CN104892721B - 一种新的19-脱甲基蟾毒内酯化合物及其在制备抗肿瘤药物制剂中的应用 - Google Patents

一种新的19-脱甲基蟾毒内酯化合物及其在制备抗肿瘤药物制剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及天然药物及化学药物领域，具体涉及一种新的19‑脱甲基蟾毒内酯化合物在制备抗肿瘤药物制剂中的应用。所述的新的19‑脱甲基蟾毒内酯化合物，具有式Ⅰ所示结构，命名为Bufogargarin A，为从蟾皮中提取分离得到。本发明的Bufogargarin A在体内外均具有显著抗肿瘤活性，且在治疗剂量下未观察到明显的毒副作用，预示它具有良好的药用前景，可以应用于制备抗肿瘤药物制剂。抗肿瘤药物制剂中含有Bufogargarin A，余量为药用辅料或其它可配伍的药物；所述药用辅料可以是各种药用溶剂、崩解剂、矫味剂、防腐剂、着色剂、粘合剂；所述的抗肿瘤药物制剂包括多种临床药物剂型。

Description

一种新的19-脱甲基蟾毒内酯化合物及其在制备抗肿瘤药物 制剂中的应用
技术领域
本发明涉及天然药物及化学药物领域，具体涉及一种新的19-脱甲基蟾毒内酯化合物及其在治疗肿瘤药物制剂中的应用。
背景技术
癌症是危害人类生命的第一大杀手，研究开发抗癌药物一直是全世界医药界研究的热点。
蟾皮为蟾蜍科动物中华大蟾蜍(Bufo bufo gargarizans Cantor)或黑框蟾蜍(Bufo melanostictus Schneider)的干燥皮，主要产于我国的浙江、江苏、山东、河北等地。该品性凉、味苦，具有清热解毒、利水消肿的功效，主治痈疽、肿毒、瘰疬等，临床常用于治疗恶性肿瘤和慢性气管炎等(中药大辞典,1977:2713-2714)。近年来的研究结果显示，蟾皮不仅具有镇痛、抗炎的功效，还具有抗肿瘤、提高免疫等多种生物活性(时珍国医国药,2009:1213-1214)。由于蟾皮及其制剂华蟾素注射液在临床治疗癌症方面的确切疗效(实用肿瘤杂志,2007,1:32-35)，从而引起了人们对蟾皮化学成分的广泛关注。研究表明，蟾皮富含一类乙型强心甾类化合物，又称蟾毒内酯类化合物。该类化合物的母核通常由24个碳原子组成，且在C-17位具有α-吡喃酮基。其中蟾毒灵(bufalin)、华蟾蜍他灵(cinobufotalin)等是蟾皮的主要成分，并具有抗肿瘤作用。然而，蟾皮的化学成分复杂，目前仅报道了约40余种蟾毒内酯类成分(Chemistry&biodiversity,2011:559-567)，其抗肿瘤活性成分有待深入发掘。
发明内容
本发明的首要目的在于提供一种新的具有抗肿瘤活性的19-脱甲基蟾毒内酯化合物。
本发明的另一目的在于提供上述19-脱甲基蟾毒内酯化合物在抗肿瘤药物制剂中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种新的19-脱甲基蟾毒内酯化合物，命名为Bufogargarin A(式I)，结构如下：
Bufogargarin A从蟾皮中提取分离得到：将蟾皮粗粉用水或有机溶剂提取，再通过硅胶柱层析、ODS柱层析、Sephadex LH-20及制备型HPLC纯化，得到Bufogargarin A。
Bufogargarin A在制备抗肿瘤药物制剂中的应用，所述药物制剂中含有治疗有效量的Bufogargarin A，余量为药用辅料或其它可配伍的药物；
所述药用辅料是指常规的药用赋形剂，如溶剂、崩解剂、矫味剂、防腐剂、着色剂和粘合剂等；
所述其它可配伍的药物，指的是以有效剂量的Bufogargarin A为药物原料，再配伍其它天然药物或化学药品；
所述的抗肿瘤药物制剂包括多种临床药物剂型，如片剂、注射液、脂质体纳米粒、控释剂等；
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明发掘了蟾皮中的一种新19-脱甲基蟾毒内酯化合物，命名为Bufogargarin A，该化合物是由23个碳原子组成骨架且10位连有氢原子的新型19-脱甲基蟾毒内酯类化合物。
(2)本发明发现Bufogargarin A在较低浓度(0.416～3.481μM)下即可抑制多种肿瘤细胞的增殖。
(3)本发明发现19-脱甲基蟾毒内酯Bufogargarin A的抗肿瘤活性明显优于对应的含19位甲基的蟾毒内酯化合物，例如Bufogargarin A对多种肿瘤细胞的增殖抑制活性强于华蟾蜍他灵(cinobufotalin)5～10倍。
(4)本发明的Bufogargarin A在体内的毒性低于华蟾蜍他灵，在治疗剂量下未观察到明显的毒副作用。
附图说明
图1是19-脱甲基蟾毒内酯化合物Bufogargarin A的1H NMR谱图。
图2是19-脱甲基蟾毒内酯化合物Bufogargarin A的13C NMR谱图。
图3是19-脱甲基蟾毒内酯化合物Bufogargarin A的HSQC谱图。
图4是19-脱甲基蟾毒内酯化合物Bufogargarin A的HMBC谱图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1化合物的提取分离和结构鉴定
(1)取干燥蟾皮11kg，用粉碎机粉碎成10～50目的蟾皮粗粉，用3倍质量的蒸馏水于100℃条件下加热回流提取4次，每次1h；合并提取液并减压浓缩至密度为1.15，加入乙醇混匀使含醇量为80％(v/v)，静置24h，吸取上清液，减压浓缩得水提取物；然后将水提取后的蟾皮粗粉残渣用3倍质量95％(v/v)的乙醇80℃条件下加热回流提取提取4次，每次1h；合并提取液并减压浓缩得到乙醇提取物；将水总提取物和乙醇总提取物合并，与6L水混悬后，用6L氯仿萃取，重复4次，合并萃取液，减压浓缩得氯仿部位(150g)以及水部位(400g)。
(2)对步骤(1)制备得到的氯仿部位进行硅胶柱层析，以环己烷-丙酮为洗脱剂，按照环己烷和丙酮体积比为100:0、98:2、95:5、90:10、85:15、80:20、70:30、1:1和0:100的洗脱梯度进行洗脱，经TLC分析并相似流份，得到8个主流份Fr.A～Fr.H；
(3)Bufogargarin A的分离纯化
①对步骤(2)中得到的组分Fr.E(11g)(由环己烷：丙酮＝85:15洗脱得到)进行反相ODS柱层析，以甲醇-水(MeOH-H2O)为洗脱剂，按照甲醇和水体积比为10:90、20:80、30:70、40:60、50:50、60:40、70:30和80:20的洗脱梯度进行洗脱，收集甲醇-水体积比为50:50的洗脱流份；
②将步骤(3)①得到的洗脱流份浓缩后上样于Sephadex LH-20色谱柱，以甲醇为流动相，流速为0.5mL/min进行洗脱，收集保留体积为100～300mL的洗脱液；
③将步骤(3)②得到的洗脱液浓缩后用甲醇溶解，然后用反相制备型HPLC分离纯化，以体积比为40:60的甲醇-水为洗脱剂，流速为3mL/min进行洗脱，收集保留时间30.8min的色谱峰，得到Bufogargarin A(29mg)；
(4)产物Bufogargarin A的结构表征
白色粉末；香草醛-浓硫酸反应(TLC)显紫色；UV(MeOH)λmax(logε)204(3.83),295(3.70)nm；IR(KBr)νmax3428,2938,2877,2368,1725,1636,1539,1454,1429,1375,1246,1133,1094,834,604cm-1；HR-ESI-MS m/z 445.2222[M+H]+(计算值C25H33O7,445.2221)。氢谱(1H NMR)和碳谱(13C NMR)数据见表1。1H NMR,13C NMR,HSQC和HMBC核磁共振图谱见图1-4。根据以上理化数据和NMR图谱，鉴定Bufogargarin A的结构如式Ⅰ所示。
表1.Bufogargarin A的1H(500MHz)和13C(125MHz)NMR数据
注：(CD3OD，δ单位为ppm，J单位为Hz)
实施例2 Bufogargarin A对肿瘤细胞增殖的抑制作用
将处于对数生长期的细胞(人肝癌细胞HepG2、人非小细胞肺癌细胞A549和人宫颈癌细胞Hela、人结肠癌细胞Lovo、人乳腺癌细胞MCF-7、人食道癌细胞Eca-109)(细胞株均购自美国模式培养物集存库American Type Culture Collection,ATCC)用胰酶消化、离心、重悬后进行细胞计数，以1×106/mL接种于96孔培养板中，每孔100μL，待细胞贴壁后，将待测药物稀释成一定的浓度梯度，每个浓度设置4个平行复孔，同时设置空白对照组和阳性对照组(Doxorubicin)，置于恒温培养箱(37℃，5％CO2中培养72h。吸掉培养基，每孔加入30μL的MTT溶液(5mg/mL)，继续培养4h，除去上清液，每孔添加100μL的DMSO，充分振荡至颗粒溶解，用酶标仪在570nm波长处检测每个孔的吸光度OD值。按下列公式计算细胞生长抑制率，重复实验至少3次以上。细胞生长抑制率计算公式：抑制率(％)＝(1-加药组OD值)/对照组OD值×100％。以样品浓度为横轴，以细胞生长抑制率为纵轴绘制曲线。根据细胞生长抑制曲线，计算出半数有效抑制浓度IC50值。
试验结果显示Bufogargarin A对人肝癌细胞HepG2、人非小细胞肺癌细胞A549、人宫颈癌细胞Hela、人结肠癌细胞Lovo、人乳腺癌细胞MCF-7和人食道癌细胞Eca-109的增殖均具有显著的抑制作用。Bufogargarin A的抗肿瘤活性明显优于对应的含19位甲基的蟾毒内酯化合物，例如Bufogargarin A对多种肿瘤细胞的增殖抑制活性强于华蟾蜍他灵(Cinobufotalin)5～10倍(表2)。
表2.Bufogargarin A对多种肿瘤细胞的生长抑制作用
实施例3 Bufogargarin A体内抗肿瘤作用
试验方法：取体重18-22g的昆明种小鼠(购自广东省动物中心)，随机分组，每组10只。分别在其右前肢腋下接种瘤细胞(S180腹水瘤细胞)2×107个，24小时后腹腔注射给药，每天给药一次，连续给药10天后处死动物，取瘤称重。
抑瘤率按如下公式计算：
抑瘤率(％)＝[1-(给药组平均瘤重)/对照组平均瘤重]×100％
统计分析采用t检验处理，P＜0.05认为有显著性差异。结果见表3。
表3.Bufogargarin A对小鼠S180实体瘤生长的抑制作用(n＝10)
与模型组相比，*P＜0.05有显著性差异
取体重18-22g的裸鼠(购自广东省动物中心)，随机分组，每组10只。分别在其右前肢腋下接种人肝癌细胞HepG21×107个，24小时后腹腔注射给药，Bufogargarin A每天给药一次，5-氟尿嘧啶(5-Fu，购于北京百灵威科技有限公司)隔天给药，连续注射21天后停药并处死动物，取瘤称重。
抑瘤率按如下公式计算：
抑瘤率(％)＝[1-(给药组平均瘤重)/对照组平均瘤重]×100％
统计分析采用t检验，P＜0.05即有显著性差异。结果见表4。
表4.Bufogargarin A对人肝癌细胞HepG2裸鼠移植瘤生长的抑制作用(n＝10)
与模型组相比，*P＜0.05有显著性差异
试验结果表明，Bufogargarin A对小鼠腹水瘤S180和人肝癌细胞HepG2裸鼠移植瘤生长有明显的抑制作用。不同浓度给药组和对照组小鼠体重无明显差异，未见小鼠外观、活动状态等方面异常，且血清CK、LDH酶水平未见明显变化，说明Bufogargarin A的毒副作用较小。
实施例4 Bufogargarin A急性毒性实验
试验方法：取体重18-22g的昆明种小鼠(购自广东省动物中心)，随机分组，每组10只，腹腔注射不同剂量的Bufogargarin A，根据小鼠存活情况，计算半数致死剂量LD50。半数致死量按如下公式计算：半数致死剂量(mg/kg)＝(小鼠一半死亡时的剂量/对应小鼠的体重)。
试验结果：Bufogargarin A的半数致死量为22mg/kg(表5)。Bufogargarin A在18mg/kg的给药剂量下，未观察到小鼠死亡。而华蟾蜍他灵在16mg/kg的给药剂量下，已观察到小鼠死亡，说明Bufogargarin A的毒性低于华蟾蜍他灵。
表5 Bufogargarin A对小鼠的急性毒性作用
实施例5片剂的制备
Bufogargarin A 5g，乳糖200g，淀粉浆适量，硬脂酸镁1g，混合，过筛，干燥后压片。每片含Bufogargarin A 0.005g。每日口服1-2片，每日两次。
实施例6注射液的制备
Bufogargarin A 1g，丙二醇50g，研磨，再加少量注射用水稀释，混匀，然后加入氯化钠适量，溶解后再加入注射用水至1000ml，调PH值5.5-6.5，滤过，灌封，灭菌，即得1000支注射用针剂。
实施例7脂质体纳米粒的制备
Bufogargarin A 1g，大豆卵磷脂500mg，溶于25ml乙醇中，另取硬脂酸200mg和大豆卵灵脂500mg溶于25ml环己烷中，混合搅拌均匀。于37℃恒温水浴中减压旋转蒸发除去有机溶剂，使药物及辅料在烧瓶壁形成均匀脂质薄膜，于真空干燥器中放置过夜，除尽有机溶剂；另取聚乙二醇单硬脂酸酯3750mg，搅拌溶解在175ml水中，加入上述薄膜中，超声10min，定容至250ml，得淡黄色透明溶液。将此溶液冷冻干燥可得冻干粉。用球磨机研磨24小时，制得粒径均匀的纳米粒，混匀并分装。每袋含Bufogargarin A 0.005g。口服，一次一袋，每日两次。
实施例8控释剂的制备
Bufogargarin A 1g，乳糖40g和淀粉浆适量直接装到旋转制粒机/包衣器制备颗粒，将稀释到15％固体的塑化乙基纤维素包衣剂悬浮液喷雾到Bufogargarin A颗粒的旋转床上。在喷雾期间，用泊洛沙姆188制成的分散体载体膜包衣颗粒，形成平均颗粒度大约为450μm的持续释放的颗粒。混匀装入胶囊，每个胶囊含Bufogargarin A 0.005g，每日口服1-2粒，每日两次。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种具有抗肿瘤活性的19-脱甲基蟾毒内酯化合物，其特征在于具有如下所示结构，命名为Bufogargarin A；
2.权利要求1所述的19-脱甲基蟾毒内酯化合物在制备抗肿瘤药物制剂中的应用。
3.根据权利要求2所述的19-脱甲基蟾毒内酯化合物在制备抗肿瘤药物制剂中的应用，其特征在于：所述药物制剂中含有药用辅料和治疗有效剂量的Bufogargarin A。
4.根据权利要求3所述的19-脱甲基蟾毒内酯化合物在制备抗肿瘤药物制剂中的应用，其特征在于：所述药用辅料是指各种药用溶剂、崩解剂、矫味剂、防腐剂、着色剂或粘合剂。
5.根据权利要求2所述的19-脱甲基蟾毒内酯化合物在制备抗肿瘤药物制剂中的应用，其特征在于：所述的抗肿瘤药物制剂是片剂、注射液、脂质体纳米粒、控释剂。
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