CN104096150B - 姜叶三七及其提取物在制备治疗和/或预防癌症药物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及姜叶三七、姜叶三七提取物、姜叶三七脂溶性提取物及姜叶三七挥发油组合物的新用途，即在制备治疗和/或预防癌症药物方面的新用途，特别是在制备治疗和/或预防肺癌药物方面的新用途。

Description

姜叶三七及其提取物在制备治疗和/或预防癌症药物的应用

技术领域

本发明涉及姜叶三七、姜叶三七提取物、姜叶三七脂溶性提取物及姜叶三七挥发油的新用途，即在制备治疗和/或预防癌症药物方面的新用途，特别是在制备治疗和/或预防肺癌药物方面的新用途。

背景技术

癌症，亦称恶性肿瘤(Malignant neoplasm)，为由控制细胞生长增殖机制失常而引起的疾病。癌细胞除了生长失控外，还会局部侵入周遭正常组织甚至经由体内循环系统或淋巴系统转移到身体其他部分。

恶性肿瘤由于分化不成熟、生长较快，浸润破坏器官的结构和功能，并可发生转移，因而对机体影响严重。恶性肿瘤除可引起与上述良性肿瘤相似的局部压迫和阻塞症状外，还可有发热、顽固性疼痛，晚期可出现严重消瘦、乏力、贫血和全身衰竭的状态。异位内分泌综合征：一些非内分泌腺肿瘤能产生和分泌激素或激素类物质，引起内分泌紊乱的临床症状，这种肿瘤称为异位内分泌性肿瘤，其所引起的临床症状称为异位内分泌综合征。此类肿瘤多为恶性肿瘤，以癌居多，如胃癌、肝癌、结肠癌，也可见于肉瘤如纤维肉瘤、平滑肌肉瘤等。此外APUD系统(弥散性神经内分泌系统)的肿瘤，也可产生生物胺或多肽激素，如类癌、嗜铬细胞瘤等。

由于肿瘤的产物(包括异位激素产生)或异常免疫反应(包括交叉免疫、自身免疫和免疫复合物沉积等)引起内分泌、神经、造血、消化、骨关节、肾脏、皮肤等系统发生病变，引起相应的临床症状，称为副肿瘤综合症状。

肺癌是肺部最常见的恶性肿瘤。世界卫生组织调查报告，许多国家和地区，肺癌的发病率占恶性肿瘤的首位。男性多于女性，男女之比约为4-8:1。城市多于农村。年龄多在40岁以上，少数病人在40岁以下。绝大多数的肺癌起源于支气管粘膜上皮，故称支气管肺癌。肺癌是它简称或通常称呼。肺癌的治疗以外科手术切除为首选。原发癌肿局限在支气管肺内，尚未发生远处转移和淋巴结转移时，手术后5年生存率可达50％以上。但多数病人在第一次来外科就诊时病变已属晚期，多数病人已失去根治性切除之机会，因此，早期发现，早期诊断及早期治疗仍是当前医者的重要任务和责任。

癌症治疗方法：

1、外科手术治疗：切除癌变组织。

2、放射疗法：利用高能电磁辐射线作用于生命体，使生物分子结构改变，达到破坏癌细胞目的。放射能够治疗癌症是因为癌细胞对放射线敏感。目前临床上应用的放射线有X线治疗和r线治疗两种。

3、化学疗法：将药物经血管带到全身，对身体所有细胞都有影响。这种疗法有时也称为“胞毒疗法”，因为所用药物都是有害的，甚至是带毒性的，体内细胞，无论是否恶性细胞，都受到破坏。

4、中医治疗癌症现在已经被国内外医疗专家广泛的认可，大量的临床试验及科研结果已经证实了中医治疗癌症的效果。

姜叶三七为姜科植物姜叶三七Stahlianthus involucratus(King ex Bak.)Craib的根状茎及块根。具清热，利湿，止痛，解毒，止血之功效，用于淋浊，胃痛，口疮，痔疮，溃疡，跌打损伤，蛇咬伤，外伤出血等症，为广西特色中药材。

“我国姜科药用植物研究Ⅵ姜三七挥发油化学成分分析”(发表于《色谱》1984年第1卷第1期)，用气液色谱和气液色谱-质谱法对姜三七挥发油各成分进行分享和鉴定，鉴定出二氢姜三七酮、α-蒎烯、茨烯、β-蒎烯、蒈烯、柠檬烯、桉叶素、芳樟醇、樟脑、α-胡椒烯、反-丁香烯、香树烯、γ-衣兰油烯、杜松烯、姜三七醌等15种成分。

申请号为CN200510098945.2“一种姜叶三七的外用药”，公开了由姜叶三七、钻石风、倒生莲、滇崖爬藤、五角枫根、无腺磷木、络石藤、乙醇组成的一种外用药，对风湿关节痛、跌打瘀痛、跌打损伤、外伤出血、关节疼痛、筋骨扭伤疼痛、筋骨疼痛、瘀肿疼痛、腰膝疼痛、关节酸痛、外伤瘀痛、软组织挫伤疗效确切，疗程更短，效果更佳。

此外，公开号为CN1814229的专利申请“一种土千年健祛湿镇痛药酒”、公开号为CN1742972的专利申请“一种四叶细辛外用药”、公开号为CN1814230的专利申请“一种山野豌豆活络镇痛药”、公开号为CN1814228的专利申请“一种矮人陀活络伤湿止痛膏”、公开号为CN101766729的专利申请“祛湿止痛液及穴敷治疗方法”均提及姜叶三七或土田七在跌打损伤或风湿疾病方面的治疗效果。

在现有公开文献中，或提到姜叶三七的挥发油成分，或提到姜叶三七治疗跌打损伤等疾病的效果，但未见公开使用姜叶三七、姜叶三七提取物、姜叶三七脂溶性提取物及姜叶三七挥发油用于治疗肿瘤、各种癌症的效果，尚未有人对姜叶三七治疗肿瘤、癌症作过全面的研究。

发明内容

本发明的目的是提供姜叶三七植物在制备治疗和/或预防癌症药物的应用；

本发明的目的是提供姜叶三七提取物在制备治疗和/或预防癌症药物的应用；

本发明的目的是提供姜叶三七挥发油提取物在制备治疗和/或预防癌症药物的应用；

本发明的另一目的是提供姜叶三七挥发油的制备方法。

姜叶三七为姜科植物姜叶三七Stahlianthus involucratus(King ex Bak.)Craib的根状茎、块根。秋末冬初叶片枯黄后采挖，除去杂质，洗净，置沸水中稍烫，晒干。收载于《广西中药材标准》1990年版第8页。

姜叶三七的别名有三七姜、姜叶三七、土田七、竹叶三七、姜叶三七、鸡心七、红沙姜、尖三七、拖颠枪(壮族)、内消子、打不死等。

根据发明人对姜叶三七植物、姜叶三七提取物、姜叶三七脂溶性提取物以及姜叶三七挥发油进行临床研究和药效学研究，发现姜叶三七植物、姜叶三七提取物、姜叶三七脂溶性提取物以及姜叶三七挥发油能够通过抑制肿瘤细胞增殖、影响肿瘤细胞发生凋亡，以及影响癌细胞周期的改变，呈现G1期阻滞，达到抗肿瘤活性、治疗癌症的功效。

在此基础上，本发明人通过对姜叶三七挥发油的有效成分进行有目的提取及含量控制以后，使其用于治疗和/或预防癌症的效果更显著。

本发明专利临床应用的安全性较高，在癌症特别是肺癌的药物治疗中不失为一种好药，其拓宽了中药制剂治疗癌症、尤其是肺癌的新方法，在不能开展介入治疗的基层医院尤为适用。

因此，申请人提供姜叶三七植物、姜叶三七提取物、姜叶三七脂溶性提取物、姜叶三七挥发油用于制备治疗和/或预防癌症药物方面的新用途。

本发明公开了姜叶三七提取物在制备治疗和/或预防癌症药物的应用，所述姜叶三七提取物的制备包括以下步骤：取姜叶三七根茎切碎，加水煎煮提取两次，第一次加入药材重量2-6倍量的水煎煮，沸腾后煮1-3小时，第二次加入药材重量1-4倍量的水煎煮1-3小时，过滤，混合两次煎煮液，浓缩至药材总重量的0.5-2倍，即得。

本发明公开了姜叶三七提取物在制备治疗和/或预防癌症药物的应用，所述姜叶三七提取物的制备还包括以下步骤：取姜叶三七根茎切碎，加入乙醇回流提取2-3次，第一次加入2-6倍体积百分比为40-70％的乙醇，提取1-3小时，第二次加入1-4倍量体积百分比为40-70％的乙醇提取1-3小时，合并煎液，过滤，回收乙醇，制成干膏，即得。

本发明还公开了姜叶三七脂溶性成分提取物在制备治疗和/或预防癌症药物的应用，所述姜叶三七脂溶性成分提取物的制备包括以下步骤：取姜叶三七根茎切碎，加石油醚回流提取2-3次，每次加入药材总重量3-5倍的石油醚，提取时间为1-3小时，合并提取液，过滤，回收石油醚，得姜叶三七脂溶性成分提取物。

本发明公开了姜叶三七脂溶性成分提取物在制备治疗和/或预防癌症药物的应用，所述姜叶三七脂溶性成分提取物的制备还可以包括以下步骤：取姜叶三七根茎切碎，加乙酸乙酯回流提取2-3次，每次加入药材总重量3-5倍的乙酸乙酯，提取时间为1-3小时，合并提取液，过滤，回收乙酸乙酯，得姜叶三七脂溶性成分提取物。

本发明公开了姜叶三七脂溶性成分提取物在制备治疗和/或预防癌症药物的应用，所述姜叶三七脂溶性成分提取物的制备还可以包括以下步骤：取姜叶三七根茎切碎，加水饱和正丁醇回流提取2-3次，每次加入药材总重量3-5倍的水饱和正丁醇，提取时间为1-3小时，合并提取液，过滤，回收水饱和正丁醇，得姜叶三七脂溶性成分提取物。

本发明公开了姜叶三七脂溶性成分提取物在制备治疗和/或预防癌症药物的应用，所述姜叶三七脂溶性成分提取物的制备还可以包括以下步骤：取姜叶三七根茎切碎，加乙醇回流提取2-3次，每次加入药材总重量3-5倍、体积百分比为30-50％的乙醇，提取时间为1-3小时，合并提取液，过滤，回收乙醇，得浓缩液。

所述浓缩液加石油醚分3次萃取，每次石油醚用量为浓缩液体积的3-5倍，收集石油醚相，浓缩干燥，得到姜叶三七脂溶性成分提取物。

所述浓缩液加乙酸乙酯分3次萃取，每次乙酸乙酯用量为浓缩液体积的3-5倍，收集石油醚相，浓缩干燥，得到姜叶三七脂溶性成分提取物。

所述浓缩液加水饱和正丁醇分3次萃取，每次水饱和正丁醇用量为浓缩液体积的3-5倍，收集水饱和正丁醇相，浓缩干燥，得到姜叶三七脂溶性成分提取物。

本发明公开了姜叶三七挥发油组合物在制备治疗和/或预防癌症药物的应用，所述姜叶三七挥发油中含有活性成份，该活性成份由姜叶三七提取的姜叶三七挥发油活性成份组成，其中包括单萜类化合物，单萜氧化物类化合物，倍半萜类化合物，倍半萜氧化物类化合物。

优选地，所述的姜叶三七挥发油活性成份包括：20-30重量份的3,6,7,8-四氢化-3,3,6,6-四甲基环戊二烯并[E]茚-1(2H)-酮，8-20重量份的莰烯；6-15重量份的1,7,7-三甲基-二环[2.2.1]庚-2-茨酮，2-8重量份的香树烯；1-6重量份的氧化石竹烯。

更优选地，所述的姜叶三七挥发油活性成份含量包括：24-28重量份的3,6,7,8-四氢化-3,3,6,6-四甲基环戊二烯并[E]茚-1(2H)-酮，11-15重量份的莰烯；8-12重量份的1,7,7-三甲基-二环[2.2.1]庚-2-茨酮，3-6重量份的香树烯；2-5重量份的氧化石竹烯。

申请人还提供了一种制备所述姜叶三七挥发油的方法，它包括如下步骤：

取姜叶三七粉碎成粗粉，加入药材总重量3-7倍的蒸馏水浸泡0.5-3小时，通过水蒸汽蒸馏提取3-6小时，收集上层精油，得姜叶三七挥发油。

优选地，姜叶三七挥发油的制备包括以下步骤：

取姜叶三七粉碎，加药材总重量5倍的蒸馏水浸泡1h，通过水蒸汽蒸馏提取4h，收集上层精油得姜叶三七挥发油组合物。

基于上述姜叶三七提取物、姜叶三七脂溶性提取物、姜叶三七挥发油，本发明的目的是提供以上组合物的一种新用途，即在制备治疗和/或预防癌症药物的应用，特别是制备治疗和/或预防肺癌药物的应用。它可以制成注射液、注射用粉针剂，注射用冻干粉针剂、片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、合剂、糖浆剂、胶囊剂、滴丸剂制剂，优选制成注射液、注射用冻干粉针剂。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

以下是本发明中药制剂的药材来源：

姜叶三七：姜科植物姜叶三七Stahlianthus involucratus(King ex Bak.)Craib的根状茎及块根。

本发明公开了姜叶三七在治疗癌症中的新用途，姜叶三七原植物和常规工艺提取物对于治疗癌症有一定的治疗效果，结果可见实验例1和实验例2，并且，姜叶三七毒性小，不会产生诸如化疗之类的强烈副作用。

姜叶三七的挥发油提取物具有更加出色的疗效，如实验例所示的细胞实验，其浓度在120μg/ml时，就已经具有了明显的活性，在24小时或36小时对肿瘤细胞的抑制率超过了对照药物组，而其浓度在360μg/ml以上时，其杀灭癌细胞的活性更是能够超过90％。

附图说明

图1是姜叶三七挥发油对鼻咽癌细胞株(CNE-2)增殖抑制率线图

图2是姜叶三七挥发油对肺癌细胞株(A549)增殖抑制率线图

图3是姜叶三七挥发油对肝癌细胞株(HepG2)增殖抑制率线图

图4是姜叶三七挥发油对乳腺癌细胞株(MCF-7)增殖抑制率线图

图5是姜叶三七挥发油对鼻咽癌细胞株CNE-2凋亡的形态变化

图6是姜叶三七挥发油对肝癌细胞株HepG2凋亡的形态变化

图7是姜叶三七挥发油对肺癌细胞株A549凋亡的形态变化

图8是姜叶三七挥发油对鼻咽癌细胞株(CNE-2)早期凋亡Annexin V-PI双染色法荧光散点图

图9姜叶三七挥发油对鼻咽癌细胞株(CNE-2)凋亡率条形图

图10是姜叶三七挥发油对肺癌细胞株(A549)早期凋亡Annexin V-PI双染色法荧光散点图

图11是姜叶三七挥发油对肺癌细胞株(A549)凋亡率条形图

图12是姜叶三七挥发油对肝癌细胞株(HepG2)早期凋亡Annexin V-PI双染色法荧光散点图

图13是姜叶三七挥发油对肝癌细胞株(HepG2)凋亡率条形图

图14是姜叶三七挥发油对乳腺癌细胞株(MCF-7)早期凋亡Annexin V-PI双染色法荧光散点图

图15是姜叶三七挥发油对乳腺癌细胞株(MCF-7)凋亡率条形图

图16是姜叶三七挥发油对CNE-2细胞周期的影响

图17是姜叶三七挥发油对A549细胞周期的影响

图18是姜叶三七挥发油对HepG2细胞周期的影响

图19是姜叶三七挥发油对MCF-7细胞周期的影响

具体实施方式

下面通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。除非另有说明，本发明中的百分数是重量百分数(乙醇为体积百分比)。

实施例1：姜叶三七挥发油

取新鲜姜叶三七150g粉碎成粗粉，加药材450ml的蒸馏水浸泡0.5h，通过水蒸汽蒸馏提取3h，收集上层精油，得姜叶三七挥发油1.7ml。

对所得姜叶三七挥发油进行检测，成分含量结果：3,6,7,8-四氢化-3,3,6,6-四甲基环戊二烯并[E]茚-1(2H)-酮为24％，莰烯为15％；1,7,7-三甲基-二环[2.2.1]庚-2-茨酮为12％，香树烯为3％；氧化石竹烯为2％。

实施例2：姜叶三七挥发油

取新鲜姜叶三七根茎150g粉碎，加750ml的蒸馏水浸泡1h，通过水蒸汽蒸馏提取4h，收集上层精油，得姜叶三七挥发油组合物2.2ml。

对所得姜叶三七挥发油进行检测，成分含量结果：3,6,7,8-四氢化-3,3,6,6-四甲基环戊二烯并[E]茚-1(2H)-酮为28％，莰烯为11％；1,7,7-三甲基-二环[2.2.1]庚-2-茨酮为8％，香树烯为6％；氧化石竹烯为5％。

实施例3：姜叶三七挥发油

取姜叶三七干燥根茎150g粉碎，加1050ml蒸馏水浸泡3h，通过水蒸汽蒸馏提取6h，收集上层精油，得姜叶三七挥发油组合物2.0ml。

对所得姜叶三七挥发油进行检测，成分含量结果：3,6,7,8-四氢化-3,3,6,6-四甲基环戊二烯并[E]茚-1(2H)-酮为30％，莰烯为20％；1,7,7-三甲基-二环[2.2.1]庚-2-茨酮为15％，香树烯为2％；氧化石竹烯为1％。

实施例4：姜叶三七脂溶性成分提取物

取姜叶三七根茎5000g切碎，加石油醚回流提取2次，第一次加入20000ml石油醚，提取2小时，第二次加入15000ml石油醚提取2小时，合并提取液，过滤，回收石油醚，得姜叶三七脂溶性成分提取物。

实施例5：姜叶三七脂溶性成分提取物

取姜叶三七根茎5000g切碎，加石油醚回流提取3次，第一次加入25000ml石油醚，提取3小时，第二次加入20000ml石油醚提取2小时，第三次加入15000ml石油醚提取时间为1小时，合并提取液，过滤，回收石油醚，得姜叶三七脂溶性成分提取物。

实施例6：姜叶三七脂溶性成分提取物

取姜叶三七根茎5000g切碎，加乙酸乙酯回流提取3次，第一次加入25000ml乙酸乙酯，提取3小时，第二次加入20000ml乙酸乙酯提取2小时，第三次加入15000ml乙酸乙酯，提取时间为1小时，合并提取液，过滤，回收乙酸乙酯，得姜叶三七脂溶性成分提取物。

实施例7：姜叶三七脂溶性成分提取物

取姜叶三七根茎5000g切碎，加水饱和正丁醇回流提取3次，第一次加入25000ml水饱和正丁醇，提取3小时，第二次加入20000ml水饱和正丁醇提取2小时，第三次加入15000ml水饱和正丁醇提提取时间为1小时，合并提取液，过滤，回收水饱和正丁醇，得姜叶三七脂溶性成分提取物。

实施例8：姜叶三七脂溶性成分提取物

取姜叶三七干燥根茎5000g切碎，加入乙醇回流提取2次，第一次加入25000ml体积百分比为40％的乙醇，提取3小时，第二次加入15000ml体积百分比为50％的乙醇提取2小时，合并提取液，过滤，回收乙醇，浓缩液加石油醚分3次萃取，每次石油醚用量分别为浓缩液体积的5倍、4倍、3倍，收集石油醚相，浓缩干燥，得到姜叶三七脂溶性成分提取物。

实施例9：姜叶三七脂溶性成分提取物

取姜叶三七干燥根茎5000g切碎，加入乙醇回流提取3次，第一次加入20000ml体积百分比为30％的乙醇，提取3小时，第二次加入15000ml体积百分比为40％的乙醇提取2小时，第三次加入10000ml体积百分比为50％的乙醇提取1小时，合并提取液，过滤，回收乙醇，浓缩液加乙酸乙酯分3次萃取，每次乙酸乙酯用量分别为浓缩液体积的5倍、4倍、3倍，收集乙酸乙酯相，浓缩干燥，得到姜叶三七脂溶性成分提取物。

实施例10：姜叶三七脂溶性成分提取物

取姜叶三七干燥根茎5000g切碎，加入乙醇回流提取3次，第一次加入20000ml体积百分比为30％的乙醇，提取3小时，第二次加入15000ml体积百分比为40％的乙醇提取2小时，第三次加入10000ml体积百分比为50％的乙醇提取1小时，合并提取液，过滤，回收乙醇，浓缩液加水饱和正丁醇分3次萃取，每次水饱和正丁醇用量分别为浓缩液体积的5倍、4倍、3倍，收集水饱和正丁醇相，浓缩干燥，得到姜叶三七脂溶性成分提取物。

实施例11：姜叶三七水提物

取新鲜姜叶三七根茎1000g切碎，第一次加6000ml煎煮，沸腾后保持3h，第二次加4000ml水煎煮提取1h。合并两次煎液，过滤，浓缩至2000ml，得姜叶三七水提物。

实施例12：姜叶三七脂溶性成分提取物

取新鲜姜叶三七根茎1000g切碎，加乙醇回流提取2次，第一次加入6倍体积百分比为70％的乙醇，提取3小时，第二次加入4倍量体积百分比为40％的乙醇提取1小时，合并煎液，过滤，回收乙醇，制成干膏，即得姜叶三七脂溶性成分提取物。

实施例13：姜叶三七挥发油注射液

将实施例1-3中的姜叶三七挥发油与葡萄糖、适量助溶剂、适量溶剂混合均匀，滤过，灭菌，制备得到注射液。

实施例14：姜叶三七挥发油冻干粉针剂

将实施例1-3中的姜叶三七挥发油与葡萄糖、适量助溶剂、适量溶剂混合均匀，灭菌，分装于安瓿或西林瓶等容器中，在无菌密闭环境中，低温下冻结，再通过降低环境气压，缓慢升高制品温度的方法使制品中的溶媒升华，留下固体形态的药物，即得本发明的冻干粉针。

实施例15：姜叶三七挥发油

取姜叶三七干燥根茎150g粉碎，加600ml蒸馏水浸泡2h，通过水蒸汽蒸馏提取5h，收集上层精油，得姜叶三七挥发油组合物1.9ml。

对所得姜叶三七挥发油进行检测，成分含量结果：3,6,7,8-四氢化-3,3,6,6-四甲基环戊二烯并[E]茚-1(2H)-酮为20％，莰烯为8％；1,7,7-三甲基-二环[2.2.1]庚-2-茨酮为6％，香树烯为8％；氧化石竹烯为6％。

药效实验

实验例1本发明对肿瘤细胞增殖抑制作用

取实施例2、5、6、7、11、12中的姜叶三七挥发油组合物、石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、水饱和正丁醇提取物、水提物和乙醇提取物，用RPMI1640培养液将上述提取物进行稀释，0.22μm微孔滤器抽滤除菌，4℃保存备用。

以MTT法检测本发明对肿瘤细胞增殖抑制作用。

1试样及实验药物

1.1肿瘤细胞培养

人鼻咽癌细胞(CNE-2)、人肺癌细胞(A549)、人肝癌细胞(HepG2)、人乳腺癌细胞(MCF-7)肿瘤细胞株均用含10％胎牛血清及100μg/ml青霉素-链霉素的RPMI1640培养基，置37℃、5％CO₂、饱和湿度条件下的恒温密闭培养箱中培养并传代。0.02EDTA-0.25％胰蛋白酶消化，每2～3d传代一次。

1.2实验药物

实验组：实施例2、5、6、7、11、12。

对比例药物：顺铂，生产厂家德州德药制药有限公司；批号：国药准字H37020524；浓度3μg/ml。

2MTT法检测姜叶三七提取物对肿瘤细胞增殖抑制作用

表1本发明实施例和顺铂对肿瘤细胞增殖的抑制率

实验结果显示：实施例2对肿瘤细胞增殖抑制作用明显强于其他实施例组和顺铂组；各实施例组与顺铂组相比，对肿瘤细胞增殖抑制作用有弱有强，但是均体现对肿瘤细胞的增殖有抑制作用。由以上可得结论：

1、姜叶三七挥发油对肿瘤细胞的增殖抑制作用明显优于姜叶三七经其他提取方法获得的提取物，以及明显优于顺铂。

2、姜叶三七石油醚提取物、乙酸乙酯提取物对肿瘤细胞的增殖抑制作用优于姜叶三七水饱和正丁醇提取物、姜叶三七水提物、姜叶三七乙醇提取物以及顺铂。

3、姜叶三七水提物、乙醇提取物以及水饱和正丁醇提取物对肿瘤细胞的增殖抑制作用与顺铂组相比较差，但同样能显示出对肿瘤细胞增殖有抑制作用。

实验例2姜叶三七挥发油体外抗肿瘤活性实验

1仪器与试药

1.1仪器挥发油测定器符合中国药典一部附录XD挥发油测定法的有关标准；Galaxy170S型CO2细胞培养箱(德国Eppendorf公司)，MLDEL680型酶标仪(日本BIO-RAD公司)，Axiovert-40型倒置相差显微镜(德国蔡司公司)，SW-CJ-2F型超净工作台(苏州净化设备有限公司)。

1.2试剂胎牛血清、RPMI1640培养基均购自美国hyclone公司；DMSO、四甲基偶氮唑蓝(MTT)均购自Sigma公司；乙醚等其他试剂均为国产分析纯。

1.3实验药物

实验组：实施例1，姜叶三七挥发油。

对比例药物：顺铂，生产厂家德州德药制药有限公司；批号：国药准字H37020524；浓度3μg/ml。

1.4供试肿瘤细胞

人鼻咽癌细胞(CNE-2)、人肺癌细胞(A549)、人肝癌细胞(HepG2)、人乳腺癌细胞(MCF-7)均由桂林医学院科学实验中心提供。

2方法与结果

2.1方法

2.1.1药物配制

用RPMI1640培养液将实施例1所得的挥发油提取物(20mg/mL)按1:10、1:13、1:20、1:40比例进行稀释，0.22μm微孔滤器抽滤除菌，4℃保存备用。

2.1.2实验分组：

A：空白对照组

B：120μg/ml姜叶三七挥发油组

C：240μg/ml姜叶三七挥发油组

D：360μg/ml姜叶三七挥发油组

E：480μg/ml姜叶三七挥发油组

2.1.3肿瘤细胞培养

CNE-2、A549、HepG2、MCF-7肿瘤细胞株均用含10％胎牛血清及100μg/ml青霉素-链霉素的RPMI1640培养基，置37℃、5％CO₂、饱和湿度条件下的恒温密闭培养箱中培养并传代。0.02EDTA-0.25％胰蛋白酶消化，每2～3d传代一次。

2.1.4MTT法检测本发明药物对肿瘤细胞增殖抑制作用

将对数生长期的肿瘤细胞按每孔4000个接种96孔培养板，37℃，5％CO₂培养箱中培养12h，24h，36h，48h，60h待细胞贴壁后，将不同浓度姜叶三七挥发油分别加入细胞株已长成单层的96孔细胞培养板中，每个浓度重复5个复孔，同时设立两个对照组：一个为空白对照组(不加细胞)，一个为细胞对照组(加1640培养液，姜叶三七挥发油的浓度为0)。置于37℃、5％CO₂培养箱内培养24h。培养结束前4h，吸弃培养板中液体，PBS冲洗3次，在避光条件下每孔加入MTT(5mg/ml)20μl，置于37℃，5％CO₂培养箱中继续培养4h，去上清液后每孔加DMSO150μl，水平摇床震荡10min，酶标读数仪比色(波长490nm)测吸光度。实验重复3次。按以下公式计算实验药物和对照药物对肿瘤细胞的抑制作用。细胞抑制率(％)＝(1-药物作用组吸光度值/细胞对照组吸光度值)×100％。

2.1.5Hoechst33258染色观察细胞形态

取浸泡于70％乙醇中的洁净盖玻片，置于六孔板内，设置A组(空白对照组)，B组(0.5mg/ml)C组(1.0mg/ml)，D组(1.5mg/ml)，无菌超净台内用无菌的PBS三遍，再用细胞培养液洗涤一遍。取对数生长期不同肿瘤细胞(CNE-2、A549、HepG2、MCF-7)，每孔接种5ｘ10⁴个细胞培养过夜。经不同浓度姜叶三七挥发油处理24h后，吸尽培养液，PBS洗涤3次，加入0.5ml固定液，固定30分钟。去固定液，用PBS洗2遍，每次3分钟，吸尽液体。加入0.5mlHoechst33258染色液，染色10分钟。去染色液，用PBS洗2遍，每次3分钟，吸尽液体。滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，让细胞接触封片液，尽量避免气泡。用的荧光激发波长350nm左右，发射波长460nm左右，在荧光显微镜下可检测到呈蓝色的细胞核。

2.1.6流式细胞仪检测挥发油对肿瘤细胞周期与细胞凋亡的影响

不同肿瘤细胞(HepG2、CNE-2、A549、MCF-7)分为四组：A组(空白对照组)、B组(120μg/ml、C组(240μg/ml、D组(360μg/ml)，经不同处理后，收集所有细胞(贴壁及悬浮细胞)后用PBS清洗一次，每组分别加入100μl buffer，吹打均匀，再分别加入3μl PI和3μAnnexin-V，避光染色1小时，加入200μl buffer，200目滤网过滤细胞，收集于流式细胞仪上样管内。使用488nm激光作为激发波长，525nm作为检测波长，在流式细胞仪上对每个样品中1万个细胞采集荧光强度数据。

2.1.7流式细胞仪检测肿瘤细胞的周期

取对数生长期不同肿瘤细胞(CNE-2、A549、HepG2、MCF-7)分为A组(空白对照组)，B组(120μg/ml)C组(240μg/ml)，D组(360μg/ml)经不同处理后，于15ml离心管中收集所有细胞(贴壁及悬浮细胞)后用PBS清洗一次，每组分别加入1mL预冷PBS重悬，吹打均匀。将离心管放置于涡旋震荡器上，边震荡边加入9ml70％冰冻乙醇固定，放置-20℃过夜。染色前用预冷PBS洗涤,离心(2000r/min，4℃)5min，去除固定液，用500μL RNaseA消化，37℃水浴30min，再加入25μL碘化丙啶(propdium iodide，PI)染色液混匀，室温避光染色30min，200目滤网过滤细胞，收集于流式细胞仪上样管内。流式细胞仪进行DNA含量和细胞周期分析,得出细胞各周期阶段的百分率。

2.1.8统计学分析

所有实验数据以均数±标准差表示，使用SPSS17.0录入和分析数据，多组间资料比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)检验，P<0.05表示差异具有显著性。

2.2结果

2.2.1本发明对肿瘤细胞生长抑制作用

采用MTT实验分析实验药物对肿瘤细胞株(CNE-2、A549、HepG2、MCF-7)增殖的影响，结果如表2-5及图1-4所示：

表2：姜叶三七挥发油对人鼻咽癌细胞株(CNE-2)增殖抑制率(％，n＝3)

表3：不同时间人肺癌细胞株(A549)增殖抑制率(％，n＝3)

表4：不同时间人肝癌细胞株(HepG2)增殖抑制率(％，n＝3)

表5：不同时间人乳腺癌细胞株(MCF-7)增殖抑制率(％，n＝3)

注：

◇：实施例组与顺铂组(阳性对照组)比较，P值>0.05，即实施例组与顺铂组比较没有统计学差异，说明实施例组的抗肿瘤活性基本等同于顺铂组。

*：实施例组与顺铂组(阳性对照组)比较，P值<0.05，即实施例组与顺铂组比较具有统计学差异，由其抑制率分析可知，实施例组比顺铂组抑制率高，说明实施例组的抗肿瘤活性要高于顺铂组。

△：实施例组与顺铂组(阳性对照组)比较，P值<0.01，即实施例组与顺铂组比较具有显著性的统计学差异，由其抑制率分析可知，实施例组比顺铂组抑制率低，说明实施例组的抗肿瘤活性要低于顺铂组或不具有抗肿瘤活性。

对表2-5实验数据进行统计分析后可知，在作用24小时后，本发明挥发油对肿瘤细胞株(CNE-2、A549、HepG2、MCF-7)的IC₅₀分别为300μg/ml，293μg/ml，198μg/ml，246μg/ml。

实验结果表明：本发明的挥发油对CNE-2、A549、HepG2、MCF-7肿瘤细胞株均具有显著的抑制作用，其效果明显优于对照药物顺铂组。并且随作用时间的延长和药物浓度的增加，其抑制作用逐渐增强，表现出明显的量-效和时-效关系。

2.2.2Hoechst33258染色观察细胞形态

Hoehst33258染色法观察细胞核形态变化，结果如图5-7所示，A组细胞核形态完整，核膜光滑，染色质均匀，部分可见分裂期细胞核的形态变化；B组、C组、D组均可见凋亡期细胞核的形态变化，即核膜消失，核边沿呈毛刺状，核染色加深，部分细胞核固缩、碎裂成核膜包裹着的碎块，呈颗粒状，形成凋亡小体，出现明显的凋亡形态(如箭头所示)。在同等数量细胞接种后，随药物剂量的增加，不同剂量浓度实验组的细胞数也明显减少，间接说明姜叶三七挥发油对不同肿瘤细胞株凋亡的作用随剂量增加而逐渐增强。

2.2.3流式细胞仪检测姜叶三七挥发油组合物对不同肿瘤细胞周期的影响

流式细胞术(FCM)结果如图16-19表6-9显示：不同质量浓度姜叶三七挥发油作用不同肿瘤细胞24h后，与A组(空白组)比较，B、C、D组(低中剂量组)细胞数量的变化：

在CNE-2、MCF-7细胞，B、C组中G0/G1期细胞数量增加，S期、G2/M期细胞比例减少，而D组(360μg/ml实验组)G1期细胞比例降低，可能是由于姜叶三七挥发油将CNE-2、MCF-7阻滞在G1期，引起肿瘤细胞凋亡，进而导致G1期细胞比例降低的，提示姜叶三七挥发油对CNE-2、MCF-7细胞具有明显的G1期阻滞作用。

在A549、HepG2细胞中，B、C、D组中G0/G1期细胞增多，S期和G2/M期细胞减少，显示姜叶三七挥发油可有效抑制细胞周期的正常转换，使细胞在G1期堆积，细胞阻滞于G1期，从而阻止细胞的有丝分裂，使细胞增殖受到抑制。

表6：姜叶三七挥发油对CNE-2细胞周期的影响(％)

表7：姜叶三七挥发油对A549细胞周期的影响(％)

表8：姜叶三七挥发油对HepG2细胞周期的影响(％)

表9：姜叶三七挥发油对MCF-7细胞周期的影响(％)

2.2.4流式细胞仪检测肿瘤细胞的凋亡

经流式细胞仪检测姜叶三七挥发油作用24小时后，不同肿瘤细胞(CNE-2、A549、HepG2、MCF-7)的凋亡率如图8-15所示，可观察到随姜叶三七挥发油浓度的增加，不同肿瘤细胞发生凋亡的比例逐渐增加。

在对CNE-2凋亡的影响中，B组引起细胞凋亡率为6％，与空白对照比较P＝0.085>0.05，无明显差异，不具有统计学意义。C组和D组凋亡率急剧上升，未呈现出明显的早期凋亡，直接引起细胞的中、晚期凋亡或细胞坏死。

对A549凋亡的影响中，B组引起细胞凋亡率为6.57％，与空白对照比较P＝0.224>0.05，无明显差异，不具有统计学意义。C组和D组与空白对照比较具有明显差异，其早期凋亡率随剂量的增加而升高。

对HepG2凋亡的影响中，各组与空白对照比较P＝0.00<0.01，具有明显的统计学意义。B、C两组的凋亡率无明显区别，D组凋亡率急剧上升，绝大多数凋亡的细胞仍处于早期凋亡。

在对MCF-7凋亡的影响中，各组与空白对照比较P＝0.00<0.01，具有明显的统计学意义。B、C、D三组之间的凋亡率无明显区别。

结论：在流式细胞仪检测肿瘤细胞的凋亡实验中，结果显示：在对CNE-2、A549凋亡的影响中B组与空白组相比无明显差异，无统计学意义，C组、D组与空白组相比有明显差异；对HepG2、MCF-7凋亡的影响中，B、C、D组与空白组相比均有明显的统计学意义。

实验结果提示：(1)对CNE-2、A549肿瘤细胞，姜叶三七挥发油低剂量无明显影响作用，中高剂量组有显著作用。(2)对HepG2、MCF-7肿瘤细胞，姜叶三七挥发油低中高剂量组均呈现出明显的影响作用。

实验结果表明，姜叶三七挥发油对CNE-2、MCF-7细胞具有明显的G1阻滞作用。对A549、HepG2细胞，可有效抑制细胞周期的正常转换，使细胞在G1期堆积，细胞阻滞于G1期，阻止细胞的有丝分裂，使细胞增殖受到抑制，从而达到抗肿瘤活性作用。

Claims (6)

1.姜叶三七挥发油在制备治疗和/或预防肺癌药物的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述姜叶三七挥发油中包括单萜类化合物，单萜氧化物类化合物，倍半萜类化合物，倍半萜氧化物类化合物。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述姜叶三七挥发油中包括如下重量配比的成分：20-30重量份的3,6,7,8-四氢化-3,3,6,6-四甲基环戊二烯并[E]茚-1(2H)-酮；8-20重量份的莰烯；6-15重量份的1,7,7,-三甲基-二环[2.2.1]庚-2-茨酮；2-8重量份的香树烯；1-6重量份的氧化石竹烯。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述姜叶三七挥发油中包括如下重量配比的成分：24-28重量份的3,6,7,8-四氢化-3,3,6,6-四甲基环戊二烯并[E]茚-1(2H)-酮；11-15重量份的莰烯；8-12重量份的1,7,7,-三甲基-二环[2.2.1]庚-2-茨酮；3-6重量份的香树烯；2-5重量份的氧化石竹烯。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述姜叶三七挥发油的制备包括以下步骤：取姜叶三七粉碎成粗粉，加入药材总重量3-7倍的蒸馏水浸泡0.5-3小时，通过水蒸气蒸馏提取3-6小时，收集上层精油，即得。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述姜叶三七挥发油的制备包括以下步骤：取姜叶三七粉碎成粗粉，加入药材总重量5倍的蒸馏水浸泡1小时，通过水蒸气蒸馏提取4小时，收集上层精油，即得。