CN106491670A - 一种鸦胆子提取物、提取方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种鸦胆子提取物、提取方法及应用，属于天然药物技术领域。鸦胆子提取物是由鸦胆子经过石油醚脱酯之后，再由乙酸乙酯或者氯仿提取而得到。提取方法，包括如下步骤：第1步，取鸦胆子粉碎，加石油醚浸泡，过滤后面得到鸦胆子药渣；第2步，将第1步得到的鸦胆子药渣采用乙醇提取之后，将提取液浓缩成稠膏，再将稠膏依次采用石油醚、乙酸乙酯、氯仿进行萃取，再收集萃取液进行减压蒸馏除溶剂、干燥后，得到提取物。采用秀丽隐杆线虫检测各有效部位急性毒性及抗肿瘤活性，鸦胆子提取物对于Ras基因具有明显的抑制调节作用，乙酸乙酯和者氯仿不同程度地提高了线虫的野生型比例。

Description

一种鸦胆子提取物、提取方法及应用

技术领域

本发明涉及一种鸦胆子提取物、提取方法及应用，属于天然药物技术领域。

背景技术

鸦胆子，为苦木科鸦胆子属植物Bruceajavanica(L.)Merr的干燥成熟果实，又名老鸦胆、苦参子、小苦楝等。作为中药，味苦，性寒，有小毒。主要有清热解毒，燥湿杀虫，止痢截疟的功效。到目前为止，从鸦胆子中分离鉴定了苦木内酯及其苷类、类苦木素类、生物碱类、黄酮苷类等成分，且这些成分具有抗炎，抗菌，抗疟，抗肿瘤的作用。现代研究表明，苦木内酯类化合物鸦胆苦醇(brusalol)、鸦胆因D(bruceineD)、鸦胆子苷A(bruceosideA)为鸦胆子抗肿瘤的主要活性成分。鸦胆子苦醇对黑色素瘤L-1210及P-388等株有明显的抑制效果，鸦胆子苦苷A，B和鸦胆子素E，F均具明显的的抗腹水肿瘤及克256瘤的活性，鸦胆因D还具有抗炎、抗疟的作用^[1]。研究发现大约30％的人类肿瘤存在ras基因突变，且多种肿瘤均检测到p21ras过表达，表明ras基因突变和p21ras过表达确实与恶性肿瘤的发生有关。因此，开发能萃取阻断人类肿瘤中ras肿瘤基因活性的药物是众多研究人员广泛关注的问题^[2]。

因此，有必要提供一种对ras肿瘤基因活性抑制效率高的鸦胆子提取物。

发明内容

本发明的目的是：提供具有较高的抗肿瘤效果的鸦胆子提取物，以及它的提取方法，该提取物具有较高的抗肿瘤活性。

技术方案是：

一种鸦胆子提取物，它是由鸦胆子经过石油醚脱酯之后，再由乙酸乙酯或者氯仿提取而得到。

鸦胆子提取物的提取方法，包括如下步骤：

第1步，取鸦胆子粉碎，加石油醚浸泡，过滤后得到鸦胆子药渣；

第2步，将第1步得到的鸦胆子药渣采用乙醇提取之后，将提取液浓缩成稠膏，再将稠膏依次采用石油醚、乙酸乙酯、氯仿进行萃取，再收集萃取液进行减压蒸馏除溶剂、干燥后，得到提取物。

所述的第1步中，鸦胆子与石油醚的重量比是1：5～10，浸泡时间20～30h。

所述的第2步中，乙醇是指95v/v％的乙醇；提取温度50～70℃，提取时间1～3h，提取次数1～3次。

所述的第2步中，石油醚、乙酸乙酯、氯仿的重量分别是稠膏重量的20～25％。

所述的第2步中，氯仿萃取后得到的萃取液需要经过大孔吸附树脂进行吸附、洗脱处理。

鸦胆子提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。

所述的抗肿瘤药物，是指抑制原癌基因ras通路过度激活的抗肿瘤药物。

有益效果

本发明提供了一种鸦胆子提取物，它对于Ras基因具有明显的抑制调节作用，采用本发明提供的提取方法可以获得效果明确的提取物，提取过程方法简单、收率高、纯度高。

附图说明

图1是鸦胆苦醇标准曲线；

图2是氯仿萃取部位急性毒性试验死亡率曲线图；

图3是乙酸乙酯萃取部位急性毒性试验死亡率曲线图；

图4是萃取残余部位急性毒性试验死亡率曲线图；

图5是鸦胆子氯仿萃取部位药效实验萃取部位活性曲线；

图6是鸦胆子乙酸乙酯萃取部位药效实验萃取部位活性曲线；

图7是鸦胆子残余萃取部位药效实验萃取部位活性曲线。

具体实施方式

1 仪器、试剂及实验材料

1.1 仪器

GFL3033型气浴恒温摇床；B2型生物安全柜；Biofuge fresco型低温高速离心机；BX51-32H01型系统显微镜；SMZ180型系统显微镜；倒置显微镜，日本奥林巴斯公司；THZ-82摇床，金坛市恒丰仪器厂；GR60DR型灭菌锅，厦门仪器厂；101-1型电热鼓风干燥箱；HH-S6型水浴锅；浮游生物计数板，北京普利特仪器有限公司；SQP型电子天平，北京赛多利斯科学仪器有限公司；YK-400B型粉碎机；RE-52型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂。

1.2 试剂

石油醚(30℃-60℃)，购于天津市津东天正精细化学试剂厂；三氯甲烷，购于天津市百世化工有限公司；乙酸乙酯，购于天津市百世化工有限公司；无水乙醇，购于天津市百世化工有限公司；二甲基亚砜，购于上海中秦化学试剂有限公司。以上均为分析纯。

1.3 实验材料

药材：市售鸦胆子，购于兰州市黄河药材市场；

线虫：MT2124，基因型：let-60(n1046sd，gf)IV，购CGC(CaenothabditisGenetiesCenier)；

大肠杆菌：E.coli OP50，尿嘧啶渗漏突变株，作为秀丽隐杆线虫的食物，购于CGC(CaenothabditisGenetiesCenier)。

2.2 含量测定

2.2.1 仪器与试药

色谱仪为安捷伦Agilent 1260 Infinity液相色谱仪；DL--180型超声波清洗器，浙江象山县石蒲海天电子仪器厂；AF10O4N型电子分析天平，上海精密科学仪器有限公司；甲醇为色谱纯，天津市康科德科技有限公司；水为二次蒸馏水；鸦胆苦醇，批号：14907-98-3，北京世纪奥科生物技术有限公司。

2.2.2 色谱条件与系统适应性

色谱柱：安捷伦Z0RBAX ODS柱(4.6*250mm，5mm)；流动相：甲醇(A)-水(B)梯度洗脱，20％～60％A(0～7min)，60％～80％A(7～18min)，80％～20％A(18～22min)；流速：1.0mL·min-1；检测波长：277nm；柱温：25℃；进样量：20μL。

2.2.3 对照品溶液的制备

精密称取对照品鸦胆苦醇适量，加入甲醇，超声辅助溶解配置成质量浓度分别为0.04mg/ml、0.08mg/ml、0.16mg/ml、0.24mg/ml、0.40mg/ml的对照品溶液，备用。

2.2.4 供试品溶液的制备

分别精密称取氯仿部位粉末、乙酸乙酯部位粉末、残余部位粉末0.0511g、00502g、0.0514g，分别置25ml容量瓶中，加入甲醇，超声辅助溶解稀释至刻度，摇匀，经0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液备用。

2.2.5 线性关系考察

精密量取对照品溶液质量浓度为0.04mg/ml、0.08mg/ml、0.16mg/ml、0.24mg/ml、0.40mg/ml各20μL，按“2.2.2”方法进行HPLC分析，以对照品质量浓度为X横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线。然后根据标准曲线，计算待检样品中鸦胆苦醇的浓度。

2.2.6 精密度试验

按“2.2.4”方法，制备供试品溶液。在“2.2.2”色谱条件下，吸取同一供试品溶液20μL，重复进样6次。

2.2.7 稳定性试验

取“2.2.6”供试品溶液，经0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，进样20μL，分别在0、2、4、8、16、24h测定。

2.2.8 重复性试验

按2.2.4方法，同时制备3份样品，在“2.2.2”条色谱条件下测定峰面积。

2.2.9 加样回收率试验

精密称取已知鸦胆苦醇含量为3.68％的苦味浸膏0.2512g，置于25ml容量瓶中，加入甲醇，超声辅助溶解，并定容至刻度，摇匀，取溶液9份各0.5ml，分别置于编号为l～9的10ml容量瓶内，其中在1～3号中加入0.8ml的鸦胆苦醇对照溶液，4～6号瓶中加入l.0ml，7～9号中加入1.2ml，经0.45μm微孔滤膜过滤，然后再加入甲醇定容至刻度，摇匀。按“2.2.2”色谱条件进行测定，计算回收率。

2.2.10 样品含量测定

按“2.2.4”方法制备供试品溶液，在“2.2.2”色谱条件下进行测定。

实施例1

将市场上买来的鸦胆子放在干燥箱中80℃恒温干燥2h，干燥至恒重，待其冷却，用粉碎机粉碎，得鸦胆子粉，称取500g，按药粉：石油醚为1：6泡药24h，共两次泡药，合并滤液后常压回收石油醚，得鸦胆子油，放4℃冰箱保存。滤渣80℃烘干，冷却，得脱脂鸦胆子粉，备用。

脱脂鸦胆子粉与95％乙醇混合，脱脂鸦胆子粉：脱脂药粉的重量比为7：1，60℃回流提取2次，每次2h，将提取液减压浓缩至稠膏，再将稠膏采用依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，石油醚、乙酸乙酯、氯仿的重量分别是稠膏重量的20％，分别回收溶剂，再分别将石油醚提取部、氯仿提取部、乙酸乙酯提取部、萃余液分别干燥后面，得到各个部位对应的提取物。

苦味浸膏各萃取部位的得率

(注：生药：500g，脱脂鸦胆子粉：440g，苦味浸膏：30.4564g)

实施例2 含量测定及方法学验证

线性关系考察

鸦胆苦醇标准曲线见图1，其在0.04～0.40mg/ml质量浓度内与峰面积呈良好线性关系，回归方程为：Y＝5780.17411X+14.749765，r＝0.99909。

精密度试验

按“2.2.4”方法，制备供试品溶液。在“2.2.2”色谱条件下，吸取同一供试品溶液20L，重复进样6次。经计算RSD为0.58％，其RSD<2％，表明仪器的精密度良好。

稳定性试验

取“2.2.6”供试品溶液，经0.45m微孔滤膜过滤，取续滤液，进样20L，分别在0、2、4、8、16、24h测定。经计算RSD为0.4％，其RSD<2％，表明样品在24h内基本稳定。

重复性试验

按2.2.4方法，同时制备3份样品，在“2.2.2”条色谱条件下测定峰面积。经计算RSD为1.5％，其RSD<3％，表明该方法重复性良好。

加样回收率试验

鸦胆苦醇加样回收率(n＝9)

样品含量测定

仅在氯仿部位供试品溶液中含有鸦胆苦醇，在乙酸乙酯部位和萃取残余中未见鸦胆苦醇。经计算测得氯仿部位鸦胆苦醇的含量为5.917mg/g。

实施例3 鸦胆子萃取部位急性毒性实验

1.大肠杆菌OP50培养

从-80℃冰箱中取出冻存的OP50菌液，首先在LB固体培养基上用接种环划线，37℃培养过夜后，挑单克隆菌落接种到LB液体培养基里，放在摇床上，37℃，180rpm，培养过夜后，10000rpm，15min离心菌液，得到单一菌体，待用，可根据要求稀释处理。

2.线虫大量培养

在已制备好的NGM培养皿上用涂棒每板涂400L的OP50菌液，37℃培养过夜，冷却后将冻存在-80℃冰箱内的秀丽隐杆线虫MT2124取出，迅速解冻，铺于培养基上，在21℃培养箱中培养至成虫。

3.线虫同步化

将在培养皿中培养了5-6天的线虫用M液冲洗到5mL离心管中，静置，弃去上清后，剩下液体少许，加入裂解液，在涡旋仪上震荡约7min，使线虫充分裂解，3000rpm，离心3min后，弃去上清液，用M液冲洗，冲洗两次，弃去冲洗液后，得到线虫虫卵。加M液至1ml，在培养箱中放置48h后，线虫发育完全，基本全部达到Ll期。收集Ll期幼虫，备用。

4.药液制备

分别精密称定氯仿部位粉末、乙酸乙酯部位粉末、萃取残余粉末0.5g，用DMSO配制成质量浓度为250mg/ml的药液，超声辅助溶解，吸取200L用蒸馏水稀释10倍并超声，得到质量浓度为25mg/ml的混悬状母液，然后按一定的浓度梯度稀释，备用。

5.药板制作

在96孔板上加入80L的M液、20L线虫液以及100L的按一定浓度梯度稀释过的药液，混合均匀，然后设置相应的空白对照和阴性对照。

计算死亡率：将做好的药板放入恒温培养箱(20℃)培养，24h后用倒置显微镜观察线虫死亡情况，计算死亡比例。

图2～4分别是氯仿、乙酸乙酯和残余萃取部位急性毒性试验死亡率曲线图。

鸦胆子萃取部位极性毒性

由图2～4可以看出，鸦胆子中氯仿部位毒性较大，其拟合曲线见上表，经计算其半数致死浓度为1.74mg/ml。乙酸乙酯部位与残余毒性在一定范围内随着浓度增大，其毒性也增大，但是，并没有达到半数致死，因而鸦胆子中各个萃取部位的急性毒性大小为：氯仿部位>乙酸乙酯>萃取残余。

实施例4 鸦胆子萃取部位药效实验

1.大肠杆菌OP50培养

从-80℃冰箱中取出冻存的OP50菌液，首先在LB固体培养基上用接种环划线，37℃培养过夜后，挑单克隆菌落接种到LB液体培养基里，放在摇床上，37℃，180rpm，培养过夜后，10000rpm，15min离心菌液，得到单一菌体，待用，可根据要求稀释处理。

2.线虫大量培养

在已制备好的NGM培养皿上用涂棒每板涂400L的OP50菌液，37℃培养过夜，冷却后将冻存在-80℃冰箱内的秀丽隐杆线虫MT2124取出，迅速解冻，铺于培养基上，在21℃培养箱中培养至成虫。

3.线虫同步化

将在培养皿中培养了5-6天的线虫用M液冲洗到5mL离心管中，静置，弃去上清后，剩下液体少许，加入裂解液，在涡旋仪上震荡约7min，使线虫充分裂解，3000rpm，离心3min后，弃去上清液，用M液冲洗，冲洗两次，弃去冲洗液后，得到线虫虫卵。加M液至1ml，在培养箱中放置48h后，线虫发育完全，基本全部达到Ll期。收集Ll期幼虫，备用。

4.药液制备

分别精密称定氯仿部位粉末、乙酸乙酯部位粉末、萃取残余粉末0.5g，用DMSO配制成质量浓度为250mg/ml的药液，超声辅助溶解，吸取200L用蒸馏水稀释10倍并超声，得到质量浓度为25mg/ml的混悬状母液，然后按一定的浓度梯度稀释，再将药液经微孔滤膜过滤，然后按一定的浓度梯度稀释，备用。

5.药板制作

在96孔板上加入140μL的S基础液、20μL线虫液、20μL的OP50菌液以及20μL的按一定浓度梯度稀释过的药液，混合均匀，然后设置相应的空白对照和阴性对照。

所有的数据用平均数±标准差(x±SD)形式表示，采用单因素方差分析(ANOVA)进行统计分析，数据统计处理采用SPSS(v17.0)软件，图形的绘制采用Origin7.0软件。

图5-7分别是鸦胆子氯信、乙酸乙酯和残余萃取部位药效实验萃取部位活性曲线图。可以发现鸦胆子萃取部位中氯仿部位随着浓度的增大，其线虫野生型比例显著增大，且其在2-50μg/ml最为明显(p<0.01)，乙酸乙酯部位在100-500μg/ml时显现一定的抗肿瘤活性，然而，萃取残余几乎无抑制ras突变的抗肿瘤活性。在实验过程中，氯仿部位制备的药液对MT2124突变体的作用浓度分别为2-50μg/ml，多次实验证明，2μg/ml为起效浓度，当浓度达到50μg/ml时，线虫的生长发育严重受到阻碍。乙酸乙酯部位制备的药液虽然没有氯仿部位显著，但其在100-500μg/ml之间也有一定的药效。因此，鸦胆子各个萃取部位中，氯仿部位的抑制ras突变的抗肿瘤活性最大，乙酸乙酯次之，残余基本没有药效，结果显示氯仿部位制备的药液可显著增大线虫的野生型比例(P<0.01)，乙酸乙酯部位不是很明显，萃取残余几乎无抑制ras突变的抗肿瘤活性。因此，可以确定，鸦胆子氯仿部位、乙酸乙酯部位都具有抑制ras突变的抗肿瘤活性，且是多种物质成分共同作用的结果，这为鸦胆子作为抗肿瘤药物的开发研究提供了一定的理论依据。

实施例5 改进的提取方式

将市场上买来的鸦胆子放在干燥箱中80℃恒温干燥2h，干燥至恒重，待其冷却，用粉碎机粉碎，得鸦胆子粉，称取500g，按药粉：石油醚为1：6泡药24h，共两次泡药，合并滤液后常压回收石油醚，得鸦胆子油，放4℃冰箱保存。滤渣80℃烘干，冷却，得脱脂鸦胆子粉，备用。

脱脂鸦胆子粉与95％乙醇混合，脱脂鸦胆子粉：脱脂药粉的重量比为7：1，60℃回流提取2次，每次2h，将提取液减压浓缩至稠膏，再将稠膏采用依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，石油醚、乙酸乙酯、氯仿的重量分别是稠膏重量的20％。

将氯仿提取部所得萃取液再送入AB-8大孔吸附树脂进行吸附，再采用85v/v％的乙醇进行洗脱，洗脱液为处理后的氯仿提取部，将得到的萃取液分别减压蒸馏除溶剂后，再分别将石油醚提取部、氯仿提取部、乙酸乙酯提取部、萃余液分别干燥后面，得到各个部位对应的提取物。

依照上述方法进行急性毒性和药效试验，结果如下：

氯仿提取部的半数致死浓度为3.67mg/ml。

从上表中可以看出，通过改进的提取方式之后，可以提高氯仿提取物的半数致死浓度。

Claims (8)

1.一种鸦胆子提取物，其特征在于，它是由鸦胆子经过石油醚脱酯之后，再由乙酸乙酯或者氯仿提取而得到。

2.权利要求1所述的鸦胆子提取物的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：第1步，取鸦胆子粉碎，加石油醚浸泡，过滤后得到鸦胆子药渣；第2步，将第1步得到的鸦胆子药渣采用乙醇提取之后，将提取液浓缩成稠膏，再将稠膏依次采用石油醚、乙酸乙酯、氯仿进行萃取，再收集萃取液进行减压蒸馏除溶剂、干燥后，得到提取物。

3.根据权利要求2所述的鸦胆子提取物的提取方法，其特征在于，所述的第1步中，鸦胆子与石油醚的重量比是1：5～10，浸泡时间20～30h。

4.根据权利要求2所述的鸦胆子提取物的提取方法，其特征在于，所述的第2步中，乙醇是指95v/v%的乙醇；提取温度50～70℃，提取时间1～3h，提取次数1～3次。

5.根据权利要求2所述的鸦胆子提取物的提取方法，其特征在于，所述的第2步中，石油醚、乙酸乙酯、氯仿的重量分别是稠膏重量的20～25%。

6.根据权利要求2所述的鸦胆子提取物的提取方法，其特征在于，所述的第2步中，氯仿萃取后得到的萃取液需要经过大孔吸附树脂进行吸附、洗脱处理。

7.权利要求1所述的鸦胆子提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物，是指抑制原癌基因ras通路过度激活的抗肿瘤药物。