CN112618676A - 姜三七及其提取物在制备治疗和/或预防血管内皮损伤药物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明为姜三七及其提取物在制备治疗和/或预防血管内皮损伤药物的应用，涉及姜三七植物、姜三七提取物、姜三七挥发油的新用途，即在制备治疗和/或预防血管内皮损伤药物方面的新用途。

Description

姜三七及其提取物在制备治疗和/或预防血管内皮损伤药物 的应用

技术领域

本发明涉及姜三七植物、姜三七提取物、姜三七挥发油的新用途，即在制备治 疗和/或预防血管内皮损伤药物方面的新用途。

背景技术

血管内皮细胞是介于血流和血管壁组织之间的一层单核细胞，可通过自分泌、 内分泌、旁分泌三种途径分泌一系列NO、PGI2、ET-1等血管活性物质发挥调节血 管紧张性、抗血栓形成、抑制平滑肌细胞增殖及血管壁炎症反应等功能。NO是内皮 细胞产生最重要的舒血管因子，由内皮细胞的NO合酶(eNOs)作用于L-精氨酸产生， NO可扩散至血管壁平滑肌细胞激活鸟氨酸环化酶，介导cGMP调控的血管舒张。不 仅如此，NO还具有抑制血小板聚集、抑制单核细胞粘附于内皮细胞、抑制平滑肌细 胞增殖等作用。然而血管内皮在受到一系列有害因素作用时，内皮细胞释放的舒血 管因子减少，缩血管因子增多，打破血管平衡稳态，最终导致一系列心血管事件的 发生。

低密度脂蛋白(LDL)在血管壁聚集并氧化形成氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)。 ox-LDL上调MCP-1、ICAM-1、VCAM-1、P-选择素、E-选择素等多种粘附分子的基因 表达，促进单核细胞粘附于血管内皮细胞。ox-LDL的这些作用主要通过激活其受体 LOX-1实现，内皮细胞通过LOX-摄取ox-LDL引起内皮细胞激活、功能障碍、完整 性丢失及分泌功能紊乱。ox-LDL与LOX-1结合还可促进内皮细胞凋亡。

姜三七为姜科植物姜三七Stahlianthus involucratus(King ex Bak.)Craib。现有公开文献中，未见公开使用姜三七、姜三七提取物、姜三七挥发油用于治疗血 管内皮损伤的效果，尚未有人对姜三七治疗血管内皮损伤作过全面的研究。

发明内容

本发明的目的是提供姜三七植物在制备治疗和/或预防血管内皮损伤药物的应用；优选的，姜三七植物的根茎在制备治疗和/或预防血管内皮损伤药物的应用；

本发明的目的是提供姜三七提取物在制备治疗和/或预防血管内皮损伤药物的应用；

本发明的目的是提供姜三七挥发油在制备治疗和/或预防血管内皮损伤药物的应用；

本发明的另一目的是提供姜三七挥发油的制备方法。

姜三七为姜科植物姜三七Stahlianthus involucratus(King ex Bak.)Craib。姜三七 的别名有三七姜、姜叶三七、土田七、竹叶三七、鸡心七、红沙姜、尖三七、拖颠 枪(壮族)、内消子、打不死等。

根据发明人对姜三七植物、姜三七提取物、以及姜三七挥发油进行药效学研究，发现姜三七，尤其是其挥发油能明显提高HUVECs损伤的细胞存活率，显著改善细 胞损伤的形态，同时能降低LDH、MDA的含量以及增加SOD、CAT、GSH-Px、 NO的含量。qRT-PCR分析表明，姜三七挥发油显著下调Bax mRNA表达水平，上 调Nrf2、NQO1、HO-1、Bcl-2mRNA表达水平，Western blot结果表明，姜三七挥 发油显著上调NQO1、HO-1蛋白表达水平。

在此基础上，本发明人通过对姜三七挥发油的有效成分分析研究，进行有目的 提取及含量控制以后，使其用于治疗和/或预防血管内皮损伤的效果更显著。

优选的，所述姜三七挥发油中含有的活性成份包括：1R-α-蒎烯、莰烯、3-蒈 烯、(+)-柠檬烯、可巴烯(α-蒎烯)、2-壬基醇、D-樟脑、香树烯、γ-衣兰油烯、 α-杜松烯、1,6-二甲基-4-异丙基四氢萘、石竹素、3，3，6，6-四甲基-3，6，7，8- 四氢化-并茚-1(2H)-酮。

优选的，所述姜三七挥发油中包括以下重量份的活性成份：1R-α-蒎烯6-10、 莰烯18-24、3-蒈烯3-8、(+)-柠檬烯1-2、可巴烯(α-蒎烯)12-18、2-壬基醇0.8-2、 D-樟脑6-12、香树烯4-10、γ-衣兰油烯1-2、α-杜松烯1-2、1,6-二甲基-4-异丙基 四氢萘0.8-2、石竹素1-3、3，3，6，6-四甲基-3，6，7，8-四氢化-并茚-1(2H)-酮 6-11。

此外，根据发明人在《华夏医学》，第30卷第4期，2017年6月，发表的文章 “三七姜挥发油成分的GC_MS分析与体外抗肿瘤活性研究”中，通过气相色谱- 质谱联用技术分离鉴定结果，姜三七挥发油中还含有三环烯、(+)-环苜蓿烯等其他 微量成分。

所述姜三七挥发油的制备方法包括以下步骤：

取姜三七粉碎成粗粉，加入药材总重量3-7倍的水浸泡0.5-3小时，通过水蒸 汽蒸馏提取3-6小时；然后继续水蒸汽蒸馏提取提取2-5次，每次加入药材总重量 3-7倍的水，每次提取时间为3-6小时，收集混合各次提取的上层精油，即得。

优选的，所述姜三七挥发油的制备方法包括以下步骤：

取姜三七粉碎成粗粉，加入药材总重量5-6倍的水浸泡1-2小时，通过水蒸汽 蒸馏提取3-5小时；然后继续水蒸汽蒸馏提取提取3-4次，每次加入药材总重量3-5 倍的水，每次提取时间为3-5小时，收集混合各次提取的上层精油，用无水乙醚溶 解，加无水硫酸钠脱水，回收乙醚后，收集得橘黄色挥发油，即得。

基于上述姜三七提取物、姜三七挥发油，本发明的目的是提供以上物质的一种 新用途，即在制备治疗和/或预防血管内皮损伤药物的应用。它可以制成注射液、注 射用粉针剂，注射用冻干粉针剂、片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、合剂、糖浆剂、胶 囊剂、滴丸剂等制剂。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

本发明公开了姜三七尤其是姜三七的挥发油提取物具有出色的疗效，如实施例 8记载的细胞实验，其浓度在50ng/ml时，就已经具有了明显的作用，与浓度在 50ng/ml的阳性药物阿司匹林对比，具有同等效果。并且，其为传统中药材，在我 国有多年的临床服用历史，毒副作用小，优于化学合成药物阿司匹林。

附图说明

图1是不同浓度姜三七挥发油对HUVECs的毒性；

图2是不同浓度姜三七挥发油对HUVECs的细胞存活率的影响；

图3是不同浓度ox-LDL对HUVECs细胞损伤的影响；

图4是不同浓度ox-LDL对HUVECs细胞存活率的影响；

图5是各药物对200μg/mL ox-LDL诱导HUVECs损伤的影响；

图6是各药物对200μg/mL ox-LDL诱导HUVECs损伤的影响；

图7是各药物对200μg/mL ox-LDL损伤的HUVECs保护作用形态学观察；

图8是各药物对200μg/mL ox-LDL诱导HUVECs损伤的氧化应激指标的影响；

图9是各药物对200μg/mL ox-LDL诱导HUVECs细胞内的活性氧影响；

图10是各药物对200μg/mL ox-LDL诱导HUVECs细胞内的活性氧影响的定量 分析；

图11是各药物对200μg/mL ox-LDL诱导HUVECs细胞凋亡的影响；

图12是各药物对200μg/mL ox-LDL诱导HUVECs细胞凋亡影响的定量分析；

图13是姜三七挥发油对ox-LDL诱导HUVECs的细胞凋亡以及抗氧化相关基因 荧光定量PCR曲线；

图14是姜三七挥发油对ox-LDL诱导HUVECs的细胞凋亡相关基因表达的影响；

图15是姜三七挥发油对ox-LDL诱导HUVECs的抗氧化相关基因表达的影响；

图16是姜三七挥发油对ox-LDL诱导HUVECs的抗氧化相关基因蛋白表达的影 响。

具体实施方式

下面通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明的实施例是用于说 明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属 于本发明要求保护的范围。除非另有说明，本发明中的百分数是重量百分数(乙醇为 体积百分比)。

实施例1：姜三七挥发油

取新鲜姜三七2000g粉碎，加入6000ml的水浸泡0.5小时，通过水蒸汽蒸馏提 取3小时；然后继续水蒸汽蒸馏提取提取2次，每次加入6000ml的水，每次提取 时间为3h，收集混合各次提取的上层精油，得姜三七挥发油25.5ml。

对所得姜三七挥发油进行检测，成分含量结果：1R-α-蒎烯6.74％、莰烯18.63％、3-蒈烯4.59％、(+)-柠檬烯1.12％、可巴烯(α-蒎烯)13.79％、2-壬基醇0.93％、D- 樟脑6.88％、香树烯5.33％、γ-衣兰油烯1.04％、α-杜松烯1.39％、1,6-二甲基-4- 异丙基四氢萘0.85％、石竹素1.42％、3，3，6，6-四甲基-3，6，7，8-四氢化-并茚 -1(2H)-酮6.90％。

实施例2：姜三七挥发油

取干燥姜三七根茎2000g粉碎，加入7000ml的水浸泡1小时，通过水蒸汽蒸 馏提取5小时；然后继续水蒸汽蒸馏提取提取4次，每次加入8000ml的水，每次 提取时间为5小时，收集混合各次提取的上层精油，用无水乙醚溶解，加无水硫酸 钠脱水，用旋转蒸发仪减压蒸馏回收乙醚后，收集得橘黄色挥发油，得姜三七挥发 油22.3ml。

对所得姜三七挥发油进行检测，成分含量结果：1R-α-蒎烯7.33％、莰烯23.47％、3-蒈烯6.84％、(+)-柠檬烯1.67％、可巴烯(α-蒎烯)17.31％、2-壬基醇1.42％、D- 樟脑9.89％、香树烯7.31％、γ-衣兰油烯1.42％、α-杜松烯1.46％、1,6-二甲基-4- 异丙基四氢萘1.26％、石竹素2.11％、3，3，6，6-四甲基-3，6，7，8-四氢化-并茚 -1(2H)-酮10.60％。

实施例3：姜三七挥发油

取姜三七干燥全株2000g粉碎，加入7000ml的水浸泡1小时，通过水蒸汽蒸 馏提取3小时；然后继续水蒸汽蒸馏提取提取5次，每次加入10000ml的水，每次 提取时间为4h，收集混合各次提取的上层精油，得姜三七挥发油27.1ml。

对所得姜三七挥发油进行检测，成分含量结果：1R-α-蒎烯8.42％、莰烯19.66％、3-蒈烯4.81％、(+)-柠檬烯1.38％、可巴烯(α-蒎烯)15.83％、2-壬基醇1.66％、D- 樟脑11.02％、香树烯5.79％、γ-衣兰油烯1.77％、α-杜松烯1.23％、1,6-二甲基-4- 异丙基四氢萘1.36％、石竹素1.71％、3，3，6，6-四甲基-3，6，7，8-四氢化-并茚 -1(2H)-酮8.14％。

实施例4：姜三七挥发油

取姜三七干燥根茎2000g粉碎，加入14000ml的水浸泡1小时，通过水蒸汽蒸 馏提取3小时；然后继续水蒸汽蒸馏提取提取3次，每次加入12000ml水，每次提 取时间为5h，收集混合各次提取的上层精油，得姜三七挥发油组合物29.3ml。

对所得姜三七挥发油进行检测，成分含量结果：1R-α-蒎烯9.03％、莰烯19.66％、3-蒈烯5.38％、(+)-柠檬烯1.55％、可巴烯(α-蒎烯)17.23％、2-壬基醇1.35％、D- 樟脑8.54％、香树烯5.66％、γ-衣兰油烯1.79％、α-杜松烯1.74％、1,6-二甲基-4- 异丙基四氢萘1.22％、石竹素1.57％、3，3，6，6-四甲基-3，6，7，8-四氢化-并茚 -1(2H)-酮6.76％。

实施例5：姜三七挥发油

取姜三七干燥根茎2000g粉碎，加入10000ml的水浸泡2小时，通过水蒸汽蒸 馏提取3小时；然后继续，水蒸汽蒸馏提取提取4次，每次加入10000ml水，每次 提取时间为4.5h，收集混合各次提取的上层精油，用无水乙醚溶解，加无水硫酸钠 脱水，用旋转蒸发仪减压蒸馏回收乙醚后，收集得橘黄色挥发油，得姜三七挥发油 组合物24.6ml。

对所得姜三七挥发油进行检测，成分含量结果：1R-α-蒎烯7.21％、莰烯21.36％、3-蒈烯4.78％、(+)-柠檬烯1.12％、可巴烯(α-蒎烯)15.43％、2-壬基醇1.21％、D- 樟脑9.43％、香树烯7.69％、γ-衣兰油烯1.09％、α-杜松烯1.64％、1,6-二甲基-4- 异丙基四氢萘1.72％、石竹素1.87％、3，3，6，6-四甲基-3，6，7，8-四氢化-并茚 -1(2H)-酮8.74％。

实施例6：姜三七挥发油

取姜三七新鲜根茎2000g粉碎，加入13000ml的水浸泡2小时，通过水蒸汽蒸 馏提取3小时；然后继续，水蒸汽蒸馏提取提取3次，每次加入11000ml水，每次 提取时间为5.5h，收集混合各次提取的上层精油，用无水乙醚溶解，加无水硫酸钠 脱水，用旋转蒸发仪减压蒸馏回收乙醚后，收集得橘黄色挥发油，得姜三七挥发油 组合物21.7ml。

对所得姜三七挥发油进行检测，成分含量结果：1R-α-蒎烯8.22％、莰烯20.61％、3-蒈烯3.87％、(+)-柠檬烯1.93％、可巴烯(α-蒎烯)14.75％、2-壬基醇1.62％、D- 樟脑11.07％、香树烯7.24％、γ-衣兰油烯1.55％、α-杜松烯1.26％、1,6-二甲基-4- 异丙基四氢萘1.43％、石竹素1.69％、3，3，6，6-四甲基-3，6，7，8-四氢化-并茚 -1(2H)-酮8.01％。

实施例7：姜三七挥发油注射液

将实施例1-4中的姜三七挥发油与葡萄糖、适量助溶剂、适量溶剂混合均匀， 滤过，灭菌，制备得到注射液。

实施例8：姜三七挥发油冻干粉针剂

将实施例1-4中的姜三七挥发油与葡萄糖、适量助溶剂、适量溶剂混合均匀， 灭菌，分装于安瓿或西林瓶等容器中，在无菌密闭环境中，低温下冻结，再通过降 低环境气压，缓慢升高制品温度的方法使制品中的溶媒升华，留下固体形态的药物， 即得本发明的冻干粉针。

实施例9：姜三七挥发油固体制剂

姜三七挥发油用β-环糊精包合后，配合相应辅料制成颗粒剂或者片剂。

实施例10

基于Nrf2/ARE氧化应激系统研究姜三七挥发油对血管内皮损伤的作用研究

目的：研究姜三七挥发油对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的人脐静脉内皮 细胞(HUVECs)损伤保护作用以及探索其通过Nrf2/ARE氧化应激通路的保护机 制，为动脉粥样硬化以及心血管疾病的预防和治疗提供实验基础和理论指导。方法： 实验分为7组：正常对照组、模型组、实施例2的姜三七挥发油低、中、高剂量组 以及阳性药组，体外培养HUVECs，用ox-LDL诱导细胞损伤模型，然后给药姜三 七挥发油和阳性药继续作用24h。采用MTT法分析细胞存活率，确定ox-LDL诱导 细胞损伤的最佳浓度与时间。Hoechst染色观察细胞损伤形态。ELISA法分析LDH、 MDA、NO、SOD、CAT、GSH-Px的含量。实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction，QRT-PCR)检测Nrf2、NQO1、HO-1、Bcl-2、 Bax mRNA表达水平。蛋白质免疫印迹分析法(Western blot)检测NQO1、HO-1蛋白表达水平。

1.实验仪器：

SW-CJ-2F洁净工作台(苏洁净化设备有限公司，中国)；CO2细胞培养箱 (Galaxy170S)(Eppendorf公司，德国)；-80℃超低温冰箱(Forma)(Thermo Scientifc， 美国)；低速离心机(TDL-80-2B)(上海安亭科学仪器厂，中国)；倒置荧光相差显 微镜(IXTIFL)(Olympus公司，日本)；流式细胞仪(FACSAria III)(Becton Dickinson 公司，美国)；涡旋混合器(Vortex Genie 2)(Scientific Industries，中国)；冷冻离心机 (Legend Micro17R)(Thermo Scientifc，美国)；7500Fast Real-Time PCR system(ABI 公司，美国)；GENEGENIUS凝胶成像系统(天能科技有限公司，上海)；电泳仪 (Bio-Rad公司，美国)；小型垂直电泳转印系统(Bio-Rad公司，美国)；摇床振荡 器(离心机械研究所，上海)；酶标仪(Bio-Rad公司，美国)；10μL、20μL、200 μL、1000μL移液枪(德国eppendorf公司)。

2.实验试剂：

氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)：北京协生生物科技有限责任公司；阿司匹林 标准品(Asp.)：中国药品生物制品鉴定所；胎牛血清(FBS)：Life Technologies NZ Ltd； DMEM培养基：GIBCO公司；胰蛋白酶消化液：GIBCO公司；青霉素-链霉素混 合溶液：Solarbio科技有限公司；四甲基偶氮唑盐(MTT)：美国Sigma公司；二 甲基亚砜(DMSO)：北京鼎国昌盛生物技术有点责任公司；Hoecgst33342细胞凋 亡染色试剂：碧云天生物技术公司；乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒：南京建成生物工 程研究所；一氧化氮(NO)试剂盒：南京建成生物工程研究所；丙二醛(MDA) 试剂盒：南京建成生物工程研究所；超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒：南京建成生 物工程研究所；过氧化氢酶(CAT)试剂盒：南京建成生物工程研究所；谷胱甘肽 过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒：南京建成生物工程研究所；TRNzol-A+总RNA提 取试剂：天根生化科技有限公司；Annexin V FITC Apoptosis Kit凋亡检测试剂盒： BD公司；活性氧检测试剂盒：碧云天生物技术公司；FastKing一步法除基因组 cDNA第一链合成预混试剂：碧云天生物技术公司；SuperReal荧光定量预混试剂： 碧云天生物技术公司；BCA蛋白定量试剂盒：碧云天生物技术公司；PCR引物： 武汉金开瑞生物工程有限公司；30％丙烯酰胺：Solarbio科技有限公司；SDS：Solarbio 科技有限公司；Tris碱：Solarbio科技有限公司；5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液： Solarbio科技有限公司；RIPA裂解液：碧云天生物技术研究所；PMSF蛋白酶抑制 剂：碧云天生物技术研究所；彩虹245光谱蛋白Marker：碧云天生物技术研究所； NQO1兔抗人单克隆抗体：Cell Signaling；HO-1兔抗人单克隆抗体：Cell Signaling；内参GAPDH抗体：Absin公司；辣根酶标记的羊抗鼠Ig G：Cell Signaling；辣根酶 标记的羊抗兔Ig G：Cell Signaling；

3.实验方法

细胞实验

3.1.1HUVECs细胞传代培养

待细胞生长成单层并且基本铺满瓶壁、细胞状态较好时，弃去培养瓶中的培养液，用PBS清洗2～3遍后加入0.25％EDTA胰酶消化液，轻轻摇动瓶身，使消化 液均匀平铺于所有细胞表面，约2～3min后，在倒置显微镜下观察，待细胞间隙变 大、细胞体回缩变圆后立即吸出消化液，加入含10％胎牛血清的DMEM完全培养 液终止消化，用尖吸管吸取瓶内的培养液轻轻反复吹打瓶壁上的细胞，使其脱落制 成单细胞悬液。将细胞悬液置于10ml的离心管中，1000rpm离心5min，弃上清 液，再加入2ml DMEM培养液重悬细胞，使用计数板计数。将细胞悬液重新接种 于新的培养瓶内(按1：3到1：4比例传代)，细胞数不少于104个，置于37℃、 5％CO2恒温培养箱中继续培养。每3～5天传代1次，取对数生长期细胞用于实验。

3.1.2 HUVECs细胞冻存

取生长状态良好的对数期细胞，于冻存前一天换液。次日弃培养液，PBS冲洗 两遍；0.25％胰蛋白酶消化2～3min，倒置显微镜下观察细胞间隙变大、细胞变圆 时弃去胰酶消化液；加入含10％胎牛血清DMEM完全培养基终止消化，尖吸管反 复轻轻吹打瓶壁，并将吹打的细胞悬液移至离心管中，1000rpm离心5min，弃去 上清液；加入已配制好的冻存液(培养基：胎牛血清：DMSO＝7：2：l)，轻轻吹打 至细胞分散均匀，移入冻存管中，每个冻存管内加细胞悬液1ml，封口膜封口。标 明细胞株及冻存时间；冻存管置4℃30min，-20℃30min，-80℃冰箱过夜后， 放置液氮罐长期保存。

3.1.3 HUVECs细胞复苏

从液氮罐取出冻存的HUVECs细胞，迅速放入37℃水浴锅内，并不时摇动使 其快速融化(1min内)；待冻存液完全溶解后，将冻存管移入超净工作台内，用75％ 酒精消毒后旋下管盖，吸出细胞悬液，移入10ml离心管内，再加入8ml完全培养 液，轻轻吹打混匀，离心机配平后1000rpm离心5min，弃上清；重复离心漂洗一 次；弃上清后，加入5ml DMEM完全培养液，吹打使成单细胞悬液，浓度为5×105/ml 移入培养瓶中，于37℃、5％CO2恒温培养箱中培养。

3.1.4细胞计数

(1)细胞计数板与盖玻片用75％酒精擦干净，自然风干后，把盖玻片覆于计 数板上方计数区；

(2)从边缘轻轻加入充分混匀的单细胞悬液1滴，使之充满计数板与盖玻片 之间的间隙；

(3)倒置光学显微镜下计数四角大方格内的细胞数，压中线者只计算左线和 上线，右线和下线不计算在内；

(4)按公式计算细胞数：细胞个数/mL＝4个大方格内细胞总数/4×104。

3.2姜三七挥发油对正常的HUVECs的影响

待细胞长至约90％时，消化细胞，制备细胞悬液，调整细胞密度为3×104个/ml，加入浓度为10、50、100、300、500ng/mL、10、50、60、80、100、200μg/mL的 实施例2的姜三七挥发油，每组6孔，每孔100μL加入至96孔板中，37℃含5％CO2 的培养箱内培养24h。MTT法检测细胞的增殖情况。

3.3 ox-LDL诱导HUVECs损伤模型建立

待细胞长至约90％时，消化细胞，制备细胞悬液，调整细胞密度为3×104个/mL，加入浓度为50、100、200、300μg/mL的ox-LDL，每组6孔，每孔100μL加入至 96孔板中，37℃含5％CO2的培养箱内培养不同时间，分别设置24h、48h。MTT 法检测细胞的增殖情况，根据所测结果，筛选出模型建立的最佳条件。

3.4姜三七挥发油对ox-LDL诱导HUVECs损伤模型的作用

找到建立ox-LD诱导HUVECs损伤模型的最佳条件后，细胞试验分为6组： 正常对照组(control)、模型组(200μg/mL ox-LDL)、实施例2的姜三七挥发油低 剂量组(200μg/mLox-LDL+10ng/mL EOFAZ)、实施例2的姜三七挥发油中剂量组 (200μg/mL ox-LDL+50ng/mLEOFAZ)、实施例2的姜三七挥发油高剂量组(200 μg/mL Lox-LDL+100ng/mL EOFAZ)、阳性药组(阿司匹林Asp.200μg/mL ox-LDL+ 50ng/mL Asp，)。细胞接种于96孔培养板内，37℃含5％CO2的培养箱内培养。细 胞贴壁后吸净培养液，造模后按组别分别给药，每组6孔，37℃含5％CO2的培养 箱内培养24h。

3.5姜三七挥发油对ox-LDL诱导HUVECs损伤模型的作用

找到建立ox-LDL诱导HUVECs损伤模型的最佳条件为200μg/mL、24h。根 据最佳条件进行细胞试验，分为6个实验组，具体为：正常对照组(control)、模型 组(200μg/mL ox-LDL)、实施例2的姜三七挥发油低剂量组(200μg/mL ox-LDL+10 ng/mL EOFAZ)、实施例2的姜三七挥发油中剂量组(200μg/mL ox-LDL+50ng/mL EOFAZ)、实施例2的姜三七挥发油高剂量组(200μg/mL Lox-LDL+100ng/mL EOFAZ)、阳性药组(阿司匹林Asp.200μg/mL ox-LDL+50ng/mL Asp)。细胞接种 于96孔培养板内，37℃含5％CO2的培养箱内培养。细胞贴壁后吸净培养液，造 模后按组别分别给药，每组6孔，37℃含5％CO2的培养箱内培养24h。

3.6细胞损伤形态学观察

细胞处理方法同3.5项下内容，(1)培养24h后，取出96孔板，用高压后的 PBS漂洗3次、2min/次。(2)吸尽孔内液体，每孔加入100μL 4％多聚甲醛固定 30min。(3)弃去甲醛，用高压后的PBS漂洗3次，2min/次。(4)每孔加50μL 稀释10陪的Hoechst染色液，室温避光染色3-5min。(5)吸出染色液，用高压后 的PBS漂洗3次，4min/次。(6)最后在激发波长350nm左右、发射波长460nm 左右的荧光显微镜下观察并拍照。严格按照细胞凋亡荧光Hoechst33242检测试剂 盒说明书操作流程进行。

3.7姜三七挥发油对ox-LDL诱导HUVECs损伤的氧化应激指标的影响

细胞接种于6孔培养板内，37℃含5％CO2的培养箱内培养。细胞贴壁后吸净 培养液，造模后以3.5项下的6个实验组的药物分别给药，然后在37℃含5％CO2 的培养箱内继续培养24h。收集上清液、裂解液，ELISA法检测：LDH、MDA含 量、NO水平、SOD、GSH-Px、CAT活性等。

3.8细胞内活性氧的测定

取对数生长期的HUVECs细胞接种于12孔板，按3.5项下的6个实验组进行 分组，待其贴壁生长至80％后，弃旧培养基，用PBS洗三次。除对照组加入完全培 养液外，其他组都加入ox-LDL损伤24h，吸出损伤液，PBS洗涤2遍。然后对照 组和模型组分别加入完全培养液，给药组分别加入含不同浓度姜三七挥发油(10、 50、100ng/mL)和阿司匹林标准品溶液(50ng/mL)的完全培养液，药物作用24h 后，用预冷的PBS洗涤三次，用0.25％胰酶消化细胞，然后用完全培养基终止消化 收集细胞到1.5mL的离心管中，1000r/min离心5min，用PBS洗涤2次，将细胞 悬浮于稀释好的DCFH-DA中，37℃培养箱内孵育20min，每隔3-5min颠倒混匀， 使探针与细胞充分接触，用无血清细胞培养液洗涤细胞3次，以充分去除未进入细 胞内的DCFH-DA，用500μL的PBS重悬细胞，过200目细胞筛，收集于流失细胞 仪上样管内，上机检测。

3.9细胞凋亡的检测

取对数生长期的HUVECs细胞接种于12孔板，按3.5项下的6个实验组进行 分组，待其贴壁生长至80％后，弃旧培养基，用PBS洗三次。除对照组加入完全培 养液外，其他组都加入ox-LDL损伤24h，吸出损伤液，PBS洗涤2遍，对照组和 模型组分别加入完全培养液，给药组分别加入含不同浓度姜三七挥发油(10、50、 100ng/mL)和阿司匹林标准品溶液(50ng/mL)的完全培养液，药物作用24h后， 用预冷的PBS洗涤三次，收集贴壁细胞及漂浮细胞(用不含EDTA的0.25％胰酶消 化细胞)到1.5mL的离心管中，1000r/min离心5min，用PBS洗涤2次，离心弃 上清，每组分别加入500μL的1×Bingding buffer重悬细胞，加入5μL Annexin-V， 混匀，再加入5μL PI，混匀，室温静置15min，每个3-5min混匀一下，200目滤 网过滤细胞，收集于流式细胞仪上样管内。尽量使整个实验检测在1h内完成，检 测以488nm为激发波长，525nm为发射波长。

3.10 qRT-PCR检测基因的表达水平

将对数生长期细胞接种于6孔板中，按3.5项下的6个实验组进行分组，待其 贴壁生长至80％后，弃培养基，用PBS洗三次。除对照组加入完全培养液外，其他 组都加入ox-LDL损伤24h，吸出损伤液，PBS洗涤2遍，对照组和模型组分别加 入完全培养液，给药组分别加入含不同浓度姜三七挥发油(10、50、100ng/mL) 的完全培养液，阳性药组加入50ng/mL的阿司匹林标准品溶液，药物作用24h后， 用预冷的PBS洗涤三次，尽量吸干孔内PBS，每孔加入1mL的TRNzol-A+试剂， 吹打数次使裂解液与细胞充分混合接触，冰上静置5min，裂解充分后，将所有液体 转移到无RNase 1.5mL的离心管中，加入200μL氯仿，在振荡器上激烈振荡混合 15s，冰上静置15min，4℃，12000r/min，15min，离心后样品分为三层：下层为黄 色酚氯仿有机相，中间层以及上层为无色水相，RNA主要在水相中。将上层无色水 相液体(约400uL)转移至干净无RNase微量离心管中，加入等体积异丙醇，轻轻颠 倒混匀后冰上静置10min。4℃，12000r/min，15min，管底部和侧壁会出现RNA沉 淀(为RNA和Ca2+等盐离子混合物)。弃上清，沿管壁轻轻加入75％乙醇(用DEPC 处理水+无水乙醇配制)1mL，上下颠倒离心管清洗沉淀。4℃，7500orpm离心5min， 此步骤重复1次。倒掉乙醇清洗液(附于管底的乙醇用移液器吸弃)，室温放置5分 钟，使RNA晾干至透明状。加入无RNase的DEPC处理水10μL，用移液器反复吹 打数次，使其完全溶解。采用NanoDrop One 2000进行浓度及纯度检测。放置-80℃ 冰箱保存。

取上述方法获取的RNA样本，用逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA，-20℃ 保存备用。取cDNA用SuperReal荧光定量预混试剂配成20μL扩增体系，置于 7500Fast PCR仪中。

引物设计：以GAPDH作为内参基因，引物由武汉金开瑞生物工程有限公司合 成，序列如下：

逆转录反应体系及步骤：

组成成分	使用量
		5×FastKing-RT SuperMix	4μL
Total RNA	按浓度计算1μg RNA所需体积
		RNase-Free ddH2O	补足到20μL

按照下表所示进行反转录反应：

反应温度	反应时间	说明
			42℃	15min	去除基因组及反转录反应
95℃	3min	酶灭活过程

PCR扩增反应体系：

PCR扩增反应条件：采用两步法PCR反应程序进行反应，加温程序设置如下：

预变性： 95℃，15min

扩增循环40次，循环内容为：

变性： 95℃，10s

退火： 60℃，32s

3.11 Western blot法检测NQO1、HO-1的表达

将对数生长期细胞接种于6孔板中，按3.5项下的6个实验组进行分组，待其 贴壁生长至80％后，弃培养基，用PBS洗三次。除对照组加入完全培养液外，其他 组都加入ox-LDL损伤24h，吸出损伤液，PBS洗涤2遍，对照组和模型组分别加 入完全培养液，给药组分别加入含不同浓度姜三七挥发油(10、50、100ng/mL) 的完全培养液，阳性药组加入50ng/mL的阿司匹林标准品溶液，药物作用24h后， 用预冷的PBS洗涤三次，尽量吸干孔内PBS，每孔加入适量的含胰蛋白酶抑制剂 PMSF的RIPA(PMSF:RIPA＝1:100)裂解液，在冰上用细胞刮刮下贴壁细胞，收集 到1.5mL的离心管中，用1mL针头匀浆8次，置于冰上裂解30min后，4℃，12000rpm， 离心15min，取上清(注意不要吸到沉淀)到新的1.5mL离心管中，进行蛋白定量，然后将各组样品蛋白与5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液以4:1比例充分混匀，100℃ 沸水浴10min使蛋白变性。-20℃保存备用，-80℃可以长期保存。

蛋白样品提取后，根据蛋白定量结果确定蛋白上样量。10％SDS-PAGE凝胶恒 压电泳至分离胶底部，恒流转膜至PVDF膜上，用5％脱脂奶粉室温封闭2h，一抗 摇床孵育过夜，用TBST洗膜(每次10min，3次)，二抗室温摇床孵育1h，用TBST 洗膜(每次10min，3次)，发光液显色曝光，用化学发光仪扫描灰度值。

4.研究结果

4.1姜三七挥发油对正常的HUVECs的影响

按3.2项下方案进行实验，选取姜三七挥发油10、50、100、300、500ng/mL、 10、50、60、80、100、200μg/mL 11个剂量与内皮细胞共同作用24h后根据OD 值进行统计分析。与正常对照组比较，当挥发油的浓度在10ng/mL～60μg/mL时对 正常的HUVECs细胞没有毒性，但＞80μg/mL时有明显的细胞毒性，均具有显著 统计学意义(P＜0.01)。结果见表1，图1，图2。

表1姜三七挥发油对正常的HUVECs的影响(24h)(

n＝6)

4.2 ox-LDL诱导HUVECs损伤的量效-时效关系

按3.3项下方案进行实验，选取ox-LDL 50、100、200、300μg/mL 4个剂量与 内皮细胞共同作用24h、48h后根据OD值进行统计分析。与正常对照组比较，随 着ox-LDL浓度的不断增大，HUVECs的存活率不断下降；随着时间的延长，细胞 的存活率也逐渐下降，呈浓度-时间依赖关系。而200μg/mL ox-LDL对细胞诱导24 h的存活率达到54.32％。因此选择200μg/mL ox-LDL损伤HUVECs细胞24h作为 最佳造模条件。结果见表2，图3，图4。

表2 ox-LDL诱导HUVECs损伤的量效-时效关系(

n＝6)

与正常对照组比较，***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05；与模型组比较，###P ＜0.001，##P＜0.01，#P＜0.05.

4.3姜三七挥发油对ox-LDL诱导HUVECs损伤模型的作用

按3.4、3.5项下方案进行实验，发现200μg/mL ox-LDL显著降低细胞的存活 率，正常对照组比较，差异有显著统计意义(P＜0.01)。造模后分别给药姜三七挥发 油(10、50、100、300、500ng/mL)、阿司匹林标准品(50ng/mL)作用24h后， 均能提高细胞的存活率，除10ng/mL的挥发油效果不明显，其他组差异均有统计 意义。因此提示，姜三七挥发油能提高ox-LDL诱导的细胞存活率。结果见表3， 图5，图6。

表3 MTT法分析各药物对200mg/L ox-LDL诱导HUVECs损伤的影响(

n＝6)

与正常对照组比较，***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05；与模型组比较，###P ＜0.001，##P＜0.01，#P＜0.05；与ASP.比较，&&P＜0.01.

4.4姜三七挥发油对ox-LDL损伤的HUVECs保护作用形态学分析

按3.6项下方案进行实验，荧光显微镜观察可见Hoechst 33242荧光染色，对照 组细胞呈均匀微弱的荧光，200μg/mL ox-LDL作用HUVECs细胞后，细胞的体积、 形态及细胞内的结构均发生了明显的变化，细胞膜与细胞核呈浓缩致密的强蓝色荧 光，显微镜下可见大量的细胞核碎片，并且细胞的死亡数量增加，细胞的数量明显 减少。凋亡细胞主要表现为细胞核浓缩及细胞核碎裂等典型改变。再用不同浓度姜 三七挥发油(10、50、100ng/mL)和阿司匹林标准品溶液(50ng/mL)培养24h后， 与模型组比较，中剂量组、高剂量组和阳性药组的细胞数量明显增加，细胞蓝色荧 光强度减弱，细胞碎片减少，而且凋亡细胞的数量也减少，结果见图7。

4.5姜三七挥发油对ox-LDL诱导HUVECs的氧化应激指标的影响

按3.7项下方案进行实验，200μg/mL ox-LDL显著升高细胞的LDH、MDA含 量，降低细胞的NO含量、SOD、CAT、GSH-Px的活性，与正常对照组比较，差 异有显著统计意义(P＜0.05或P＜0.01)。造模后分别给药姜三七挥发油(10、50、100ng/mL)、阿司匹林标准品(50ng/mL)作用24h后，均能降低细胞的LDH、 MDA含量，升高细胞的NO含量、SOD、CAT、GSH-Px的活性，除10ng/mL的 挥发油效果不明显，其他组差异均有统计意义。因此提示，姜三七挥发油能提高 ox-LDL诱导的细胞损伤。结果见表4，图8。

表4GPNEO对HUVECs损伤LDH、NO、MDA含量和SOD、CAT、GSH-Px 活性的影响(

n＝6)

与正常对照组比较，***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05；与模型组比较，###P ＜0.001，##P＜0.01，#P＜0.05；与ASP.比较，&&P＜0.01.

4.6姜三七挥发油对ox-LDL诱导HUVECs细胞内的活性氧的影响

按3.8项下方案进行实验，使用活性氧检测试剂盒通过流式细胞仪检测各组细 胞内活性氧水平结果见表5，图9，图10，模型组的ROS水平为118.95％，与对照 组(100％)相比，具有显著统计学差异(P＜0.01)。当分别给药姜三七挥发油(10、 50、100ng/mL)、阿司匹林标准品溶液(50ng/mL)作用24h后，与模型组相比， 均能降低细胞内的ROS水平，除10ng/mL的挥发油效果不明显，其他组均具有显 著统计差异(P＜0.05)。因此提示，姜三七挥发油能降低ox-LDL诱导的HUVECs 细胞内ROS水平的升高。

表5姜三七挥发油对ox-LDL诱导HUVECs的细胞内活性氧的影响(％，

n＝3)

与正常对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05.

4.7姜三七挥发油对ox-LDL诱导HUVECs的细胞凋亡的影响

按3.9项下方案进行实验，Annexin V FITC/PI双染流式细胞检测部分结果见表6，图11，图12，位于右下象限Q4(FITC+,PI-)为细胞早凋，右上象限Q2(FITC+,PI+) 为晚期凋亡细胞，在左下象限双阴性Q3(FITC-,PI-)细胞则为活细胞。HUVECs细 胞凋亡率如图所示，模型组的凋亡率为27.93％，与对照组相比，具有显著统计学差 异(P＜0.01)。当分别给药姜三七挥发油(10、50、100ng/mL)、阿司匹林标准品 溶液(50ng/mL)作用24h后，细胞凋亡率分别为19.13％，13.33％，13.77％，12.90％， 与模型徐相比，均具有显著统计学差异(P＜0.05或P＜0.01)。因此提示，姜三七 挥发油能降低ox-LDL诱导的HUVECs细胞凋亡。

表6姜三七挥发油对ox-LDL诱导HUVECs的细胞凋亡率的影响(％，

n＝3)

与正常对照组比较，**P＜0.01，*P＜0.05；与模型组比较，##P＜0.01，#P＜ 0.05.

4.8姜三七挥发油对ox-LDL诱导HUVECs的细胞凋亡相关基因表达的影响

按3.10项下方案进行实验，实时荧光定量PCR反应结束后，得到内参基因 (GAPDH)和目的基因(Bax、Bcl-2)典型的“S”型扩增曲线，扩增曲线的横坐 标为循环次数，纵坐标为荧光强度变化。熔解曲线呈较为锐利的单一峰，无非特异 性扩增。结果见图13。

各实验组细胞中细胞凋亡相关基因表达情况，结果如图14，模型组细胞Bcl-2mRNA表达显著降低、Bax mRNA表达显著升高，与对照组比较具有显著统计学差 异(P＜0.01)。当分别给药姜三七挥发油(10、50、100ng/mL)、阿司匹林标准品 溶液(50ng/mL)作用24h后，与模型组相比，除10ng/mL的挥发油效果不明显， 其他组均能增强Bcl-2mRNA表达、降低Bax mRNA表达，均具有显著统计差异(P ＜0.01)。

因此提示，姜三七挥发油能提高ox-LDL诱导的HUVECs细胞Bcl-2mRNA表 达、降低Bax mRNA表达。

4.9姜三七挥发油对ox-LDL诱导HUVECs的抗氧化相关基因表达的影响

按3.11项下方案进行实验，实时荧光定量PCR反应结束后，得到内参基因 (GAPDH)和目的基因(Nrf2、NQO1、HO-1)典型的“S”型扩增曲线，扩增曲 线的横坐标为循环次数，纵坐标为荧光强度变化。熔解曲线呈较为锐利的单一峰， 无非特异性扩增。结果见图13。

各实验组细胞中Nrf2及其下游抗氧化基因NQO1、HO-1的表达情况，结果如 图15，模型组细胞Nrf2、NQO1、HO-1mRNA表达显著降低，与对照组比较具有 显著统计学差异(P＜0.01)。当分别给药姜三七挥发油(10、50、100ng/mL)、阿 司匹林标准品溶液(50ng/mL)作用24h后，与模型组相比，均能增强细胞Nrf2、 NQO1、HO-1mRNA表达，均具有显著统计差异(P＜0.05)。因此提示，姜三七挥 发油能提高ox-LDL诱导的HUVECs细胞Nrf2、NQO1、HO-1mRNA表达。

4.10姜三七挥发油对ox-LDL诱导HUVECs的抗氧化相关基因蛋白表达的影响

各实验组细胞中抗氧化基因蛋白的表达情况，结果如图16，模型组细胞NQO1、 HO-1基因蛋白表达量显著降低。当分别给药姜三七挥发油(10、50、100ng/mL)、 阿司匹林标准品溶液(50ng/mL)作用24h后，与模型组相比，除10ng/mL的挥 发油效果不明显，其他组均能增加NQO1、HO-1基因蛋白表达量。因此提示，姜 三七挥发油能提高ox-LDL诱导的HUVECs细胞的NQO1、HO-1基因蛋白表达。

5.结论

5.1通过ox-LDL对HUVECs损伤的作用成功建立了氧化损伤模型

5.2姜三七挥发油对ox-LDL诱导的HUVECs氧化损伤具有保护作用。

5.3姜三七挥发油对ox-LDL诱导的HUVECs损伤保护作用可能与Nrf2/ARE 抗氧化应激通路以及抑制Bax和提高Bcl-2的表达有关。

Claims (8)

1.姜三七植物在制备治疗和/或预防血管内皮损伤药物的应用。

2.姜三七根茎在制备治疗和/或预防血管内皮损伤药物的应用。

3.姜三七提取物在制备治疗和/或预防血管内皮损伤药物的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的姜三七提取物为姜三七挥发油。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：

所述姜三七挥发油中含有的活性成份包括：1R-α-蒎烯、莰烯、3-蒈烯、（+）-柠檬烯、可巴烯(α-蒎烯)、2-壬基醇、D-樟脑、香树烯、γ-衣兰油烯、α-杜松烯、1,6-二甲基-4-异丙基四氢萘、石竹素、3，3，6，6-四甲基-3，6，7，8-四氢化-并茚-1(2H)-酮。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述姜三七挥发油中包括以下重量份的活性成份：1R-α-蒎烯6-10、莰烯18-24、3-蒈烯3-8、（+）-柠檬烯1-2、可巴烯(α-蒎烯) 12-18、2-壬基醇0.8-2、D-樟脑6-12、香树烯4-10、γ-衣兰油烯1-2、α-杜松烯1-2、1,6-二甲基-4-异丙基四氢萘0.8-2、石竹素1-3、3，3，6，6-四甲基-3，6，7，8-四氢化-并茚-1(2H)-酮6-11。

7.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述姜三七挥发油的制备方法包括以下步骤：

取姜三七粉碎成粗粉，加入药材总重量3-7倍的水浸泡0.5-3小时，通过水蒸汽蒸馏提取3-6小时；然后继续水蒸汽蒸馏提取提取2-5次，每次加入药材总重量3-7倍的水，每次提取时间为3-6小时；收集混合各次提取的上层精油，即得。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述姜三七挥发油的制备方法包括以下步骤：

取姜三七粉碎成粗粉，加入药材总重量5-6倍的水浸泡1-2小时，通过水蒸汽蒸馏提取3-5小时；然后继续水蒸汽蒸馏提取提取3-4次，每次加入药材总重量3-5倍的水，每次提取时间为3-5小时；收集混合各次提取的上层精油，用无水乙醚溶解，加无水硫酸钠脱水，回收乙醚后，收集得橘黄色挥发油，即得。

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