CN115433152B - 从金丝梅果实内分离出的化合物、制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了从金丝梅果实内分离出的化合物及其用途，该化合物的制备方法包括从金丝梅鲜果中醇提并经过树脂吸附分离、柱层析和凝胶分离的步骤。本发明公开的化合物可以用于制备治疗宫颈癌、胃癌、肝癌、结肠癌或乳腺癌的药品，以及制备具有抗癌活性的保健品和食品。

Description

从金丝梅果实内分离出的化合物、制备方法和用途
技术领域
本发明属于天然产物分离领域，具体涉及从涉及一种金丝梅药材中提取、分离的化合物、其制备方法和用途。
背景技术
金丝梅为藤黄科金丝桃属植物金丝梅(Hypericum patulumThunb.ex Murray)的新鲜成熟果实，收载于《贵州省中药材、民族药材质量标准》(2003版)，在《中华本草》(苗药卷)、《苗族医学》也有收载，又名过路黄、大过路黄等，具有清热解毒、舒经活络、舒肝、止血的功效。目前国内外对于金丝梅的化学成分研究主要集中在全株、叶和花的小极性部位化学成分分离鉴定，对极性较大部位化学成分研究较少，也未见金丝梅成熟果实系统的化学成分研究。
药理实验研究发现金丝梅鲜果具有抗抑郁、抑菌活性、抗氧化活性、抗肿瘤镇痛活性等，故对其内化合物进行分离和研究具有较为重要的意义。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种从金丝梅鲜果提取的蒽醌类化合物，本发明的另外一个目的在于提供从金丝梅鲜果中获取有效化学成分的方法，并提供该化合物的用途。
根据本发明的一个方面，本发明首先公开了从金丝梅果实内分离出的化合物，其特征在于，所述化合物具有如式1-5所示的结构
根据本发明的第二个方面，本发明公开了前述化合物的制备方法，包括：金丝梅鲜果经醇提获取第一醇提物，所述第一醇提物经大孔树脂进行吸附后经醇洗脱获得第一洗脱液，洗脱液后经柱层析分离获得化合物1-5。
在本发明的一个实施例中，所述第一醇提物的制备方法包括：
所述金丝梅鲜果经干燥和粉碎处理后使用乙醇溶液回流提取获得第一滤液，所述第一滤液经浓缩获得第一醇提物。
在本发明的一个实施例中，步骤1中，采用20％-40％乙醇回流提取2-4次获得第一醇提物，优选采用30％乙醇回流提取2-4次获得第一醇提物。
在本发明的一个实施例中，所述大孔树脂为D101大孔吸附树脂，所述洗脱为使用水和醇溶液进行洗脱。
在本发明的一个实施例中，所述大孔树脂为D101大孔吸附树脂，所述洗脱为使用水和醇溶液进行洗脱。
在本发明的一个实施例中，所述柱层析使用正相柱、反相柱和凝胶色谱进行，所述从洗脱液中获得化合物I的过程包括：
对所述洗脱液进行一次正相柱层析，使用薄层色谱检测并对洗脱液进行合并，得到按序收集的11组洗脱液S1-S11，收集第1组洗脱组分S1；
对S1经浓缩后使用正相柱层析，使用薄层色谱检测并对洗脱液进行合并，得到按序收集的13组洗脱液S1,1-S1,13，其中第11组洗脱液S1,11经凝胶色谱和反相色谱分离获得化合物1。
在本发明的一个实施例中，所述方法进一步包括步骤：
对洗脱液S8经过滤获得滤液S8s，对所述滤液S8s使用反相柱层析，使用薄层色谱检测并对洗脱液进行合并，得到按序收集的14组洗脱液S8s，1-S8s，14，收集第5组洗脱组分S8s,5，并过滤获得滤液S8s,5s,后经反相柱层析和凝胶色谱分离获得化合物2。
在本发明的一个实施例中，所述方法进一步包括步骤：
对洗脱液S8经过滤获得滤液S8s，对所述滤液S8s使用反相柱层析，使用薄层色谱检测并对洗脱液进行合并，得到按序收集的14组洗脱液S8s，1-S8s，14，收集第6组洗脱组分S8s,6，并过滤获得滤饼S8s,6,后经凝胶色谱和正向柱层析分离获得化合物3。
在本发明的一个实施例中，所述方法进一步包括步骤：
对洗脱液S10经凝胶色谱分离，使用薄层色谱检测并对洗脱液进行合并，得到按序收集的11组洗脱液S10，1-S10，11，收集第3组洗脱组分S10，3和第4组洗脱组分S10,3，经凝胶色谱、正向柱层析和反相柱层析分离获得化合物4和5。
在本发明的一个实施例中，所述的柱层析为正相柱层析时，使用100-300目的硅胶作为填料。
在本发明的一个实施例中，所述的柱层析包括使用Sephadex LH-20，ToyopearlHW-40F柱色谱进行分离纯化。
在本发明的一个实施例中，所述的柱层析为正相柱层析时，使用石油醚-乙酸乙酯、石油醚-二氯甲烷、二氯甲烷、甲醇、乙酸乙酯-甲醇、二氯甲烷-甲醇作为淋洗液。
根据本发明的第三个方面，本发明还公开了前述的化合物在制备治疗宫颈癌、胃癌、肝癌、结肠癌或乳腺癌的药物中的应用。
通过对分离得到的化合物I进行抗肿瘤活性研究，发现金丝梅含有多种抗肿瘤活性化合物，可能存在作用靶点多和作用途径多等特点，其可以用于制备抗宫颈癌、胃癌、肝癌、结肠癌或乳腺癌的药物。本发明新化合物和衍生物可以作为其他化合物合成先导物，以及新药开发和药理活性研究的原料。
本发明中的化合物可单独施用，但通常是和药用载体混合物给予，所述药用载体的选择要根据所需用药途径和标准药物实践，例如片剂、胶囊剂、注射剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、外用搽剂和软膏剂等；优选为片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、液剂、混悬剂、乳剂或胶囊剂的口服制剂。
用于口服给药时，可以混合至少一种以上的如淀粉、碳酸钙(calciumcarbonate)、蔗糖(sucrose)、乳糖(lactose)或明胶等赋形剂制备。此外，除了单一的赋形剂之外，还可以使用硬脂酸镁、滑石等润滑剂。
根据本发明的第四个方面，本发明还公开了前述的化合物在制备抗癌保健品和食品中的应用。
与现有技术相比，本发明的优势在于：
本发明从金丝梅鲜果中分离提取得到式1-5的化合物，该化合物的纯度为82％～93％。经实验检测，所述的化合物1-5对于例如人肺癌A549细胞的癌细胞具有一定的抑制活性。本发明的制备方法步骤简单、成本低、产率高且获得的化合物纯度高，促进了苗药金丝梅在医药、保健品、食品等方面的开发，并对推动行业的可持续发展起到重要意义。
附图说明
图1为化合物I的HR-ESI-MS；
图2为化合物II的HR-ESI-MS图；
图3为化合物III的HR-ESI-MS图；
图4为化合物IV的HR-ESI-MS图；
图5为化合物V的HR-ESI-MS图；
图6为化合物I的1H-NMR图；
图7为化合物II的1H-NMR图；
图8为化合物III的1H-NMR图；
图9为化合物IV的1H-NMR图；
图10为化合物V的1H-NMR图；
图11为化合物I的13C-NMR图；
图12为化合物II的13C-NMR图；
图13为化合物III的13C-NMR图；
图14为化合物IV的13C-NMR图；
图15为化合物V的13C-NMR图；
图16为化合物I的核磁共振HMQC图；
图17为化合物II的核磁共振HMQC图；
图18为化合物III的核磁共振HMQC图；
图19为化合物IV的核磁共振HMQC图；
图20为化合物V的核磁共振HMQC图；
图21为化合物I的核磁共振HMBC图；
图22为化合物II的核磁共振HMBC图；
图23为化合物III的核磁共振HMBC图；
图24为化合物IV的核磁共振HMBC图；
图25为化合物V的核磁共振HMBC图。
具体实施方式
下面将结合实施例进一步详细说明本发明的实质内容。需说明的是，以下实施例仅是对本发明的进一步说明，而不能作为对本发明的限制。
实施例1
步骤1、取金丝梅鲜果药材(40kg)，用30％乙醇回流提取，重复提取3次，每次1.5小时，第一次用8倍量30％乙醇，第二次和第三次分别加入6倍量30％乙醇，醇提液滤过，合并滤液后减压回收乙醇，直接加热浓缩不断加水挥乙醇直到无明显乙醇味；
步骤2、将浸膏拌样后经D101大孔吸附树脂进行粗分，经大孔吸附树脂吸附，依次用水，80％乙醇洗脱浓缩，得到不同组分段(水段，80％乙醇段)；
步骤3、将80％乙醇段浸膏上正相硅胶柱，以氯仿-甲醇(10:0-6:4)梯度洗脱，经薄层色谱进行检测，显色，合并显色的洗脱部位，TLC检测合并，得到11个组分(Fr.1-11)将合并后的洗脱部位经减压浓缩至干，备用；
步骤4、将步骤3中Fr.1经正相硅胶(石油醚:乙酸乙酯)洗脱，TLC检测合并后浓缩，得到13个组分(Fr.1.1-1.13)，Fr.1.11经Sephadex LH-20凝胶(二氯甲烷-甲醇1:1)洗脱，Sephadex LH-20凝胶(甲醇)，ODS反相柱(80％甲醇水)，正相硅胶(石油醚-乙酸乙酯10:0-5:5)洗脱得化合物1。
步骤5、Fr.8过滤得到2个组分(Fr.8.1-8.2)，Fr.8.2为滤液。Fr.8.2过反相MCI(30％乙醇水起)梯度洗脱，TLC检测合并后浓缩得到14个组分(Fr.8.2.1-8.2.14)。Fr.8.2.5.2经ODS反相柱，Toyopearl HW-40F凝胶柱层析(甲醇)，TLC检测合并后浓缩得化合物2，Fr.8.2.6.1经二氯甲烷-甲醇体系(6:1)，Toyopearl HW-40F凝胶柱层析(甲醇)，正相硅胶柱(乙酸乙酯-甲醇35:1)得化合物3。
步骤6、将步骤3中Fr.10经Sephadex LH-20凝胶柱层析(甲醇)，TLC检测合并后浓缩得到11个组分(Fr.10.1-10.11)。其中，Fr.10.3和Fr.10.4合并，经反复过Sephadex LH-20凝胶柱层析(甲醇)，Toyopearl HW-40F凝胶柱层析(甲醇)，正相硅胶柱(二氯甲烷-甲醇8:2)，Toyopearl HW-40F凝胶柱层析(甲醇)，ODS反相柱(20％甲醇水)，Sephadex LH-20凝胶柱层析(50％丙酮水)等得化合物4，化合物5。
本发明进行的TLC检识的条件：显色剂a：紫外灯(254nm，365nm)下观察荧光；显色剂b：碘显色；显色剂c：10％硫酸乙醇
结构鉴定：采用1H NMR、13C NMR核磁谱、二维核磁谱、高分辨质谱对分离得到的单体化合物进行结构鉴定。
化合物1为淡黄色粉末，分子式为：C18H18O5；旋光度为：-6.67(c 1.2,MeOH)；IR(KBr)νmax 3432,2977,2931,1736,1657,1597,1342,1256,1235,1018,986cm-1.；HR-ESI-MS m/z:315.1222[M+H]+，计算值为315.1277；通过光谱技术确定化合物为Patulumnaphthoquinone A，其核磁数据见表1。
化合物2为淡黄色固体,分子式为：C15H22O7；旋光度为：-47.3(c1.69,MeOH)；IR(KBr)νmax3378,2962,2927,2873,1597,1452,1171,1074,1046,1022cm-1；HR-ESI-MS m/z:337.1254[M+Na]+，计算值为337.1257；通过光谱技术确定化合物为Patulumside A，其核磁数据见表2。
化合物3为淡黄色固体，分子式为：C16H22O8；旋光度为：+4.15(c1.74,MeOH)；IR(KBr)νmax 3391,2919,1728,1441,1276,1206,1159,1077,1032cm-1；HR-ESI-MS m/z:365.1201[M+Na]+，计算值为365.1206；通过光谱技术确定化合物为Patulumside B，其核磁数据见表3。
化合物4为淡黄色粉末，分子式为：C21H36O11；旋光度为：-84.0(c 1.0,MeOH)；IR(KBr)νmax 3401,2971,2934,2877,1666,1621,1506,1305,1180,1083,1050cm-1；HR-ESI-MS m/z:529.1910[M+H]+，计算值为529.1915；通过光谱技术确定化合物为Patulumside C，其核磁数据见表4。
化合物5为白色固体，分子式为：C27H34O14；旋光度为：-48(c 0.5,MeOH)；IR(KBr)νmax 3514,3553,2943,2913,1705,1518,1230,1084,1050cm-1；HR-ESI-MS m/z:627.1925[M+HCOO]-，计算值为627.1920；通过光谱技术确定化合物为Patulumside D，其核磁数据见表5，相应带有标号的化学式参见下式1-5。
表1：化合物I的1H(400MHz,CD3OD),13C(100MHz,CD3OD)
表2：化合物II的1H(600MHz,DMSO-d6),13C(150MHz,DMSO-d6)
表3：化合物III的1H(600MHz,DMSO-d6),13C(150MHz,DMSO-d6)
表4：化合物IV的1H(600MHz,CD3OD),13C(150MHz,CD3OD)
表5：化合物V的1H(400MHz,CD3OD),13C(100MHz,CD3OD)
/>
实施例2
步骤1、取金丝梅鲜果药材(40kg)，用30％乙醇回流提取，重复提取3次，每次1.5小时，第一次用8倍量30％乙醇，第二次和第三次分别加入6倍量30％乙醇，醇提液滤过，合并滤液后减压回收乙醇，直接加热浓缩挥乙醇直到无明显乙醇味；
步骤2、将浸膏拌样后经D101大孔吸附树脂进行粗分，经大孔吸附树脂吸附，依次用水，80％乙醇洗脱浓缩，得到不同组分段(水段，80％乙醇段)；
步骤3、将80％乙醇段浸膏上正相硅胶柱，以氯仿-甲醇(10:0-6:4)梯度洗脱，经薄层色谱进行检测，显色，合并显色的洗脱部位，TLC检测合并，得到11个组分(Fr.1-11)将合并后的洗脱部位经减压浓缩至干，备用；
步骤4、将步骤3中Fr.1经正相硅胶(石油醚:乙酸乙酯)洗脱，TLC检测合并后浓缩，得到13个组分(Fr.1.1-1.13)，Fr.1.11经Sephadex LH-20凝胶(二氯甲烷-甲醇1:1)洗脱，Sephadex LH-20凝胶(甲醇)，ODS反相柱(80％甲醇水)，正相硅胶(石油醚-乙酸乙酯10:0-5:5)洗脱得化合物1。
步骤5、Fr.8过滤得到2个组分(Fr.8.1-8.2)，Fr.8.2为滤液。Fr.8.2过反相MCI(30％乙醇水起)梯度洗脱，TLC检测合并后浓缩得到14个组分(Fr.8.2.1-8.2.14)。Fr.8.2.5.2经ODS反相柱，Toyopearl HW-40F凝胶柱层析(甲醇)，TLC检测合并后浓缩得化合物2，Fr.8.2.6.1经二氯甲烷-甲醇体系(6:1)，Toyopearl HW-40F凝胶柱层析(甲醇)，正相硅胶柱(乙酸乙酯-甲醇35:1)得化合物3。
步骤6、将步骤3中Fr.10经Sephadex LH-20凝胶柱层析(甲醇)，TLC检测合并后浓缩得到11个组分(Fr.10.1-10.11)。其中，Fr.10.3和Fr.10.4合并，经反复过Sephadex LH-20凝胶柱层析(甲醇)，Toyopearl HW-40F凝胶柱层析(甲醇)，正相硅胶柱(二氯甲烷-甲醇8:2)，Toyopearl HW-40F凝胶柱层析(甲醇)，ODS反相柱(20％甲醇水)，Sephadex LH-20凝胶柱层析(50％丙酮水)等得化合物4，化合物5。
试验例1
为实现本发明的上述目的，本发明对金丝梅中提取物进行抗肿瘤机制研究，现做以下抗肿瘤实验。
抗肿瘤实验的实验原理为：Cell Counting Kit-8(简称CCK-8)试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。该试剂中含有WST-8[化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐]，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物(Formazan dye)，生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比，因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析；
步骤1、A549细胞株培养于含10％胎牛血清和1％双抗(100U/mL青霉素、100mg/L链霉素)的DMEM培养液中，37℃，5％CO2培养箱中传代培养。用0.25％胰蛋白酶胰酶消化贴壁细胞进行传代，取对数生长期细胞进行试验。
步骤2、取对数生长期A549细胞，用10％胎牛血清的DMEM培养液调整细胞数为5×105个/mL，接种于96孔细胞培养板，每孔0.2mL，待细胞贴壁70％～80％时，吸弃旧培养液，分别加入含不同浓度化合物I～14(1.5、3.0、6.0、12.0、24.0、48.0、96.0、192μg/mL)的培养液0.2mL，每组设3个重复，即每个剂量组设3个平行孔取平均值。培养24h后，每孔加入10μLCCK-8溶液，继续培养4h，用酶标仪测定在450nm处的吸光度。按照以下公式计算各组细胞增殖抑制率：细胞增殖抑制率＝(1-A实验组/A对照组)×100％，用SPSS18.0软件计算半数抑制浓度(IC50)。
表6化合物I-V对A549细胞的抑制活性(X±S,n＝3)
其中，IC50(μM)为增殖抑制率为50％时化合物的浓度，用于表示抗肿瘤活性；5-氟尿嘧啶为阳性对照药。
如表6所示，化合物1-5对人肺癌A549细胞均具有一定的抑制活性，可以用人肺癌A549细胞的抑制剂的参考使用，并用于相关药物的制备。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (9)

1.一种从金丝梅果实内分离出的化合物，其特征在于，所述化合物具有如式1、式3、式4和式5所示的结构
2.一种从金丝梅果实内分离出的化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
金丝梅鲜果经醇提获取第一醇提物，所述第一醇提物经大孔树脂进行吸附后经醇洗脱获得第一洗脱液，洗脱液后经柱层析分离获得化合物1-5；
所述化合物1-5具有如式1到式5所示的结构
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述第一醇提物的制备方法包括如下步骤：
所述金丝梅鲜果经干燥和粉碎处理后使用乙醇溶液回流提取获得第一滤液，所述第一滤液经浓缩获得第一醇提物。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述大孔树脂为D101大孔吸附树脂，所述洗脱为使用水和醇溶液进行洗脱。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述柱层析使用正相柱、反相柱和凝胶色谱进行，所述从洗脱液中获得化合物I的过程包括：
对所述洗脱液进行一次正相柱层析，使用薄层色谱检测并对洗脱液进行合并，得到按序收集的11组洗脱液S1-S11，收集第1组洗脱组分S1；
对S1经浓缩后使用正相柱层析，使用薄层色谱检测并对洗脱液进行合并，得到按序收集的13组洗脱液S1,1-S1,13，其中第11组洗脱液S1,11经凝胶色谱和反相色谱分离获得化合物1。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，进一步包括步骤：
对洗脱液S8经过滤获得滤液S8s，对所述滤液S8s使用反相柱层析，使用薄层色谱检测并对洗脱液进行合并，得到按序收集的14组洗脱液S8s，1-S8s，14，收集第5组洗脱组分S8s,5，并过滤获得滤液S8s,5s,后经反相柱层析和凝胶色谱分离获得化合物2。
7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，进一步包括步骤：
对洗脱液S8经过滤获得滤液S8s，对所述滤液S8s使用反相柱层析，使用薄层色谱检测并对洗脱液进行合并，得到按序收集的14组洗脱液S8s，1-S8s，14，收集第6组洗脱组分S8s,6，并过滤获得滤饼S8s,6,后经凝胶色谱和正向柱层析分离获得化合物3。
8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，进一步包括步骤：
对洗脱液S10经凝胶色谱分离，使用薄层色谱检测并对洗脱液进行合并，得到按序收集的11组洗脱液S10，1-S10，11，收集第3组洗脱组分S10，3和第4组洗脱组分S10,4，经凝胶色谱、正向柱层析和反相柱层析分离获得化合物4和5。
9.如权利要求1所述的化合物在制备治疗宫颈癌、胃癌、肝癌、结肠癌或乳腺癌的药物中的应用。
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