CN104083688B - 姜叶三七及其提取物在制备治疗和/或预防肝癌药物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及姜叶三七、姜叶三七提取物、姜叶三七脂溶性提取物及姜叶三七挥发油组合物的新用途，即在制备治疗和/或预防肝癌药物方面的新用途。
Description
技术领域
本发明涉及姜叶三七、姜叶三七提取物、姜叶三七脂溶性提取物及姜叶三七挥发油的新用途，即在制备治疗和/或预防肝癌药物方面的新用途。
背景技术
肝癌是指发生于肝脏的恶性肿瘤，包括原发性肝癌和转移性肝癌两种，人们日常说的肝癌指的多是原发性肝癌。原发性肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，根据最新统计，全世界每年新发肝癌患者约六十万，居恶性肿瘤的第五位。原发性肝癌按细胞分型可分为肝细胞型肝癌、胆管细胞型肝癌及混合型肝癌。
大量的研究证实，肿瘤是一类细胞周期疾病，肿瘤的特征之一是细胞周期异常，使肿瘤细胞无限增殖，细胞周期的任何一个时相的生物合成被阻断，都可使细胞周期的连续性中断，肿瘤治疗的中心环节就是阻断肿瘤细胞的细胞周期，诱导细胞凋亡。
细胞凋亡发生于所有的肿瘤组织中，与肿瘤的发生、发展及转移密切相关。化疗药物主要通过诱导癌细胞凋亡达到治疗效果，因此，诱导肿瘤细胞凋亡成为研究肿瘤治疗的热点。
细胞凋亡的特征是细胞体积缩小，随即与邻近的细胞的连接丧失，彼此脱离，失去微绒毛，胞浆浓缩，内质网扩张呈泡状并与细胞膜融合，线粒体无大的变化，核染色质浓缩呈半月形，染色质凝聚靠近于核膜周边，核仁裂解，进而细胞膜内陷，形成凋亡小体，细胞凋亡的过程不导致溶酶体破裂，没有细胞内涵物外泄，故不引起炎症反应和次级损伤，Ca2+/Mg2+依赖核酸内切酶活性增高，使DNA降解，DNA电泳表现为梯状，目前这些变化已成为判断细胞凋亡的重要指标。但是并非意味核酸内切酶的激活是细胞凋亡过程中所必需的，在有些细胞凋亡中不一定出现DNA电泳呈梯状。
细胞凋亡的发生是否需要新的RNA和蛋白质的主动合成，取决于细胞类型和诱导凋亡的因素，或许某些信号途径需要新基因的表达，而有些不需要。也有报道凋亡细胞没有DNA降解，提示DNA降解并非细胞凋亡过程中必不可少。细胞凋亡是一个非常复杂的生理和病理过程，机体内、外多种因素可影响细胞凋亡的发生，并明显受到分子遗传学影响。不同的肿瘤细胞对不同药物、或相同药物的不同浓度敏感性不同，可以激活一种肿瘤细胞凋亡作用的物质，可能对另一种肿瘤细胞无效。比如紫杉醇主要适用于卵巢癌和乳腺癌，对肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤也都有一定疗效。而治其他的癌症则效果不佳。总之，细胞凋亡的分子机制尚不清楚，有待于深入研究。
姜叶三七为姜科植物姜叶三七Stahlianthus involucratus(King ex Bak.)Craib的根状茎及块根。具清热，利湿，止痛，解毒，止血之功效，用于淋浊，胃痛，口疮，痔疮，溃疡，跌打损伤，蛇咬伤，外伤出血等症，为广西特色中药材。
“我国姜科药用植物研究Ⅵ姜三七挥发油化学成分分析”(发表于《色谱》1984年第1卷第1期)，用气液色谱和气液色谱-质谱法对姜三七挥发油各成分进行分享和鉴定，鉴定出二氢姜三七酮、α-蒎烯、茨烯、β-蒎烯、蒈烯、柠檬烯、桉叶素、芳樟醇、樟脑、α-胡椒烯、反-丁香烯、香树烯、γ-衣兰油烯、杜松烯、姜三七醌等15种成分。
申请号为CN200510098945.2“一种姜叶三七的外用药”，公开了由姜叶三七、钻石风、倒生莲、滇崖爬藤、五角枫根、无腺磷木、络石藤、乙醇组成的一种外用药，对风湿关节痛、跌打瘀痛、跌打损伤、外伤出血、关节疼痛、筋骨扭伤疼痛、筋骨疼痛、瘀肿疼痛、腰膝疼痛、关节酸痛、外伤瘀痛、软组织挫伤疗效确切，疗程更短，效果更佳。
此外，公开号为CN1814229的专利申请“一种土千年健祛湿镇痛药酒”、公开号为CN1742972的专利申请“一种四叶细辛外用药”、公开号为CN1814230的专利申请“一种山野豌豆活络镇痛药”、公开号为CN1814228的专利申请“一种矮人陀活络伤湿止痛膏”、公开号为CN101766729的专利申请“祛湿止痛液及穴敷治疗方法”均提及姜叶三七或土田七在跌打损伤或风湿疾病方面的治疗效果。
在现有公开文献中，或提到姜叶三七的挥发油成分，或提到姜叶三七治疗跌打损伤等疾病的效果，但未见公开使用姜叶三七、姜叶三七提取物、姜叶三七脂溶性提取物及姜叶三七挥发油用于治疗肿瘤、各种癌症的效果，尚未有人公开姜叶三七可用于治疗肝癌，亦没有报道公开姜叶三七对肝癌细胞周期、增殖或凋亡的影响。
发明内容
本发明的目的是提供姜叶三七植物在制备治疗和/或预防肝癌药物的应用；
本发明的目的是提供姜叶三七提取物在制备治疗和/或预防肝癌药物的应用；
本发明的目的是提供姜叶三七挥发油提取物在制备治疗和/或预防肝癌药物的应用；
本发明的另一目的是提供姜叶三七挥发油的制备方法。
姜叶三七为姜科植物姜叶三七Stahlianthus involucratus(King ex Bak.)Craib的根状茎、块根。秋末冬初叶片枯黄后采挖，除去杂质，洗净，置沸水中稍烫，晒干。收载于《广西中药材标准》1990年版第8页。
姜叶三七的别名有三七姜、姜叶三七、土田七、竹叶三七、姜叶三七、鸡心七、红沙姜、尖三七、拖颠枪(壮族)、内消子、打不死等。
根据发明人对姜叶三七植物、姜叶三七提取物、姜叶三七脂溶性提取物以及姜叶三七挥发油进行临床研究和药效学研究，发现姜叶三七植物、姜叶三七提取物、姜叶三七脂溶性提取物以及姜叶三七挥发油能够通过抑制肝癌细胞增殖、影响肝癌细胞发生凋亡，以及影响肝癌细胞周期的改变，达到抗肿瘤活性、治疗肝癌的功效。
在此基础上，本发明人通过对姜叶三七挥发油的有效成分进行有目的提取及含量控制以后，使其用于治疗和/或预防癌症的效果更显著。姜叶三七挥发油与其他姜叶三七提取物相比，对肝癌细胞HepG2更具有显著的抑制作用，可有效抑制细胞周期的正常转换，使细胞在G1期堆积，细胞阻滞于G1期，从而阻止细胞的有丝分裂，使细胞增殖受到抑制。
本发明专利临床应用的安全性较高，在肝癌的药物治疗中不失为一种好药，其拓宽了中药制剂治疗肝癌的新方法，在不能开展介入治疗的基层医院尤为适用。
因此，申请人提供姜叶三七植物、姜叶三七提取物、姜叶三七脂溶性提取物、姜叶三七挥发油用于制备治疗和/或预防肝癌药物方面的新用途。
本发明公开了姜叶三七提取物在制备治疗和/或预防肝癌药物的应用，所述姜叶三七提取物的制备包括以下步骤：取姜叶三七根茎切碎，加水煎煮提取两次，第一次加入药材重量2-6倍量的水煎煮，沸腾后煮1-3小时，第二次加入药材重量1-4倍量的水煎煮1-3小时，过滤，混合两次煎煮液，浓缩至药材总重量的0.5-2倍，即得。
本发明公开了姜叶三七提取物在制备治疗和/或预防肝癌药物的应用，所述姜叶三七提取物的制备还包括以下步骤：取姜叶三七根茎切碎，加入乙醇回流提取2-3次，第一次加入2-6倍体积百分比为40-70％的乙醇，提取1-3小时，第二次加入1-4倍量体积百分比为40-70％的乙醇提取1-3小时，合并煎液，过滤，回收乙醇，制成干膏，即得。
本发明还公开了姜叶三七脂溶性成分提取物在制备治疗和/或预防肝癌药物的应用，所述姜叶三七脂溶性成分提取物的制备包括以下步骤：取姜叶三七根茎切碎，加石油醚回流提取2-3次，每次加入药材总重量3-5倍的石油醚，提取时间为1-3小时，合并提取液，过滤，回收石油醚，得姜叶三七脂溶性成分提取物。
本发明公开了姜叶三七脂溶性成分提取物在制备治疗和/或预防肝癌药物的应用，所述姜叶三七脂溶性成分提取物的制备还可以包括以下步骤：取姜叶三七根茎切碎，加乙酸乙酯回流提取2-3次，每次加入药材总重量3-5倍的乙酸乙酯，提取时间为1-3小时，合并提取液，过滤，回收乙酸乙酯，得姜叶三七脂溶性成分提取物。
本发明公开了姜叶三七脂溶性成分提取物在制备治疗和/或预防肝癌药物的应用，所述姜叶三七脂溶性成分提取物的制备还可以包括以下步骤：取姜叶三七根茎切碎，加水饱和正丁醇回流提取2-3次，每次加入药材总重量3-5倍的水饱和正丁醇，提取时间为1-3小时，合并提取液，过滤，回收水饱和正丁醇，得姜叶三七脂溶性成分提取物。
本发明公开了姜叶三七脂溶性成分提取物在制备治疗和/或预防肝癌药物的应用，所述姜叶三七脂溶性成分提取物的制备还可以包括以下步骤：取姜叶三七根茎切碎，加乙醇回流提取2-3次，每次加入药材总重量3-5倍、体积百分比为30-50％的乙醇，提取时间为1-3小时，合并提取液，过滤，回收乙醇，得浓缩液。
所述浓缩液加石油醚分3次萃取，每次石油醚用量为浓缩液体积的3-5倍，收集石油醚相，浓缩干燥，得到姜叶三七脂溶性成分提取物。
所述浓缩液加乙酸乙酯分3次萃取，每次乙酸乙酯用量为浓缩液体积的3-5倍，收集石油醚相，浓缩干燥，得到姜叶三七脂溶性成分提取物。
所述浓缩液加水饱和正丁醇分3次萃取，每次水饱和正丁醇用量为浓缩液体积的3-5倍，收集水饱和正丁醇相，浓缩干燥，得到姜叶三七脂溶性成分提取物。
本发明公开了姜叶三七挥发油组合物在制备治疗和/或预防肝癌药物的应用，所述姜叶三七挥发油中含有活性成份，该活性成份由姜叶三七提取的姜叶三七挥发油活性成份组成，其中包括单萜类化合物，单萜氧化物类化合物，倍半萜类化合物，倍半萜氧化物类化合物。
优选地，所述的姜叶三七挥发油活性成份包括：20-30重量份的3,6,7,8-四氢化-3,3,6,6-四甲基环戊二烯并[E]茚-1(2H)-酮，8-20重量份的莰烯；6-15重量份的1,7,7-三甲基-二环[2.2.1]庚-2-茨酮，2-8重量份的香树烯；1-6重量份的氧化石竹烯。
更优选地，所述的姜叶三七挥发油活性成份含量包括：24-28重量份的3,6,7,8-四氢化-3,3,6,6-四甲基环戊二烯并[E]茚-1(2H)-酮，11-15重量份的莰烯；8-12重量份的1,7,7-三甲基-二环[2.2.1]庚-2-茨酮，3-6重量份的香树烯；2-5重量份的氧化石竹烯。
申请人还提供了一种制备所述姜叶三七挥发油的方法，它包括如下步骤：
取姜叶三七粉碎成粗粉，加入药材总重量3-7倍的蒸馏水浸泡0.5-3小时，通过水蒸汽蒸馏提取3-6小时，收集上层精油，得姜叶三七挥发油。
优选地，姜叶三七挥发油的制备包括以下步骤：
取姜叶三七粉碎，加药材总重量5倍的蒸馏水浸泡1h，通过水蒸汽蒸馏提取4h，收集上层精油得姜叶三七挥发油组合物。
基于上述姜叶三七提取物、姜叶三七脂溶性提取物、姜叶三七挥发油，本发明的目的是提供以上组合物的一种新用途，即在制备治疗和/或预防肝癌药物的应用。它可以制成注射液、注射用粉针剂，注射用冻干粉针剂、片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、合剂、糖浆剂、胶囊剂、滴丸剂制剂，优选制成注射液、注射用冻干粉针剂。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
以下是本发明中药制剂的药材来源：
姜叶三七：姜科植物姜叶三七Stahlianthus involucratus(King ex Bak.)Craib的根状茎及块根。
本发明公开了姜叶三七在治疗肝癌中的新用途，姜叶三七原植物和常规工艺提取物对于治疗肝癌有一定的治疗效果，结果可见实验例1和实验例2，并且，姜叶三七毒性小，不会产生诸如化疗之类的强烈副作用。
姜叶三七的挥发油提取物具有更加出色的疗效，如实验例所示的细胞实验，其浓度在120μg/ml时，就已经具有了明显的活性，在12小时的时候对肝癌细胞的抑制率超过了对照药物组，即姜叶三七的挥发油抑制肿瘤活性的效力高于顺铂组，而其浓度在360μg/ml以上时，其杀灭癌细胞的活性更是能够超过90％。
附图说明
图1是姜叶三七挥发油对肝癌细胞株(HepG2)增殖抑制率线图
图2是姜叶三七挥发油对肝癌细胞株HepG2凋亡的形态变化
图3是姜叶三七挥发油对HepG2细胞周期的影响
图4是姜叶三七挥发油对肝癌细胞株(HepG2)早期凋亡Annexin V-PI双染色法荧光散点图
图5是姜叶三七挥发油对肝癌细胞株(HepG2)凋亡率条形图
具体实施方式
下面通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。除非另有说明，本发明中的百分数是重量百分数(乙醇为体积百分比)。
实施例1：姜叶三七挥发油
取新鲜姜叶三七150g粉碎成粗粉，加药材450ml的蒸馏水浸泡0.5h，通过水蒸汽蒸馏提取3h，收集上层精油，得姜叶三七挥发油1.7ml。
对所得姜叶三七挥发油进行检测，成分含量结果：3,6,7,8-四氢化-3,3,6,6-四甲基环戊二烯并[E]茚-1(2H)-酮为24％，莰烯为15％；1,7,7-三甲基-二环[2.2.1]庚-2-茨酮为12％，香树烯为3％；氧化石竹烯为2％。
实施例2：姜叶三七挥发油
取新鲜姜叶三七根茎150g粉碎，加750ml的蒸馏水浸泡1h，通过水蒸汽蒸馏提取4h，收集上层精油，得姜叶三七挥发油组合物2.2ml。
对所得姜叶三七挥发油进行检测，成分含量结果：3,6,7,8-四氢化-3,3,6,6-四甲基环戊二烯并[E]茚-1(2H)-酮为28％，莰烯为11％；1,7,7-三甲基-二环[2.2.1]庚-2-茨酮为8％，香树烯为6％；氧化石竹烯为5％。
实施例3：姜叶三七挥发油
取姜叶三七干燥根茎150g粉碎，加1050ml蒸馏水浸泡3h，通过水蒸汽蒸馏提取6h，收集上层精油，得姜叶三七挥发油组合物2.0ml。
对所得姜叶三七挥发油进行检测，成分含量结果：3,6,7,8-四氢化-3,3,6,6-四甲基环戊二烯并[E]茚-1(2H)-酮为30％，莰烯为20％；1,7,7-三甲基-二环[2.2.1]庚-2-茨酮为15％，香树烯为2％；氧化石竹烯为1％。
实施例4：姜叶三七脂溶性成分提取物
取姜叶三七根茎5000g切碎，加石油醚回流提取2次，第一次加入20000ml石油醚，提取2小时，第二次加入15000ml石油醚提取2小时，合并提取液，过滤，回收石油醚，得姜叶三七脂溶性成分提取物。
实施例5：姜叶三七脂溶性成分提取物
取姜叶三七根茎5000g切碎，加石油醚回流提取3次，第一次加入25000ml石油醚，提取3小时，第二次加入20000ml石油醚提取2小时，第三次加入15000ml石油醚提取时间为1小时，合并提取液，过滤，回收石油醚，得姜叶三七脂溶性成分提取物。
实施例6：姜叶三七脂溶性成分提取物
取姜叶三七根茎5000g切碎，加乙酸乙酯回流提取3次，第一次加入25000ml乙酸乙酯，提取3小时，第二次加入20000ml乙酸乙酯提取2小时，第三次加入15000ml乙酸乙酯，提取时间为1小时，合并提取液，过滤，回收乙酸乙酯，得姜叶三七脂溶性成分提取物。
实施例7：姜叶三七脂溶性成分提取物
取姜叶三七根茎5000g切碎，加水饱和正丁醇回流提取3次，第一次加入25000ml水饱和正丁醇，提取3小时，第二次加入20000ml水饱和正丁醇提取2小时，第三次加入15000ml水饱和正丁醇提提取时间为1小时，合并提取液，过滤，回收水饱和正丁醇，得姜叶三七脂溶性成分提取物。
实施例8：姜叶三七脂溶性成分提取物
取姜叶三七干燥根茎5000g切碎，加入乙醇回流提取2次，第一次加入25000ml体积百分比为40％的乙醇，提取3小时，第二次加入15000ml体积百分比为50％的乙醇提取2小时，合并提取液，过滤，回收乙醇，浓缩液加石油醚分3次萃取，每次石油醚用量分别为浓缩液体积的5倍、4倍、3倍，收集石油醚相，浓缩干燥，得到姜叶三七脂溶性成分提取物。
实施例9：姜叶三七脂溶性成分提取物
取姜叶三七干燥根茎5000g切碎，加入乙醇回流提取3次，第一次加入20000ml体积百分比为30％的乙醇，提取3小时，第二次加入15000ml体积百分比为40％的乙醇提取2小时，第三次加入10000ml体积百分比为50％的乙醇提取1小时，合并提取液，过滤，回收乙醇，浓缩液加乙酸乙酯分3次萃取，每次乙酸乙酯用量分别为浓缩液体积的5倍、4倍、3倍，收集乙酸乙酯相，浓缩干燥，得到姜叶三七脂溶性成分提取物。
实施例10：姜叶三七脂溶性成分提取物
取姜叶三七干燥根茎5000g切碎，加入乙醇回流提取3次，第一次加入20000ml体积百分比为30％的乙醇，提取3小时，第二次加入15000ml体积百分比为40％的乙醇提取2小时，第三次加入10000ml体积百分比为50％的乙醇提取1小时，合并提取液，过滤，回收乙醇，浓缩液加水饱和正丁醇分3次萃取，每次水饱和正丁醇用量分别为浓缩液体积的5倍、4倍、3倍，收集水饱和正丁醇相，浓缩干燥，得到姜叶三七脂溶性成分提取物。
实施例11：姜叶三七水提物
取新鲜姜叶三七根茎1000g切碎，第一次加6000ml煎煮，沸腾后保持3h，第二次加4000ml水煎煮提取1h。合并两次煎液，过滤，浓缩至2000ml，得姜叶三七水提物。
实施例12：姜叶三七脂溶性成分提取物
取新鲜姜叶三七根茎1000g切碎，加乙醇回流提取2次，第一次加入6倍体积百分比为70％的乙醇，提取3小时，第二次加入4倍量体积百分比为40％的乙醇提取1小时，合并煎液，过滤，回收乙醇，制成干膏，即得姜叶三七脂溶性成分提取物。
实施例13：姜叶三七挥发油注射液
将实施例1-3中的姜叶三七挥发油与葡萄糖、适量助溶剂、适量溶剂混合均匀，滤过，灭菌，制备得到注射液。
实施例14：姜叶三七挥发油冻干粉针剂
将实施例1-3中的姜叶三七挥发油与葡萄糖、适量助溶剂、适量溶剂混合均匀，灭菌，分装于安瓿或西林瓶等容器中，在无菌密闭环境中，低温下冻结，再通过降低环境气压，缓慢升高制品温度的方法使制品中的溶媒升华，留下固体形态的药物，即得本发明的冻干粉针。
实施例15：姜叶三七挥发油
取姜叶三七干燥根茎150g粉碎，加600ml蒸馏水浸泡2h，通过水蒸汽蒸馏提取5h，收集上层精油，得姜叶三七挥发油组合物1.9ml。
对所得姜叶三七挥发油进行检测，成分含量结果：3,6,7,8-四氢化-3,3,6,6-四甲基环戊二烯并[E]茚-1(2H)-酮为20％，莰烯为8％；1,7,7-三甲基-二环[2.2.1]庚-2-茨酮为6％，香树烯为8％；氧化石竹烯为6％。
药效实验
实验例1本发明对肝癌细胞增殖抑制作用
取实施例2、5、6、7、11、12中的姜叶三七挥发油组合物、石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、水饱和正丁醇提取物、水提物和乙醇提取物，用RPMI1640培养液将上述提取物进行稀释，0.22μm微孔滤器抽滤除菌，4℃保存备用。
以MTT法检测本发明对肝癌细胞增殖抑制作用。
1试样及实验药物
1.1肝癌细胞培养
人肝癌细胞(HepG2)用含10％胎牛血清及100μg/ml青霉素-链霉素的RPMI1640培养基，置37℃、5％CO2、饱和湿度条件下的恒温密闭培养箱中培养并传代。0.02EDTA-0.25％胰蛋白酶消化，每2～3d传代一次。
1.2实验药物
实验组：实施例2、5、6、7、11、12。
对比例药物：顺铂，生产厂家德州德药制药有限公司；批号：国药准字H37020524；浓度3μg/ml。
2MTT法检测姜叶三七提取物对肝癌细胞增殖抑制作用
表1本发明实施例和顺铂对肝癌细胞增殖的抑制率
实验结果显示：实施例2对肝癌细胞增殖抑制作用明显强于其他实施例组和顺铂组；各实施例组与顺铂组相比，对肝癌细胞增殖抑制作用有弱有强，但是均体现对肝癌细胞的增殖有抑制作用。由以上可得结论：
1、姜叶三七挥发油对肝癌细胞的增殖抑制作用明显优于姜叶三七经其他提取方法获得的提取物，以及明显优于顺铂。。
2、姜叶三七石油醚提取物、乙酸乙酯提取物对肝癌细胞的增殖抑制作用优于姜叶三七水饱和正丁醇提取物、姜叶三七水提物、姜叶三七乙醇提取物以及顺铂。
3、姜叶三七水提物、乙醇提取物以及水饱和正丁醇提取物对肝癌细胞的增殖抑制作用与顺铂组相比较差，但同样能显示出对肝癌细胞增殖有抑制作用。
实验例2姜叶三七挥发油体外抗肝癌肿瘤活性实验
1仪器与试药
1.1仪器挥发油测定器符合中国药典一部附录XD挥发油测定法的有关标准；Galaxy170S型CO2细胞培养箱(德国Eppendorf公司)，MLDEL680型酶标仪(日本BIO-RAD公司)，Axiovert-40型倒置相差显微镜(德国蔡司公司)，SW-CJ-2F型超净工作台(苏州净化设备有限公司)。
1.2试剂胎牛血清、RPMI1640培养基均购自美国hyclone公司；DMSO、四甲基偶氮唑蓝(MTT)均购自Sigma公司；乙醚等其他试剂均为国产分析纯。
1.3实验药物
实验组：实施例1，姜叶三七挥发油。
对比例药物：顺铂，生产厂家德州德药制药有限公司；批号：国药准字H37020524；浓度3μg/ml。
1.4供试肝癌细胞
人肝癌细胞(HepG2)由桂林医学院科学实验中心提供。
2方法与结果
2.1方法
2.1.1药物配制
用RPMI1640培养液将实施例1所得的挥发油提取物(20mg/mL)按1:10、1:13、1:20、1:40比例进行稀释，0.22μm微孔滤器抽滤除菌，4℃保存备用。
2.1.2实验分组：
A：空白对照组
B：120μg/ml姜叶三七挥发油组
C：240μg/ml姜叶三七挥发油组
D：360μg/ml姜叶三七挥发油组
E：480μg/ml姜叶三七挥发油组
2.1.3肿瘤细胞培养
人肝癌细胞(HepG2)用含10％胎牛血清及100μg/ml青霉素-链霉素的RPMI1640培养基，置37℃、5％CO2、饱和湿度条件下的恒温密闭培养箱中培养并传代。0.02EDTA-0.25％胰蛋白酶消化，每2～3d传代一次。
2.1.4MTT法检测本发明药物对肝癌细胞增殖抑制作用
将对数生长期的肝癌细胞按每孔4000个接种96孔培养板，37℃，5％CO2培养箱中培养12h，24h，36h，48h，60h待细胞贴壁后，将不同浓度姜叶三七挥发油分别加入细胞株已长成单层的96孔细胞培养板中，每个浓度重复5个复孔，同时设立两个对照组：一个为空白对照组(不加细胞)，一个为细胞对照组(加1640培养液，姜叶三七挥发油的浓度为0)。置于37℃、5％CO2培养箱内培养24h。培养结束前4h，吸弃培养板中液体，PBS冲洗3次，在避光条件下每孔加入MTT(5mg/ml)20μl，置于37℃，5％CO2培养箱中继续培养4h，去上清液后每孔加DMSO150μl，水平摇床震荡10min，酶标读数仪比色(波长490nm)测吸光度。实验重复3次。按以下公式计算实验药物和对照药物对肝癌细胞(HepG2)的抑制作用。细胞抑制率(％)＝(1-药物作用组吸光度值/细胞对照组吸光度值)×100％。
2.1.5Hoechst33258染色观察细胞形态
取浸泡于70％乙醇中的洁净盖玻片，置于六孔板内，设置A组(空白对照组)，B组(120μg/ml)C组(240μg/ml)，D组(360μg/ml)，无菌超净台内用无菌的PBS三遍，再用细胞培养液洗涤一遍。取对数生长期不同肝癌细胞(HepG2))，每孔接种5ｘ104个细胞培养过夜。经不同浓度姜叶三七挥发油处理24h后，吸尽培养液，PBS洗涤3次，加入0.5ml固定液，固定30分钟。去固定液，用PBS洗2遍，每次3分钟，吸尽液体。加入0.5ml Hoechst33258染色液，染色10分钟。去染色液，用PBS洗2遍，每次3分钟，吸尽液体。滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，让细胞接触封片液，尽量避免气泡。用的荧光激发波长350nm左右，发射波长460nm左右，在荧光显微镜下可检测到呈蓝色的细胞核。2.1.6流式细胞仪检测挥发油对肝癌细胞周期与细胞凋亡的影响
人肝癌细胞(HepG2)分为四组：A组(空白对照组)、B组(120μg/ml)C组(240μg/ml)，D组(360μg/ml)，经处理后，收集所有细胞(贴壁及悬浮细胞)后用PBS清洗一次，每组分别加入100μl buffer，吹打均匀，再分别加入3μl PI和3μAnnexin-V，避光染色1小时，加入200μlbuffer，200目滤网过滤细胞，收集于流式细胞仪上样管内。使用488nm激光作为激发波长，525nm作为检测波长，在流式细胞仪上对每个样品中1万个细胞采集荧光强度数据。
2.1.7流式细胞仪检测肝癌细胞的周期
取对数生长期不同肝癌细胞(HepG2)分为A组(空白对照组)，B组(120μg/ml)C组(240μg/ml)，D组(360μg/ml)经不同处理后，于15ml离心管中收集所有细胞(贴壁及悬浮细胞)后用PBS清洗一次，每组分别加入1mL预冷PBS重悬，吹打均匀。将离心管放置于涡旋震荡器上，边震荡边加入9ml70％冰冻乙醇固定，放置-20℃过夜。染色前用预冷PBS洗涤,离心(2000r/min，4℃)5min，去除固定液，用500μL RNaseA消化，37℃水浴30min，再加入25μL碘化丙啶(propdium iodide，PI)染色液混匀，室温避光染色30min，200目滤网过滤细胞，收集于流式细胞仪上样管内。流式细胞仪进行DNA含量和细胞周期分析,得出细胞各周期阶段的百分率。
2.1.8统计学分析
所有实验数据以均数±标准差表示，使用SPSS17.0录入和分析数据，多组间资料比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)检验，P<0.05表示差异具有显著性。
2.2结果
2.2.1本发明对肝癌细胞生长抑制作用
采用MTT实验分析实验药物对人肝癌细胞(HepG2)增殖的影响，结果如表2及图1所示：
表2：不同时间人肝癌细胞株(HepG2)增殖抑制率(％，n＝3)
注：
*：实施例组与顺铂组(阳性对照组)比较，P值<0.05，即实施例组与顺铂组比较具有统计学差异，由其抑制率分析可知，实施例组对肝癌细胞的抑制率高于顺铂组，说明实施例组的抗肝癌细胞活性要高于顺铂组。
对表2实验数据进行统计分析后可知，在作用24小时后，本发明挥发油物对人肝癌细胞(HepG2)的IC50为198μg/ml。
实验结果表明：本发明的挥发油对人肝癌细胞株(HepG2)具有显著的抑制作用，其效果明显优于对照药物顺铂组。并且随作用时间的延长和药物浓度的增加，其抑制作用逐渐增强，表现出明显的量-效和时-效关系。
2.2.2Hoechst33258染色观察细胞形态
Hoehst33258染色法观察细胞核形态变化，结果如图2所示，A组细胞核形态完整，核膜光滑，染色质均匀，部分可见分裂期细胞核的形态变化；B组、C组、D组均可见凋亡期细胞核的形态变化，即核膜消失，核边沿呈毛刺状，核染色加深，部分细胞核固缩、碎裂成核膜包裹着的碎块，呈颗粒状，形成凋亡小体，出现明显的凋亡形态(如箭头所示)。在同等数量细胞接种后，随药物剂量的增加，不同剂量浓度实验组的细胞数也明显减少，间接说明姜叶三七挥发油对肝癌细胞株凋亡的作用随剂量增加而逐渐增强。
2.2.3流式细胞仪检测姜叶三七挥发油组合物对不同肝癌细胞周期的影响
流式细胞术(FCM)结果如图3及表3显示：不同质量浓度姜叶三七挥发油作用人肝癌细胞(HepG2)24h后，与A组(空白组)比较，B、C、D组(低中剂量组)细胞数量的变化：
图3和表3说明，在HepG2细胞中，B、C、D组中G0/G1期细胞增多，S期和G2/M期细胞减少，显示姜叶三七挥发油可有效抑制细胞周期的正常转换，使细胞在G1期堆积，细胞阻滞于G1期，从而阻止细胞的有丝分裂，使细胞增殖受到抑制。
表3：姜叶三七挥发油对HepG2细胞周期的影响(％)
2.2.4流式细胞仪检测肝癌细胞的凋亡
经流式细胞仪检测姜叶三七挥发油作用24小时后，人肝癌细胞(HepG2)的凋亡率如图4、图5所示，可观察到随姜叶三七挥发油浓度的增加，人肝癌细胞(HepG2)发生凋亡的比例逐渐增加。
对HepG2凋亡的影响中，各组与空白对照比较P＝0.00<0.01，具有明显的统计学意义。B、C两组的凋亡率无明显区别，D组凋亡率急剧上升，绝大多数凋亡的细胞仍处于早期凋亡。
实验结果表明：姜叶三七挥发油低、中、高剂量组均对HepG2肿瘤细胞呈现出明显的影响作用，可有效抑制细胞周期的正常转换，使细胞在G1期堆积，细胞阻滞于G1期，阻止细胞的有丝分裂，使细胞增殖受到抑制，从而达到抗HepG2肿瘤活性作用。
Claims (6)
1.姜叶三七挥发油在制备治疗和/或预防肝癌药物的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述姜叶三七挥发油中含有活性成份，该活性成份由姜叶三七提取的姜叶三七挥发油活性成份组成，其中包括单萜类化合物，单萜氧化物类化合物，倍半萜类化合物，倍半萜氧化物类化合物。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述姜叶三七挥发油中含有活性成份，该活性成份由姜叶三七提取的姜叶三七挥发油活性成份组成，其中包括如下重量配比的成分：
20-30重量份的3,6,7,8-四氢化-3,3,6,6-四甲基环戊二烯并[E]茚-1(2H)-酮，8-20重量份的莰烯；6-15重量份的1,7,7-三甲基-二环[2.2.1]庚-2-茨酮，2-8重量份的香树烯；1-6重量份的氧化石竹烯。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述姜叶三七挥发油中含有活性成份，该活性成份由姜叶三七提取的姜叶三七挥发油活性成份组成，其中包括如下重量配比的成分：
24-28重量份的3,6,7,8-四氢化-3,3,6,6-四甲基环戊二烯并[E]茚-1(2H)-酮，11-15重量份的莰烯；8-12重量份的1,7,7-三甲基-二环[2.2.1]庚-2-茨酮，3-6重量份的香树烯；2-5重量份的氧化石竹烯。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述姜叶三七挥发油的制备包括以下步骤：
取姜叶三七粉碎成粗粉，加入药材总重量3-7倍的蒸馏水浸泡0.5-3小时，通过水蒸汽蒸馏提取3-6小时，收集上层精油，即得。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述姜叶三七挥发油的制备包括以下步骤：
取姜叶三七粉碎成粗粉，加药材总重量5倍的蒸馏水浸泡1h，通过水蒸汽蒸馏提取4h，收集上层精油，即得。
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Effective date of registration: 20190909 Address after: 210032 Room 02, 13 storeys, Phase I Building A, Yangtze Kechuang Center, 211 Pubin Road, Jiangbei New District, Nanjing City, Jiangsu Province Patentee after: Nanjing Shijiang Pharmaceutical Technology Co., Ltd. Address before: 541004 No. two, 109 North Road, Guilin, the Guangxi Zhuang Autonomous Region Patentee before: Guilin Medical College |
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