CN108403751B

CN108403751B - 瓜蒌皮中三萜皂苷的应用

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Publication number: CN108403751B
Application number: CN201810503634.7A
Authority: CN
Inventors: 陈德宇; 李慧; 李陈跟
Original assignee: Fuyang Normal University
Current assignee: Fuyang Normal University
Priority date: 2018-05-23
Filing date: 2018-05-23
Publication date: 2021-04-06
Anticipated expiration: 2038-05-23
Also published as: CN108403751A

Abstract

本发明涉及瓜蒌皮中三萜皂苷的应用。具体地，本发明提供了瓜蒌皮的三萜皂苷提取物在除脚气的药物中的应用。此外，本发明还提供了一种除脚气的药物，包括作为活性成分的瓜蒌皮的三萜皂苷提取物以及一种或多种药学上可接受的载体。本发明设计并验证了瓜蒌皮三萜皂苷提取物是否具有抗真菌的作用。由于引起脚气的真菌顽固且难除去，采用脚气菌的一种—红色毛癣菌设计了实验，结果显示三萜皂苷提取物具有较强的抗真菌的作用，并且抑菌率约在48.31％，由此可知瓜蒌皮可以作为除脚气的药物的有效成分。

Description

瓜蒌皮中三萜皂苷的应用

技术领域

本发明涉及药物化学领域，更具体地，涉及瓜蒌皮中三萜皂苷的应用。

背景技术

栝楼属于葫芦科，是一种传统藤状草本植物。它的顶端的花柱托为圆形，尾部稍尖，成熟的瓜蒌表皮为橙黄色。果实较脆，因此很容易破开，果皮的内表面是乳黄色，果瓤的黄色更深，其中多数种子包裹行成团状，且种子占比较大。

瓜蒌皮为栝楼的干燥成熟的果皮，是为临床普遍使用的一味中药，具有多种药理活性，药理作用包括抑制炎症、抗癌、抗肺纤维化等。目前对瓜蒌皮的药用多在清热化痰、散结润燥、辅助顺气上。该属植物中含有大量的三萜类化学物，其中化学式结构主要以四环三萜化合物和五环三萜化合物为主。瓜蒌中含有丰富的以羊毛甾烷型为主的四环三萜化合物和以齐墩果酸型为主的五环三萜类化合物。测定主成分齐墩果酸的含量可以作为控制总三萜皂苷提取物质量的有效方法之一。

三萜皂苷在中药中分布广泛，因具有降血脂、降血压、抗癌、抗肿瘤等多种生物活性而受到学者的重视。但是对瓜蒌尤其是瓜蒌皮上三萜皂苷的研究不多，具体瓜蒌皮中三萜皂苷的含量和生物学功能等研究更是缺乏。

脚气在一定程度上严重影响到人们的生活质量，并且强传染性强，容易被传染却不容易治愈，而引起脚气的主要菌——红色毛癣菌，因此研究探讨瓜蒌皮提取液的抗脚气菌作用具有很大的现实意义。

发明内容

本发明的研究表明，瓜蒌皮三萜皂苷提取液具有较强的抑制红色毛癣菌的作用，可以作为除脚气的药物的有效成分。

本发明提供了瓜蒌皮的三萜皂苷提取物在除脚气的药物中的应用。

本发明还提供了一种除脚气的药物，包括作为活性成分的瓜蒌皮的三萜皂苷提取物以及一种或多种药学上可接受的载体。

在上述除脚气的药物中，其中，所述载体包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂和增效剂中的一种或多种。

在上述除脚气的药物中，其中，所述药物用于抑制和除去红色毛癣菌引起的脚气。

在上述除脚气的药物中，其中，所述药物的剂型为注射剂、片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂或乳剂。

本发明设计并验证了瓜蒌皮三萜皂苷提取物是否具有抗真菌的作用。由于引起脚气的真菌顽固且难除去，采用脚气菌的一种—红色毛癣菌设计了实验，结果显示三萜皂苷提取物具有较强的抗真菌的作用，并且抑菌率约在48.31％，由此可知瓜蒌皮可以作为除脚气的药物的有效成分。

附图说明

图1示出了齐墩果酸的标准曲线图。

图2示出了红色毛癣菌在培养基上的正面(左)和背面(右)培养图。

图3示出了瓜蒌提取液的抑菌作用检测结果，其中左边为对照组，右边为实验组。

图4示出了瓜蒌皮三萜皂苷提取液对DPPH自由基的清除能力的图。

具体实施方式

下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

1实验材料和试剂

1.1实验仪器

菌种：红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)上海北诺生物科技有限公司

菌种编号：BNCC 40195

100mm培养皿、5mm打孔器、0.2μm过滤除菌器

2.1试验方法

2.2三萜皂苷提取溶液的制备

精密称取瓜蒌皮干燥粉40g过40目筛，根据陈颖等人(陈颖，孙海燕.正交实验优选天花粉总皂苷的提取工艺[J].时珍国医国药，2011，22(7):1668-1669)对天花粉中三萜皂苷的提取方法。即得到瓜蒌皮总三萜皂苷浸膏，并用一定量无水乙醇定容。

2.3标准曲线的绘制

准确称取5mg齐墩果酸(OA)标准品,用无水乙醇将其定容，配成OA标准品溶液，浓度为0.08mg/mL。依次精密吸取OA溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL分置于10mL的试管中，水浴蒸干溶剂，加入新配置的显色剂进行显色反应(陈颖，孙海燕.正交实验优选天花粉总皂苷的提取工艺[J].时珍国医国药，2011，22(7):1668-1669)。在550nm处由实验测定吸光度。以吸光度为Y轴，标准品OA的质量浓度为X轴，制作标准曲线。

2.4抗真菌实验

2.4.1培养基制备

综合PDA培养基(马铃薯煮汁1000mL+维生素B1 10mg+葡萄糖20g+琼脂20g+磷酸二氢钾3g+pH自然+硫酸镁1.5g)。

马铃薯煮汁：将洗净处理后的马铃薯，于蒸馏水中，煮沸半小时，过滤得滤液，并定容一定体积，备用。121℃下高压灭菌15min。

2.4.2抑菌实验

菌丝抑制生长法：吸取200μL经过0.2μm过滤除菌器的无菌瓜蒌提取液(c＝24.86mg/mL)，均匀涂布于PDA平板上，用直径为5mm的打孔器分别在红色毛癣菌边缘等距位置打成大小一致的菌碟，挑取菌碟，分别接种到PDA平板中心，对照组方法相同。将红色毛癣菌接种到涂布有200μL无菌水的PDA平板中心，每组3个重复，于28℃恒温培养7天。分别测量对照和处理的病原菌半径，并计算抑菌率。

计算：抑菌率＝[菌落半径(CK)-菌落半径(处理)]/[菌落半径(CK)-0.25mm]×100％

2.5抗氧化实验--DPPH自由基清除能力的测定

溶液1.0.1mmol/L DPPH乙醇溶液

精确称取0.0040g DPPH固体粉末，用适量乙醇进行溶解。并定容到100mL容量瓶中,避光保存备用。

溶液2.不同浓度的粗体液

设置6个浓度梯度，分别为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mg/mL。

溶液3：不同浓度的Vc(维生素C)溶液

设置6个浓度梯度，浓度梯度同粗提液。

实验分组：全部避光处理

样品组：2.0mL不同浓度的样品溶液(c＝24.86mg/mL)，2.0mL 0.1mmol/L DPPH乙醇溶液。

对照管：2.0mL不同浓度的样品溶液，2.0mL 95％乙醇。

空白管：2.0mL纯水，2.0mL的0.1mmol/L DPPH乙醇溶液。

避光反应30min,用2.0mL纯水和2.0mL 95％乙醇溶液进行调零，在400-600nm波长下进行扫描，确定最佳测定波长，并测定在此最佳波长下处的吸光度Abs。

重复以上实验三次，用Vc作阳性对照，实验分组如上，设置并进行三组平行实验，结果取平均值。

计算：DPPH自由基清除率(％)＝(A空白-(A样品-A对照))/A空白*100

2.6数据分析

根据标准品吸光度值，进行线性回归分析，并采用Excel绘制拟合曲线，采用SPSS软件进行数理统计分析。

3.1结果与讨论

3.1.2最大吸收波长的确定

按照操作2.3方法制备一定浓度标准品OA的混合溶液，移液枪取样后，用酶标仪在200-700nm波长范围内扫描，确定最大吸收波长是550nm，确定采用选择该波长作为测定波长来扫描。

3.1.3标准曲线的绘制

分别移取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL标准品溶液按照2.3的方法在550nm下测定吸光值。结果以标准品浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。经计算得回归方程为y＝0.2921x-0.0146，R²＝0.9959。

表明吸光度和齐墩果酸的含量在8～48μg范围内呈现良好的线性关系，具体如图1所示。

3.1.4样品溶液的测定

精密吸取0.5mL的三萜皂苷提取液，按照2.3的方法测定吸光度，根据标准曲线计算瓜蒌皮中总皂苷含量。

总皂苷含量计算总皂苷(％)＝测得瓜蒌皮皂苷含量/瓜蒌皮粉量*100％，测定总三萜皂苷含量为2.62％。

3.1.5精密度实验

准确吸取5份OA标准品溶液0.2mL,按照2.3的方法，测定其吸光度值分别为0.104、0.133、0.106、0.105、0.104，由此计算得到RSD为0.12％。说明此法测定瓜蒌皮中总三萜皂苷的精密度较高。

3.1.6重复性实验

准确称取样品溶液5份，每份取0.5mL,按照2.3的方法测定齐墩果酸的吸光度分别为0.638、0.640、0.636、0.640、0.634，计算得RSD为0.41％。说明该法测定瓜蒌皮中总三萜皂甙含量的重复性较好。

3.1.7回收率实验

准确吸取已知总三萜皂苷浓度为4.19mg/mL的样品溶液共3份，每份取10μL，分别精密加入OA标准品50、100、150、200、250μg，测定结果并计算回收率及RSD，结果如下表1所示。

表1

3.1.8抑菌实验

抑菌实验结果如图2-3所示，由图3可知，瓜蒌皮总三萜皂苷提取液对供试的脚气菌——红色毛癣菌有较强的抑制作用，抑制率约在48.31％,实验组和对照组的差异具有统计学意义(P<0.01)。表2示出了瓜蒌总三萜皂苷提取液的抑菌率。

表2

3.1.9抗氧化实验

如图4，系列1为三萜皂苷提取液，系列2为维生素C溶液。在所测得浓度范围内，三萜皂苷提取液和维生素C对自由基的清除率有一定正比关系，即是随着浓度的增加而增加，以维生素C作为阳性对照，可见三萜皂苷提取液具有一定的自由基清除能力。其中维生素C对照组与实验组之间P<0.05，空白组和实验组间P<0.001。

本发明采用分光度计测定了瓜蒌皮中总三萜皂苷的含量，该方法使用操作简便，可以精准快速地测定目标成分的含量。分光光度计测定时，采用5％的香草醛-高氯酸试剂进行比色，试剂对分析样品的测定干扰小，显色灵敏度高。并由精密度和重复性实验得出，精密度中RSD＝0.12％,可知试验精密度高，回收率中RSD为0.41％，证明重复性也良好。可见该方法完全可用于瓜蒌皮中三萜皂苷含量的测定。

瓜蒌皮购于安徽亳州，烘干打碎过筛，由于齐墩果酸型皂苷易溶于有机溶剂，难溶解在水中，因此采用乙醇热浸提，以及超声波辅助提取。采用水和石油醚除去了一部分水溶性和脂溶性物质，再经正丁醇反复萃取，蒸干回收正丁醇，得浸膏定容到乙醇中，即得到三萜皂苷提取液，含量测定得知为2.619％，与之前报道相关瓜蒌根制得的天花粉中总皂苷含量分析得到的结果1.223％对比，瓜蒌皮中三萜皂苷的含量相对于天花粉更高。

瓜蒌皮中所含的总三萜皂苷主要有齐墩果酸型，因此测定主要成分齐墩果酸的含量可以作为瓜蒌皮中总三萜皂苷的含量测定。本发明设计并验证了瓜蒌皮三萜皂苷提取液中是否具有抗真菌的作用。由于引起脚气的真菌顽固且难除去，采用脚气菌的一种—红色毛癣菌设计了实验，结果显示提取液具有较强的抗真菌的作用，并且抑菌率约在48.31％，由此可知瓜蒌皮可以作为除脚气的药物的有效成分之一。

近年来，关于瓜蒌皮抗氧化作用的研究多集中在多糖提取和瓜蒌籽油上，本发明设计抗氧化实验，结果发现三萜皂苷的提取液具有较强的DPPH自由基清除能力，并采用抗坏血酸和空白组进行对照，统计得知P值分别为P<0.05和P<0.001，由此可知提取液和维生素C在自由基清除率上两组差别无显著意义，空白对照组和提取液在清除率效果上具有极其显著差异。由此得到，瓜蒌皮三萜皂苷提取液具有较强的抗氧化作用，也在DPPH自由基清除能力上和维生素C接近，可以成为一种有效的抗氧化物质。

本领域技术人员应理解，以上实施例仅是示例性实施例，在不背离本申请的精神和范围的情况下，可以进行多种变化、替换以及改变。

Claims

1.一种通过抑制和除去红色毛癣菌来除脚气的药物，由作为活性成分的瓜蒌皮的三萜皂苷提取物以及一种或多种药学上可接受的载体组成。

2.根据权利要求1所述的除脚气的药物，其特征在于，所述载体包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂和增效剂中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的除脚气的药物，其特征在于，所述药物的剂型为乳剂。