CN111995560B - 一种单萜吲哚类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种单萜吲哚类化合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种单萜吲哚类化合物及其制备方法和应用。本发明提供的单萜吲哚类化合物(polonidine A)对肝癌细胞MHCC97H、乳腺癌细胞BT549、肺癌细胞H1299、结肠癌细胞SW620、神经胶质瘤T98G和肺癌细胞A549均表现出良好的抑制活性，其IC50值分别为7.08μg/mL、6.05μg/mL、20.39μg/mL、7.64μg/mL、17.97μg/mL和15.96μg/mL。本发明提供的polonidine A为开发抗肿瘤药物提供了新途径。本发明通过微生物发酵制备得到单萜吲哚类化合物，制备方法周期短、培养条件温和、副产物少、成本低，易于实现工业化。

Description

一种单萜吲哚类化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种单萜吲哚类化合物及其制备方法和应用。
背景技术
随着工业的发展，大气污染日益严重，人类生存环境质量不断下降，甚至影响到了人类健康。根据相关统计目前肿瘤性疾病的发病率呈逐年上升的趋势，已成为威胁人类健康的重大疾病之一。而化疗、外科手术对人体有明显毒副作用，且康复情况不容乐观，因此研发高效低毒的抗肿瘤药物对于人类健康具有十分重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种单萜吲哚类化合物，所述单萜吲哚类化合物具有显著的抗肿瘤活性，能够用于制备抗肿瘤药物。
本发明提供了一种单萜吲哚类化合物，具有式I所示结构：
Figure BDA0002651262610000011
本发明还提供了上述技术方案所述单萜吲哚类化合物的制备方法，包括以下步骤：
将波兰青霉进行发酵，得到波兰青霉发酵物；
将所述波兰青霉发酵物与醇类溶剂混合，进行超声提取，得到醇提物；
将所述醇提物进行纯化，得到所述单萜吲哚类化合物；
所述纯化包括以下步骤：
将所述醇提物溶解于氯仿-甲醇中，得到待纯化溶液；
将所述待纯化溶液进行第一硅胶柱层析，所述第一硅胶柱层析的洗脱程序为第一梯度洗脱，所述第一梯度洗脱用洗脱剂为氯仿-甲醇混合物，收集以氯仿和甲醇体积比为49～51:1的洗脱剂进行洗脱得到的洗脱液，记为Fr2馏分；
将所述Fr2馏分进行第二硅胶柱层析，所述第二硅胶柱层析的洗脱程序为第二梯度洗脱，所述第二梯度洗脱用洗脱剂为石油醚-丙酮混合物，收集以石油醚和丙醇体积比为9～11:1的洗脱进行第二梯度洗脱得到的洗脱液，记为FrA3馏分；
将所述FrA3馏分进行反相硅胶柱层析，所述反相硅胶柱层析的洗脱程序为线性梯度洗脱，所述线性梯度洗脱用洗脱剂为甲醇-水混合溶液，收集甲醇体积浓度为39～41％的甲醇水溶液的洗脱液，得到收集洗脱液，所述收集洗脱液中含有式I所示化合物。
优选的，所述发酵为固体发酵；
所述发酵的温度为20～30℃，时间为25～35天。
优选的，所述醇类溶剂包括甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇；
所述波兰青霉发酵物的质量与醇类溶剂的体积比为(60～80)g:(80～150)mL。
优选的，所述超声提取的功率为250～350W，时间为20～40min。
优选的，所述氯仿-甲醇混合物中氯仿和甲醇的体积比为5～100:1；所述石油醚-丙酮混合物中石油醚和丙酮的体积比为1～20:1；所述甲醇-水混合溶液中甲醇的体积浓度为0～100％。
优选的，所述第一梯度洗脱、第二梯度洗脱和线性梯度洗脱用洗脱剂的流速独立的为1～4mL/min。
优选的，所述第一硅胶柱层析和第二硅胶柱层析用色谱柱独立的为正相硅胶柱，所述硅胶柱用硅胶的粒径为300～400目；所述反相硅胶柱层析用色谱柱为RP-18反相硅胶柱。
本发明提供了上述技术方案所述单萜吲哚类化合物或上述技术方案所述制备方法制备得到的单萜吲哚类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明提供的单萜吲哚类化合物，具有式I所示结构：
Figure BDA0002651262610000021
本发明提供的单萜吲哚类化合物(波兰青霉定甲，polonidineA)对肝癌细胞MHCC97H、乳腺癌细胞BT549、肺癌细胞H1299、结肠癌细胞SW620、神经胶质瘤T98G和肺癌细胞A549均表现出了良好的抑制活性，其IC50值分别为7.08μg/mL、6.05μg/mL、20.39μg/mL、7.64μg/mL、17.97μg/mL和15.96μg/mL。
本发明还提供了上述技术方案所述单萜吲哚类化合物的制备方法，包括以下步骤：将波兰青霉进行发酵，得到波兰青霉发酵物；将所述波兰青霉发酵物与醇混合后进行超声提取，得到醇提物；将所述醇提物进行纯化，得到所述单萜吲哚类化合物；所述纯化包括以下步骤：将波兰青霉进行发酵，得到波兰青霉发酵物；将所述波兰青霉发酵物与醇类溶剂混合，进行超声提取，得到醇提物；将所述醇提物进行纯化，得到所述单萜吲哚类化合物；所述纯化包括以下步骤：将所述醇提物溶解于氯仿-甲醇中，得到待纯化溶液；将所述待纯化溶液进行第一硅胶柱层析，所述第一硅胶柱层析的洗脱程序为第一梯度洗脱，所述第一梯度洗脱用洗脱剂为氯仿-甲醇混合物，收集以氯仿和甲醇体积比为49～51:1的洗脱剂进行洗脱得到的洗脱液，记为Fr2馏分；将所述Fr2馏分进行第二硅胶柱层析，所述第二硅胶柱层析的洗脱程序为第二梯度洗脱，所述第二梯度洗脱用洗脱剂为石油醚-丙酮混合物，收集以石油醚和丙醇体积比为9～11:1的洗脱进行第二梯度洗脱得到的洗脱液，记为FrA3馏分；将所述FrA3馏分进行反相硅胶柱层析，所述反相硅胶柱层析的洗脱程序为线性梯度洗脱，所述线性梯度洗脱用洗脱剂为甲醇-水混合溶液，收集甲醇体积浓度为39～41％的甲醇水溶液的洗脱液，得到收集洗脱液，所述收集洗脱液中含有式I所示化合物。本发明通过微生物发酵制备得到单萜吲哚类化合物，制备方法周期短、培养条件温和、副产物少、成本低，不仅易于实现工业化，也符合现代环保和低碳经济的需求。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的单萜吲哚类化合物polonidineA的1H-NMR谱图；
图2为本发明实施例1制备的单萜吲哚类化合物polonidine A的13C-NMR和DEPT谱图；
图3为本发明实施例1制备的单萜吲哚类化合物polonidineA的1H-1H COSY谱图；
图4为本发明实施例1制备的单萜吲哚类化合物polonidineA的HMBC谱图；
图5为本发明实施例1制备的单萜吲哚类化合物polonidineA的HSQC谱图；
图6为本发明实施例1制备的单萜吲哚类化合物polonidineA的NOESY谱图；
图7为本发明实施例1制备的单萜吲哚类化合物polonidine A的HR-ESI-MS谱图；
图8为本发明实施例1制备的单萜吲哚类化合物polonidineA的红外光谱图。
生物保藏说明
波兰青霉Penicilliumpolonicum TY12，于2020年8月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，武汉大学保藏中心，保藏编号为CCTCCNo.M2020442；保藏单位代码(China Center forType Culture Collection)CCTCC。
具体实施方式
本发明提供了一种单萜吲哚类化合物，具有式I所示结构：
Figure BDA0002651262610000041
本发明还提供了上述技术方案所述单萜吲哚类化合物的制备方法，包括以下步骤：
将波兰青霉进行发酵，得到波兰青霉发酵物；
将所述波兰青霉发酵物与醇混合，进行超声提取，得到醇提物；
将所述醇提物进行纯化，得到所述单萜吲哚类化合物；
所述纯化包括以下步骤：
将所述醇提物溶解于氯仿-甲醇中，得到待纯化溶液；
将所述待纯化溶液进行第一硅胶柱层析，所述第一硅胶柱层析的洗脱程序为第一梯度洗脱，所述第一梯度洗脱用洗脱剂为氯仿-甲醇混合物，收集以氯仿和甲醇体积比为49～51:1的洗脱剂进行洗脱得到的洗脱液，记为Fr2馏分；
将所述Fr2馏分进行第二硅胶柱层析，所述第二硅胶柱层析的洗脱程序为第二梯度洗脱，所述第二梯度洗脱用洗脱剂为石油醚-丙酮混合物，收集以石油醚和丙醇体积比为9～11:1的洗脱进行第二梯度洗脱得到的洗脱液，记为FrA3馏分；
将所述FrA3馏分进行反相硅胶柱层析，所述反相硅胶柱层析的洗脱程序为线性梯度洗脱，所述线性梯度洗脱用洗脱剂为甲醇-水混合溶液，收集甲醇体积浓度为39～41％的甲醇水溶液的洗脱液，得到收集洗脱液，所述收集洗脱液中含有式I所示化合物。
本发明将波兰青霉进行发酵，得到波兰青霉发酵物。在本发明中，所述波兰青霉为黄草乌的内生真菌，优选从黄草乌的根部分离得到。本发明对所述分离的方法无特殊要求采用本领域常规的技术手段即可。
本发明在进行发酵前优选对所述波兰青霉进行活化；所述活化优选为将所述波兰青霉接种到PDA斜面培养基上，进行恒温培养，得到活化的波兰青霉。在本发明中，所述波兰青霉的质量和PDA斜面培养基的体积比优选为10～20mg:30mL，更优选为15～18mg:30mL。在本发明中，所述恒温培养的温度优选为25～30℃，更优选为28℃，时间优选5～7天，更优选为6天。本发明优选将得到的活化的波兰青霉置于5℃的环境中储存备用。
在本发明中，所述发酵优选为固体发酵；所述发酵采用的发酵培养基优选按照如下步骤进行制备：
将培养基的原料依次进行高温灭菌和冷却，得到发酵培养基。
在本发明中，所述培养基的原料优选为大米或马铃薯；当所述原料为马铃薯时优选将所述马铃薯进行去皮和破碎，所述破碎优选将所述马铃薯进行切块，所述切块得到的块体的体积优选为0.8～1.2cm3，更优选为1cm3。当所述原料为大米时，优选将所述大米进行浸泡处理，所述浸泡用溶剂优选为水，所述大米的质量和水的体积比优选为50～65g:50mL，更优选为60g:50mL；所述浸泡的时间优选为10～14h，更优选为12h。在本发明中，所述发酵培养基的制备过程优选在组织培养瓶中进行；所述培养基的原料的质量与组织培养瓶的体积之比优选为55～65g：350mL，更优选为60g：350mL。
在本发明中，所述高温灭菌的温度优选为120～150℃，更优选为121～130℃；时间优选为30～50min，更优选为31～40min。本发明在进行高温灭菌时优选将组织培养瓶进行加盖处理。本发明对冷却的方式无特殊限定，只要能够冷却至室温即可。
在本发明中，所述发酵优选为将活化的波兰青霉接种在发酵培养基中，所述接种的接种量(波兰青霉和发酵培养基的质量比)优选为1～3％。本发明对所述接种的条件没有特殊的要求，选用本领域技术人员熟知的方式进行接种即可。在本发明中，所述发酵的温度优选为20～30℃，更优选为26～28℃；时间优选为25～35天，更优选为25～28天。本发明采用固体发酵方式能够有效缩短发酵时间。
得到波兰青霉发酵物后，本发明将所述波兰青霉发酵物与醇类溶剂混合，进行超声提取，得到醇提物。在本发明中，所述醇类溶剂优选包括甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇，更优选为甲醇。在本发明中，所述波兰青霉发酵物的质量与醇类溶剂的体积比为(60～80)g:(80～150)mL，更优选为60.4g:120mL。在本发明中，所述醇类溶剂对单萜吲哚类化合物(polonidineA)具有很好的溶解性，能够很好的将polonidineA从波兰青霉发酵物中分离出来。本发明对混合的方式无特殊要求只要能够混合均匀即可。
在本发明中，所述超声提取的功率优选为250～350W，更优选为300W，时间优选为20～40min，更优选为30min。
所述超声提取后，本发明还优选包括将超声提取后的体系过滤，得到的滤液为醇提物；本发明对所述过滤无特殊限定，采用常规的过滤方式即可。所述过滤后，本发明优选对所得滤液进行减压蒸馏除去滤液中醇类溶剂，得到醇提物。在本发明中，所述减压蒸馏的的真空度优选为10～15kPa，更优选为12kPa；所述减压蒸馏的温度优选为45～55℃，更优选为50℃。本发明对减压蒸馏的时间无特殊限定只要能够将滤液中醇类溶剂除去即可。
得到醇提物后，本发明将所述醇提物进行纯化，得到所述单萜吲哚类化合物。在本发明中，所述纯化包括以下步骤：
将所述醇提物溶解于氯仿-甲醇中，得到待纯化溶液；
将所述待纯化溶液进行第一硅胶柱层析，所述第一硅胶柱层析的洗脱程序为第一梯度洗脱，所述第一梯度洗脱用洗脱剂为氯仿-甲醇混合物，收集以氯仿和甲醇体积比为49～51:1的洗脱剂进行洗脱得到的洗脱液，记为Fr2馏分；
将所述Fr2馏分进行第二硅胶柱层析，所述第二硅胶柱层析的洗脱程序为第二梯度洗脱，所述第二梯度洗脱用洗脱剂为石油醚-丙酮混合物，收集以石油醚和丙醇体积比为9～11:1的洗脱进行第二梯度洗脱得到的洗脱液，记为FrA3馏分；
将所述FrA3馏分进行反相硅胶柱层析，所述反相硅胶柱层析的洗脱程序为线性梯度洗脱，所述线性梯度洗脱用洗脱剂为甲醇-水混合溶液，收集甲醇体积浓度为39～41％的甲醇水溶液的洗脱液，得到收集洗脱液，所述收集洗脱液中含有式I所示化合物。
本发明将所述醇提物溶解于氯仿-甲醇溶液中，得到待纯化溶液。在本发明中，所述醇提物的质量和氯仿-甲醇溶液的体积比优选为10～18g:40mL，更优选为12～14.7g:40mL。本发明对所述氯仿-甲醇溶液中氯仿和甲醇的体积比无特殊限定，采用任意比即可，在本发明的实施例中，所述氯仿和甲醇的体积比为1:1。
得到待纯化溶液后，本发明将所述待纯化溶液进行第一硅胶柱层析，所述第一硅胶柱层析的洗脱程序为第一梯度洗脱，所述第一梯度洗脱用洗脱剂为氯仿-甲醇混合物，收集以氯仿和甲醇体积比为49～51:1的洗脱剂进行洗脱得到的洗脱液，记为Fr2馏分。本发明在进行第一硅胶柱层析之前优选将所述待纯化溶液与硅胶混合后依次进行减压浓缩和装柱。在本发明中，所述第一梯度洗脱用色谱柱为正相硅胶柱，所述正相硅胶柱用硅胶的粒径优选为300～400目。在本发明中，所述待纯化溶液中含有的醇提物与硅胶的质量比优选为1:0.8～1.5，更优选为1:1。本发明通过减压浓缩除去待纯化溶液与硅胶混合后产物中的溶剂。在本发明中，所述减压浓缩的温度优选为45～55℃，更优选为50℃；所述减压浓缩的真空度优选为10～14kPa，更优选为12～13kPa；所述减压浓缩的时间的优选为10～20min，更优选为10～15min。本发明对装柱无特殊要求，按照常规方式进行即可。
在本发明中，所述氯仿-甲醇混合物中氯仿和甲醇的体积比优选为5～100:1；所述氯仿-甲醇混合物的流速优选为为1～4mL/min，更优选为3mL/min。本发明依次用氯仿和甲醇的体积比为98～102:1、49～51:1和19～21:1的氯仿-甲醇溶液进行第一梯度洗脱依次得到Fr1馏分、Fr2馏分和Fr3馏分，所述Fr1馏分、Fr2馏分和Fr3馏分优选通过TLC点板监测得到；所述氯仿和甲醇的体积比依次优选为100:1、50:1和20:1。
进行第一硅胶柱层析后，本发明将所述Fr2馏分进行第二硅胶柱层析，所述第二硅胶柱层析的洗脱程序为第二梯度洗脱，所述第二梯度洗脱用洗脱剂为石油醚-丙酮混合物，收集以石油醚和丙醇体积比为9～11:1的洗脱进行第二梯度洗脱得到的洗脱液，记为FrA3馏分。在本发明中，所述第二梯度洗脱用色谱柱为正相硅胶柱，所述正相硅胶柱用硅胶的粒径优选为300～400目。本发明在进行第二硅胶柱层析之前优选对所述Fr2馏分进行浓缩，除去Fr2馏分中的溶剂，本发明对所述浓缩的方式无特殊要求，在本发明的实施例中具体采用减压浓缩，所述减压浓缩的温度为50℃；所述减压浓缩的真空度为12kPa；所述减压浓缩的时间的为30min。
本发明将除去溶剂后的Fr2馏分进行装柱，本发明对装柱无特殊要求，按照常规方式进行即可。
在本发明中，所述石油醚-丙酮混合物中石油醚和丙酮的体积比优选为1～20:1；所述石油醚-丙酮混合物的流速优选为1～4mL/min，更优选为3mL/min。本发明依次用石油醚和丙酮的体积比为19～21:1、14～16:1、9～11:1和4～6:1的石油醚-丙酮混合物进行梯度洗脱依次得到FrA1馏分、FrA2馏分、FrA3馏分和FrA4馏分，所述FrA1馏分、FrA2馏分、FrA3馏分和FrA4馏分优选通过TLC点板监测得到，所述石油醚和丙酮的体积比依次优选为20:1、15:1、10:1和5:1。
进行第二硅胶柱层析后，本发明将所述FrA3馏分进行反相硅胶柱层析，所述反相硅胶柱层析的洗脱程序为线性梯度洗脱，所述线性梯度洗脱用洗脱剂为甲醇-水混合溶液，收集甲醇体积浓度为39～41％的甲醇水溶液的洗脱液，得到收集洗脱液，所述收集洗脱液中含有式I所示化合物。在本发明中，所述线性梯度洗脱用色谱柱优选为RP-18反相硅胶色谱柱。在本发明中，所述甲醇-水混合溶液中甲醇体积浓度优选为0～100％；所述甲醇-水混合溶液的流速优选为1～4mL/min，更优选为3mL/min；所述甲醇-水混合溶液中甲醇体积浓度优选按照8～12％/h的速率变化，更优选为10％/h。本发明进行线性梯度洗脱过程中收集甲醇体积浓度为39～41％的甲醇-水混合溶液的洗脱液，得到收集洗脱液，本发明优选收集甲醇体积浓度为40％的甲醇-水混合溶液的洗脱液。
本发明优选将所述收集洗脱液进行干燥，去除溶剂得到polonidineA。在本发明中，所述干燥优选为减压蒸馏，所述减压蒸馏的温度优选为48～55℃，更优选为50℃；所述减压蒸馏的真空度优选为10～15kPa，更优选为12～13kPa，本发明对所述减压蒸馏的时间无特殊限定，只要能够将洗脱液中的溶剂完全除去即可。
本发明还提供了上述技术方案所述单萜吲哚类化合物或上述技术方案所述制备方法制备得到的单萜吲哚类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明以polonidineA为原料制备得到的抗肿瘤药物还优选包括药用辅料，所述抗肿瘤药物中polonidine A的质量百分含量优选为1～99％，更优选为50～85％。本发明对所述药用辅料没有特殊的限定，选择本领域常规的制药辅料即可。本发明对所述抗肿瘤药物的制备方法没有特殊的限定，采用本领域熟知的制备方法制成片剂、颗粒剂或注射剂等剂型均可。
在本发明中，所述抗肿瘤药物中的肿瘤优选包括肝癌细胞MHCC97H、乳腺癌细胞BT549、肺癌细胞H1299、结肠癌细胞SW620、神经胶质瘤T98G和肺癌细胞A549。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
将15mg波兰青霉接种到体积为30mL的PDA斜面培养基上，在28℃条件下恒温培养6天后，得到活化的波兰青霉，置于5℃环境中储存备用；
将4.8kg马铃薯去皮切成体积为1cm3的土豆块并分装于60个体积为350mL组织培养瓶中(60g/瓶)，然后将组织培养瓶加盖后在121℃下高温灭菌30min，冷却，得到发酵培养基；
将所述活化的波兰青霉按照1％的接种量接种到所述发酵培养基中，加盖后在28℃下恒温培养30天，得到波兰青霉发酵物；
将60.4g所述波兰青霉发酵物与120mL甲醇混合后进行超声(300W，30min)，过滤，取滤液进行减压蒸馏(真空度为12kPa，50℃)至无醇味，得到14.7g醇提物；
将所述14.7g醇提物溶解于40mL氯仿-甲醇溶液(体积比为1:1)中，得到待纯化溶液；将所述待纯化溶液与14.0g硅胶(300～400目)混合后减压浓缩(真空度为12kPa，50℃)去除溶剂，进行装柱；利用氯仿和甲醇的体积比为100:1、50:1和20:1的氯仿-甲醇溶液依次进行第一梯度洗脱(流速为3mL/min)，根据TLC板检测依次得到Fr1馏分、Fr2馏分和Fr3馏分；取Fr2馏分进行浓缩(温度50℃，真空度12kPa，时间30min)后以石油醚和丙酮的体积比为20:1、15:1、10:1和5:1的石油醚-丙酮为洗脱剂依次过正相硅胶柱(硅胶粒径为300～400目)进行第二梯度洗脱(流速为3mL/min)，根据TLC板检测依次得到FrA1馏分、FrA2馏分、FrA3馏分和FrA4馏分和；取FrA3馏分以甲醇-水混合溶液为洗脱剂，在RP-18反相硅胶色谱柱中进行线性梯度洗脱(流速为3mL/min，甲醇体积浓度变化速率为10％/h)，收集甲醇体积分数为40％的甲醇-水混合溶液洗脱下来的馏分经减压蒸馏(50℃，真空度为12kPa)，得到化合物polonidineA。
将实施例1制备得到的polonidine A进行核磁共振光谱仪检测，得到1D/2D NMR(一维核磁共振波谱和二维核磁共振波谱，)如图1～6所示，其中图1为polonidineA的1H-NMR谱图；图2为polonidineA的13C-NMR和DEPT谱图；图3为polonidineA的1H-1H COSY谱图；图4为polonidineA的HMBC谱图；图5为polonidineA的HSQC谱图；图6为polonidineA的NOESY谱图；
将实施例1制备得到的polonidineA进行高分辨电喷雾电离质谱检测，得到HR-ESI-MS谱图，如图7所示；
将实施例1制备得到的polonidineA进行傅里叶红外光谱仪检测，得到红外光谱图，如图8所示。
由HSQC谱结合碳谱可以得到化合物polonidineA的H和与之相连接的C的化学位移δ归属，如表1所示。
表1polonidineA的13C(600MHz)和1H(600MHz)NMR数据，CDCl3为溶剂(δ：化学位移，J：耦合常数)。
Figure BDA0002651262610000111
化合物polonidineA为棕红色油状固体，通过HR-ESI-MS(m/z 405.2295[M+Na]+)推断其分子式为C27H30N2，不饱和度为14，在13C NMR谱中仅存在14个碳信号，表明该化合物具有对称的同型二聚体结构。综合分析1H和13CNMR,DEPT,1H-1H COSY和HSQC光谱数据表明该化合物具有两个3位取代吲哚结构(δC 123.5d,113.7s,129.7s,119.4d,118.6d,120.6d,113.8d,136.0s)，两个[M-C(CH3)2(CH＝CH2)]结构单元(δH 6.15ddJ＝17.4,10.7Hz H-2'；5.16ddJ＝17.4,1.3Hz,H-3'a；5.19ddJ＝10.7,1.3Hz H-3'b；1.70s H-4'；1.70s H-5'；δC58.9s,144.7d,113.3t,28.1q,28.1q)和一个亚甲基(δH4.23 s H-1”；δC 21.4t)，由于H-1”与C-2,C-3和C-4存在HNBC相关，并且H-1”分别与H-5(δH 7.64ddJ＝7.7,1.2Hz)和H-2(δH7.08s)存在NOE相关，故而推断出C-1”与C-3相连。由于H-8(δH 7.51ddJ＝8.3,1.2Hz)分别与H-4'，H-5',H-2'以及H2-3'存在NOE相关，H-2与H-4'和C-5'也存在NOE相关，再结合H-2和C-1'之间存在HMBC相关，推断出C-1'与N相连。由此解出该化合物结构。
综上所述，可以确定实施例1制备得到的化合物polonidineA的结构式如下式所示：
Figure BDA0002651262610000121
实施例2
按照实施例1的方法对波兰青霉进行活化；
将60g大米在50mL水中浸泡12h，将浸泡后的大米置于体积为350mL组织培养瓶中，然后将组织培养瓶加盖后在121℃下高温灭菌30min，冷却，得到发酵培养基；
将所述活化的波兰青霉按照1％的接种量接种到所述发酵培养基中，加盖后在26℃下恒温培养25天，得到波兰青霉发酵物；
将60g所述波兰青霉发酵物与120mL甲醇混合后进行超声(300W，30min)，过滤，取滤液进行减压蒸馏(真空度为12kPa，50℃)至无醇味，得到12g醇提物；
将所述12g醇提物溶解于40mL氯仿-甲醇溶液(体积比为1:1)中，得到待纯化溶液；将所述待纯化溶液与12g硅胶(300～400目)混合后减压浓缩(真空度为12kPa，50℃)去除溶剂，进行装柱；利用氯仿和甲醇的体积比为100:1、50:1和20:1的氯仿-甲醇溶液依次进行第一梯度洗脱(流速为3mL/min)，根据TLC板检测得到Fr1馏分、Fr2馏分和Fr3馏分；取Fr2馏分进行浓缩(温度50℃，真空度12kPa，时间30min)后以石油醚和丙酮的体积比为20:1、15:1、10:1和5:1的石油醚-丙酮为洗脱剂过正相硅胶柱(硅胶粒径为300～400目)进行第二梯度洗脱(流速为3mL/min)，通过TLC板检测依次得到FrA1馏分、FrA2馏分、FrA3馏分和FrA4馏分；取FrA3馏分以甲醇-水混合溶液为洗脱剂，在RP-18反相硅胶色谱柱中进行线性梯度洗脱(流速为3mL/min，甲醇体积浓度变化速率为10％/h)，收集甲醇体积分数为40％的甲醇-水混合溶液洗脱下来的馏分经减压蒸馏(真空度为12kPa，50℃)，得到化合物polonidineA。
测试例
MTS法检测细胞活性原理：MTS为一种全新的MTT类似物，全称为3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfopheny)-2H-t etrazolium)，是一种黄颜色的染料。活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MTS，生成可溶性的甲臜化合物，甲臜的含量可以用酶标仪在490nm处进行测定。在通常情况下，甲臜生成量与活细胞数成正比，因此，可根据光密度OD值推测出活细胞的数目。
利用MTS法将实施例1制备的polonidineA进行抗肿瘤活性测试，具体步骤如下：
(1)接种细胞：用含10％胎牛血清的培养液(DMEM或者RMPI1640)配成单个细胞悬液，以每孔7000个细胞接种到96孔板，每孔体积100μL，贴壁细胞提前15h接种培养；
(2)加入polonidineA溶液：polonidineA溶解于DMSO中，polonidine A溶液中polonidineA的浓度以40μmol/L、8μmol/L、1.6μmol/L、0.32μmol/L、0.064μmol/L浓度复筛，每孔终体积200μL，每种处理均设3个复孔。
(3)显色：37℃培养48h，贴壁细胞弃孔内培养液，每孔加MTS溶液20μL和培养液100μL；悬浮细胞弃100μL培养上清液，每孔加20μL的MTS溶液；设3个空白复孔(MTS溶液20μL和培养液100μL的混合液)，继续孵育3小时，使反应充分进行后测定光吸收值。
(4)比色：选择492nm波长，多功能酶标仪(MULTISKAN FC)读取各孔光吸收值，记录结果，数据处理后以浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标绘制细胞生长曲线，应用两点法(Reed and Muench法)计算化合物的IC50值。
(5)阳性对照化合物：每次实验均设紫杉醇(Taxol)为阳性化合物，以浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标绘制细胞生长曲线，应用两点法(Reed andMuench法)计算化合物的IC50值。
实验结果显示，化合物polonidineA对体外六种肿瘤细胞的抑制活性(阳性对照为：顺铂，紫杉醇)筛选试验中，polonidineA对肝癌细胞MHCC97H、乳腺癌细胞BT549、肺癌细胞H1299、结肠癌细胞SW620、神经胶质瘤T98G、肺癌细胞A549均表现出了良好的抑制活性，其IC50值分别为7.08μg/mL、6.05μg/mL、20.39μg/mL、7.64μg/mL、17.97μg/mL和15.96μg/mL。
本发明提供的单萜吲哚类化合物，该化合物结构新颖，丰富了单萜吲哚类化合物的多样性；本发明提供的polonidineA具有抗肿瘤活性，根据测试例数据可知，polonidineA对6种肿瘤细胞表现出了明显的抑制活性。
本发明通过微生物发酵制备得到单萜吲哚类化合物，制备方法周期短、培养条件温和、副产物少、立体选择性强、成本低，易于实现工业化，不仅符合现代环保和低碳经济的需求，还能够为单萜吲哚类化合物的量产提供了新途径；本发明提供的单萜吲哚类化合物能够应用于制备抗肿瘤药物，为开发抗肿瘤药物提供了新的选择。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (9)

1.一种单萜吲哚类化合物，其特征在于，具有式I所示结构：
Figure FDA0003211818580000011
2.权利要求1所述单萜吲哚类化合物的制备方法，包括以下步骤：
将波兰青霉进行发酵，得到波兰青霉发酵物；
将所述波兰青霉发酵物与醇类溶剂混合，进行超声提取，得到醇提物；
将所述醇提物进行纯化，得到所述单萜吲哚类化合物；
所述纯化包括以下步骤：
将所述醇提物溶解于氯仿-甲醇中，得到待纯化溶液；
将所述待纯化溶液进行第一硅胶柱层析，所述第一硅胶柱层析的洗脱程序为第一梯度洗脱，所述第一梯度洗脱用洗脱剂为氯仿-甲醇混合物，收集以氯仿和甲醇体积比为49～51:1的洗脱剂进行洗脱得到的洗脱液，记为Fr2馏分；
将所述Fr2馏分进行第二硅胶柱层析，所述第二硅胶柱层析的洗脱程序为第二梯度洗脱，所述第二梯度洗脱用洗脱剂为石油醚-丙酮混合物，收集以石油醚和丙醇体积比为9～11:1的洗脱进行第二梯度洗脱得到的洗脱液，记为FrA3馏分；
将所述FrA3馏分进行反相硅胶柱层析，所述反相硅胶柱层析的洗脱程序为线性梯度洗脱，所述线性梯度洗脱用洗脱剂为甲醇-水混合溶液，收集甲醇体积浓度为39～41％的甲醇水溶液的洗脱液，得到收集洗脱液，所述收集洗脱液中含有式I所示化合物。
3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述发酵为固体发酵；
所述发酵的温度为20～30℃，时间为25～35天。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述醇类溶剂包括甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇；
所述波兰青霉发酵物的质量与醇类溶剂的体积比为(60～80)g:(80～150)mL。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述超声提取的功率为250～350W，时间为20～40min。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述氯仿-甲醇混合物中氯仿和甲醇的体积比为5～100:1；所述石油醚-丙酮混合物中石油醚和丙酮的体积比为1～20:1；所述甲醇-水混合溶液中甲醇的体积浓度为0～100％。
7.根据权利要求6所 述的制备方法，其特征在于，所述第一梯度洗脱、第二梯度洗脱和线性梯度洗脱用洗脱剂的流速独立的为1～4mL/min。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述第一硅胶柱层析和第二硅胶柱层析用色谱柱独立的为正相硅胶柱，所述正相硅胶柱用硅胶的粒径独立的为300～400目；所述反相硅胶柱层析用色谱柱为RP-18反相硅胶柱。
9.权利要求1所述单萜吲哚类化合物在制备抗肝癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌细胞和神经胶质瘤药物中的应用。
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