CN102382164A - 蟾蜍内酰胺类化合物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种蟾蜍内酰胺类化合物及其制备方法与应用。本发明通过将蟾蜍内酯类化合物及醋酸铵按摩尔比1∶3～8混合，有机溶剂溶解，在惰性气体的保护下于100～160℃反应0.5～3h；减压浓缩去除有机溶剂，用制备型高效液相色谱方法分离纯化，得到蟾蜍内酰胺类化合物。该制备方法简单易行，安全可靠，产率较高。本发明证实获得的蟾蜍内酰胺类化合物具有良好的抗肿瘤作用，对多种癌细胞如PC3、DU145、LNCaP、MCF-7、Hela有很强的抑制作用，特别是对激素依赖型癌细胞LNCaP及MCF-7的选择性抑制作用方面明显优于蟾蜍内酯类化合物、而且对正常细胞的毒性亦显著低于蟾蜍内酯类化合物。将该蟾蜍内酰胺类化合物应用于制备抗肿瘤药物，高效低毒，符合药物发展的要求。

Description

蟾蜍内酰胺类化合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于药物化学领域，特别涉及一种蟾蜍内酰胺类化合物及其制备方法与应用。

背景技术

恶性肿瘤一直是威胁人类健康的重大疾病。随着人们的饮食结变化，生存环境恶化等众多因素，癌症病发率呈上升趋势。其死亡率仅低于心血管疾病而居第二位。目前恶性肿瘤的主要治疗方法仍是手术、放疗和化疗。其中化疗占据着重要地位，但是目前使用的大多数化疗药物具有毒性大、安全性低、易产生耐药性等不足，所以高效低毒抗肿瘤药物的研发一直是药物研发的重点和难点。近年的研究发现一些天然产物具有很强的抗肿瘤效果，如紫杉醇，长春碱等。但是鉴于天然产物结构的有限性，现在对中药有效成分的结构改造已成为了新药研发的重要手段，目前很多天然产物的衍生物已成为临床上使用的抗肿瘤药物，例如多烯紫杉醇、依托泊苷等。

蟾蜍属动物的皮，干燥全体，以及耳后腺分泌物均可用药。其分泌物又称为蟾酥，属名贵药材，首见于《药性本草》，别名又蟾蜍眉脂(《药性论》)，蟾蜍眉酥(《日华子本草》)，癞蛤蟆酥(《全国中草药汇编》)等。《中国药典》收载的蟾蜍为来源于中华大蟾蜍(Bufo bufo gargarizans Cantor)或黑眶蟾蜍(Bufomelanostictus Schneider)的干燥分泌物，辛，温，有毒，具有解毒，止痛，开窍醒神的功效，用于痈疽疔疮，咽喉肿痛等症(国家药典编委会.中华人民共和国药典(一部).北京：化学工业出版社.2005：265.)。来源于蟾蜍及蟾皮等的制剂具有很好的抗肿瘤活性，临床上应用广泛，如蟾皮水提物制剂华蟾素注射液在临床上用于治疗肝癌，具有明显的疗效；在联合化疗治疗胃癌等方面亦具有很好的辅助作用，且毒副作用较小(张瑞刚，程朝辉，沈冰等.华蟾素联合化疗治疗晚期胃癌的临床观察.临床肿瘤学杂志.2004，9，269-270.)。此外，蟾酥制剂蟾蜍注射液对晚期非小细胞肺癌的治疗具有辅助作用；在其抗肿瘤作用的药理研究中表明，蟾酥对肝癌，胃癌，结肠癌，宫颈癌等多种肿瘤均具有一定的疗效(张加梅.蟾酥抗癌作用研究进展.齐鲁药事.2008，27：417-418.)。其作用机制主要表现为抑制肿瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞凋亡、诱导恶性肿瘤细胞分化等多方面(夏俊，江敏，姜彦峰.蟾酥及其有效成分体外抗肿瘤作用研究进展，现代肿瘤医学.2008，16：1441-1444.)。

现代研究表明，蟾蜍内酯类化合物为蟾蜍的主要活性成分，具有很强的强心、抗肿瘤等药理作用(Yoshiaki Kamano，Ayano Kotake，Hirofumi Hashima.Structures-cytotoxic activity relationship for the toad poison bufadienolides[J].Bioorg.Med.Chem，2002，45：5440-5447)。但蟾蜍内酯类成分的毒性较大，安全窗口小，常由于误服或过量服用而中毒，中毒症状表现为呼吸急促、痉挛、心律不齐以及麻痹死亡等(韩静田，陈小艺，徐瑞成.蟾毒灵的药理活性研究进展[J].中药药物与临床，2002，2(2)：120-122.)。因此，对于中药蟾酥中蟾蜍内酯类化学成分的结构修饰研究有重要的意义。

发明内容

本发明的首要目的在于降低蟾蜍内酯类化合物的毒性，提供一种蟾蜍内酰胺类化合物。

本发明的另一目的在于提供所述的蟾蜍内酰胺类化合物的制备方法。

本发明的再一目的在于提供所述的蟾蜍内酰胺类化合物的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种蟾蜍内酰胺类化合物，其结构式如式I所示：

其中，R₁为H、OH或OAc；R₂为H或OH；R₃为-CH₃或-CHO；R₄为H₂，OH或OAc；R₅为OH、H₂或＝O；R₆为OH、H₂或＝O；R₇为H、OH或与R₈形成环氧；R₈为H、OH或与R₇形成环氧；

所述的蟾蜍内酰胺类化合物的制备方法，包含以下步骤：将蟾蜍内酯类化合物和醋酸铵按摩尔比1∶3～8混合，用有机溶剂溶解，在惰性气体的保护下于100～160℃反应0.5～3h，反应完后冷却，减压浓缩去除有机溶剂，得到的产物用制备型高效液相分离纯化，得到蟾蜍内酰胺类化合物。

所述的蟾蜍内酯类化合物为本实验从蟾蜍中提取分离的华蟾蜍精、16β-羟基蟾蜍灵、嚏根草配基、沙蟾蜍精、脂蟾蜍配基、华蟾蜍它灵、异沙蟾蜍精或蟾蜍灵；

所述的蟾蜍内酯类化合物和所述的醋酸铵更优选按摩尔比1∶6.5配比；

所述的有机溶剂最优选为二甲基甲酰胺(DMF)；

所述的惰性气体优选为氮气；

所述的反应的条件优选为100℃反应1h；

所述的分离纯化方法的具体步骤优选如下：将前述得到的产物溶于甲醇中，选用制备液相柱分离，流速为8ml/min，检测波长296nm，用乙腈水溶液作为流动相，收集体积比14～90％的乙腈洗脱液，回收溶剂，得到蟾蜍内酰胺类化合物；

所述的制备液相柱优选为waters C18规格为5μm，20×250mm的制备液相柱；

所述的乙腈洗脱液的浓度更优选为14～42％；

在本发明制备方法中，所的产物的结构通过紫外光谱、红外光谱、质谱、核磁共振及单晶X-射线衍射技术进行结构鉴定，并用HPLC法进行纯度检测。

本发明的蟾蜍内酰胺类化合物及其药物上可接受的成盐化产物可与药用常见辅料或载体结合，制备得到具抗肿瘤活性的药物组合物，从而达到预防或治疗的效果。上述药物组合物可根据实际需要选择适合的剂型，如片剂、注射剂、栓剂、气雾剂、纳米制剂等。

用本发明蟾蜍内酰胺类化合物及其药物上可接受的成盐化产物制备成的药物组合物，可用于治疗多种肿瘤，包括：前列腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、宫颈癌，皮肤癌、鼻咽癌、口腔癌、或白血病。其中对乳腺癌和前列腺癌的预防或治疗效果最佳。

本发明中所述蟾蜍内酰胺类化合物的应用，在用于制备预防或治疗肿瘤药物时，蟾蜍内酰胺类化合物的含量在0.1～95wt％。

与现有技术相比较，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明利用生物电子等排体原理，将蟾蜍内酯类化合物中的内酯环中的氧原子替换成-NH-，在保持抗肿瘤活性的同时还能降低毒副作用。经体外实验证明，本发明所提供的蟾蜍内酰胺类化合物与其母体蟾蜍内酯类化合物相比，降低了对正常细胞的毒副作用。

(2)本发明所述的蟾蜍内酰胺类化合物的制备方法所用原料易得，所需设备方便，制备方法简单易行，产率高，纯化方法简便。

(3)本发明蟾蜍内酰胺类化合物结构新颖，对肿瘤细胞生长具有良好的抑制效果，毒副作用小，具备良好的开发价值，对抗肿瘤药物的研发具有重要意义。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

(1)具有抗肿瘤活性的华蟾蜍精内酰胺的制备：

在氮气保护下，将华蟾蜍精(由本课题组分离纯化并鉴定结构，纯化步骤及结构鉴定数据参见田海妍，蟾酥抗肿瘤活性成分研究，中国药科大学博士论文，2010)0.44g(1mmol)及醋酸铵0.5g(6.5mmol)，溶解于12ml二甲基甲酰胺(DMF)，并置于100ml的耐压试管中，放入一个搅拌子，氮气保护密封，于油浴锅中搅拌加热。在100℃反应3小时，用薄层检测反应终点；反应完毕后，将反应混合物冷却至室温，用减压浓缩除去溶剂DMF；将反应后样品溶于甲醇中，选用制备液相柱(waters，C18，5μm，20×250mm)分离，流速为8ml/min，用乙腈水溶液作为流动相，检测波长296nm，收集体积比40％浓度的乙腈洗脱液，回收溶剂，得到华蟾蜍精内酰胺0.25g。

(2)对步骤(1)得到的产物进行结构分析

波谱数据：¹H NMR(300MHz，CD₃OD)δ7.84(1H，s，H-22)，7.24(1H，s，H-21)，6.41(1H，d，J＝9.5，H-23)，5.44(1H，dd，J＝9.2，1.3，H-16)，4.04(1H，s，H-3)，3.71(1H，d，J＝0.9，H-15)，3.03(1H，d，J＝9.2，H-17)，2.05(1H，m，H-8)，1.95，1.33(2H，m，H-4)，1.82，1.54(2H，m，H-12)，1.80，1.20(2H，m，H-6)，1.76(1H，m，H-5)，1.76(3H，s，H-COCH3)，1.73(1H，m，H-9)，1.63(2H，m，H-2)，1.54，1.33(2H，m，H-11)，1.50(2H，m，H-1)，1.47，1.04(2H，m，H-7)，0.98(3H，s，H-19)，0.76(3H，s，H-18).¹³C NMR  (75MHz，CD₃OD)δ171.67，164.80，148.94，137.97，118.72，118.35，77.01，73.33，67.61，60.74，54.03，46.43，40.94，40.33，37.35，36.53，34.50，34.04，30.67，28.49，26.96，24.21，22.22，21.65，20.32，17.77.HR-ESI-MS m/z 442.2606[M+H]⁺。

根据以上波谱数据，鉴定化合物为华蟾蜍精内酰胺，化学结构如式II所示：

(3)对步骤(1)得到的华蟾蜍精内酰胺的抗肿瘤活性进行检测

①采用MTT法检测步骤(1)得到的华蟾蜍精内酰胺对前列腺癌细胞PC3(购自美国模式培养物保藏所ATCC)增殖的抑制作用。取单层培养的PC3细胞(RPMI 1640，含有10％v/v胎牛血清)，用质量体积比0.25％的胰蛋白酶溶液消化，并接种于96孔板上(每孔加入细胞悬浮液100μl，细胞数为3000个)。接种24小时后，加入不同浓度待测样品，并以相同体积比DMSO作为对照。培养72小时后，每孔加入20μl MTT溶液(5mg/ml)，4小时后离心弃上清液，加入DMSO(100μl/孔)，振荡15min左右，置酶标仪测定OD值，波长为570nm，并计算细胞存活率，同时作图并用SPSS 18.0软件求得半数抑制浓度(IC50)。

②采用MTT法检测步骤(1)得到的华蟾蜍精内酰胺对前列腺癌细胞DU145(购自美国模式培养物保藏所ATCC)增殖的抑制作用。取单层培养的DU145细胞(RPMI 1640，含有10％v/v胎牛血清)，用质量体积比0.25％的胰蛋白酶溶液消化，并接种于96孔板上(每孔加入细胞悬浮液100μl，细胞数为3000个)。接种24小时后，加入不同浓度待测样品，并以相同体积比DMSO作为对照。培养72小时后，每孔加入20μl MTT溶液(5mg/ml)，4小时后离心弃上清液，加入DMSO(100μl/孔)，振荡15min左右，置酶标仪测定OD值，波长为570nm，并计算细胞存活率，同时作图并用SPSS 18.0软件求得半数抑制浓度(IC50)。

③采用MTT法检测步骤(1)得到的华蟾蜍精内酰胺对激素依赖型前列腺癌细胞LNCaP(购自美国模式培养物保藏所ATCC)增殖的抑制作用。取单层培养的LNCaP细胞(RPMI 1640，含有10％v/v胎牛血清)，用质量体积比0.25％的胰蛋白酶溶液消化，并接种于96孔板上(每孔加入细胞悬浮液100μl，细胞数为5000个)。接种24小时后，加入不同浓度待测样品，并以相同体积比DMSO作为对照。培养72小时后，每孔加入20μl MTT溶液(5mg/ml)，4小时后离心弃上清液，加入DMSO(100μl/孔)，振荡15min左右，置酶标仪测定OD值，波长为570nm，并计算细胞存活率，同时作图并用SPSS 18.0软件求得半数抑制浓度(IC50)。

④采用MTT法检测步骤(1)得到的华蟾蜍精内酰胺对乳腺癌细胞MCF7(购自美国模式培养物保藏所ATCC)增殖的抑制作用。取单层培养的MCF7细胞(RPMI 1640，含有10％v/v胎牛血清)，用质量体积比0.25％的胰蛋白酶溶液消化，并接种于96孔板上(每孔加入细胞悬浮液100μl，细胞数为3000个)。接种24小时后，加入不同浓度待测样品，并以相同体积比DMSO作为对照。培养72小时后，每孔加入20μl MTT溶液(5mg/ml)，4小时后离心弃上清液，加入DMSO(100μl/孔)，振荡15min左右，置酶标仪测定OD值，波长为570nm，并计算细胞存活率，同时作图并用SPSS 18.0软件求得半数抑制浓度(IC50)。

⑤采用MTT法检测步骤(1)得到的华蟾蜍精内酰胺对宫颈癌细胞HeLa(购自美国模式培养物保藏所ATCC)增殖的抑制作用。取单层培养的HeLa细胞(RPMI 1640，含有10％胎牛血清)，用质量体积比0.25％的胰蛋白酶溶液消化，并接种于96孔板上(每孔加入细胞悬浮液100μl，细胞数为3000个)。接种24小时后，加入不同浓度待测样品，并以相同体积比DMSO作为对照。培养72小时后，每孔加入20μl MTT溶液(5mg/ml)，4小时后离心弃上清液，加入DMSO(100μl/孔)，振荡15min左右，置酶标仪测定OD值，波长为570nm，并计算细胞存活率，同时作图并用SPSS 18.0软件求得半数抑制浓度(IC50)。

⑥采用MTT法检测步骤(1)得到的华蟾蜍精内酰胺对正常猴肾细胞Vero(购自美国模式培养物保藏所ATCC)增殖的抑制作用。取单层培养的BV2细胞(RPMI 1640，含有10％v/v胎牛血清)，用质量体积比0.25％的胰蛋白酶溶液消化，并接种于96孔板上(每孔加入细胞悬浮液100μl，细胞数为3000个)。接种24小时后，加入不同浓度待测样品，并以相同体积比DMSO作为对照。培养72小时后，每孔加入20μl MTT溶液(5mg/ml)，4小时后离心弃上清液，加入DMSO(100μl/孔)，振荡15min左右，置酶标仪测定OD值，波长为570nm，并计算细胞存活率，同时作图并用SPSS 18.0软件求得半数抑制浓度(IC₅₀)。

采用上述方法比较了华蟾蜍精内酰胺及华蟾蜍精对肿瘤细胞PC3、DU145、LNCaP、MCF-7、Hela及正常细胞Vero的抑制活性。华蟾蜍精内酰胺对上述肿瘤细胞的IC₅₀分别为26.0±3.75μM，22.5±2.19μM，15.5±2.5μM，16.3±2.4μM，28.7±4.23μM，而其对正常绿猴肾细胞Vero的IC₅₀大于100μM；华蟾蜍精对上述肿瘤细胞的IC₅₀分别为5.0±0.4μM，5.5±0.6μM，4.5±0.5μM，4.6±0.4μM，4.8±0.6μM，而其对正常绿猴肾细胞Vero的IC₅₀为6.4±0.8μM；

小结：华蟾蜍精内酰胺对癌细胞的抑制活性低于华蟾蜍精，但华蟾蜍精内酰胺对激素依赖性的LNCaP及MCF-7细胞的抑制活性明显强于其他癌细胞，选择性好，而华蟾蜍精对各癌细胞的抑制活性相似，无选择性，并且华蟾蜍精内酰胺对正常细胞Vero的毒性显著低于华蟾蜍精，故华蟾蜍精内酰胺的安全性明显强于华蟾蜍精。

实施例2

(1)具有抗肿瘤活性的16β-羟基蟾蜍灵内酰胺的制备：

在氮气保护下，16β-羟基蟾蜍灵(由本课题组分离纯化并鉴定结构，纯化步骤及结构鉴定数据参见田海妍，蟾酥抗肿瘤活性成分研究，中国药科大学博士论文，2010)0.40g(1mmol)，醋酸铵0.5g(6.5mmol)，DMF(12ml)置于100ml的耐压试管中，放入一个搅拌子，氮气保护密封，于油浴锅中搅拌加热，在140℃反应1.5小时，TLC检测反应终点；反应完毕后，将反应混合物冷却至室温，用减压浓缩除去溶剂DMF。将反应后样品溶于甲醇中，选用制备液相柱(waters，C18，5μm，20×250mm)分离，流速为8ml/min，检测波长296nm，用乙腈水溶液作为流动相，收集体积比32％浓度的乙腈洗脱液，回收溶剂，得到分离得到终产品0.28g。

(2)对步骤(1)得到的产物进行结构分析

波谱数据：¹H NMR(300MHz，DMSO)δ7.64(1H，dd，J＝9.4，2.2Hz，H-22)，7.11(1H，d，J＝2.3Hz，H-21)，6.12(1H，d，J＝9.5Hz，H-23)，4.34(1H，m，H-16)，3.89(1H，brs，H-3)，2.68(1H，d，J＝7.5Hz，H-17)，2.37(1H，dd，J＝14.2，7.2Hz，H-15)，1.81，1.17(2H，m，H-4)，1.77，1.27(2H，m，H-7)，1.76，1.12(2H，m，H-6)，1.66(1H，m，H-9)，1.63(1H，m，H-15′)，1.54(1H，m，H-5)，1.50，1.30(2H，m，H-2)，1.38(1H，m，H-8)，1.36(2H，m，H-1)，1.26(m，2H，H-12)，1.05(m，2H，H-11)，0.85(s，2H)，0.61(s，3H)ppm；¹³C NMR(75MHz，DMSO)δ161.79，147.07，135.37，116.60，116.55，83.66，71.16，64.65，60.16，48.53，42.21，41.24，40.59，35.66，34.93，34.72，33.13，29.53，27.58，26.52，23.80，21.07，20.97，17.32；HR-ESI-MS m/z 402.2633[M+H]⁺

综合以上波谱数据，可确定该化合物为16β-羟基蟾蜍灵内酰胺其结构式如式III所示，并且该化合物结构得到单晶衍射分析的证实，结构式如式IV所示：

(3)对步骤(1)得到的16β-羟基蟾蜍灵内酰胺的抗肿瘤活性进行检测

采用与实施例1中同样的方法检测16β-羟基蟾蜍灵内酰胺和16β-羟基蟾蜍灵对肿瘤细胞的抑制活性。16β-羟基蟾蜍灵内酰胺对PC3、DU145、LNCaP、MCF-7、Hela的IC50分别为17.4±1.9μM，21.1±1.1μM，13.4±2.3μM，14.3±2.9μM，27.7±4.5μM，而其对猴肾细胞细胞Vero的IC50大于100μM；16β-羟基蟾蜍灵对上述肿瘤细胞的IC50分别为3.8±0.6μM，5.3±0.3μM，4.6±0.4μM，3.5±0.4μM，4.3±0.2μM，而其对正常绿猴肾细胞Vero的IC50为5.4±0.8μM；

小结：16β-羟基蟾蜍灵内酰胺对癌细胞的抑制活性低于16β-羟基蟾蜍灵，但16β-羟基蟾蜍灵内酰胺对激素依赖性的LNCaP及MCF-7细胞的抑制活性明显强于其他癌细胞，选择性好，而16β-羟基蟾蜍灵对各癌细胞的抑制活性相似，无选择性，并且16β-羟基蟾蜍灵内酰胺对正常细胞Vero的毒性显著低于16β-羟基蟾蜍灵，故16β-羟基蟾蜍灵内酰胺的安全性明显强于16β-羟基蟾蜍灵。

实施例3

(1)具有抗肿瘤活性嚏根草配基内酰胺的制备：

在氮气保护下，嚏根草配基(由本课题组分离纯化并鉴定结构，纯化步骤及结构鉴定数据参见田海妍，蟾酥抗肿瘤活性成分研究，中国药科大学博士论文，2010)0.42g(1mmol)，醋酸铵0.5g(6.5mmol)，DMF(12ml)置于100ml的耐压试管中，放入一个搅拌子，氮气保护密封，于油浴锅中搅拌加热。在120℃反应1小时，升温至160℃再反应0.5小时，TLC检测反应终点；反应完毕后，将反应混合物冷却至室温，用减压浓缩除去溶剂DMF。将反应后样品溶于甲醇中，选用制备液相柱(waters，C18，5μm，20×250mm)分离，流速为8ml/min，用乙腈水溶液作为流动相，检测波长296nm，收集体积比22％浓度的乙腈洗脱液，回收溶剂，得到分离得到终产品0.31g。

(2)对步骤(1)得到的产物进行结构分析

波谱数据：¹H NMR(300MHz，DMSO)δ10.04(1H，s，H-19)，7.64(1H，dd，J＝9.5，2.5Hz，H-22)，7.08(1H，d，J＝2.2Hz，H-21)，6.21(1H，d，J＝9.5Hz，H-23)，4.01(1H，brs，H-3)，2.47(1H，m，H-17)，2.08，1.20(2H，m，H-7)，2.06，1.67(2H，m，H-2)，2.06，1.33(2H，m，H-4)，2.01，1.55(2H，m，H-6)，1.94，1.54(2H，m，H-15)，1.93，1.53(2H，m，H-1)，1.76(1H，m，H-8)，1.59(1H，m，H-9)，1.56(2H，m，H-16)，1.42，0.94(2H，m，H-11)，1.35(2H，m，H-12)，0.48(3H，s，H-18)ppm：¹³C NMR(75MHz，DMSO)δ208.81，161.71，143.65，133.32，121.95，118.58，83.20，73.68，65.55，54.67，52.68，47.64，41.45，39.83，38.60，37.34，36.78，36.12，31.09，29.54，26.24，23.80，22.34，17.02，16.76ppm.HR-ESI-MS m/z 416.2430[M+H]⁺

综合以上波谱数据，可确定嚏根草配基内酰胺的结构如式V所示：

(3)对步骤(1)得到的嚏根草配基内酰胺的抗肿瘤活性进行检测

采用与实施例1中同样的方法检测嚏根草配基内酰胺及嚏根草配基对肿瘤细胞的抑制活性。嚏根草配基内酰胺对PC3、DU145、LNCaP、MCF-7、Hela的IC50分别为16.5±1.3μM，16.0±1.2μM，2.5±0.3μM，5.3±0.5μM，17.7±2.3μM，而其对猴肾细胞细胞Vero的IC₅₀大于100μM；嚏根草配基对上述肿瘤细胞的IC₅₀分别为2.3±0.8μM，3.1±0.6μM，4.5±0.7μM，1.7±0.4μM，2.6±0.3μM，而其对正常绿猴肾细胞Vero的IC₅₀为2.4±0.3μM。

小结：嚏根草配基内酰胺对癌细胞的抑制活性低于嚏根草配基，但嚏根草配基内酰胺对激素依赖性的LNCaP及MCF-7细胞的抑制活性明显强于其他癌细胞，选择性好，而嚏根草配基对各癌细胞的抑制活性相似，无选择性，并且嚏根草配基内酰胺对正常细胞Vero的毒性显著低于嚏根草配基，故嚏根草配基内酰胺的安全性明显强于嚏根草配基。

实施例4

(1)具有抗肿瘤活性的脂蟾蜍配基内酰胺的制备：

在氮气保护下，脂蟾蜍配基(由本课题组分离纯化并鉴定结构，纯化步骤及结构鉴定数据参见田海妍，蟾酥抗肿瘤活性成分研究，中国药科大学博士论文，2010)0.38g(1mmol)，醋酸铵0.5g(6.5mmol)，DMF(12ml)置于100ml的耐压试管中，放入一个搅拌子，氮气保护密封，于油浴锅中搅拌加热。在160℃反应0.5小时，TLC检测反应终点；反应完毕后，将反应混合物冷却至室温，用减压浓缩除去溶剂DMF。将反应后样品溶于甲醇中，选用制备液相柱(waters，C18，5μm，20×250mm)分离，流速为8ml/min，用乙腈水溶液作为流动相，检测波长296nm，收集体积比39％浓度的乙腈洗脱液，回收溶剂，得到纯品0.18g。

(2)对步骤(1)得到的产物进行结构分析

波谱数据：¹H NMR(300MHz，CD₃OD)δ7.74(1H，dd，J＝9.4，2.4Hz，H-22)，7.29(1H，d，J＝2.4Hz，H-21)，6.43(1H，d，J＝9.4Hz，H-23)，4.04(1H，s，H-3)，3.59(1H，s，H-15)，2.66(1H，d，J＝9.1Hz，H-17)，2.44(1H，dd，J＝14.2，10.3Hz，H-4)，1.96(2H，m，H-16)，1.95(1H，m，H-9)，1.86，1.16(2H，m，H-6)，1.73(1H，m，H-5)，1.73(1H，m，H-8)，1.55(2H，m，H-2)，1.53，1.30(2H，m，H-11)，1.52(2H，m，H-12)，1.50(2H，m，H-1)，1.45，1.04(2H，m，H-7)，1.30(1H，m，H-4′)，0.98(3H，s，H-19)，0.68(3H，s，H-18).¹³C NMR(75MHz，CD₃OD)δ164.81，147.26，135.61，126.27，119.08，75.95，67.61，61.16，51.04，46.40，40.53，40.33，37.37，36.51，35.04，34.08，33.23，30.69，28.51，27.07，24.28，22.33，21.76，17.34ppm.HR-ESI-MS m/z 384.2538[M+H]⁺。

综合以上波谱数据，可确定脂蟾蜍配基内酰胺的结构如式VI所示：

(3)对步骤(1)得到的脂蟾蜍配基内酰胺的抗肿瘤活性进行检测

采用与实施例1中同样的方法检测脂蟾蜍配基内酰胺及脂蟾蜍配基对肿瘤细胞的抑制活性。脂蟾蜍配基内酰胺对PC3、DU145、LNCaP、MCF-7、Hela的IC50分别为18.6±2.2μM，19.3±3.2μM，11.5±2.4μM，12.3±2.4μM，20.8±3.2μM，而其对猴肾细胞细胞Vero的IC50大于100μM。脂蟾蜍配基对上述肿瘤细胞的IC₅₀均大于100，Vero的IC50为93±0.8μM。

小结：脂蟾蜍配基内酰胺对癌细胞的抑制活性高于脂蟾蜍配基，且脂蟾蜍配基内酰胺对激素依赖性的LNCaP及MCF-7细胞的抑制活性明显强于其他癌细胞，选择性好，而脂蟾蜍配基对各癌细胞的抑制活性相似，无选择性，并且脂蟾蜍配基内酰胺对正常细胞Vero的毒性低于脂蟾蜍配基，故脂蟾蜍配基内酰胺的抗肿瘤活性及安全性明显强于脂蟾蜍配基。

实施例5

(1)具有抗肿瘤活性的华蟾蜍它灵内酰胺的制备：

在氮气保护下，华蟾蜍它灵(由本课题组分离纯化并鉴定结构，纯化步骤及结构鉴定数据参见田海妍，蟾酥抗肿瘤活性成分研究，中国药科大学博士论文，2010)0.46g(1mmol)，醋酸铵0.5g(6.5mmol)，DMF(12ml)置于100ml的耐压试管中，放入一个搅拌子，氮气保护密封，于油浴锅中搅拌加热。在120℃反应2小时，TLC检测反应终点；反应完毕后，将反应混合物冷却至室温，用减压浓缩除去溶剂DMF。将反应后样品溶于甲醇中，选用制备液相柱(waters，C18，5μm，20×250mm)分离，流速为8ml/min，用乙腈水溶液作为流动相，检测波长296nm，收集体积比34％浓度的乙腈洗脱液，回收溶剂，得到产物0.29g。

(2)对步骤(1)得到的产物进行结构分析

波谱数据：¹H NMR(300MHz，CD₃OD)δ7.86(1H，s，H-22)，7.24(1H，s，H-21)，6.41(1H，d，J＝9.5Hz，H-23)，5.43(1H，dd，J＝9.2，1.3Hz，H-16)，4.10(1H，brs，H-3)，3.72(1H，s，H-15)，3.02(1H，d，J＝9.30Hz，H-17)，2.23，1.46(2H，m，H-1)，2.07(1H，m，H-9)，1.82，1.40(2H，m，H-6)，1.81，1.56(2H，m，H-12)，1.75(3H，s，H--COCH3)，1.69，1.58(2H，m，H-2)，1.69，1.30(2H，m，H-4)，1.68(1H，m，H-8)，1.61，1.00(2H，m，H-7)，1.60，1.41(2H，m，H-11)，0.96(3H，s，H-19)，0.74(3H，s，H-18)ppm：¹³C NMR  (75MHz，CD₃OD)δ171.66，164.81，148.92，138.00，118.65，118.38，76.90，76.03，73.28，69.04，60.76，53.87，46.27，43.66，42.03，40.95，37.68，35.08，33.58，28.49，26.08，23.86，22.66，20.30，17.67，17.22ppm.

HR-ESI-MS m/z 458.2520[M+H]⁺

综合以上波谱数据，可确定华蟾蜍它灵内酰胺的结构如式VII所示：

(3)对步骤(1)得到的华蟾蜍它灵内酰胺的抗肿瘤活性进行检测

采用与实施例1中同样的方法检测华蟾蜍它灵内酰胺和华蟾蜍它灵对肿瘤细胞的抑制活性。华蟾蜍它灵内酰胺对PC3、DU145、LNCaP、MCF-7、Hela的IC50分别为50.0±5.3μM，46.1±4.2μM，18.5±2.6μM，19.3±2.8μM，40.8±3.6μM，而其对猴肾细胞细胞Vero的IC50大于100μM。华蟾蜍它灵对上述肿瘤细胞的IC₅₀分别为7.8±0.5μM，6.3±0.8μM，9.3±0.4μM，7.2±0.3μM，5.9±0.6μM，而其对正常绿猴肾细胞Vero的IC₅₀为4.4±0.8μM；

小结：华蟾蜍它灵内酰胺对癌细胞的抑制活性低于华蟾蜍它灵，但华蟾蜍它灵内酰胺对激素依赖性的LNCaP及MCF-7细胞的抑制活性明显强于其他癌细胞，选择性好，而华蟾蜍它灵对各癌细胞的抑制活性相似，无选择性，并且华蟾蜍它灵内酰胺对正常细胞Vero的毒性显著低于华蟾蜍它灵，故华蟾蜍它灵内酰胺的安全性明显强于华蟾蜍它灵。

实施例6

(1)具有抗肿瘤活性的异沙蟾蜍精内酰胺的制备：

在氮气保护下，异沙蟾蜍精(由本课题组分离纯化并鉴定结构，纯化步骤及结构鉴定数据参见田海妍，蟾酥抗肿瘤活性成分研究，中国药科大学博士论文，2010)0.41g(1mmol)，醋酸铵0.5g(6.5mmol)，DMF(12ml)置于100ml的耐压试管中，放入一个搅拌子，氮气保护密封，于油浴锅中搅拌加热。在110℃反应1小时，再升温至140℃反应1小时，TLC检测反应终点；反应完毕后，将反应混合物冷却至室温，用减压浓缩除去溶剂DMF。将反应后样品溶于甲醇中，选用制备液相柱(waters，C18，5μm，20×250mm)分离，流速为8ml/min，用乙腈水溶液作为流动相，检测波长296nm，收集体积比14％浓度的乙腈洗脱液，回收溶剂，得到产物0.26g。

(2)对步骤(1)得到的产物进行结构分析

波谱数据：¹H NMR(300MHz，CD₃OD)δ7.84(1H，dd，J＝9.5，2.6Hz，H-22)，7.28(1H，d，J＝2.4Hz，H-21)，6.46(1H，d，J＝9.5Hz，H-23)，4.05(1H，s，H-12)，4.02(1H，brs，H-3)，3.3(1H，m，H-17)，2.78(1H，d，J＝12.8Hz，H-9)，2.38，1.97(2H，m，H-15)，2.37，1.97(2H，m，H-16)，2.05，1.52(2H，m，H-1)，2.05(1H，m，H-8)，1.91，1.50(2H，m，H-7)，1.90，1.23(2H，m，H-6)，1.90，1.35(2H，m，H-4)，1.68(2H，m，H-5)，1.52(2H，m，H-2)，0.41(3H，s，H-18)，1.21(3H，s，H-19)ppm；¹³C NMR(75MHz，CD₃OD)δ211.44，164.99，146.66，135.16，125.80，119.31，84.70，81.00，67.24，60.58，50.15，45.51，44.61，38.20，36.04，34.09，33.54，30.51，30.26，28.81，27.29，24.28，23.62，11.44ppm；HR-ESI-MS m/z 438.2233[M+Na]⁺

综合以上波谱数据，可确定化合物为异沙蟾蜍精内酰胺，结构如式VIII所示：

(3)对步骤(1)得到的异沙蟾蜍精内酰胺的抗肿瘤活性进行检测

采用与实施例1中同样的方法检测异沙蟾蜍精内酰胺及异沙蟾蜍精对肿瘤细胞的抑制活性。异沙蟾蜍精内酰胺对PC3、DU145、LNCaP、MCF-7、Hela的IC50分别为46.5±4.6μM，41.3±4.2μM，19.5±2.9μM，18.3±2.6μM，47.8±4.8μM，而其对猴肾细胞细胞Vero的IC50大于100μM；异沙蟾蜍精对上述肿瘤细胞的IC₅₀均大于100μM。

小结：异沙蟾蜍精内酰胺对癌细胞的抑制活性显著高于于异沙蟾蜍精，且异沙蟾蜍精内酰胺对激素依赖性的LNCaP及MCF-7细胞的抑制活性明显强于其他癌细胞，选择性好，而异沙蟾蜍精对各癌细胞的抑制活性弱，无选择性；此外异沙蟾蜍精内酰胺对正常细胞Vero的毒性低，故安全性高。

实施例7

(1)具有抗肿瘤活性的蟾蜍灵内酰胺的制备：

在氮气保护下，蟾蜍灵(由本课题组分离纯化并鉴定结构，纯化步骤及结构鉴定数据参见田海妍，蟾酥抗肿瘤活性成分研究，中国药科大学博士论文，2010)0.39g(1mmol)，醋酸铵0.5g(6.5mmol)，DMF(12ml)置于100ml的耐压试管中，放入一个搅拌子，密封，于油浴锅中搅拌加热。程序升温，在120℃反应3小时，TLC检测反应终点；反应完毕后，将反应混合物冷却至室温，用减压浓缩除去溶剂DMF。将反应后样品溶于甲醇中，选用制备液相柱(waters，C18，5μm，20×250mm)分离，流速为8ml/min，用乙腈水溶液作为流动相，检测波长296nm，收集体积比42％浓度的乙腈洗脱液，回收溶剂，分离得到终产品0.29g。

(2)对步骤(1)得到的产物进行结构分析

波谱数据：¹H NMR(400MHz，DMSO)δ7.66(1H，dd，J＝9.5，2.5Hz，H-22)，7.08(1H，d，J＝2.2Hz，H-21)，6.21(1H，d，J＝9.5Hz，H-23)，3.88(1H，brs，H-3)，2.48(1H，m，H-17)，2.06，1.65(2H，m，H-16)，1.94，1.57(2H，m，，H-15)，1.81，1.17(2H，m，H-4)，1.77，1.13(2H，m，H-6)，1.74，1.12(2H，m，H-11)，1.68(1H，m，H-5)，1.58(1H，m，H-9)，1.47(1H，m，H-8)，1.47，1.34(2H，m，H-2)，1.38(2H，m，H-12)，1.36(2H，m，H-1)，1.30，1.06(2H，m，H-7)，0.86(3H，s，H-19)，0.52(3H，s，H-18)ppm；¹³C NMR(101MHz，DMSO)δ161.72，143.80，133.25，122.25，118.52，83.49，64.56，53.03，48.00，41.33，40.49，35.70，35.00，34.96，33.10，32.02，29.76，29.57，27.56，26.58，23.80，21.25，21.11，17.05ppm.

HR-ESI-MS m/z 386.2692[M+H]⁺

综合以上波谱数据，可确定蟾蜍灵内酰胺的结构如式IX所示：

(3)对步骤(1)得到的蟾蜍灵内酰胺的抗肿瘤活性进行检测

采用与实施例1中同样的方法检测蟾蜍灵内酰胺及蟾蜍灵对肿瘤细胞的抑制活性。蟾蜍灵内酰胺对PC3、DU145、LNCaP、MCF-7、Hela的IC50分别为36.7±4.1μM，21.3±2.5μM，9.0±1.2μM，10.3±1.5μM，28.7±3.7μM，而其对猴肾细胞细胞Vero的IC50大于100μM；蟾蜍灵对上述肿瘤细胞的IC₅₀分别为0.58±0.04μM，0.34±0.06μM，0.67±0.05μM，0.49±0.08μM，0.54±0.07μM，而其对正常绿猴肾细胞Vero的IC₅₀为0.38±0.04μM；

小结：蟾蜍灵内酰胺对癌细胞的抑制活性低于蟾蜍灵，但蟾蜍灵内酰胺对激素依赖性的LNCaP及MCF-7细胞的抑制活性明显强于其他癌细胞，选择性好，而蟾蜍灵对各癌细胞的抑制活性相似，无选择性，并且蟾蜍灵内酰胺对正常细胞Vero的毒性显著低于蟾蜍灵，故蟾蜍灵内酰胺的安全性明显强于蟾蜍灵。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种蟾蜍内酰胺类化合物，其特征在于其结构式如式I所示：

其中，R₁为H、OH或OAc；

R₂为H或OH；

R₃为-CH₃或-CHO；

R₄为H₂，OH或OAc；

R₅为OH、H₂或＝O；

R₆为OH、H₂或＝O；

R₇为H、OH或与R₈形成环氧；

R₈为H、OH或与R₇形成环氧。

2.权利要求1所述的蟾蜍内酰胺类化合物的制备方法，其特征在于包含以下步骤：将蟾蜍内酯类化合物和醋酸铵按摩尔比1∶3～8混合，用有机溶剂溶解，在惰性气体的保护下于100～160℃反应0.5～3h；反应结束后冷却，减压浓缩去除有机溶剂，得到的产物用制备型高效液相分离纯化，得到蟾蜍内酰胺类化合物。

3.根据权利要求2所述的蟾蜍内酰胺类化合物的制备方法，其特征在于：所述的蟾蜍内酯类化合物为华蟾蜍精、16β-羟基蟾蜍灵、嚏根草配基、沙蟾蜍精、脂蟾蜍配基、华蟾蜍它灵、异沙蟾蜍精或蟾蜍灵。

4.根据权利要求2所述的蟾蜍内酰胺类化合物的制备方法，其特征在于：所述的蟾蜍内酯类化合物和所述的醋酸铵按摩尔比1∶6.5配比。

5.根据权利要求2所述的蟾蜍内酰胺类化合物的制备方法，其特征在于：

所述的有机溶剂为二甲基甲酰胺；

所述的惰性气体为氮气；

所述的反应的条件为100～160℃反应0.5～3h。

6.根据权利要求2所述的蟾蜍内酰胺类化合物的制备方法，其特征在于：所述的分离纯化方法的具体步骤如下：将所述的产物溶于甲醇中，用制备液相柱分离，流速为8ml/min，检测波长296nm，用乙腈水溶液作为流动相，收集体积比14～90％的乙腈洗脱液，回收溶剂，得到蟾蜍内酰胺类化合物。

7.一种具抗肿瘤活性的药物组合物，含有权利要求1所述的蟾蜍内酰胺类化合物和/或其药物上可接受的成盐化产物。

8.根据权利要求7所述的具抗肿瘤活性的药物组合物，其特征在于：所述的具抗肿瘤活性的药物组合物的剂型为片剂、注射剂、栓剂、气雾剂或纳米制剂。

9.根据权利要求7所述的具抗肿瘤活性的药物组合物，其特征在于：所述的肿瘤为前列腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、宫颈癌，皮肤癌、鼻咽癌、口腔癌或白血病。

10.根据权利要求7所述的具抗肿瘤活性的药物组合物，其特征在于：所述的蟾蜍内酰胺类化合物的含量为质量百分比0.1～95％。