CN110452948A - 鹿心蛋白水解物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种鹿心蛋白水解物及其制备方法和应用，属于生物医药技术领域。该制备方法包括以下步骤：前处理：取鹿心，加入生理盐水后进行组织匀浆，制得酶解原液，待用；酶解：取上述酶解原液，加入胃蛋白酶进行酶解反应，得酶解液；纯化：取上述酶解液，以葡聚糖凝胶柱进行分离纯化，取3KD‑15KD的多肽，即得。本发明本文以梅花鹿鹿心为原料，经过组织匀浆处理，采取合适的酶解方法，获得小分子多肽物质。并建立衰老的心肌细胞模型，采用MTT法检测各种酶解产物对心肌细胞增殖率的影响，实验证实所得鹿心蛋白水解物对缓解心肌细胞衰老具有较好的活性。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种鹿心蛋白水解物及其制备方法和应用。
背景技术
梅花鹿(Cervus nippon)是一种东亚季风区特产的珍贵药用动物,兼具肉用、皮用和观赏用,具有很高的经济价值。鹿心是补气安神的佳品，以形补形的传统中医理论认为，鹿心可以治疗风湿性心脏病、心力衰竭、心慌心悸等多种有关心脏方面的疾病，以其得天独厚的营养价值和传统食用鹿心的习惯，一直以来备受专家和学者的青睐，在研究心脏疾病和抗衰老方面称成为了热点。
然而，梅花鹿心在民间配伍中草药，以丸散等剂型或以药膳方式用于心脏疾病的治疗。传统的鹿心作为名贵药材经常被人类用来烹饪成美食佳肴，目前并没有现代医学对梅花鹿深入的研究。
发明内容
基于此，有必要针对上述问题，提供一种鹿心蛋白水解物及其制备方法和应用，采用现代化医学手段对梅花鹿鹿心的有效成分进行了深入的研究，得到的鹿心蛋白水解物对缓解心肌细胞衰老具有较好的活性。
一种鹿心蛋白水解物的制备方法，包括以下步骤：
前处理：取鹿心，加入生理盐水后进行组织匀浆，制得酶解原液，待用；
酶解：取上述酶解原液，加入胃蛋白酶进行酶解反应，得酶解液；
纯化：取上述酶解液，以葡聚糖凝胶柱进行分离纯化，取3KD-15KD的多肽，即得。
本发明本文以梅花鹿鹿心为原料，经过组织匀浆处理，采取合适的酶解方法，以获得分子量小于15KD的小分子多肽物质。酶解反应温和，条件可控，副产物生成较少，本文选用胃蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶三种酶，对鹿心蛋白进行水解，在各种酶的最适反应条件下，制得各种酶解产物，建立衰老的心肌细胞模型，采用MTT法检测各种酶解产物对心肌细胞增殖率的影响，以得到最合适的酶为胃蛋白酶，所得鹿心蛋白水解物对缓解心肌细胞衰老具有较好的活性。
在其中一个实施例中，所述前处理步骤中，还将均浆液在3000-4000r/min离心20-40min，取上清液，制得所述酶解原液。上述超高速离心得到鹿心蛋白上清液，对上清液进行酶解可提高酶解效率及多肽产率。优选的，按照1：9的料液比加入生理盐水进行匀浆。
在其中一个实施例中，所述酶解步骤中，加入酶量为5000±1000U/g鹿心，所述酶解反应在pH为1.7±0.2，温度为37±1℃的条件下反应120±20min。酶解反应可以提高蛋白质的生物活性和利用度，提高多肽产率，每一种蛋白酶对底物都有特异性，这种特异性和水解条件参数(pH、时间、温度)将会影响肽链的大小和氨基酸的序列，也会影响游离氨基酸的生成量，最终影响酶解产物的生物活性。采用上述方法酶解，具有最佳的酶解效率和生物活性。
在其中一个实施例中，所述纯化步骤中，采用Sephadex G-50进行分离纯化，具体方法为：柱平衡后上样，以1±0.1ml/min的流速洗脱，紫外280±2nm检视，收集洗脱体积为第90-210ml的馏分，去除溶剂，即得。
在其中一个实施例中，柱体积为2.5×60cm(直径×高)，收集第90-150ml的馏分，优选90-125ml馏分。
利用分子筛原理，采用Sephadex G-50对蛋白水解物进行分离，大分子物质在凝胶柱中，直径较大，不易进入凝胶颗粒的内部，所以会被先洗脱出来。小分子物质直径较小，可以在凝胶颗粒之间和凝胶颗粒内部扩散，因此洗脱时间较长，最后流出。上述组份在冷冻干燥后作用于衰老心肌细胞具有最佳效果。
本发明还公开了上述的鹿心蛋白水解物的制备方法制备得到的鹿心蛋白水解物。
上述鹿心蛋白水解物，能够清除衰老心肌细胞的氧自由基，提高心肌细胞超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽还原酶的含量，降低心肌细胞丙二醛的含量，从而提高心肌细胞的抗氧化水平，改善心肌细胞衰老。并通过进一步的研究表明，鹿心蛋白水解物改善心肌细胞衰老可能与降低P21、P53、Bax的表达，提高Bal-2的表达有关。
在其中一个实施例中，所述水解物为3KD-15KD的多肽。
本发明还公开了上述的鹿心蛋白水解物作为P53和/或P21蛋白抑制剂中的应用。
本发明还公开了上述的鹿心蛋白水解物作为Bax蛋白抑制剂中的应用。
本发明还公开了上述的鹿心蛋白水解物作为Bcl-2蛋白激活剂中的应用。
本发明还公开了上述的鹿心蛋白水解物在制备用于抗心肌衰老药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的一种鹿心蛋白水解物的制备方法，以梅花鹿鹿心为原料，经过组织匀浆处理，采取合适的酶解方法，以获得分子量小于15KD的小分子多肽物质。酶解反应温和，条件可控，副产物生成较少，本文选用胃蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶三种酶，对鹿心蛋白进行水解，在各种酶的最适反应条件下，制得各种酶解产物，建立衰老的心肌细胞模型，采用MTT法检测各种酶解产物对心肌细胞增殖率的影响，以得到最合适的酶为胃蛋白酶，所得鹿心蛋白水解物对缓解心肌细胞衰老具有较好的活性。
并通过进一步的研究表明，该鹿心蛋白水解物改善心肌细胞衰老可能与降低P21、P53、Bax的表达，提高Bal-2的表达有关。
附图说明
图1为Folin-酚标准曲线；
图2为各种酶解产物对衰老心肌细胞增殖率的影响；
图3为Sephadex G-50的洗脱曲线；
图4为各组分(P1-P3)对衰老心肌细胞的增殖影响；
图5为Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳分析；
图6为倒置相差显微镜观察心肌细胞；
其中：A为×10，3d；B为×20，3d；
图7为β-半乳糖苷酶染色鉴别衰老心肌细胞；
图8为DAPI染色鉴别心肌细胞凋亡结果；
图9为心肌细胞SOD、MDA、CAT、GSH-PX含量检测结果；
图10为流式细胞仪心肌细胞凋亡率检测结果；
图11为Western-Blot法检测P21、P53、Bcl-2、Bax的表达。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
1、材料与试剂
鹿心：吉林市双阳梅花鹿鹿场；Wistar大鼠：实验动物生产许可证号:SCXK(吉)-2016-0003，动物批号:201800020754
2、主要试剂的配制
(1)MTT(5mg/mL)溶液的配制：用天平精密称取20mg MTT粉末，溶于4mL PBS中，用锡纸包好EP管，轻轻震荡使其完全溶解，至肉眼不可见细小微粒，用0.22μm针孔式滤器过滤，放于4℃冰箱中，避光宝保存并现用现配。
(2)阿糖胞苷溶液的配制：用天平精密称取6.71mg阿糖胞苷，用10mL三蒸水溶解并混匀，用0.22μm针孔式滤器过滤，分装冻存于-20℃冰箱中，使用时，取100μL阿糖胞苷液体加入2mL乳鼠心肌细胞培养液中，即为浓度0.1mmol/L。
(3)10g/L D-半乳糖的配制：取100mg D-半乳糖溶于10mL灭菌水中，并用0.22μm针孔式滤器过滤。
(4)30％分离胶储存液：称取丙烯酰胺30g，N,N'-亚甲基丙烯酰胺0.8g，溶于双蒸水中，最后定容至100mL，过滤，置于棕色瓶中，4℃保存。
(5))分离胶缓冲液(3mol·L-1Tris-HCl缓冲液，pH 8.9)：称取Tris 36.3g，溶于双蒸水中，用1mol·L-1HCl调pH值至8.9，用双蒸水定容至100mL，4℃保存。
(6)10％浓缩胶储存液：称取丙烯酰胺10g，N,N'-亚甲基丙烯酰胺0.5g，溶于双蒸水中，最后定容至100mL，过滤，置于棕色瓶中，4℃保存。
(7)10％SDS：称取SDS 1g，加入去离子水100mL，加热使之充分溶解，室温保存。如果长期保存过程中出现沉淀，则用水浴加热，待沉淀溶解后使用。
(8)1％TEMED：取TEMED 1mL，加双蒸水至100mL，置棕色瓶中，4℃保存。
(9)20％过硫酸铵：称取过硫酸铵0.2g，溶于1mL去离子水中，4℃保存，该试剂最好现用现配。
(10)转膜缓冲液：称取甘氨酸2.90g、Tris 5.80g、SDS 0.37g，溶解在700m L双蒸水中，加200mL甲醇，最后加双蒸水定容至1000mL，4℃保存。
(11)10×TBS：称取Tris 22.25g、NaCl 88g溶解在800mL双蒸水中，然后用HCl调pH至8.0，加双蒸水定容至1000m L，使用时用双蒸水稀释10倍。
(12)TBST：为含0.1％吐温-20的TBS，即在999mL TBS中加入1mL吐温-20。
(13)封闭液：称取脱脂奶粉5g，将其溶解在100mL TBST中，即为5％脱脂奶粉的TBST溶液(W/V)。
3、实验仪器
实施例
一、前处理。
将冷冻好的梅花鹿鹿心从-80℃冰箱中取出，4℃条件下解冻，用蒸馏水洗净，至无血水，用洁净的刀将鹿心切碎成小块，称取10g鹿心按照液料比为1：9加入生理盐水90ml对鹿心进行组织匀浆，3500r/min离心30min，取上清，将上清液放在4℃冰箱中冷藏以备后续实验。
二、酶解。
1、酶的筛选。
1.1 酶解。
选取胃蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶对鹿心上清液进行酶解，各种酶的最适反应条件如下：
表1各种酶的最适反应条件
在各种酶的最适反应温度下，反应时间为3h，以相同的酶活力添加(5000U/g Pr)，反应完全后90℃水浴10min，对酶进行灭活，离心(10000r/min，20min)取上清液，将上清液冻干，将酶解产物用0.22μm滤膜过滤，调整合适的浓度，作用于衰老的心肌细胞，筛选出最合适的酶。
1.2 活性筛选方法。
1.2.1 Folin-酚试剂盒检测多肽产率
严格按照试剂盒进行操作，在660nm处用酶标仪检测吸光度，绘制标准曲线，标准曲线见图1。
1.2.2 心肌细胞的原代培养
(1)对细胞室进行紫外照射，消毒处理，将新出生1-3d内的Wistar大鼠乳鼠浸泡在75％乙醇溶液中10s，无菌条件下取出乳鼠心脏15只，实验过程均在冰盒上完成。
(2)用预冷的PBS洗净心脏内的血液，3次，去除心脏上的筋膜和结缔组织，取心尖部分，用眼科弯剪刀将心尖部分尽可能剪碎，将心脏组织置于预冷的高糖DMEM培养液中，静置5min除去培养液。
(3)向心脏组织中加入10ml 0.25％的胰蛋白酶，37℃水浴下消化10min，除去上清液，在向心脏组织中加入0.125％的胰蛋白酶6ml，37℃水浴下消化10min，用移液枪吸出消化液并向其中加入等体积的含15％胎牛血清的高糖DMEM培养液，重复数次，直至心脏组织消化完全。
(4)将含有血清的消化液过200目筛网，1500r/min离心10min，去掉上清液，用含15％FBS的高糖DMEM培养液10ml混匀细胞。
(5)将细胞混悬液放入75cm2细胞培养瓶中，将培养瓶放入37℃、含5％CO2的孵箱中差速贴壁培养2h，吸出培养液并调整细胞浓度为5×105个/ml接种到6孔板中，1.5×104个/ml接种到96孔板中，并向每孔中加入阿糖胞苷，培养3d进行后续实验。
1.2.3 D-半乳糖诱导心肌细胞衰老模型的建立
将1.5x104个/mL心肌细胞接种96孔板中,每孔200μL,待细胞接近融合状态时每孔分别加入5g/L、10g/L、15g/L、20g/L的D-半乳糖溶液，用正常高糖培养液培养的细胞为对照组，每孔各设3个平行孔，选取不同时间点，用MTT法检测心肌细胞存活率，每孔加入5mg/mLMTT，37℃孵箱中继续培养4h,之后每孔加入150μL DMSO溶解MTT蓝紫色结晶，在酶标仪波长490nm处测定吸光度，并计算细胞增殖率。
1.2.4 MTT法检测各种酶解物对衰老心肌细胞的增殖作用
将原代培养的心肌细胞以1.5×104个/mL接种到96孔板中，待细胞培养至80％融合时，以D-半乳糖诱导，建立心肌细胞衰老模型，每孔100μL，以10g/L的D-半乳糖培养心肌细胞48h，正常细胞不加任何处理，给药组细胞分别加入不同浓度的鹿心蛋白酶解产物，酶标仪在490nm处检测OD值。
(1)胃蛋白酶水解物对衰老心肌细胞率增殖的影响
细胞贴壁后，将96孔板中的培养液移除，加入浓度为100、200、300、400μg/mL的胃蛋白酶水解物的培养液，每个浓度设4个复孔。将该96孔板置于培养箱中培养24h，药物作用结束后，每孔加入20μL MTT试剂，置于培养箱培养3-4h后，终止培养，小心吸去孔内培养液，每孔加入150μL DMSO，37℃孵箱中孵育10min，使用酶标仪在490nm处测OD值。细胞增殖率(％)＝[(给药组OD-空白组OD)/(对照组OD-空白组OD)]×100％，做3次平行。
(2)胰蛋白酶水解物对衰老心肌细胞增殖率的影响
细胞贴壁后，将96孔板中的培养液移除，加入浓度为100、200、300、400μg/mL的胰蛋白酶水解物的培养液，每个浓度设4个复孔。将该96孔板置于培养箱中培养24h，药物作用结束后，每孔加入20μL MTT试剂，置于培养箱培养3-4h后，终止培养，小心吸去孔内培养液，每孔加入150μL DMSO，37℃孵箱中孵育10min，使用酶标仪在490nm处测OD值。细胞增殖率(％)＝[(给药组OD-空白组OD)/(对照组OD-空白组OD)]×100％，做3次平行。
(3)碱性蛋白酶水解物对衰老心肌细胞增殖率的影响
细胞贴壁后，将96孔板中的培养液移除，加入浓度为100、200、300、400μg/mL的碱性蛋白酶水解物的培养液，每个浓度设4个复孔。将该96孔板置于培养箱中培养24h，药物作用结束后，每孔加入20μL MTT试剂，置于培养箱培养3-4h后，终止培养，小心吸去孔内培养液，每孔加入150μL DMSO，37℃孵箱中孵育10min，使用酶标仪在490nm处测OD值。细胞增殖率(％)＝[(给药组OD-空白组OD)/(对照组OD-空白组OD)]×100％，做3次平行。
1.3 活性筛选结果。
1.3.1 Folin-酚标准曲线的绘制
由图1可以看出，标准曲线为Y＝0.0015x+0.1399，R2>0.999，差异具有统计学意义。
1.3.2 D-半乳糖诱导心肌细胞衰老模型建立
不同作用时间和浓度的细胞增殖率如下表所示。
表2不同作用时间和浓度对D-半乳糖浓度的筛选
从上述结果中可以看出，培养3d以后的细胞基本融合，加入不同浓度的D-半乳糖：5g/L、10g/L、15g/L、20g/L，培养至不同时间，细胞经D-半乳糖诱导后，吸光度逐渐升高，在48h后达到最高，随后下降，在10g/L时，吸光度接近正常组，所以在D-半乳糖浓度为10g/L，作用细胞48h后，对细胞是有利的。
1.3.3 不同酶水解物对衰老心肌细胞增殖率的影响
不同酶水解物对衰老心肌细胞增殖率的影响如图2所示，图中Con表示空白对照组，Pep表示胃蛋白酶水解物组，Try表示胰蛋白酶水解物组，Alk表示碱性蛋白酶水解物组。从上述结果中可以看出，与正常组相比，胃蛋白酶水解的蛋白产物作用于衰老心肌细胞的增殖率较胰蛋白酶和碱性蛋白酶高，P<0.05，差异具有统计学意义，故选用胃蛋白酶作为最佳水解酶进行后续试验。
1.4 蛋白水解工艺优化方法。
筛选出最佳蛋白酶为胃蛋白酶，以酶解时间、温度、pH为试验因素，设计正交试验，以确定最佳的酶解条件，试验重复3次，并采用极差分析法得出最佳工艺条件，并进行验证。
1.5 蛋白水解工艺优化结果。
胃蛋白酶水解鹿心蛋白正交试验结果如下表所示。
表3胃蛋白酶水解鹿心蛋白正交实验分析
表4胃蛋白酶水解鹿心蛋白方差分析
从上述结果中可以看出，酶解时间对多肽提取率的影响显著，因此三个因素对实验指标的影响的的主次顺序是时间>温度>pH值，酶解时间的长短决定了酶解反应的完全与否，极大的提高了鹿心多肽的产率，温度和pH对蛋白酶的活性有影响，对多肽的提取影响较小。正交实验结果筛选出的最佳反应条件为pH值1.7，37℃条件下处理120min。
三、纯化。
1、Sephadex G-50对蛋白水解物的分离纯化。
1.1 方法。
取适量的Sephadex G-50凝胶干粉，用研钵棒进行研钵，确保颗粒要均匀，加入足量的去离子水溶胀，在4℃冰箱中过夜，使得凝胶溶胀完全。充分溶胀后，倾倒掉浮在表面上的微小颗粒，进行装柱处理。将2.5×70cm层析柱垂直固定于铁架台上，关闭柱出水口，向柱内加入柱体积约1/3的蒸馏水，然后边搅拌边加入处理好的凝胶，用玻璃棒引流将凝胶装入层析柱中，待凝胶沉积后打开出水口，同时不断缓慢加入凝胶混悬液，待沉积胶面上升至标记处时，灌胶完毕。等凝胶完全沉淀(凝胶柱高为60ml)后，用2-3倍柱床体积的蒸馏水进行平衡。
经平衡后，胶头滴管吸去凝胶表面多余的蒸馏水，关闭出水口。用加样器吸取10ml样品溶液(0.05-0.07g/ml)，贴柱内壁缓慢加入，加样完毕后打开出水口，让样品缓慢渗入凝胶床内，待液面恰与凝胶表面持平时在加入蒸馏水冲洗内壁，进行洗脱。流速为1ml/min，紫外检测仪在280nm处检测，绘制洗脱曲线。
1.2 结果。
洗脱曲线见图3所示，层析柱的流速为1ml/min，每2ml收集1管，在紫外检测仪280nm处进行检测，绘制洗脱曲线，得到三个峰，收集每个峰对应的酶解产物。
1.3 活性筛选。
将上述三个组分(峰1-3)冻干，用0.22μm的滤膜对蛋白水解物进行过滤，作用于衰老的心肌细胞，按照上述方法检测各个组分对衰老心肌细胞增值率的影响。
结果如图4所示，从结果中可以看出，峰1(P1：洗脱体积第90-125ml)对应的酶解产物对衰老的心肌细胞的增值作用是最高的，故选用峰1对应的酶解产物(以下定义为鹿心蛋白水解物A)进行后续实验的研究。
四、鹿心蛋白水解物质量测定及活性验证。
1、Tricine-SDS-PAGE鉴定多肽的存在。
常规的SDS-PAGE凝胶电泳可以鉴别分子量为10-200KD分子量的蛋白质，但对于分子量小于10KD的蛋白质鉴别较差，故本实验采用Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳对分子量小于10KD的蛋白进行鉴别。
1.1 方法。
1.1.1 凝胶成分。
表5凝胶的制备
1.1.2 分离胶的制备
①将49.5％T，6％C贮存液、凝胶缓冲液、脲按照上表在试管中混匀，并使脲完全溶解。
②加过硫酸铵和TEMED轻轻搅拌使其混匀。
③用移液枪轻轻吸取凝胶缓冲液缓慢加入两块玻璃板之间，距离玻璃板顶端3cm处。
④在分离胶溶液上面轻轻加入少量水，使凝胶表面变得平整。
⑤等待30min后，待凝胶聚合后弃去水层，并用吸水纸吸干残留水分。
1.1.3 间隙胶的制备
①将49.5％T，3％C贮存液、凝胶缓冲液按表在一个小试管中混匀。
②加入过硫酸铵和TEMED,轻轻搅拌使其混匀，用移液枪吸取并加入两块玻璃板之间。
③轻轻在分离胶溶液上覆盖少许水,使凝胶表面变得平整。
④等待30min后,使凝胶聚合后弃去水层,并用吸水纸吸干残留的水分。
1.1.4 浓缩胶的制备
①将49.5％T，3％C贮存液、凝胶缓冲液按表在一个小试管中混匀。
②加入过硫酸铵和TEMED，轻轻搅拌使其混匀。
③用移液枪轻轻吸取凝胶溶液加在间隙胶上面，直至凝胶溶液到达玻璃板的顶端。
④将梳子插入凝胶内。
⑤等待30min后，使凝胶聚合。
⑥聚合后，小心地拔出梳子，不要产生气泡。
1.1.5 上样
①将凝胶放入电泳槽内,内槽装阴极缓冲液,外槽装阳极缓冲液。
②将提取的鹿心冻干粉溶于蒸馏水后和上样缓冲液按1：1的比例混合均匀,沸水浴10min，Marker沸水浴10min。
③取10μL样品溶液加入点样孔内,另取10μL蛋白质标准品加入另一点样孔。
1.1.6 电泳
①先恒压60V，当样品进入分离胶后,电压升至90V，当溴酚蓝指示剂跑到距离凝胶底部约1cm处时，停止电泳。
②从电泳槽中取出凝胶玻璃板，轻轻撬开玻璃板后小心地取下凝胶。
1.1.7 染色和脱色
将取下的凝胶置于染色液中染色后转至脱色液中多次脱色直到背景清晰。
1.2结果。
结果如图5所示，图中左侧条带为Marker，右侧条带为鹿心蛋白水解物A，出现多条条带，根据低分子量Marker的条带判断水解产物的分子量，鹿心蛋白水解产物的条带分布较广，较宽的三条条带分子量大约为3.3KD、6.5KD和15.0KD，证明大多数鹿心蛋白都被胃蛋白酶所水解。
2、β-半乳糖苷酶鉴别衰老心肌细胞
心肌细胞以3×105个/mL接种到6孔板中，每组设三个复孔，细胞贴壁后，进行实验分组，正常组为未经处理的心肌细胞，衰老组为10g/L的D-半乳糖处理的心肌细胞，实验组为鹿心蛋白水解物A100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL预处理过在经10g/L的D-半乳糖处理的心肌细胞。48h后吸走培养基，PBS冲洗2次，室温下经多聚甲醛和戊二醛固定10-15min，吸走固定液，PBS冲洗2次，加入X-gal染色液，在无CO2的37℃恒温培养箱中培养24h，倒置相差显微镜下可见衰老细胞细胞质呈现蓝色。
图6为倒置相差显微镜观察正常组心肌细胞，A为放大10倍，B为放大20倍，图中可以看出，心肌细胞刚开始接种后为圆形，接种48h后大多数细胞贴壁，呈延展性生长，细胞形态为火焰型、梭形、或多角形，排列松散，且出现伪足相互交织呈网状结构。细胞开始出现同步搏动，每分钟约为120次左右。
实验组如图7所示，其中A为衰老组心肌细胞，B为实验组心肌细胞。从图中可以看出，心肌细胞经10g/L D-半乳糖作用48h后，经β-半乳糖苷酶染色后，大多数心肌细胞细胞质被染成蓝色，证明心肌细胞已达到衰老的水平。经鹿心蛋白水解物预处理后，在相同的实验条件下，衰老细胞数量显著下降，证明鹿心蛋白水解物A能够改善细胞的衰老水平。
3、DAPI染色法检测细胞凋亡
DAPI为一种荧光染料，可以穿透细胞膜与细胞核中的双链DNA结合而发挥标记的作用，显微镜下可以看到显蓝色荧光的细胞，荧光显微镜观察细胞标记的效率高，且对活细胞无毒副作用。
将处理后的各组细胞加入DAPI染液，于37℃孵箱中染色15min。染色结束后，弃去DAPI染色液，加入甲醇1ml洗去残留的DAPI染色液，再加入PBS 1ml，于荧光倒置显微镜下观察并拍照。
结果如8所示，图中A为正常心肌细胞，B为衰老心肌细胞，C为鹿心蛋白水解物A预处理心肌细胞，从图中可以看出，DAPI染色荧光镜下观察，衰老细胞核中DNA显示点状聚集分布，细胞核收缩和染色质浓缩略有增加，箭头表示D-半乳糖诱导的细胞核收缩和染色质凝聚，经鹿心蛋白水解物A的预处理，衰老的心肌细胞逐渐减少。
4、心肌细胞SOD、MDA、CAT、GSH-PX含量检测。
4.1 心肌细胞内SOD活力及MDA产生量的测定方法
正常生长的心肌细胞接种于24孔板上培养24h后，经给药处理后，加入0.25％胰酶消化后，血清中止消化，收集细胞转移到EP管内，1000r/min离心8min，将培养液吸净后加入500μL 0.01M PBS，混匀制成细胞悬液。反复冻融3次，取样量为200μL。详细操作操作方法及检测过程按照试剂盒说明进行。
4.2 细胞内CAT活性及GSH-Px活力的测定方法
正常生长的心肌细胞接种于24孔板上培养24h后，经给药处理后，加入0.25％胰酶消化后，血清中止消化，收集细胞转移到EP管内，1000r/min离心8min，将培养液吸净后加入500μL 0.01M PBS，混匀制成细胞悬液。反复冻融3次，取样量为200μL。详细操作操作方法及检测过程按照试剂盒说明进行。
4.3 检测结果。
结果如图9所示，图中A为正常心肌细胞，B为衰老心肌细胞，C为鹿心蛋白水解物A预处理心肌细胞，可以看出，与正常对照组比较，衰老细胞内SOD活性下降、MDA含量升高，细胞内CAT、GSH-PX活力明显降低，鹿心蛋白水解物A预处理组与之相反，说明鹿心多肽对机体自由基有清除作用，能够缓解衰老。
5、线粒体膜电位的测定。
将处理过的心肌细胞用0.25％胰蛋白酶消化后收集于离心管中，用PBS洗涤两次，离心去除细胞碎片，加入5mg/L的罗丹明123 50μL，轻轻混匀，37℃避光孵育30min(隔10min振摇1次)，PBS洗涤，2000r/min离心5min，弃去染液，加入Triton-X100 80μL轻轻混匀后，400目尼龙网过滤，流式细胞仪检测线粒体膜电位，激发光波长为488nm，发射光波长为534nm，数据采集分析应用Cellquest软件处理。结果如下表所示。
表6心肌细胞线粒体膜电位的检测
与正常组相比，衰老组心肌细胞的膜电位显著降低，与衰老组相比，鹿心蛋白水解物A可以明显提高衰老心肌细胞的MMP，差异显著。
6、流式细胞仪检测心肌细胞凋亡。
原理：Annexin是磷脂结合蛋白，与细胞膜上的磷脂酰丝氨酸(PS)有很高的亲和性。在调亡早期，细胞内膜的磷脂酰丝氨酸移位到细胞外膜，极易被荧光标记的AnnexinV(磷脂结合蛋白)检测到。由于PS外膜化比凋亡引起的核酸变化更早，所以该方法是检测早期调亡的灵敏指标。碘化丙啶(PI)，是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但能够透过凋亡中晚期和死细胞胞膜而使胞核红染。将AnnexinV与PI匹配使用进行双染色，可以区分活细胞、凋亡细胞核坏死细胞。
细胞以2×105个/mL接种至六孔板，按实验分组进行相应处理后，心肌细胞用不含EDTA的胰酶消化收集，然后用PBS洗涤细胞2次(2000rpm/min，离心5min)收集细胞；加入500μL的Binding Buffer悬浮细胞，再加入5μL AnnexinV于细胞悬液中，用移液器轻轻混匀，在加入5μL PI轻轻混匀，室温、避光、反应15min，再上流式细胞仪(激发波长488nm，发射波长530nm)进行检测。分别计算调亡细胞及坏死细胞占总细胞的比率，实验重复三次以上。结果如图10所示。
图10为流式细胞仪心肌细胞凋亡率检测结果，图中A为正常心肌细胞，B为衰老心肌细胞，C为鹿心蛋白水解物A预处理心肌细胞，可以看出，与正常组相比，衰老模型组心肌细胞凋亡率明显升高(P<0.01),与衰老模型组相比，鹿心蛋白水解物A细胞凋亡率明显降低(P<0.01)，D-半乳糖致心肌细胞衰老得到了明显的缓解。
五、鹿心蛋白水解物作用机理研究。
1、心肌细胞总蛋白的提取。
以3×105个/mL的密度将心肌细胞接种到6孔培养板中，每孔接种2mL细胞悬液，按照前述方法处理后，弃去培养液，用预冷的PBS洗一次，按照每孔加入200μL裂解液的比例加入Western及IP细胞裂解液，用移液器吹打数下，使裂解液充分与细胞接触，充分裂解后，4℃10000r/min离心5min，收集上清，即为细胞总蛋白。
2、Western-Blot检测衰老相关蛋白。
2.1 方法。
(1)分离胶、浓缩胶的的配制
表7分离胶的配制
表8浓缩胶的配制
(2)分离胶、浓缩胶的灌注
安装铸胶盒及铸胶架，在两块玻璃板之间迅速地灌注配制好的分离胶，直至距离玻璃板上沿1.5cm为止，避免气泡产生。然后在凝胶上层轻轻覆盖一层蒸馏水进行水封，以防止氧气扩散进入凝胶抑制聚合反应，室温放置30min，待分离胶聚合后，弃去用来水封的蒸馏水，并用滤纸吸净残留水分。
在已聚合的分离胶上层灌注已配制好的浓缩胶，灌满后立即插入梳子，避免产生气泡，室温放置60min。
(3)待浓缩胶聚合后，小心将凝胶中的梳子拔出，立即用电泳缓冲液冲洗加样孔，以去除没有聚合的丙烯酰胺，然后将凝胶固定于电泳槽中，并加满电泳缓冲液。
(4)样品处理：取分装好的心肌细胞总蛋白，加入5×上样缓冲液5μL，100℃水浴中煮沸10min，使蛋白质变性。
(5)用微量加样器向加样孔中加入处理好的样品和预染蛋白Marker，接通电源，调节电压为100V，当染料进入分离胶后，调节电流至120V，继续电泳，当染料到达分离胶底部0.5cm时，停止电泳。
(6)转膜PVDF膜进行活化，将夹子放置转膜缓冲液中，顺序：黑面塑料转膜板→海绵→双层滤纸→胶→膜→双层滤纸→海绵→白面塑料转膜板,在转膜缓冲液中用小玻璃瓶轻轻地来回擀用于去掉气泡；后夹紧夹子。放入电转槽，注意顺序，将电转仪周围放上适量冰袋，在4℃层析柜100V转移100min。
(7)敷抗体电泳完毕，将膜取出封闭，将封闭结束的PVDF膜用TBST洗膜4次，每次10min，然后将PVDF膜装入封闭小袋中。将抗体用说明书要求的稀释液进行一定比例的稀释，然后加入相应的PVDF膜封闭小袋中，4℃孵育过夜。孵育过夜后，用TBST洗膜4次，每次15min。
(8)加入酶标记二抗与一抗结合加入按一定比例稀释的HRP标记的羊抗兔Ig G，室温孵育1h。然后用TBST洗膜4次，每次10min。
(9)显影将ECL试剂盒中的试剂A和试剂B等量混合均匀，向PVDF膜蛋白面加适量上述混合液，再用凝胶图像分析仪进行拍照。
2.2 统计学处理.
统计学方法每组数据均测定3次，用SPSS 19.0统计学软件处理数据，数据以平均数±标准差的形式表示,并计算平均值，求3个数据的SD(相对标准偏差)，t检验用于评估各实验组和对照组之间的差异，绘图与t检验通过Origin软件制得。P＜0.05代表数据存在差异，有统计学意义。
2.3 结果。
Western-Blot法检测P21、P53、Bcl-2、Bax的表达如图11所示，从图中可以看出，与空白组比较，模型组P53、P21、Bax蛋白表达均明显升高，而Bcl-2蛋白表达明显降低。与模型组比较，鹿心蛋白水解物各组p53、p21、Bax蛋白表达明显降低，而Bcl-2蛋白表达明显升高。结果显示，鹿心蛋白水解物可以延缓心肌细胞衰老，可能与P53-P21信号通路，Bax与Bcl-2凋亡途径有关。
P53蛋白是重要的细胞周期、凋亡调节蛋白，P53参与到体内外多种细胞衰老过程中。细胞中依赖P53的周期阻滞是细胞对刺激的重要反应，其调节功能主要表现在G1期与G2期的检验点上，在G1期阻止受损DNA复制，在G2期抑制有丝分裂的进行[57]。P53活化的一个主要效应分子是P21，可依赖P53发挥细胞周期调控作用，也可通过非P53依赖方式抑制从G1期进入S期所需的下游基因的表达，使细胞周期停滞。P53可以参与细胞凋亡调控，它可以通过上调Bax的表达，以及下调Bcl-2来共同完成促进凋亡作用。本实验免疫印迹法检测结果，P53蛋白的表达，模型组比空白组升高，鹿心蛋白水解物处理过的衰老细胞P53蛋白表达比空白组明显降低，提示P53可能发挥着重要作用。而P21蛋白空白组和鹿心蛋白水解物处理组各组中均为低表达，模型组P21高表达，由此可以推断可能是P53蛋白表达升高，激活下游基因编码P21蛋白，P21与周期蛋白结合成复合物降低周期蛋白活性，使细胞阻滞在G1期，使细胞进入衰老期。而鹿心蛋白水解物处理组相比模型组P53和P21蛋白表达均降低，由此可以推测，鹿心蛋白水解物可能通过降低P53蛋白的表达，从而降低P21蛋白的合成，致使其对细胞周期蛋白的抑制作用减弱，从而达到延缓心肌细胞的衰老作用。本实验结果Bax蛋白表达模型组相比空白组和鹿心蛋白处理组为高表达，而Bcl-2蛋白表达模型组相比空白组和鹿心蛋白处理组为低表达，提示可能与P53调控凋亡途径有关。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种鹿心蛋白水解物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
前处理：取鹿心，加入生理盐水后进行组织匀浆，制得酶解原液，待用；
酶解：取上述酶解原液，加入胃蛋白酶进行酶解反应，得酶解液；
纯化：取上述酶解液，以葡聚糖凝胶柱进行分离纯化，取3KD-15KD的多肽，即得。
2.根据权利要求1所述的鹿心蛋白水解物的制备方法，其特征在于，所述前处理步骤中，还将匀浆液在3000-4000r/min离心20-40min，取上清液，制得所述酶解原液。
3.根据权利要求1所述的鹿心蛋白水解物的制备方法，其特征在于，所述酶解步骤中，加入酶量为5000±1000U/g鹿心，所述酶解反应在pH为1.7±0.2，温度为37±1℃的条件下反应120±20min。
4.根据权利要求1所述的鹿心蛋白水解物的制备方法，其特征在于，所述纯化步骤中，采用Sephadex G-50进行分离纯化，具体方法为：柱平衡后上样，以1±0.1ml/min的流速洗脱，紫外280±2nm检视，收集洗脱体积为第90-210ml的馏分，去除溶剂，即得。
5.权利要求1-4任一项所述的鹿心蛋白水解物的制备方法制备得到的鹿心蛋白水解物。
6.根据权利要求5所述的鹿心蛋白水解物，其特征在于，所述水解物为3KD-15KD的多肽。
7.权利要求5或6所述的鹿心蛋白水解物作为P53和/或P21蛋白抑制剂中的应用。
8.权利要求5或6所述的鹿心蛋白水解物作为Bax蛋白抑制剂中的应用。
9.权利要求5或6所述的鹿心蛋白水解物作为Bcl-2蛋白激活剂中的应用。
10.权利要求5或6所述的鹿心蛋白水解物在制备用于抗心肌衰老药物中的应用。
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