂质体及其制备方法，该专利公开了将二硬脂酰磷脂酰胆碱，胆固醇，二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000，二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-羧基交连物溶于氯仿中；蟾酥溶于甲醇中，两者按照体积比1:1混合，采用薄膜分散法除去氯仿、甲醇，再将该脂质膜在等渗盐缓冲液中水化。然后将所述混合物在80℃保持一定时间，并分别在开始的、中间的和末端的时间点将它用涡流搅拌，最后将得到的制剂使用挤出机经过直径为25 mm的Whatman 100 nm聚碳酸酯过滤器用数个循环挤出，直到粒径在20-200 nm之内。再取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）和N-羟基硫代琥珀酰亚胺（S-NHS）加入上述制备的包裹蟾酥的脂质体PBS缓冲液中，室温搅拌后，加入碳酸酐酶CA9抗体，置于4℃条件下反应。然后用PBS作为透析介质透析袋透析，重复上述操作2次，除去未包封的蟾酥、未反应的碳酸酐酶CA9抗体、EDC·HCl、S-NHS及普通脂质体。
上述脂质体的制备均使用了胆固醇，而胆固醇为多环不饱和醇，具有易发生结构衍生化的官能团，如双键和羟基，易在加工储存过程中受氧、光、金属等外界条件的影响产生胆固醇氧化产物。胆固醇氧化产物种类多样，且具有一定的细胞毒性、致突变性和潜在致癌性、可明显促进动脉粥样硬化，进而影响脂质体制剂的稳定性、安全性，危害人体健康。而且脂质体具有较好的EPR效应，常用于抗肿瘤药物的递送，而在肿瘤部位过量摄入胆固醇会抑制T细胞的抗肿瘤活性，影响肿瘤免疫微环境。
发明内容
蟾酥提取物中蟾毒内酯是强心甾体类化合物，具有与胆固醇类似的结构，可替换普通脂质体处方中的胆固醇。能够减少患有高血脂、冠心病、高血压等心血管疾病的患者和肿瘤患者服用该脂质体时胆固醇的摄入量，有针对性的对癌细胞进行抑制，减少对人体正常细胞的伤害和患者治疗痛苦，提高治疗效果。采用无胆固醇脂质体制剂处方，空出了载药空间，该新型无胆固醇脂质体与普通脂质体相比载药量更高；同时，利用脂质体内部水相内核，实现对水溶性药效成分蟾蜍色胺类化合物的共载，该新型无胆固醇脂质体能同时包载蟾酥提取物中脂溶性蟾毒内酯和水溶性蟾蜍色胺类化合物，充分发挥蟾酥中有效成分蟾毒内酯抗肿瘤作用，蟾蜍色胺类的镇痛作用，从而实现蟾酥提取物中多组分的高效载药和靶向递送，解决蟾酥脂溶性有效组分水溶性差、生物利用度低及毒性大等问题，发挥中药多组分、多环节、多靶点的特点。
本发明的目的之一在于提供一种蟾酥提取物无胆固醇脂质体。
本发明的目的之二在于提供一种所述蟾酥提取物无胆固醇脂质体的制备方法。
本发明的目的之三在于提供一种所述蟾酥提取物无胆固醇脂质体在制备治疗癌症药物和/或镇痛药物中的应用。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种蟾酥提取物无胆固醇脂质体，所述蟾酥提取物无胆固醇脂质体不含胆固醇，包括以下组分：磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇衍生物和蟾酥提取物；
其中，所述蟾酥提取物中蟾毒内酯类成分嵌入脂质体的磷脂双分子层之间，所述蟾酥提取物中蟾蜍色胺类成分包裹在脂质体的水相内核中；
所述蟾酥提取物无胆固醇脂质体中，总蟾毒内酯类成分含量为190.00～280.00μg/mL，具体为193.10～279.66μg/mL，优选为220～280μg/mL，总蟾蜍色胺类成分含量为49.00～73.00μg/mL，具体为49.92～72.30μg/mL，优选为58～73μg/mL，优选其中蟾毒灵、华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的总含量为142.00～207.00μg/mL，具体为142.42～206.17μg/mL；
所述蟾酥提取物无胆固醇脂质体中，磷脂酰胆碱与磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇衍生物的质量比为21～32:20～31，优选为1:0.8～1:1.2。
本发明的蟾酥提取物新型无胆固醇脂质体利用蟾毒内酯结构与胆固醇的相似性，采用蟾毒内酯替代胆固醇，药辅合一，其与普通脂质体（含胆固醇）的对比图如图1所示。
如图所示，在普通脂质体中，胆固醇嵌入磷脂双分子层之间，蟾毒内酯类（图中从左至右、从上至下依次为蟾毒灵、蟾蜍他里定、去乙酰华蟾酥毒基、去乙酰华蟾毒它灵、日蟾毒它灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、华蟾酥毒基、酯蟾毒配基）成分被包封于磷脂双分子层之间，蟾蜍色胺类成分包裹在脂质体水相内核中。本申请新型无胆固醇脂质体中，蟾酥提取物中蟾毒内酯类成分替代了普通脂质体中胆固醇的位置，嵌入磷脂双分子层之间，蟾蜍色胺类成分仍包裹在脂质体水相内核中。
在一些实施方式中，磷脂酰胆碱为选自大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、单棕榈酰磷脂酰胆碱和甘油磷脂酰胆碱中的一种或多种，优选为二硬脂酰磷脂酰胆碱（DSPC）。
在一些实施方式中，磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇衍生物为选自二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇3400、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5000、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5000及二油酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000中的一种或多种，优选为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（DSPE-MPEG2000）。
蟾酥提取物主要由蟾毒内酯和蟾蜍色胺类化合物组成，主要有13种成分，分别为蟾毒内酯类成分：去乙酰华蟾酥毒基、日蟾毒它灵、沙蟾毒精、蟾蜍他里定、去乙酰华蟾毒它灵、远华蟾毒精、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、酯蟾毒配基，以及蟾蜍色胺类成分：蟾蜍特尼定、蟾蜍色胺。其含量以蟾毒内酯和蟾蜍色胺类化合物中13种成分计算。蟾酥提取物可以根据本领域常规方法制备得到。
在一些实施方式中，所述蟾酥提取物无胆固醇脂质体中，水溶性成分（蟾蜍特尼定、蟾蜍色胺）的包封率为35～42%，具体为35.3%～41.6%，脂溶性成分（去乙酰华蟾酥毒基、日蟾毒它灵、沙蟾毒精、蟾蜍他里定、去乙酰华蟾毒它灵、远华蟾毒精、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、酯蟾毒配基）的包封率为87～94%，具体为87.6%～93.1%；所述蟾酥提取物无胆固醇脂质体的载药量为2.3%～2.9%。
在一些实施方式中，所述蟾酥提取物无胆固醇脂质体的平均粒径为70～200 nm，具体为75.60～195.64 nm，优选为70～150 nm；所述蟾酥提取物无胆固醇脂质体的Zeta电位为-9～-14 mV，具体为-9.9～-13.9 mV。
优选地，所述蟾酥提取物无胆固醇脂质体的多分散指数PDI<0.3。
第二方面，本发明提供一种上述蟾酥提取物无胆固醇脂质体的制备方法，包括以下步骤：
（1）将原料磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇衍生物和蟾酥提取物溶于有机溶剂中，得到混合溶液，混合溶液除去有机溶剂，形成一层薄膜，真空干燥；
其中，磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇衍生物和蟾酥提取物的质量比为21～32:20～31:4～7，具体为21.79～31.53:20.37～30.50:4.35～6.3，优选为26～32:23～31:5～7，具体为26.95～31.53:23.93～30.5:5.1～6.3；
（2）将薄膜用磷酸缓冲溶液水化，得到脂质水分散体；
（3）将脂质水分散体进行超声或均质化处理；
（4）除去未包封的蟾酥提取物，得到纯化的蟾酥提取物无胆固醇脂质体。
在一些实施方式中，步骤（1）中，所述有机溶剂可以为甲醇和氯仿的混合溶剂，优选甲醇和氯仿的体积比为1:1。
在一些实施方式中，步骤（1）中，混合溶液可以在55～65℃，优选60℃下恒温减压除去有机溶剂。
在一些实施方式中，步骤（1）中，真空干燥的时间可以为1～3 h，优选1 h。
在一些实施方式中，步骤（2）中，所述磷酸缓冲溶液可以为PBS溶液，所述PBS溶液的pH值优选为5～8，优选5.5。
在一些实施方式中，步骤（2）中，水化温度可以为55～65 ℃，优选60 ℃，水化时间可以为10～30 min，优选20 min。
在一些实施方式中，步骤（3）中，超声为冰水浴探头超声处理，优选的探头超声条件为50～100 W，优选80 W，3S on/3S off，5～15 min，优选10 min。
在一些实施方式中，步骤（3）中，均质化处理在高压均质仪中分散，优选的条件为15000～25000 PSI循环3次，优选20000 PSI循环3次。
在一些实施方式中，步骤（4）中，可以使用透析袋透析以除去未包封的蟾酥提取物。
为便于保存和运输，本发明还可通过冷冻干燥将上述脂质体制成干粉剂。
第三方面，本发明提供一种上述蟾酥提取物无胆固醇脂质体在制备治疗癌症药物和/或镇痛药物中的应用。
所述治疗癌症药物包括但不限于肝癌药物、肺癌药物、结肠癌药物、膀胱癌药物、子宫颈癌药物、脑胶质瘤药物、胃癌药物等。
本发明的蟾酥提取物新型无胆固醇脂质体不仅抗肿瘤效果较好；同时，还具有较强的镇痛的作用。
本发明的蟾酥提取物新型无胆固醇脂质体可用作静脉注射给药，能提高蟾酥提取物的生物利用度。
本发明的有益效果在于：
（1）本发明利用蟾毒内酯结构与胆固醇的相似性，采用蟾毒内酯替代胆固醇，药辅合一，采用无胆固醇脂质体制剂处方，增大了载药空间，与普通脂质体相比，包封率与载药量更高，稳定性更好，贮存过程中渗漏率更低；同时，利用脂质体中水相内核，实现对水溶性药效成分蟾蜍色胺类化合物的共载，充分发挥蟾酥中有效成分蟾毒内酯类化合物的抗肿瘤作用以及蟾蜍色胺类化合物的镇痛作用，具有良好的应用前景。
（2）本发明中使用蟾毒内酯替代脂质体处方中胆固醇，能够减少患有高血脂、冠心病、高血压等心血管疾病的患者服用脂质体时胆固醇的摄入量，有针对性的对癌细胞进行抑制，减少对人体正常细胞的伤害和患者治疗痛苦，提高治疗效果。
附图说明
图1为本发明无胆固醇脂质体与含胆固醇的普通脂质体的对比图。
图 2 为实施例1的无胆固醇脂质体的粒径分布图。
图 3为实施例1的无胆固醇脂质体的透射电镜图。
图 4 为蟾酥提取物、对比例1的普通脂质体和实施例1的无胆固醇脂质体对HepG2细胞毒性结果图（n=3）。
图 5 为经不同制剂（生理盐水、蟾酥提取物、对比例1的普通脂质体和实施例1的无胆固醇脂质体）治疗后荷瘤Balb/c-nu裸鼠肿瘤体积变化结果图（n=6）。**代表P<0.01，n.s.代表无显著差异。
图 6 为经不同制剂（生理盐水、蟾酥提取物、对比例1的普通脂质体和实施例1的无胆固醇脂质体）治疗后各组肿瘤重量结果图（n=6）。**代表P<0.01，n.s.代表无显著差异。
图 7 为不同制剂（生理盐水、蟾酥提取物、实施例1的无胆固醇脂质体、吗啡组）对小鼠腹腔注射醋酸后在15分钟内扭动次数的影响结果图（n=10）。**代表P<0.01。
具体实施方式
为了更好地对本发明进行说明，下面将结合实施例对本发明进行清楚、完整的描述，但不能把它们理解为对本发明保护范围的限制。基于本发明中的实施例，熟悉本领域的技术人员可以在本发明的精神和实质的范围内对实施方案进行各种改进和调整。
除特殊说明外，在实施例中所采用的原料、试剂、方法等均为本领域常规的原料、试剂、方法。
磷脂DSPC，DSPE-MPEG2000为艾伟拓（上海）医药科技有限公司生产；
磷酸盐缓冲液（PBS）按2020年《中国药典》自配；
蟾酥提取物为自制：称取蟾酥粗粉（安徽华庄药业有限公司产）0.2g，以120倍量（24 mL）70％乙醇溶液提取2次，每次提取时间为140 min，合并两次提取液，滤过，滤液减压回收乙醇至稠膏状，经干燥后得蟾酥提取物浸膏，其中蟾酥提取物中13种成分占整个提取物的重量百分比为56.33%。
其余试剂均为常规市售产品。
脂质体粒径采用Nano S900激光粒度仪（英国Malvern公司）进行测定。
探头超声采用JY92-IIN超声波细胞粉碎仪（宁波新芝生物科技有限公司）进行；高压均质采用NS1001L高压均质机（意大利GEA Niro Soavi公司）进行。
脂质体包封率和载药量测定：
采用葡聚糖凝胶柱法测定脂质体的包封率，即使用葡聚糖凝胶柱将制备的脂质体与未包封的游离药物进行分离，然后通过超高效液相色谱（UPLC）法测得脂质体中包载的蟾酥提取物中的13种成分，即可换算出脂质体中的药物总量。具体方法如下：
将Sephadex G-50葡聚糖凝胶室温下浸泡在蒸馏水中24 h，使其充分溶胀，分别装填于柱内，然后将柱垂直安装好，先加入1/3柱体积蒸馏水，接着将溶胀好的凝胶边搅匀边连续装入，使它们在柱内自然沉降。装柱后的凝胶必须均匀，不能有气泡或明显条纹。装好后，用蒸馏水平衡10倍柱体积后加脂质体样品1mL分离，收集洗脱液，乙腈破乳后过0.45 μm滤膜，进UPLC分析。
包封率（EE）计算公式为：
式中，M 总为药物总质量，M 包为包载进脂质体中的药物质量。
载药量计算公式为：
式中，M 包为包载进脂质体中的药物质量，M 脂质为加入的脂质材料（DSPC+ DSPE-MPEG2000）的总质量。
实施例1
将6.30 mg蟾酥提取物，31.53 mg DSPC，30.50 mg DSPE-MPEG2000溶于5 mL甲醇和氯仿的混合溶剂中（甲醇：氯仿=1：1），得到混合溶液。将混合溶液在60 ℃下恒温减压除去有机溶剂，在瓶壁内侧形成一层黄色透明薄膜，然后真空干燥1 h。按中国药典配制pH=5.5的磷酸盐缓冲液（PBS）。然后将脂质膜用上述PBS水化，水化温度为60 ℃，水化时间为20min。将上述水化后的混合溶液用冰水浴探头超声处理，探头超声条件为80 W，3S on/3Soff，10 min。使用透析袋透析上述混合溶液，透析用去离子水的量为2 L，除去未包封的蟾酥提取物，即得新型无胆固醇脂质体。所得到的新型无胆固醇脂质体采用激光粒度仪测定粒径，平均粒径为75.60nm，PDI＜0.3，电位为-13.1mV，其粒径分布如图2，透射电镜结果如图3。水溶性成分包封率为41.6%，脂溶性成分包封率为93.1%，载药量为2.9%，其中总蟾毒内酯类成分含量为279.66μg/mL，总蟾蜍色胺类成分含量为72.30μg/mL，其中蟾毒灵、华蟾酥毒基、酯蟾毒配基的含量为206.17μg/mL。
实施例2
将6.00 mg蟾酥提取物，30.39 mg DSPC，28.51 mg DSPE-MPEG2000溶于5 mL甲醇和氯仿的混合溶剂中（甲醇：氯仿=1：1），得到混合溶液。将混合溶液在60 ℃下恒温减压除去有机溶剂，在瓶壁内侧形成一层黄色透明薄膜，然后真空干燥1 h。按中国药典配制pH=5.5的磷酸盐缓冲液（PBS）。然后将脂质膜用上述PBS水化，水化温度为60 ℃，水化时间为20min。将上述水化后的混合溶液用冰水浴探头超声处理，探头超声条件为80 W，3S on/3Soff，10 min。使用透析袋透析上述混合溶液，透析用去离子水的量为2 L，除去未包封的蟾酥提取物，即得新型无胆固醇脂质体。所得到的新型无胆固醇脂质体采用激光粒度仪测定粒径，平均粒径为126.46nm，PDI<0.3，电位为-10.5mV。水溶性成分包封率为39.8%，脂溶性成分包封率为89.4%，载药量为2.8%，其中总蟾毒内酯类成分含量为265.71μg/mL，总蟾蜍色胺类成分含量为68.85μg/mL，其中蟾毒灵、华蟾酥毒基、酯蟾毒配基的含量为195.55μg/mL。
实施例3
将5.85 mg蟾酥提取物，28.67 mg DSPC，25.46 mg DSPE-MPEG2000溶于5 mL甲醇和氯仿的混合溶剂中（甲醇：氯仿=1：1，得到混合溶液）。将混合溶液在60 ℃下恒温减压除去有机溶剂，在瓶壁内侧形成一层黄色透明薄膜，然后真空干燥1 h。按中国药典配制pH=5.5的磷酸盐缓冲液（PBS）。然后将脂质膜用上述PBS水化，水化温度为60 ℃，水化时间为20min。将上述水化后的混合溶液用冰水浴探头超声处理，探头超声条件为80 W，3S on/3Soff，10 min。使用透析袋透析上述混合溶液，透析用去离子水的量为2 L，除去未包封的蟾酥提取物，即得新型无胆固醇脂质体。所得到的新型无胆固醇脂质体采用激光粒度仪测定粒径，平均粒径为149.94nm，PDI<0.3，电位为-9.9mV。水溶性成分包封率为37.5%，脂溶性成分包封率为91.7%，载药量2.7%，其中总蟾毒内酯类成分含量为257.74μg/mL，总蟾蜍色胺类成分含量为66.79μg/mL，其中蟾毒灵、华蟾酥毒基、酯蟾毒配基的含量为189.65μg/mL。
实施例4
将5.10 mg蟾酥提取物，26.95 mg DSPC，23.93 mg DSPE-MPEG2000溶于5 mL甲醇和氯仿的混合溶剂中（甲醇：氯仿=1：1，得到混合溶液）。将混合溶液在60 ℃下恒温减压除去有机溶剂，在瓶壁内侧形成一层黄色透明薄膜，然后真空干燥1 h。按中国药典配制pH=5.5的磷酸盐缓冲液（PBS）。然后将脂质膜用上述PBS水化，水化温度为60 ℃，水化时间为20min。将上述水化后的混合溶液用冰水浴探头超声处理，探头超声条件为80 W，3S on/3Soff，10 min。使用透析袋透析上述混合溶液，透析用去离子水的量为2 L，除去未包封的蟾酥提取物，即得新型无胆固醇脂质体。所得到的新型无胆固醇脂质体采用激光粒度仪测定粒径，平均粒径为97.56nm，PDI＜0.3，电位为-11.2mV，未见大于200nm的粒子。水溶性成分包封率为41.2%，脂溶性成分包封率为88.4%，载药量为2.9%，其中总蟾毒内酯类成分含量为226.39μg/mL，总蟾蜍色胺类成分含量为58.53μg/mL，其中蟾毒灵、华蟾酥毒基、酯蟾毒配基的含量为166.77μg/mL。
实施例5
将4.50 mg蟾酥提取物，21.79 mg DSPC，24.55 mg DSPE-MPEG2000溶于5 mL甲醇和氯仿的混合溶剂中（甲醇：氯仿=1：1，得到混合溶液）。将混合溶液在60 ℃下恒温减压除去有机溶剂，在瓶壁内侧形成一层黄色透明薄膜，然后真空干燥1 h。按中国药典配制pH=5.5的磷酸盐缓冲液（PBS）。然后将脂质膜用上述PBS水化，水化温度为60 ℃，水化时间为20min。 将上述水化后的混合溶液用冰水浴探头超声处理，探头超声条件为80 W，3S on/3Soff，10 min。使用透析袋透析上述混合溶液，透析用去离子水的量为2 L，除去未包封的蟾酥提取物，即得新型无胆固醇脂质体。所得到的新型无胆固醇脂质体采用激光粒度仪测定粒径，平均粒径为119.85nm，PDI>0.3，电位为-12.1mV，未见大于200nm的粒子。水溶性成分包封率为40.1%，脂溶性成分包封率为90.3%，载药量为2.8%，其中总蟾毒内酯类成分含量为199.28μg/mL，总蟾蜍色胺类成分含量为51.64μg/mL，其中蟾毒灵、华蟾酥毒基、酯蟾毒配基的含量为146.85μg/mL。
实施例6
将4.35 mg蟾酥提取物，22.94 mg DSPC，20.37 mg DSPE-MPEG2000溶于5 mL甲醇和氯仿的混合溶剂中（甲醇：氯仿=1：1，得到混合溶液）。将混合溶液在60 ℃下恒温减压除去有机溶剂，在瓶壁内侧形成一层黄色透明薄膜，然后真空干燥1 h。按中国药典配制pH=5.5的磷酸盐缓冲液（PBS）。然后将脂质膜用上述PBS水化，水化温度为60 ℃，水化时间为20min。将上述水化后的混合溶液用冰水浴探头超声处理，探头超声条件为80 W，3S on/3Soff，10 min。使用透析袋透析上述混合溶液，透析用去离子水的量为2 L，除去未包封的蟾酥提取物，即得新型无胆固醇脂质体。所得到的新型无胆固醇脂质体采用激光粒度仪测定粒径，平均粒径为195.64nm，PDI＜0.3，电位为-13.9mV，未见大于200nm的粒子。水溶性成分包封率为39.7%，脂溶性成分包封率为89.9%，载药量为2.9%，其中总蟾毒内酯类成分含量为193.10μg/mL，总蟾蜍色胺类成分含量为49.92μg/mL，其中蟾毒灵、华蟾酥毒基、酯蟾毒配基的含量为142.42μg/mL。
实施例7
将63.00 mg蟾酥提取物，315.30 mg DSPC，305.00 mg DSPE-MPEG2000溶于50 mL甲醇和氯仿的混合溶剂中（甲醇：氯仿=1：1，得到混合溶液）。将混合溶液在60 ℃下恒温减压除去有机溶剂，在瓶壁内侧形成一层黄色透明薄膜，然后真空干燥1 h。按中国药典配制pH=5.5的磷酸盐缓冲液（PBS）。然后将脂质膜用上述PBS水化，水化温度为60 ℃，水化时间为20 min，得到新型无胆固醇脂质体粗悬液。将新型无胆固醇脂质体粗悬液于高压均质仪中分散，20000 PSI条件下循环3次，使用透析袋透析上述混合溶液，透析用去离子水的量为2 L，除去未包封的蟾酥提取物，即得新型无胆固醇脂质体。所得到的新型无胆固醇脂质体采用激光粒度仪测定粒径，平均粒径为77.85nm，PDI＜0.3，电位为-13.6mV。水溶性成分包封率为35.3%，脂溶性成分包封率为87.6%，载药量为2.3%，其中总蟾毒内酯类成分含量为220.41μg/mL，总蟾蜍色胺类成分含量为56.88μg/mL，其中蟾毒灵、华蟾酥毒基、酯蟾毒配基的含量为157.80μg/mL。
对比例1普通脂质体
将6.30 mg蟾酥提取物，31.53 mg DSPC，30.50 mg DSPE-MPEG2000，胆固醇1.93mg溶于5 mL甲醇和氯仿的混合溶剂中（甲醇：氯仿=1：1），得到混合溶液。将混合溶液在60℃下恒温减压除去有机溶剂，在瓶壁内侧形成一层黄色透明薄膜，然后真空干燥1 h。按中国药典配制pH=5.5的磷酸盐缓冲液（PBS）。然后将脂质膜用上述PBS水化，水化温度为60℃，水化时间为20 min。将上述水化后的混合溶液用冰水浴探头超声处理，探头超声条件为80 W，3S on/3S off，10 min。使用透析袋透析上述混合溶液，透析用去离子水的量为2 L，除去未包封的蟾酥提取物，即得普通脂质体。所得到的普通脂质体采用激光粒度仪测定粒径，平均粒径为76.40nm，PDI＜0.3，电位为-15.3mV。水溶性成分包封率为22.7%，脂溶性成分包封率为86.9%，载药量为2.2%，其中总蟾毒内酯类成分含量为212.04μg/mL，总蟾蜍色胺类成分含量为54.72μg/mL，其中蟾毒灵、华蟾酥毒基、酯蟾毒配基的含量为156.70μg/mL。
试验例1 稳定性测试
将制备好的实施例1的新型无胆固醇脂质体和对比例1的普通脂质体储藏在4°C冰箱内，每隔5天对脂质体的渗漏率、粒径变化进行测量，结果如表1。
渗漏率是指包封率随时间变化的稳定性，即脂质体在储藏期间包封率随时间的变化情况，是评价脂质体稳定性的重要参数，定义为储藏一段时间后渗漏到介质中的药量与刚制备时包封的总药量的比值。
脂质体渗漏率计算公式为：
渗漏率(%)=()×100%
式中，EE 0为储藏前脂质体包封率，EE X为储藏X天脂质体包封率。
表 1 脂质体储存30天内粒径和渗漏率变化
表1显示，在30天内，普通脂质体粒径由初始的76.40 nm增加到了179.60 nm，而新型无胆固醇脂质体的粒径则只由初始的75.60 nm变化到了88.26 nm，新型无胆固醇脂质体的粒径变化较小；在30天内，普通脂质体的渗漏率高达61.6%，而新型无胆固醇脂质体的渗漏率仅为3.8%，且样品均没有出现分层、沉淀等现象。以上结果表明新型无胆固醇脂质体具有更好的稳定性。
试验例2 脂质体对肿瘤细胞成活率的影响
取对数生长期HepG 2细胞，用胰酶消化后计数，以1 × 105cells/mL的密度将细胞接种至96孔板中，每孔100 μL，然后细胞放入细胞培养箱中培养24 h。换成含有不同浓度的蟾酥提取物、不同浓度的对比例1的普通脂质体以及实施例1的新型无胆固醇脂质体的培养基，每个浓度3个复孔，并同时设对照组（加细胞、培养基、CCK-8）、空白组（培养基、CCK-8）。24 h后加入含CCK8 20μL的培养基100 μL，避光孵育2 h后于450 nm处测定吸光度值（A）。根据下面公式算出制剂对HepG2细胞的生长抑制率：
图4显示，蟾酥提取物、普通脂质体以及新型无胆固醇脂质体的IC50值分别为1.39、0.48、0.51μg/mL。相比于蟾酥提取物，普通脂质体以及新型无胆固醇脂质体对HepG2细胞具有更强的细胞毒作用。
试验例3 脂质体体内抗肿瘤药效研究
将24只已接种HepG 2细胞的荷瘤裸鼠随机分成4组，每组6只。设置生理盐水组、蟾酥提取物组、普通脂质体（对比例1）组以及新型无胆固醇脂质体（实施例1）组，各组小鼠正常饲养，待肿瘤体积长至50 mm3后开始尾静脉注射给药（以蟾酥提取物中13种成分计为0.4mg/kg），每两天给药一次，共给药6次，同时测定各组裸鼠的肿瘤体积和体重。依据公式V瘤=π/6×a2×b（短径a、长径b）计算肿瘤体积。停药后隔一天，记录肿瘤大小及体重，处死后取瘤体和器官称重。依据下面公式计算抑瘤率（TGI）：
TGI（%）=（1-M治疗组/M对照组）×100% （M为各组平均瘤重）
图5显示，相同时间下，生理盐水组和蟾酥提取物组的肿瘤体积最大，而普通脂质体组以及新型无胆固醇脂质体组最小；图6显示，新型无胆固醇脂质体组的肿瘤重量与普通脂质体组接近，但显著小于生理盐水组和蟾酥提取物组的肿瘤重量（P<0.01），抑瘤率高达77.8%，进而说明本发明的新型无胆固醇脂质体对肿瘤具有较好的抑制作用，药效较好。
试验例4 脂质体体内镇痛作用研究
取小鼠50只，随机分成5组，每组10只。设置模型组（给予生理盐水）、蟾酥提取物组、新型无胆固醇脂质体（实施例1）组以及吗啡组，静脉注射给药（蟾酥提取物组、新型无胆固醇脂质体组给药剂量以蟾酥提取物中13种成分计为0.4mg/kg，吗啡组以吗啡计为10mg/kg），给药2 h后，各小鼠腹腔注射0.8%醋酸，0.2 mL/只；另设置正常组（不腹腔注射0.8%醋酸，给予生理盐水）作为对照，观察小鼠在15 min内扭体次数（腹部内凹、躯干与后腿伸张、臀部高起）。
图7结果显示：与模型组比较，新型无胆固醇脂质体组能降低小鼠在15 min内的扭体次数，差异有统计学意义（P<0.01）。

Claims (9)

1.一种蟾酥提取物无胆固醇脂质体，其特征在于，所述蟾酥提取物无胆固醇脂质体不含胆固醇，包括以下组分：磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇衍生物和蟾酥提取物；
其中，所述蟾酥提取物中蟾毒内酯类成分嵌入脂质体的磷脂双分子层之间，所述蟾酥提取物中蟾蜍色胺类成分包裹在脂质体的水相内核中；
所述蟾酥提取物无胆固醇脂质体中，蟾毒内酯类成分包括去乙酰华蟾酥毒基、日蟾毒它灵、沙蟾毒精、蟾蜍他里定、去乙酰华蟾毒它灵、远华蟾毒精、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、酯蟾毒配基；蟾蜍色胺类成分包括蟾蜍特尼定、蟾蜍色胺；
所述蟾酥提取物无胆固醇脂质体中，磷脂酰胆碱与磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇衍生物的质量比为21～32:20～31；
所述磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇衍生物为选自二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇3400、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5000、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5000和二油酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的蟾酥提取物无胆固醇脂质体，其特征在于，所述磷脂酰胆碱为选自大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、单棕榈酰磷脂酰胆碱和甘油磷脂酰胆碱中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的蟾酥提取物无胆固醇脂质体，其特征在于，所述磷脂酰胆碱为二硬脂酰磷脂酰胆碱；所述磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇衍生物为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000。
4. 根据权利要求1-3任一项所述的蟾酥提取物无胆固醇脂质体，其特征在于，所述蟾酥提取物无胆固醇脂质体中，蟾毒灵、华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的总含量最高达207 μg/mL。
5. 根据权利要求1-3任一项所述的蟾酥提取物无胆固醇脂质体，其特征在于，所述蟾酥提取物无胆固醇脂质体的平均粒径为70～200 nm；和/或
所述蟾酥提取物无胆固醇脂质体的多分散指数PDI<0.3；和/或
所述蟾酥提取物无胆固醇脂质体的Zeta电位为-9～-14 mV。
6. 根据权利要求4所述的蟾酥提取物无胆固醇脂质体，其特征在于，所述蟾酥提取物无胆固醇脂质体中，蟾毒内酯类成分含量最高达280 μg/mL，蟾蜍色胺类成分含量最高达73μg/mL，其中蟾毒灵、华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的总含量为162～207 μg/mL。
7.一种权利要求1-6任一项所述的蟾酥提取物无胆固醇脂质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将原料磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇衍生物和蟾酥提取物溶于有机溶剂中，得到混合溶液，混合溶液除去有机溶剂，形成一层薄膜，真空干燥；
其中，磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇衍生物和蟾酥提取物的质量比为21～32:20～31:4～7；
（2）将薄膜用磷酸缓冲溶液水化，得到脂质水分散体；
（3）将脂质水分散体进行超声或均质化处理；
（4）除去未包封的蟾酥提取物，得到纯化的蟾酥提取物无胆固醇脂质体。
8. 根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，水化温度为55～65 ℃，水化时间为10～30 min；和/或
步骤（3）中，超声为探头超声，探头超声条件为50～100W，5～15 min；均质化处理为在高压均质仪中分散，条件为15000～25000 PSI循环3次。
9.一种权利要求1-6任一项所述的蟾酥提取物无胆固醇脂质体在制备治疗肝癌药物和/或镇痛药物中的应用。
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