CN113024551B - 一种从鸦胆子中提取分离的化合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及中药的提取、分离领域，尤其涉及从鸦胆子中提取、分离和鉴定出的化合物及其分离方法和应用。本发明提供的化合物，分子式为C22H18N2O6，命名为Bi‑4‑methoxycarbonyl‑2‑quinolone。经研究发现本发明的化合物具有显著的抗炎及抗癌活性。
Description
技术领域
本发明涉及中药的提取、分离领域，尤其涉及从鸦胆子种子中提取、分离和鉴定出的化合物及其分离方法，具体为一种从鸦胆子中提取分离的化合物及其制备方法和应用。
背景内容
鸦胆子是苦木科鸦胆子（Bruceajavanica ( L. ) Merr.）的干燥成熟果实，主要分布于我国的广东、广西等地区。全世界鸦胆子属植物有6种，我国有2种，为鸦胆子和柔毛鸦胆子，均不同程度地作为民间传统用药，具有多种药理活性。据2020版《中国药典》记载，鸦胆子具有良好的清热解毒、截疟、止痢、腐蚀赘疣等作用，内用治疗各种疟疾、痢疾，外用治疗赘疣、鸡眼等。现代药理活性研究表明，鸦胆子有抗炎、拒食、抗疟、抗病毒、抗溃疡、降血糖和除草等多方面的作用。目前，鸦胆子油乳及其软胶囊已作为临床一线抗癌药在国内上市销售，用于多种癌症的辅助性治疗。具有很高的药用价值，民间还用于治疗多种疾病。
然而，近年来国内外关于鸦胆子的化学成分报道较少，目前报道的鸦胆子主要有效化学成分为苦木内酯类化合物，且物质基础尚不明确。因此亟待对鸦胆子种子的化学成分进行深入研究，分离其中的活性成分。
发明内容
发明目的：针对上述问题，本发明提供了一种从鸦胆子种子中提取分离的化合物Bi-4-Methoxycarbonyl-2-quinolone及其制备方法和应用，经研究发现本发明的化合物具有显著的抗炎及抗癌活性。同时提供一种针对本发明化合物的简便、快速、纯度高的提取分离方法。
技术方案：本发明提供的所述化合物分子式为C22H18N2O6，命名为Bi-4-Methoxycarbonyl-2-quinolone，化学结构式为：
上述化合物的制备方法包括以下步骤：
（a）将鸦胆子种子粉碎，采用石油醚脱脂2-3次，过滤，得脱脂鸦胆子药材；
（b）待脱脂鸦胆子药材挥干石油醚后，加入乙醇溶液回流提取2-3次，每次1.5-2h，合并提取液，过滤，减压浓缩滤液，得提取物；
（c）将提取物加甲醇溶解，然后加入硅胶拌样，上样于硅胶柱，分别用体积比为100:1、20:1、2:1、0:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，共得4个馏分A、B、C、D；
（d）将馏分B进行色谱分离纯化，得到所述化合物。
进一步地，步骤（d）所述馏分B进行色谱分离纯化的步骤具体为：
（1）将馏分B上样于HP-20大孔吸附树脂柱进行柱层析，分别用体积比为30%、50%、70%、95%的甲醇-水梯度洗脱，获得70%甲醇洗脱物；
（2）取70%甲醇洗脱物进行硅胶柱层析，分别用体积比为100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1、0:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，共得8个馏分B-2-a、B-2-b、B-2-c、B-2-d、B-2-e、B-2-f、B-2-g、B-2-h；
（3）取馏分B-2-d进行Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离，用纯甲醇进行洗脱，洗脱液经TLC检识后，得6个洗脱部位B-2-d-L1、B-2-d-L2、B-2-d-L3、B-2-d-L4、B-2-d-L5、B-2-d-L6；
（4）取凝胶柱色谱洗脱部位B-2-d-L3经半制备HPLC纯化，体积比为13:87的乙腈-0.1%甲酸水溶液洗脱，从洗脱液中收集主峰得到纯的化合物。
进一步地，步骤（a）中，石油醚的加入量为鸦胆子种子质量的4-6倍，脱脂温度35-45℃，每次脱脂时间10-12 h。
进一步地，步骤（b）中，乙醇溶液的浓度为90-95%，乙醇溶液加入量与脱脂鸦胆子药材的体积比为（8-10）：1，提取温度为98-100℃。
进一步地，步骤（c）中，提取物按照0.88-0.92g/mL加甲醇进行溶解，所述硅胶为100-200目，所述硅胶与提取物的质量比为1：（0.9-0.92），所述硅胶柱为5kg100-200目硅胶柱。
进一步地，步骤（1）中，馏分B与大孔吸附树脂的体积比为1：（18-22），步骤（2）中，70%甲醇洗脱物与硅胶的体积比为1：（28-32）。
进一步地，步骤（3）中Sephadex LH-20凝胶柱的色谱条件为：色谱柱尺寸1200*30mm，粒径10 μm，流速2 ml/min。
进一步地，步骤（4）中半制备HPLC的色谱条件为：C18色谱柱，色谱柱尺寸180*5mm，粒径5 μm，流速0.8 ml/min。
本发明内容还包括所述的化合物在制备抗炎、抗肿瘤药物中的应用。
有益效果：与现有技术相比，本发明具备以下优点：
本发明中所述鸦胆子种子中化合物的分离纯化和药理活性研究未被现有论文期刊所报道，本发明提供来源于鸦胆子种子的化合物及一种针对本发明化合物的提取分离纯化方法，采用醇提取、大孔吸附树脂柱层析、硅胶柱层析、凝胶柱层析及半制备HPLC进行分离纯化，成功获得新的化合物，操作方法简便及快速，且经该方法分离得到的化合物纯度较高，均大于95%，此外经研究表明以上化合物具有显著的抗炎及抗肿瘤活性，可用于制备抗炎及抗肿瘤的药物。
附图说明
图1为本发明制备的化合物的化学结构式；
图2为本发明从鸦胆子中提取分离化合物的工艺流程图；
图3为本发明制备的化合物的1H NMR谱图；
图4为本发明制备的化合物的13C NMR谱图；
图5为本发明制备的化合物的DEPT NMR谱图；
图6为本发明制备的化合物的HSQC谱图；
图7为本发明制备的化合物的HMBC谱图；
图8为本发明制备的化合物的1H-1H COSY谱图；
图9为本发明制备的化合物的NOESY 谱图；
图10为本发明制备的化合物的X单晶衍射图；
图11为本发明制备的化合物的高分辨质谱图；
图12为本发明制备的化合物对RAW264.7的细胞活力示意图；
图13为本发明制备的化合物对LPS诱导的RAW264.7的抑制作用示意图；
图14为本发明制备的化合物对HepG2的细胞活力示意图；
图15为本发明制备的化合物对Lewis的细胞活力示意图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
其中，本发明所用的鸦胆子药材于2018年11月采于广西壮族自治区，标本存于江西中医药大学中药固体制剂制造技术国家工程研究中心。
实施例1
本实施例提供了一种从鸦胆子中提取分离的化合物，所述化合物的分子式为C22H18N2O6，其化学结构式如附图1。
如附图2所示，该化合物的制备方法为：
（a）取鸦胆子药材，粉碎，将鸦胆子药材置于容器中，加入石油醚，石油醚的加入量为鸦胆子药材质量的4倍，脱脂2次，脱脂温度35℃，每次脱脂时间10 h，过滤，得脱脂鸦胆子药材；
（b）待脱脂鸦胆子药材挥干石油醚后，加入90%乙醇，乙醇溶液加入量与脱脂鸦胆子药材的体积比为8：1，在98℃回流提取2次，每次1.5 h，合并提取液，滤过，减压浓缩滤液，得提取物；
（c）按照0.88g/mL将提取物加甲醇溶解，然后加入100目硅胶拌样，上样于5kg100目硅胶柱，硅胶与提取物的质量比为1：0.9，依次用体积比为100:1、20:1、2:1、0:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，共得4个馏分A、B、C、D；
（d）将馏分B上样于HP-20大孔吸附树脂柱进行柱层析，馏分B与大孔吸附树脂的体积比为1：18，依次用体积比为30%、50%、70%、95%的甲醇-水梯度洗脱，获得70%甲醇洗脱物；取70%甲醇洗脱物经硅胶柱层析，70%甲醇洗脱物与硅胶的体积比为1：28，依次用体积比为100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1、0:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，得8个馏分B-2-a、B-2-b、B-2-c、B-2-d、B-2-e、B-2-f、B-2-g、B-2-h；馏分B-2-d经Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离，用纯甲醇进行洗脱，TLC检识后，得6个洗脱部位B-2-d-L1、B-2-d-L2、B-2-d-L3、B-2-d-L4、B-2-d-L5、B-2-d-L6；洗脱部位B-2-d-L3经半制备HPLC纯化，用体积比为13:87的乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）洗脱，收集主峰，得到该化合物。
其中，Sephadex LH-20凝胶柱的色谱条件为色谱柱尺寸1200*30 mm，粒径10 μm，流速2 ml/min。半制备HPLC的色谱条件为：C18色谱柱，色谱柱尺寸180*5 mm，粒径5 μm，流速0.8 ml/min。
实施例2
本实施例提供了一种从鸦胆子中提取分离的化合物，所述化合物的制备方法为：
（a）取鸦胆子药材，粉碎，将鸦胆子药材置于容器中，加入石油醚，石油醚的加入量为鸦胆子药材质量的5倍，脱脂3次，脱脂温度40℃，每次脱脂时间11 h，过滤，得脱脂鸦胆子药材；
（b）待脱脂鸦胆子药材挥干石油醚后，加入93%乙醇，乙醇溶液加入量与脱脂鸦胆子药材的体积比为9：1，在99℃回流提取3次，每次1.8 h，合并提取液，滤过，减压浓缩滤液，得提取物；
（c）按照0.9g/mL将提取物加甲醇溶解，然后加入150目硅胶拌样，上样于5kg150目硅胶柱，硅胶与提取物的质量比为1：0.91，依次用体积比为100:1、20:1、2:1、0:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，共得4个馏分A、B、C、D；
（d）将馏分B上样于HP-20大孔吸附树脂柱进行柱层析，馏分B与大孔吸附树脂的体积比为1：20，依次用体积比为30%、50%、70%、95%的甲醇-水梯度洗脱，获得70%甲醇洗脱物；取70%甲醇洗脱物经硅胶柱层析，70%甲醇洗脱物与硅胶的体积比为1：30，依次用体积比为100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1、0:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，得8个馏分B-2-a、B-2-b、B-2-c、B-2-d、B-2-e、B-2-f、B-2-g、B-2-h；馏分B-2-d经Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离，用纯甲醇进行洗脱，TLC检识后，得6个洗脱部位B-2-d-L1、B-2-d-L2、B-2-d-L3、B-2-d-L4、B-2-d-L5、B-2-d-L6；洗脱部位B-2-d-L3经半制备HPLC纯化，用体积比为13:87的乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）洗脱，收集主峰，得到该化合物。
其余与实施例1相同。
实施例3
本实施例提供了一种从鸦胆子中提取分离的化合物，所述化合物的制备方法为：
（a）取鸦胆子药材，粉碎，将鸦胆子药材置于容器中，加入石油醚，石油醚的加入量为鸦胆子药材质量的6倍，脱脂3次，脱脂温度45℃，每次脱脂时间12 h，过滤，得脱脂鸦胆子药材；
（b）待脱脂鸦胆子药材挥干石油醚后，加入95%乙醇，乙醇溶液加入量与脱脂鸦胆子药材的体积比为10：1，在100℃回流提取3次，每次2 h，合并提取液，滤过，减压浓缩滤液，得提取物；
（c）按照0.92g/mL将提取物加甲醇溶解，然后加入200目硅胶拌样，上样于5kg200目硅胶柱，硅胶与提取物的质量比为1： 0.92，依次用体积比为100:1、20:1、2:1、0:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，共得4个馏分A、B、C、D；
（d）将馏分B上样于HP-20大孔吸附树脂柱进行柱层析，馏分B与大孔吸附树脂的体积比为1：22，依次用体积比为30%、50%、70%、95%的甲醇-水梯度洗脱，获得70%甲醇洗脱物；取70%甲醇洗脱物经硅胶柱层析，70%甲醇洗脱物与硅胶的体积比为1：32，依次用体积比为100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1、0:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，得8个馏分B-2-a、B-2-b、B-2-c、B-2-d、B-2-e、B-2-f、B-2-g、B-2-h；馏分B-2-d经Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离，用纯甲醇进行洗脱，TLC检识后，得6个洗脱部位B-2-d-L1、B-2-d-L2、B-2-d-L3、B-2-d-L4、B-2-d-L5、B-2-d-L6；洗脱部位B-2-d-L3经半制备HPLC纯化，用体积比为13:87的乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）洗脱，收集主峰，得到该化合物。
其余与实施例1相同。
本发明实施例1-3制备的化合物为黄色无定型粉末。现以实施例1制备的化合物为例，进行相关化合物分析。
一、化合物的结构鉴定
对实施例1得到的化合物进行分析，高分辨质谱给出准分子离子峰m/z 407.1241[M + H]+，（计算值407.1253），结合1H NMR、13C NMR及HRESIMS确定该化合物的分子式为C22H18N2O6。1H NMR （600 MHz，DMSO-d 6 ）显示有1个甲氧基氢信号δ H3.7（3H，s，H-12），1个酰胺基氢信号δ H10.17（1H，s，H-1），1个次甲基氢信号δ H3.9（1H，s，H-3）；4个亚甲基氢信号δ H[6.6，6.7，6.8，7.1]。 13C NMR （150MHz，DMSO-d 6 ）显示该化合物有11个特征碳信号，其中，1个甲氧基碳信号δ C 52.6，1组苯环碳信号[δ C115.1，129.3，129.3，121.4，115.3和138.5]，1个酰胺基碳信号δ C 163.9，1个酯羰基碳信号δ C171.8。这些特征信号表明该化合物与结构2-羟基喹啉-4-羧酸甲酯非常相似，但是，通过核磁数据比对发现δ C41.9（C-3）与δ C57.3（C-4）明显向高场区移动，说明双键断开，且HRESIMS分析发现该化合物中有22个碳信号，推测该化合物为2个2-羟基喹啉-4-羧酸甲酯3，4位对称连接而成。另外HMBC谱显示δ H3.9（H-3）与δ C57.3（C-4'），171.8（C-11），163.9（C-2）相关；δ H3.7（H-12）与δ C 171.8（C-11）相关。通过X单晶衍射法确定该化合物为中心对称结构，且通过C-3与C-4'，C4与C-3'相连而成。综上，确定了该化合物的结构，并命名为Bi-4-Methoxycarbonyl-2-quinolone。表1为该化合物的1HNMR与13C NMR数据，表2为化合物的X单晶衍射数据。具体图谱见图3-11。
表1：本发明化合物Bi-4-Methoxycarbonyl-2-quinolone的1H NMR （600 MHz，DMSO-d 6 ）和 13C NMR （150MHz，DMSO-d 6 ）数据
表2：本发明化合物Bi-4-Methoxycarbonyl-2-quinolone的X单晶衍射数据
二、化合物的抗炎活性测试
采用CCK-8法测定实施例1制备的化合物Bi-4-Methoxycarbonyl-2-quinolone对RAW264.7的细胞毒性。取对数生长期的RAW264.7细胞接种于96孔板中（1×104个细胞/孔），37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h，弃去上清，将含有不同浓度化合物的1640纯培养基100 μL/孔加入96孔板中，另在正常细胞对照组中加入不含药物的1640纯培养基，每组6个副孔。37 ℃、5% CO2培养箱培养24 h，弃上清，加入含10% CCK-8的纯培养基溶液，每孔100 μL，酶标仪450 nm处测定吸光度（OD值），计算其IC50。
采用Griess试剂法测定化合物Bi-4-Methoxycarbonyl-2-quinolone的抗炎活性。将RAW264.7细胞接种于96孔板中（5×104个细胞/孔），37 ℃、5% CO2条件下培养24 h，弃去旧培养基，给药组和阳性药组（地塞米松）每孔加入100 μL含药1640培养基，模型组每孔加入100 μL 1640纯培养基，空白组每孔加入200 μL 1640纯培养基，培养1 h后，除空白对照组外，其余各组每孔加入100 μL的LPS（2 μg/mL）溶液，继续培养24 h，24 h后，每孔吸取100μL上清液于新的96孔板中，加入Griess Ⅰ液50 μL，置于培养箱中培养10 min，取出，再加入Griess Ⅱ液50 μl，培养箱中10 min，取出，摇床振摇5 min，用酶标仪在550 nm处测其OD值，计算NO水平。
实验结果显示，本发明化合物对RAW264.7的IC50值为18.30 μM，如图12所示。其在10 μM浓度条件下可显著抑制LPS诱导的RAW264.7产生NO的水平，如图13所示。
三、化合物的抗肿瘤活性测试
取人肝癌HepG-2细胞和小鼠肺癌Lewis细胞，用含10%胎牛血清的1640完全培养基，于37℃，5%CO2培养箱中培养传代。取对数生长期的HepG-2和Lewis细胞接种于96孔板，每孔约5×103个细胞，随机分成对照组、给药组（实施例1制备的化合物Bi-4-Methoxycarbonyl-2-quinolone用DMSO配制成100 mM的母液，用完全培养液稀释，终浓度分别为100 μM、50 μM、25 μM、12.5 μM、6.25 μM、3.125 μM），每组设5个复孔，放置于37℃，5%CO2培养箱中培养。作用24 h后，弃上清，加入含10% CCK-8的纯培养基溶液，每孔100 μL，酶标仪450 nm处测定吸光度（OD值），计算其IC50值。
实验结果显示本发明化合物对HepG-2和Lewis细胞有抑制作用，其IC50值分别为4.567μM和20.83 μM，如图14、15所示。说明Bi-4-Methoxycarbonyl-2-quinolone对上述两种肿瘤细胞具有较强的抑制作用，可用于制备抗癌药物。
最后应说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种从鸦胆子中提取分离的化合物，其特征在于：所述化合物的分子式为C22H18N2O6，其化学结构式如下：
2.根据权利要求1所述的从鸦胆子中提取分离的化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（a）将鸦胆子种子粉碎，采用石油醚脱脂2-3次，过滤，得脱脂鸦胆子药材；
（b）待脱脂鸦胆子药材挥干石油醚后，加入乙醇溶液回流提取2-3次，每次1.5-2 h，合并提取液，过滤，减压浓缩滤液，得提取物；
（c）将提取物加甲醇溶解，然后加入硅胶拌样，上样于硅胶柱，用体积比为100:1、20:1、2:1、0:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，共得4个馏分A、B、C、D；
（d）将馏分B进行色谱分离纯化，得到所述化合物。
3.根据权利要求2所述的从鸦胆子中提取分离的化合物的制备方法，其特征在于：步骤（d）所述馏分B进行色谱分离纯化的步骤具体为：
（1）将馏分B上样于HP-20大孔吸附树脂柱进行柱层析，用体积比为30%、50%、70%、95%的甲醇-水梯度洗脱，获得70%甲醇洗脱物；
（2）取70%甲醇洗脱物进行硅胶柱层析，用体积比为100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1、0:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，共得8个馏分B-2-a、B-2-b、B-2-c、B-2-d、B-2-e、B-2-f、B-2-g、B-2-h；
（3）取馏分B-2-d进行Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离，用纯甲醇进行洗脱，洗脱液经TLC检识后，得6个洗脱部位B-2-d-L1、B-2-d-L2、B-2-d-L3、B-2-d-L4、B-2-d-L5、B-2-d-L6；
（4）取凝胶柱色谱洗脱部位B-2-d-L3经半制备HPLC纯化，体积比为13:87的乙腈-0.1%甲酸水溶液洗脱，从洗脱液中收集主峰得到纯的化合物。
4.根据权利要求2所述的从鸦胆子中提取分离的化合物的制备方法，其特征在于：步骤（a）中，石油醚的加入量为鸦胆子种子质量的4-6倍，脱脂温度35-45℃，每次脱脂时间10-12h。
5.根据权利要求2所述的从鸦胆子中提取分离的化合物的制备方法，其特征在于：步骤（b）中，乙醇溶液的浓度为90-95%，乙醇溶液加入量与脱脂鸦胆子药材的体积比为（8-10）：1，提取温度为98-100℃。
6.根据权利要求2所述的从鸦胆子中提取分离的化合物的制备方法，其特征在于：步骤（c）中，提取物按照0.88-0.92g/mL加甲醇进行溶解，所述硅胶为100-200目，所述硅胶与提取物的质量比为1：（0.9-0.92），所述硅胶柱为5kg100-200目硅胶柱。
7.根据权利要求3所述的从鸦胆子中提取分离的化合物的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，馏分B与大孔吸附树脂的体积比为1：（18-22），步骤（2）中，70%甲醇洗脱物与硅胶的体积比为1：（28-32）。
8.根据权利要求3所述的从鸦胆子中提取分离的化合物的制备方法，其特征在于：步骤（3）中Sephadex LH-20凝胶柱的色谱条件为：色谱柱尺寸1200*30 mm，粒径10 μm，流速2ml/min。
9.根据权利要求3所述的从鸦胆子中提取分离的化合物的制备方法，其特征在于：步骤（4）中半制备HPLC的色谱条件为：C18色谱柱，色谱柱尺寸180*5 mm，粒径5 μm，流速0.8 ml/min。
10.如权利要求1所述的化合物在制备抗炎、抗肿瘤药物中的应用。
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