CN113876783B - 蟾毒配基类成分的降解物的制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了蟾毒配基类成分的降解物在制备治疗乳腺癌药物中的应用。通过华蟾酥毒基、华蟾毒它灵和蟾毒它灵，及其降解产物去乙酰基华蟾毒精、去乙酰基华蟾毒它灵和去乙酰基蟾毒它灵体外对人乳腺癌MCF‑7细胞抗肿瘤和对人乳腺上皮MCF‑10A细胞毒性的实验比较，发现去乙酰基华蟾毒精、去乙酰基华蟾毒它灵和去乙酰基蟾毒它灵不仅具有显著的抗肿瘤活性，而且可有效降低对正常乳腺上皮细胞的毒性，与降解前体物质比较，抗肿瘤作用更安全，有望成为蟾酥抗癌作用的关键物质被开发成抗乳腺癌药物。

Description

蟾毒配基类成分的降解物的制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种治疗乳腺癌的蟾毒配基类成分的降解物的制备方法和应用。
背景技术
乳腺癌是目前世界上最常见的恶性肿瘤之一，其发病率位于肿瘤发病率的第六位，位居女性肿瘤发病率首位，近年来乳腺癌发病率逐年上升，且趋于年轻化，据2018年国家癌症研究机构(IARC)调查的最新数据显示，乳腺癌在全球女性癌症中的发病率为24.2％，位居女性癌症的首位，其中52.9％发生在发展中国家。在我国，每年有30万余女性被诊断出乳腺癌，在东部沿海城市及发达地区，乳腺癌的发病率上升尤其明显。现代医学研究表明，乳腺癌发病机制复杂，涉及遗传因素、基因突变、机体免疫功能下降、神经功能异常等多种病因，机制不清且十分复杂。目前，临床上治疗乳腺癌多以手术为主，辅助以放化疗、内分泌治疗和生物免疫治疗以及中医药个体化综合治疗。常用临床治疗药物有化疗药蒽环类、紫杉类和环磷酰胺类，内分泌治疗药物他莫昔芬，HER-2靶向药物曲妥珠单抗、拉帕替尼等，这些药物除具有显著的抗肿瘤作用外，同时具有许多不良反应，蒽环类药物累积剂量超过300mg/m2时，可引起心脏毒性，使患者心力衰竭的风险随之增加；内分泌治疗药物可导致患者出现类似更年期综合征、骨质疏松、药物性肝损伤等不良反应；曲妥珠单抗不良反应发生率≥5％，主要表现在骨髓抑制、肝肾毒性和神经毒性等方面。因此，进一步研究开发高效、低毒，具有靶向性的抗乳腺癌药物，具有重要的科学意义和研究价值。
蟾酥为蟾蜍科动物中华大蟾蜍Bufo bufogargarizans Cantor或黑眶蟾蜍Bufomelanostictus Schneider的干燥分泌物。其性温，味辛，有毒，归心经，具有解毒、止痛、开窍醒神之功效，用于治疗痈疽疔疮、咽喉肿痛、中暑神昏、痧胀腹痛吐泻。蟾酥单味药制成的蟾酥注射液、华蟾素注射液、华蟾素胶囊和华蟾素片，具有良好的抗肿瘤作用，临床主要用于治疗中、晚期肿瘤，尤其对原发性肝癌、肺癌、食管癌和胃癌具有较好的疗效，并能增强机体免疫力，减少放化疗的毒副反应，加强放化疗效果，防止肿瘤治疗后复发与转移，在减轻癌症患者症状和痛苦、提高生存质量、延长寿命等。现代药学研究表明，蟾毒配基类成分是蟾酥抗肿瘤的主要药效物质，2020年版《中国药典》(一部)中以华蟾酥毒基为参照，采用一测多评法测定药材中蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的总量，来评价蟾酥药材质量合格与否。
蟾酥及其制剂不仅对原发性肝癌、肺癌、食管癌和胃癌有治疗作用，而且对乳腺癌有显著的抑制作用，蟾酥注射剂(1.0μg·mL-1)可显著抑制人乳腺癌细胞MCF-7和人前列腺癌细胞DU145中细胞周期蛋白-D1(Cyc D1)、mTOR下游底物S6蛋白激酶1(S6K1)和4E-BP1蛋白的表达、降低Rb蛋白磷酸化，抑制mTOR-cyclin D1/Rb通路从而引起细胞G1期阻滞，有效抑制人乳腺癌细胞和人前列腺癌细胞的增殖。但蟾酥相关制剂，尤其是蟾酥注射液和华蟾素注射液，在临床使用中发现，其主要成分华蟾酥毒基、华蟾毒它灵和蟾毒它灵等成分稳定性差，制剂在储藏期间易降解，从而影响制剂中华蟾酥毒基、华蟾毒它灵和蟾毒它灵等成分的含量，对该药物的临床使用有一定影响。
发明内容
本发明的目的是提供蟾毒配基类成分的降解物的制备方法及其在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：
蟾毒配基类成分的降解物在制备治疗乳腺癌药物中的应用。
优选的，蟾毒配基类成分的降解物的制备方法，包括：用溶剂将蟾毒配基类成分溶解，调整pH至2.0-9.0，25℃-45℃反应5-15d，得到反应物，后将反应物减压浓缩，纯化分离得到蟾毒配基类成分的降解物。
优选的，所述蟾毒配基类成分的降解物包括去乙酰基的蟾毒配基类成分。
优选的，所述蟾毒配基类成分的降解物包括去乙酰基华蟾毒精、去乙酰基华蟾毒它灵和去乙酰基蟾毒它灵一种或几种。
去乙酰基华蟾毒精为华蟾酥毒基的降解物，去乙酰基华蟾毒它灵为华蟾毒它灵的降解物，去乙酰基蟾毒它灵为蟾毒它灵的降解物。
一种蟾毒配基类成分的降解物的制备方法，包括：
用溶剂将蟾毒配基类成分溶解，调整pH至2.0-9.0，25℃-45℃反应5-15d，得到反应物，后将反应物减压浓缩，纯化分离得到蟾毒配基类成分的降解物。
优选的，所述纯化分离步骤包括将减压浓缩后的反应物经ODS反相柱、正相硅胶柱或葡聚糖凝胶柱中一种或几种进行分离纯化。
优选的，所述纯化分离步骤包括将减压浓缩后的反应物加甲醇溶解，上反相硅胶柱色谱，依次用2-3倍柱体积的50％甲醇溶液、60％甲醇溶液和70％甲醇溶液洗脱，洗脱速度1mL/min，结合TLC收集洗脱液，减压浓缩，制得蟾毒配基类成分的降解物。
优选的，所述反相硅胶柱色谱为ODS反相硅胶柱色谱(ф2.0×50.0cm)。
优选的，所述葡聚糖凝胶柱为Sephadex LH-20。
优选的，所述纯化分离步骤包括将减压浓缩后的反应物上正相硅胶柱，用4-5倍柱体积的环己烷-三氯甲烷-丙酮混合溶液洗脱，洗脱速度2mL/min，结合TLC收集洗脱液，60℃减压浓缩，制得蟾毒配基类成分的降解物。
优选的，所述正相硅胶柱为300～400目，ф2.0×50.0cm的正相硅胶柱。
优选的，所述环己烷-三氯甲烷-丙酮混合溶液中，环己烷-三氯甲烷-丙酮的重量比为4:3:2。
优选的，所述溶剂为质量浓度为20％-100％的甲醇溶液或20％-100％的乙醇溶液。
优选的，所述溶剂为30％-100％的甲醇溶液、30％-100％的乙醇溶液。
蟾毒配基类成分极性较小，用水，或低于30％的甲醇或乙醇溶剂，样品溶解不完全，导致反应不完全。
优选的，所述pH为7-8。
pH条件对蟾毒配基类的酯键的降解影响较大，当pH为7.0-8.0时，华蟾酥毒基、华蟾毒它灵和蟾毒它灵降解程度较完全。当pH超过10以后，内酯键被打开，就得不到去乙酰基的蟾毒配基类成分。
本发明还要求保护一种治疗乳腺癌的药物组合物，所述药物组合物的活性成分包括蟾毒配基类成分的降解物。
优选的，所述蟾毒配基类成分的降解物包括去乙酰基的蟾毒配基类成分。
优选的，所述蟾毒配基类成分的降解物包括去乙酰基华蟾毒精、去乙酰基华蟾毒它灵和去乙酰基蟾毒它灵本身或者他们药学上可接受的成盐化合物中的一种或几种。
优选的，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。
优选的，所述药物组合物制备成注射剂、粉针剂、片剂、胶囊剂、口服液或膏剂。
下面对本发明做进一步的解释：
蟾酥中主含华蟾酥毒基、脂蟾毒配基、蟾毒灵、华蟾毒它灵和蟾毒它灵等蟾毒配基类成分，其中，华蟾酥毒基、华蟾毒它灵和蟾毒它灵因结构中16-位含有乙酰氧基，在酸碱性、光照、加热、pH 2～9或水、甲醇和乙醇等条件下易降解，具体反应见图1。降解物的生成对中成药的质量稳定性、安全性和有效性，存在巨大的风险。因此，鉴于蟾酥及其制剂临床应用中存在的主要问题以及用药前景，申请人以蟾酥中主成分蟾毒灵类(I型)-蟾毒它灵，脂蟾毒配基类(II型)-华蟾酥毒基和华蟾毒它灵为代表化合物，研究其降解产物在治疗乳腺癌药物中的应用，为临床安全合理用药、扩大蟾酥临床用药范围提供科学依据，具有极大的经济和社会意义。
通过去乙酰基华蟾毒精、去乙酰基华蟾毒它灵和去乙酰基蟾毒它灵在体外对人乳腺癌MCF-7细胞抗肿瘤和对人乳腺上皮MCF-10A细胞的毒性实验，发现华蟾酥毒基、华蟾毒它灵和蟾毒它灵的降解产物去乙酰基华蟾毒精、去乙酰基华蟾毒它灵和去乙酰基蟾毒它灵，不仅具有显著的抗肿瘤活性，而且可有效降低对正常乳腺上皮细胞的毒性，与降解前体物质华蟾酥毒基、华蟾毒它灵和蟾毒它灵比较，抗肿瘤作用更安全。本发明所提供的去乙酰基华蟾毒精、去乙酰基华蟾毒它灵和去乙酰基蟾毒它灵成分抗乳腺癌活性强，毒性相对较低，有望成为蟾酥抗癌作用的关键物质被开发成抗乳腺癌药物。
本发明的有益效果为：
去乙酰基华蟾毒精、去乙酰基华蟾毒它灵和去乙酰基蟾毒它灵不仅具有显著的抗肿瘤活性，而且可有效降低对正常乳腺上皮细胞的毒性，抗肿瘤作用更安全。
附图说明
图1为蟾毒配基类化合物降解途径示意图；
图2为实施例1的蟾酥总提取物的HPLC色谱图；其中，1.日蟾毒它灵；2.沙蟾毒精和去乙酰基华蟾毒它灵；3.去乙酰基蟾毒它灵；4.远华蟾毒精；5.去乙酰基华蟾毒精；6.蟾毒它灵；7.华蟾毒它灵；8.蟾毒灵；9.华蟾酥毒基；10.脂蟾毒配基；
图3为不同pH条件下去乙酰基华蟾毒精的转化情况比较；A、pH 4.0；B、pH 5.0；C、pH6.0；D、pH 7.0；E、pH 8.0；1、去乙酰基华蟾毒精；2、华蟾酥毒基；
图4为华蟾酥毒基OB21-8的13C NMR谱(150MHz，CDCl3)；
图5为华蟾酥毒基1H NMR谱(600MHz，CDCl3)；
图6为去乙酰基华蟾毒精的13C NMR谱(150MHz，CDCl3)；
图7为去乙酰基华蟾毒精的13H NMR谱(600MHz，CDCl3)；
图8为华蟾毒它灵的13C NMR谱(150MHz，CDCl3)；
图9为华蟾毒它灵的1H NMR谱(600MHz，CDCl3)；
图10为去乙酰基华蟾毒它灵的13C NMR谱(150MHz，CD3OD)；
图11为去乙酰基华蟾毒它灵的1H NMR谱(600MHz，CDCl3)；
图12为蟾毒它灵的13C NMR谱(150MHz，CD3OD)；
图13为蟾毒它灵的1H NMR谱(600MHz，CD3OD)；
图14为去乙酰基蟾毒它灵的13C NMR谱(150MHz，CD3OD)；
图15为去乙酰基蟾毒它灵的1H NMR谱(600MHz，CD3OD)；
图16为为顺铂对MCF-7细胞抑制作用和MCF-10A细胞的毒性作用；
图17为为蟾酥样品对MCF-7细胞抑制作用和MCF-10A细胞的毒性作用。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
蟾酥药材中蟾毒配基类成分及其降解产物的成分分析。
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.3％乙酸溶液为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱；柱温为30℃；流速为每分钟0.6mL；检测波长为296nm。理论板数按华蟾酥毒基峰计算应不低于10000。
表1蟾酥药材中蟾毒配基类化学成分的分析方法
供试品溶液的制备：取蟾酥药材粗粉100g加0.5％ HCl溶液(去除蟾毒色胺类等刺激性成分)，搅拌，浸提10h，过滤，滤液弃去，滤渣加适量水洗涤至中性，60℃减压干燥，干燥物粉碎后粗粉，加6倍溶剂量的乙醇回流提取3次，每次1h，过滤，合并3次提取液，60℃减压浓缩至干，得蟾酥蟾毒配基类总提取物16.2g。精密称取蟾酥总提取物7.2mg，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，过0.22μm有机膜，制得浓度为0.72mg/mL的供试品溶液。
混合对照品溶液的制备分别取日蟾毒它灵、沙蟾毒精、去乙酰基华蟾毒它灵、远华蟾毒精、去乙酰基华蟾毒精、蟾毒它灵、去乙酰基蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基对照品适量(每种30-90μg不等)，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，过0.22μm有机膜，制得混合对照品溶液。由于此处检测只需要定性检测，不需要定量，因此每种样品加入的量无影响，
测定法：分别精密吸取混合对照品溶液10μL、供试品溶液20μL，注入液相色谱仪，测定。
通过对照品定位，分析蟾酥总提取物的HPLC色谱图，如图2所示，蟾酥总提取物中主含蟾毒配基类化合物，主要成分含量从高到低依次为华蟾酥毒基、脂蟾毒配基、蟾毒灵、华蟾毒它灵、蟾毒它灵、日蟾毒它灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精；去乙酰华蟾毒精和去乙酰基蟾毒它灵分别为华蟾酥毒基和蟾毒它灵的降解产物，含量相对较低，图2中去乙酰华蟾毒它灵与沙蟾毒精在相同为位置处，虽不能直接观察到其降解情况，但通过制剂中成分的含量分析，发现华蟾毒它灵，以及华蟾酥毒基和蟾毒它灵含量随着储存时间的延长逐步降低。
实施例2
蟾酥注射液中蟾毒配基类成分的稳定性考察
检测样品：蟾酥注射液(生产厂家：江苏安格药业有限公司，批号：190701、190702、190703)
实验方法：取三批蟾酥注射液，分别于0、3、6、9、12、18和24个月，采用HPLC法(见实施例3中含量测定方法)检测蟾酥注射液中指标成分蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量的稳定性。检测方法具体如下：
色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.3％乙酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为30℃；流速为每分钟0.6mL；检测波长为296nm。理论板数按华蟾酥毒基峰计算应不低于10000。
表2蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的HPLC分析方法
测定法：分别精密吸取上述样品溶液20μL，注入液相色谱仪，测定。
实验结果显示(见表3-5)，蟾酥注射液三批样品储存2年，蟾毒灵和脂蟾毒配基含量相对稳定，有少量降解；但华蟾酥毒基极不稳定，190701批降解了63.3％、190702批降解了54.5％、190703批降解了66.1％。
表3 190701批蟾酥注射液主成分的稳定性考察
表4 190702批蟾酥注射液主成分的稳定性考察
表5 190703批蟾酥注射液主成分的稳定性考察
实施例3
华蟾酥毒基酯键水解生成去乙酰基华蟾毒精的制备方法
1降解物生成条件考察
以华蟾酥毒基为例：华蟾酥毒基酯键受酸碱影响较大，当碱性过强时，内酯环易开环，当酸度过低时，华蟾酥毒基结构中环氧乙烷基易开环降解，因此，本实验考察了pH 4～8条件下，去乙酰基华蟾毒精的制备工艺。
实验方法：精密称取华蟾酥毒基2.0mg，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解，并定容至刻度，摇匀，精密移取2mL，置10mL容量瓶中，加2L甲醇，再补加蒸馏水至刻度，摇匀，即得5个样品溶液，分别滴加0.01％HCl溶液或0.1％NaOH溶液适量，调pH至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，分别置25℃放置10d，HPLC法测定含量。
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.3％乙酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为30℃；流速为每分钟0.6mL；检测波长为296nm。理论板数按华蟾酥毒基峰计算应不低于10000。
表6华蟾酥毒基及其降解产物的HPLC分析方法
测定法：分别精密吸取上述样品溶液5μL，注入液相色谱仪，测定。
实验结果：见表7和图3，在不同pH条件下，华蟾酥毒基的酯键随着pH的升高，降解程度逐步增强，当pH为4.0～6.0时，在短时间内，华蟾酥毒基的降解率＜10％，当pH为8.0时，华蟾酥毒基的降解率达92.0％，因此，pH条件对华蟾酥毒基的降解影响很大，当pH为7.0时，华蟾酥毒基降解44.5％，当pH为8.0时，华蟾酥毒基降解较完全。当pH超过10.0时，去乙酰基华蟾毒精完全检测不到。
表7不同pH条件下华蟾酥毒基降解情况分析
2去乙酰基华蟾毒精的纯化工艺
精密称取华蟾酥毒基20mg，置25mL容量瓶中，加甲醇10mL溶解，再加水定容至刻度，摇匀，滴加0.1％NaOH溶液适量，调pH至8.0，25℃放置10d，60℃减压浓缩至干，加少量甲醇溶解，上柱。
方法一：甲醇溶解样品上ODS反相硅胶柱(ф2.0×50.0cm)，依次用2倍柱体积的的50％甲醇水溶液、2倍柱体积的的60％甲醇水溶液和2倍柱体积的的70％甲醇溶液洗脱，洗脱速度1mL/min，结合TLC收集洗脱液，60℃减压浓缩至干，制得纯的降解物。经NMR谱解析，鉴定该降解产物为去乙酰基华蟾毒精，分离得到18.6mg，得率为93.0％。
方法二：甲醇溶解样品上硅胶柱(300～400目，ф2.0×50.0cm)，用4倍柱体积的的环己烷-三氯甲烷-丙酮(4：3：2)洗脱，洗脱速度2mL/min，结合TLC收集洗脱液，60℃减压浓缩至干，制得纯的降解物18.6mg，得率为93.0％。经NMR谱解析，鉴定该降解产物为去乙酰基华蟾毒精。华蟾毒它灵和和蟾毒它灵降解产物的制备方法同华蟾酥毒基降解产物的制备方法，制得降解产物去乙酰基华蟾毒它灵(得率为86.5％)和去乙酰基蟾毒它灵(得率为89.5％)，13C-NMR数据见表8，NMR谱见图4～15。
表8蟾毒配基类化合物及其降解产物的13C-NMR数据(ppm)
a:Measured in CDCl3,b:Measured in CD3OD.,Measured at 600MHz for 1H NMR,Measured at 150MHz for13C NMR.
实施例4：
蟾酥化合物及其降解产物抗乳腺癌活性实验
1.试剂与仪器
样品与试剂：6个化合物信息及编号见表9；顺铂(规格：25mg/瓶，美国Sigma公司，批号：MKCL0026)；DMEM高糖培养基(规格：500mL/瓶，武汉普诺赛生命科技有限公司，批号：WH01122012SP01)；胎牛血清(规格：50mL/瓶，武汉普诺赛生命科技有限公司，批号：SA190501)；MTT(规格：250mg/瓶，北京索莱宝科技有限公司，批号：715F0510)；PBS(规格：500mL/瓶，武汉普诺赛生命科技有限公司)；DMSO(规格：500mL/瓶，美国Sigma公司，批号：C10921091)；75％医用酒精(规格：500mL/瓶，山东安捷高科技消毒科技有限公司，批号：2020110225)。
表9蟾酥样品样品信息
阳性对照品(顺铂溶液)的配制：精密称取5mg顺铂粉末，置于10mL离心管中，加入10μL DMSO，用DMEM培养基定容至10mL，超声至完全溶解后过0.22μm微孔滤膜除菌，即得1666.39μM顺铂溶液母液，临用时取适量母液用DMEM培养基稀释至相应浓度。
样品溶液的配制：取各蟾酥样品约3mg，精密称定，置于2mL EP管中，加入1mL甲醇充分溶解后，精确量取相应体积于2mL EP管分装成200mmol/管，临用时加入2μLDMSO和适量DMEM培养基溶解，超声至完全溶解后定容至2mL，并过0.22μm微孔滤膜除菌，即得样品溶液母液(浓度见表9)。
培养基的配制：MCF-7细胞培养基MEM+0.01mg/mL Insulin+10％ FBS+1％ P/S，4℃低温保存。MCF-10A细胞培养基DMEM/F12+5％ HS+20ng/mL EGF+0.5μg/mLHydrocortisone+10μg/mL Insulin+1％ NEAA+1％ P/S，4℃低温保存。
MTT试剂的配制：精密称取MTT 50mg，放入10mL的离心管中，用PBS缓冲液配置成10mL，超声完全溶解后过0.22μm微孔滤膜除菌，得浓度为5mg/mL的MTT溶液，-20℃保存。
细胞株：人乳腺癌MCF-7细胞(武汉普诺赛生命科技有限公司)；人乳腺上皮MCF-10A细胞(武汉普诺赛生命科技有限公司)。
仪器设备：SW-CJ-1FD型超净工作台(苏州艾克林净化设备有限公司)；3111型二氧化碳培养箱(赛默飞世尔科技有限公司)；TS2型倒置显微镜(上海衡浩仪器有限公司)；AG135型分析天平(赛多利斯科学仪器(北京)公司)；XKA-2200型低度冷冻离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；HH-600型数显恒温水浴锅(上海齐欣科学仪器有限公司)；800TS型酶标仪(Bio Tek公司)；YCD-FL289型冰箱(合肥美菱股份有限公司)。
2实验方法
2.1细胞培养
细胞复苏：细胞实验室内先进行常规消毒，紫外线消毒照射达30min以上，超净工作台保持通风10min；将冻存管从冻存盒中取出，置于37℃恒温水浴中，轻摇使其快速融化，取出冻存管，酒精消毒，缓缓吸出细胞悬液注入离心管，加5-10倍量的培养液，混匀，1000r/min离心3min，弃去上清液。再用适量的培养液稀释，轻轻混匀，接种于培养瓶。
细胞传代：倒置显微镜下观察细胞铺满瓶底至80％-90％，弃去培养瓶内旧的培养基，加0.25％胰蛋白酶1mL进行消化，1min后，倒置显微镜下观察到细胞变圆、细胞间麋变宽时弃去胰蛋白酶，加含10％胎牛血清的培养液配成单个细胞悬液，取细胞悬液接种在新的培养瓶中继续培养。
细胞冻存：取生长状态良好的细胞，用0.25％胰蛋白酶进行消化后，用含10％胎牛血清的培养液配成均匀的细胞悬液，注入离心管中，1000r/min离心5min，弃去上清液，加1mL新鲜配制并预冷好的冻存液重悬并混匀细胞，使细胞液浓度约为5×106个/mL。将细胞悬液转移至无菌冻存管中于4℃放置4h，-20℃放置12h，之后放入-80℃中保存。
2.2MTT法考察顺铂和蟾酥样品对MCF-7细胞的抑制作用和MCF-10A细胞的毒性作用
取生长状态良好、处于对数生长期的MCF-7和MCF-10A细胞，用DMEM完全培养基配制成单细胞悬液，细胞计数，调节浓度至1×105个/mL，每孔100μL均匀接种于96孔板中，于37℃，5％ CO2细胞培养箱中培养24h。设置空白组、对照组、阳性对照组和样品组，空白组不加细胞，其他组均加入含细胞的DMEM完全培养基，于37℃，5％ CO2细胞培养箱中培养24h后，弃去旧培养基，空白组和对照组加入100μL DMEM完全培养基，阳性对照组加入不同浓度的顺铂溶液(3.33、6.66、16.66、33.31、66.62、99.93和133.24μM)100μL，样品组分别加入浓度为0.001、0.01、0.1、1、10和100μM的蟾酥样品100μL；每组设3个复孔。96孔板培养24h后，每孔加入20μL MTT，继续培养4h，弃去培养基，加入150μL DMSO溶液，低速振荡10min后，于酶标仪490nm处测定各孔吸光值(OD值)，按公式计算抑制率。公式如下：
2.3数据处理
数据用GraphPad Prism 7.0软件进行统计分析，数据以形式表示。
3实验结果
3.2蟾酥样品对MCF-7细胞的抑制作用和MCF-10A细胞的毒性作用
顺铂对MCF-7细胞的抑制作用和MCF-10A细胞的毒性作用见表10，图16。
实验结果可知，顺铂对MCF-7细胞增殖有良好的抑制作用，IC50为42.13±0.33μM，且其抑制效果呈剂量依赖性增加，同时顺铂对MCF-10A细胞也具有一定的毒性，CC50为59.66±0.21μM。
蟾酥样品对MCF-7细胞的抑制作用和MCF-10A细胞的毒性作用见表10，图17。
表10蟾酥化合物对MCF-7细胞的抑制作用和MCF-10A细胞的毒性作用
实验结果显示，去乙酰基华蟾毒它灵是华蟾毒它灵的降解产物，降解产物虽然对MCF-7细胞的抑制作用有所降低(IC50由7.131±0.37μM升至11.25±0.31μM)，但对MCF-10A细胞的毒性大大下降(CC50由10.16±0.26μM升至>100μM)；去乙酰基华蟾毒精是华蟾酥毒基的降解产物，降解产物对MCF-7细胞的抑制作用有所降低(IC50由0.4813±0.18μM升至1.914±0.24μM)，但对MCF-10A细胞的毒性作用有所缓解(CC50由0.045±0.24μM升至1.756±0.16μM)；去乙酰基蟾毒它灵是蟾毒它灵的降解产物，降解产物对MCF-7细胞的抑制作用少量降低(IC50由0.0205±0.22μM升至0.1057±0.31μM)，但对MCF-10A细胞的毒性作用大大降低(CC50由0.0416±0.17μM升至>100μM)。华蟾毒它灵和蟾毒它灵的降解产物去乙酰基华蟾毒它灵和去乙酰基蟾毒它灵对MCF-10A细胞的毒性作用非常低；虽然华蟾酥毒基的降解产物去乙酰基华蟾毒精对MCF-10A细胞仍有较强的细胞毒作用，但去乙酰基华蟾毒精较华蟾酥毒基对MCF-10A细胞的毒性降低了39倍；提示华蟾毒它灵、华蟾酥毒精和蟾毒它灵的降解产物，在治疗乳腺癌的同时，可有效降低对正常人乳腺上皮细胞的毒副作用，可提高蟾酥药材的应用价值。

Claims (8)

1.蟾毒配基类成分的降解物在制备治疗乳腺癌药物中的应用；所述蟾毒配基类成分的降解物为去乙酰基蟾毒它灵。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，蟾毒配基类成分的降解物的制备方法包括：用溶剂将蟾毒配基类成分溶解，调整pH至7.0-8.0，25℃-45℃反应5-15d，得到反应产物，后将反应物减压浓缩，纯化分离得到蟾毒配基类成分的降解物。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述溶剂为甲醇。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述纯化分离步骤包括将减压浓缩后的反应产物经ODS反相柱、正相硅胶柱中一种或几种进行分离纯化。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述纯化分离步骤包括将减压浓缩后的反应产物加甲醇溶解，上反相硅胶柱色谱，依次用2-3倍柱体积的50%甲醇水溶液、60%甲醇水溶液和70%甲醇水溶液洗脱，洗脱速度1mL/min，结合TLC收集洗脱液，减压浓缩，制得蟾毒配基类成分的降解物。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述纯化分离步骤包括将减压浓缩后的反应物上正相硅胶柱，用4-5倍柱体积的环己烷-三氯甲烷-丙酮混合溶液洗脱，洗脱速度2mL/min，结合TLC收集洗脱液，60℃减压浓缩，制得蟾毒配基类成分的降解物。
7.一种治疗乳腺癌的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的活性成分为蟾毒配基类成分的降解物；所述蟾毒配基类成分的降解物为去乙酰基蟾毒它灵本身或者其药学上可接受的成盐化合物。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物制备成片剂、胶囊剂、口服液或膏剂。
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