CN104745664B - 一种动物胎盘提取物的制备工艺 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种动物胎盘提取物的制备工艺。该制备工艺取动物胎盘预处理分别与胃蛋白酶、胰酶混合进行酶解。采用酶解方法提取，大大提高了产品的纯度及品质。与其他直接水解的方法相比，本发明得到的胎盘粉多肽以及游离氨基酸含量比较高，脂肪含量非常低。除杂过程除了超滤之外还采用琼脂糖凝胶氢键吸附层析，除去高分子杂质，进一步提高产品的纯度。

Description

一种动物胎盘提取物的制备工艺

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种动物胎盘提取物的制备工艺。

背景技术

动物胎盘是畜牧养殖，尤其是母畜繁殖过程中的副产物。近年来动物胎盘的研究不断增多，许多动物胎盘如羊、鹿、牦牛、奶牛等的生理活性被不断发现。

胎盘提取物是来源于动物胚胎、胎盘的一类复合活性成分，含有丰富的氨基酸、蛋白质、荷尔蒙、卵磷脂、多糖体、维生素、矿物元素等，其精华所在为核酸，是一种较为理想的免疫调节剂和营养美容保健品，具有增强记忆、抗应激、调节内分泌、增强免疫力、防治老年痴呆、延缓衰老、补血美容等功效，是一种安全、无毒副作用的营养物质。根据世界卫生组织公布的统计数字，人类96％以上的疾病都是因为年老力衰或免疫问题导致的。胎盘提取物虽然无法对抗老化，却可以延缓老化的发生。

根据目前相关研究进展可知，胎盘提取物主要有以下几大主要作用：①促进末梢血液循环使皮肤的毛细血管，血液循环畅通；②促进细胞及组织呼吸，帮助构成真皮的胶原纤维、弹性纤维活性化；③去除自由基，增进细胞分裂；④保湿作用，丰富的透明质酸能保持皮肤的弱酸性，帮助保持皮肤水分，使肌肤充满弹性和张力；⑤调整自律神经的状况，辅助治疗更年期障碍等自律神经系列的疾病；⑥免疫赋活作用，改善过敏性皮肤炎等；⑦美颜作用，阻碍黑色素合成，祛除雀斑、老年性斑点、黄褐斑、疤痕等，治疗肌肤暗淡、肌肤干燥、肌肤光泽不良，防辐射、防晒。

目前，已有多种利用胎盘提取有效活性物质的专利。这些专利获取胎盘提取物的方法主要以下3种：(1)直接提取法胎盘组织经匀浆后加提取液提取，或胎盘匀浆后反复冻融法提取，提取液离心、冻干即可。(2)超临界CO₂萃取法胎盘组织冻干、粉碎、超临界萃取后，萃取物匀浆、离心，冻干离心液。(3)酶辅助提取法胎盘经1-2种蛋白酶适度酶解后，离心、冻干离心液。除了上述提到的方法，还有以上两种或两种以上方法混合使用的提取技术。

如上述方法及其制备的产品存在以下缺点：(1)获得的胎盘提取物以大分子蛋白为主，人体吸收效率低；(2)缺乏提取液精制工艺，产品成分复杂，品质低；(3)产品脂肪含量较高，易发生脂肪氧化，缩短保质期；(4)提取方法简单粗放，提取效率低，原料利用率低。

发明内容

本发明提供了一种同时提高胎盘提取物的提取率、纯度和活性的提取与制备技术，极大提高了提取效率。

为解决上述技术问题，本发明提供一套复合酶法提取、制备胎盘提取物的工艺，包括以下步骤：

步骤1：取动物胎盘预处理、碾磨后与水混合，调节pH值至1.8，制得待提取物；

步骤2：取所述待提取物与胃蛋白酶混合，于pH 1.8、40℃酶解6h，于100℃变性15min终止酶解反应，过滤，收集滤液；所述胃蛋白酶与所述动物胎盘的质量比为0.4～1.2:100；

步骤3：将步骤2制得的滤液调节pH值至7.0，与胰酶混合后，于pH 7.0、40℃酶解4h，于100℃变性15min终止酶解反应；

所述胰酶与所述动物胎盘的质量比为0.04～0.12:100。

在本发明的一些具体实施方案中，动物胎盘提取物的制备工艺中所述胃蛋白酶的酶活不小于10000IU/g。

在本发明的一些具体实施方案中，动物胎盘提取物的制备工艺中所述胰酶的酶活不小于3800IU/g。

在本发明的一些具体实施方案中，动物胎盘提取物的制备工艺中步骤3所述终止酶解反应后还包括冷却、超滤的步骤。

在本发明的一些具体实施方案中，动物胎盘提取物的制备工艺中所述超滤采用10kD超滤膜。

在本发明的一些具体实施方案中，动物胎盘提取物的制备工艺中所述超滤之后还包括纯化和冷冻干燥的步骤。

在本发明的一些具体实施方案中，动物胎盘提取物的制备工艺中所述纯化包括琼脂糖凝胶氢键吸附层析、活性检测。

在本发明的一些具体实施方案中，动物胎盘提取物的制备工艺中所述纯化具体为超滤之后收集超滤液进行琼脂糖凝胶氢键吸附层析，收集洗脱液于35℃～39℃进行旋蒸，得到浓缩液，冷冻干燥。

在本发明的一些具体实施方案中，动物胎盘提取物的制备工艺中所述琼脂糖凝胶氢键吸附层析具体为将凝胶在水中浸泡至少24小时，水洗滤干后，将溶胀的凝胶与水按体积比3：1混合，经超声波脱气后湿态装柱；所述柱的径高比为1～5：20，用3～5个柱体积纯水平衡层析柱；将所述层析柱下端出液口与紫外检测器进口连接，所述层析柱上端进液口与泵系统连接；取所述超滤液小心加于所述层析柱的上表面，上样体积为柱床体积的2％～25％；打开所述层析柱下端出口，使所述超滤液进入凝胶内；在所述层析柱的上表面上加入水，保持液位高度为3～4cm，调节洗脱速度为30ml/min；在214nm紫外检测器下在线监测，分段收集活力大于10％峰的洗脱液。

在本发明的一些具体实施方案中，动物胎盘提取物的制备工艺中所述冷冻干燥具体为真空冷冻干燥机可以实现压缩机、冷阱和真空泵一体化设计，可实现手动、自动两种程序冻干。冷阱温度可达到-55℃，最大容量为8L，冻干量≥5L/24h。真空泵配有油雾过滤器，抽气率≥100L/min，真空度可达到≤1MPa。

优选的，碾磨后产物与水的质量比为1:1。

本发明提供了一种动物胎盘提取物的制备工艺，取动物胎盘预处理、碾磨后与水混合，调节pH值至1.8，制得待提取物；取所述待提取物与胃蛋白酶混合，于pH 1.8、40℃酶解6h，于100℃变性15min终止酶解反应，过滤，收集滤液；所述胃蛋白酶与所述动物胎盘的质量比为0.4～1.2:100；将步骤2制得的滤液调节pH值至7.0，与胰酶混合后，于pH 7.0、40℃酶解4h，于100℃变性15min终止酶解反应；所述胰酶与所述动物胎盘的质量比为0.04～0.12:100。

目前一般都是进行盐析、反复冻融或细胞破碎来制备胎盘提取物。除杂过程一般只进行简单的过滤。这就导致产品的纯度比较低，高分子杂质含量偏高。本发明的目的旨在提高产品的纯度和品质，进一步除去高分子杂质，得到分子量小于10000道尔顿的小分子活性物质。

本发明采用酶解方法提取，大大提高了产品的纯度及品质。与其他直接水解的方法相比，本发明得到的胎盘粉多肽以及游离氨基酸含量比较高，脂肪含量非常低。超滤除杂，并且采用琼脂糖凝胶氢键吸附层析提高活性以及进一步除去高分子杂质，提高产品的纯度。

具体实施方式

本发明公开了一种动物胎盘提取物的制备工艺，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的动物胎盘提取物的制备工艺中所用动物胎盘、试剂均可由市场购得。其中动物胎盘中猪胎盘购自萧山红垦农场。胃蛋白酶购自重庆格瑞林有限公司，酶活不小于10000IU/g；胰酶购自重庆格瑞林有限公司，酶活不小于3800IU/g。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

取新鲜冷冻的猪胎盘，去除筋膜及脐带且冲洗干净。用胶体磨碾磨后加1:1水，并将pH调至1.8。

分别加入猪胎盘质量0.4％、0.8％，1.2％的高活力胃蛋白酶(酶活不小于10000IU/g)，在40℃下分别反应6h。反应期间适时搅拌并保持pH在1.8。反应完之后加热到100℃变性15min以终止酶解反应。变性后过300目无纺布过滤，收集滤液。

调节上述滤液的pH到7.0，分别加入猪胎盘质量0.04％、0.08％、0.12％的胰酶(酶活不小于3800IU/g)，在40℃下反应4h。反应期间适时搅拌并保持pH在7.0。反应完之后100℃变性15min以终止酶解反应。变性后冷却至室温进行超滤得到超滤液。超滤液为淡黄色澄清透明溶液，带有轻微腥味。

超滤液进行琼脂糖凝胶氢键吸附层析，提高活性。。

琼脂糖凝胶氢键吸附层析具体操作方法：

ⅰ、装柱：将凝胶在纯水中浸泡24小时以上，水洗滤干后，将溶胀的凝胶与水按体积比3：1混合，经超声波脱气后湿态装柱；装柱要求无气泡、无裂纹、填料分布均匀；柱的径高比为1～5：20，用3～5个柱体积纯水平衡层析柱；

ⅱ、系统连接：将装好的层析柱下端出液口与紫外检测器进口连接；层析柱上端进液口与泵系统连接；

ⅲ、加样：取猪胎盘超滤液小心加于该层析柱的上表面，上样体积为柱床体积的2％～25％；打开柱下端出口，使猪胎盘超滤液进入凝胶内；

ⅳ、洗脱：在层析柱的上表面上加入水，保持液位高度为3～4cm，调节洗脱速度为30ml/min；

ⅴ、收集：在214nm紫外检测器下在线监测，分段收集活力大于10％峰的洗脱液。

将上述洗脱液进行旋蒸(旋蒸时控制水温在37℃±2.0)，得到浓缩液。

将上述浓缩液直接或根据需要加入适当辅料冷冻干燥，得到胎盘提取物冻干粉，包装即得。

胎盘提取物冻干粉为白色或淡黄色粉末，味微腥。

相应的提取工艺处理见表1。

表1提取工艺处理

组别	胃蛋白酶与动物胎盘的质量比	胰酶与动物胎盘的质量比
			实验组1	0.4:100	0.04:100
实验组2	0.8:100	0.08:100
			实验组3	1.2:100	0.12:100

实施例2

取新鲜冷冻的猪胎盘6kg，去除筋膜及脐带且冲洗干净。用胶体磨碾磨后加1:1水，并将pH调至1.8。

加入猪胎盘质量0.8％的高活力胃蛋白酶，在40℃下反应6h。反应期间适时搅拌并保持pH在1.8。反应完之后加热到100℃变性15min以终止酶解反应。变性后过300目无纺布过滤，收集滤液。

调节上述滤液的pH到7.0，加入猪胎盘质量0.08％的胰酶，在40℃下反应4h。反应期间适时搅拌并保持pH在7.0。反应完之后100℃变性15min以终止酶解反应。变性后冷却至室温进行超滤得到超滤液。超滤液为淡黄色澄清透明溶液，带有轻微腥味。

超滤液进行琼脂糖凝胶氢键吸附层析(同实施例1的操作)，提高活性。

将上述洗脱液进行旋蒸(旋蒸时控制水温在37℃±2.0)，得到浓缩液。

将上述浓缩液直接或根据需要加入适当辅料冷冻干燥，得到胎盘提取物冻干粉0.577kg，包装即得。胎盘提取物冻干粉为白色或淡黄色粉末，味微腥。

实施例3

对各实验组得到的胎盘提取物冻干粉进行各项理化检测，检测结果见表2。

各项指标的具体检测方法：

A.pH：取本品，加水配制成2％的溶液，依法(中国药典2010版二部附录ⅥH)检查，pH值应为5.0～7.0。

B.干燥失重：采用40℃真空干燥方法测定干燥失重(参照中国药典2010版二部附录ⅧL)。

C.总氮：半微量法测定样品中的总氮(参照中国药典2010版二部附录ⅦD)。

D.氨基氮：采用甲醛值法测定氨基氮。取样品约0.5g，精密称定，加水30ml使之充分溶解，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.0，然后加入预先调节pH至9.0的甲醛溶液10ml，搅匀，用0.1mol/L氢氧化钠滴定液滴定至pH为9.0，按加入甲醛溶液后所消耗的0.1mol/L氢氧化钠滴定液的量(ml)计算。每1ml的0.1mol/L氢氧化钠滴定液相当于1.401mg的氨基氮。

E.脂肪含量：利用酸水解法测定脂肪含量。精确称取样品1.0g左右，放入50ml大试管中，加入8ml的水用玻璃棒充分搅匀，加10ml盐酸，混匀后于70～80℃水浴，每隔10min左右搅匀一次直至脂肪游离为止，约需40～50min。取出静止冷却后，加入10ml乙醇，混合，冷却后将混合物移入100ml具塞筒中，用25ml乙醚分次冲洗试管，洗液一并倒入具塞筒中，加塞震摇1min，将塞子慢慢转松放气后再塞好，静止15min，小心开塞，用石油醚-乙醚等量混合液冲洗塞及筒中附着的脂肪，静止10～20min，待上清液体清晰，吸出上清于已恒重的锥形瓶中，再加5ml乙醚于具塞筒内震摇，静置后仍将上层乙醚吸出放入锥形瓶。将锥形瓶水浴蒸干，置105℃烘箱干燥2h，称重。

F.多肽含量：福林酚法测定多肽含量。精密称取对照品，用水溶解并定量稀释成每1ml中约含0.3mg的溶液，样品(约相当于15mg多肽)精密称定，置100ml容量瓶中加水适量，充分溶解后定容到刻度线，摇匀。精密量取对照品0.0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9ml、样品1ml，分别置具塞试管中，各加水至1.0ml，再分别加入碱性铜试液(取氢氧化钠10g，碳酸钠50g，加水400ml使溶解作为甲液；取酒石酸钾0.5g，加水50ml使溶解，另取硫酸铜0.25g，加水30ml使溶解，将两液混合作为乙液。临用前，合并甲、乙两液，并加水至500ml)1ml，混匀，各加入福林酚试液(取福林试液中的贮备液1 16)4.0ml，立即摇匀，置55℃水浴中准确反应5min，取出，置冷水浴中10min，以0号管作为空白，照紫外可见分光光度法(中国药典2010版二部附录ⅣA)在650nm波长处测定吸光度。以对照品溶液的浓度为横坐标，吸光值为纵坐标作图，并计算回归方程。从回归方程计算出多肽的含量，并乘以稀释倍数即得。

G.活性测定：采用T细胞活性检测(脱E受体法)。①脱E受体胸腺T细胞悬液的制备：取新鲜猪胸腺，去脂肪并剪碎，加适量Hank’s液使成细胞悬液，经100目筛过滤，每分钟1500转离心3～5分钟，弃去上清液，加入少量Hank’s液打匀，将此溶液加入已具有1/3滤液量的分离液的离心管中，以每分钟2000转离心20分钟，小心吸出中间层的胸腺细胞，放入另一离心管中，加适量Hank’s液洗涤，摇匀，以每分钟1500转离心3～5分钟，弃去上清液，洗涤一次后，在沉淀物中加入适量Hank’s液，混匀，45℃恒温水浴保温30分钟(每隔5分钟振摇一次)。以每分钟1500转离心3～5分钟，弃去上清液，再加入适量Hank’s液，混匀后，置45℃恒温水浴保温30分钟，取出后以每分钟1500转离心3～5分钟，弃去上清夜。用Hank’s洗涤三次(操作同前)，最后用Hank’s液适当稀释并计数，使最终浓度为每1ml中(3×106)～(5×106)个细胞。②绵羊红血球悬液的制备：取适量羊血，用Hank’s液洗三次(同前)。弃去上清液，加适量Hank’s液稀释并计数，使最终浓度为脱E受体胸腺T细胞悬液浓度的8～10倍。③供试品溶液的制备：取供试品，用Hank’s液配制成每1ml中含1mg的溶液。④测定：取小试管6支，其中3支各加Hank’s液0.1ml作对照管，另3支各加供试品溶液0.1ml作测定管，每管中各加脱E受体胸腺T细胞悬液0.2ml，37℃保温1小时后，加入绵羊红血球悬液0.2ml，摇匀，以每分钟500转离心3分钟，放入4℃冰箱过夜，次日取出，弃去上清夜，每管中各加入固定液一滴，轻轻摇匀，静置10分钟，加入染色液2滴并摇匀，静置15分钟后开始计数，显微镜视野中淡蓝色的较大的细胞为淋巴细胞，共数计数板16个大方格上所有淋巴细胞的个数(不少于200个)，统计其中的E玫瑰花结形成的细胞数(结合3个以上绵羊红细胞的淋巴细胞)，求得结花百分率，取平均值。即为供试品管或对照管的平均值。

样品活力＝供试品测定管E玫瑰花结百分率—对照管E玫瑰花结百分率。

表2理化指标(具体实验数据附在括号中)

对比例

对照组1：直接水解：将胎盘去筋膜洗净，碾磨，加两倍水100℃水煮1h，去上清液后再加两倍水水煮1h，过滤。滤渣放烘箱中95℃烘干。烘干后用粉碎机粉碎得到胎盘粉。

各项检测数据：总氮：142.64mg/g

氨基氮：2.24mg/g

脂肪：14.23％

直接水解提取，多肽含量很低，氨基酸以及活性不检测。

对照组2：反复三次冻融：将胎盘去筋膜洗净，碾磨后加一倍水，反复冻融三次后用高速离心机离心(8000r/min，20min)，取上清超滤后冻干，得到胎盘粉。

各项检测数据：氨基酸：0.936％

多肽：67.89mg/g

对照组3：离子交换层析纯化：将胎盘去筋膜洗净，碾磨后加一倍水，分别按实施实例2比例加酶反应后用高速离心机离心(8000r/min，20min)，取上清，过离子交换层析柱，收集洗脱液冷冻干燥。

*示与对照组3相比，实验组具有显著差异(P＜0.05)

对比上表可知，对照组中，直接水解法和反复冻融法的总氮收率高，但产品脂肪含量高，几乎没有活性；离子交换层析制备的产品氨基酸总量与本发明相近，但产品活性、多肽含量、总氮收率等显著(P＜0.05)低于本发明。因此，本发明在提高提取效率、产品活性和品质方面具有较强的优势。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种动物胎盘提取物的制备工艺，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：取动物胎盘预处理、碾磨后与水混合，调节pH值至1.8，制得待提取物；

步骤2：取所述待提取物与胃蛋白酶混合，于pH 1.8、40℃酶解6h，于100℃变性15min终止酶解反应，过滤，收集滤液；所述胃蛋白酶与所述动物胎盘的质量比为0.4～1.2:100；

步骤3：将步骤2制得的滤液调节pH值至7.0，与胰酶混合后，于pH 7.0、40℃酶解4h，于100℃变性15min终止酶解反应；

所述胰酶与所述动物胎盘的质量比为0.04～0.12:100。

2.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征在于，所述胃蛋白酶的酶活不小于10000IU/g。

3.根据权利要求1或2所述的制备工艺，其特征在于，所述胰酶的酶活不小于3800IU/g。

4.根据权利要求3所述的制备工艺，其特征在于，步骤3所述终止酶解反应后还包括冷却、超滤的步骤。

5.根据权利要求4所述的制备工艺，其特征在于，所述超滤采用10kD超滤膜。

6.根据权利要求5所述的制备工艺，其特征在于，所述超滤之后还包括纯化的步骤。

7.根据权利要求6所述的制备工艺，其特征在于，所述纯化包括琼脂糖凝胶氢键吸附层析、活性检测和冷冻干燥。

8.根据权利要求6所述的制备工艺，其特征在于，所述纯化具体为超滤之后收集超滤液进行琼脂糖凝胶氢键吸附层析，收集洗脱液于35℃～39℃进行旋蒸，得到浓缩液，冷冻干燥。

9.根据权利要求7或8所述的制备工艺，其特征在于，所述琼脂糖凝胶氢键吸附层析具体为将凝胶在水中浸泡至少24小时，水洗滤干后，将溶胀的凝胶与水按体积比3：1混合，经超声波脱气后湿态装柱；所述柱的径高比为1～5：20，用3～5个柱体积纯水平衡层析柱；将所述层析柱下端出液口与紫外检测器进口连接，所述层析柱上端进液口与泵系统连接；取所述超滤液小心加于所述层析柱的上表面，上样体积为柱床体积的2％～25％；打开所述层析柱下端出口，使所述超滤液进入凝胶内；在所述层析柱的上表面上加入水，保持液位高度为3～4cm，调节洗脱速度为30ml/min；在214nm紫外检测器下在线监测，分段收集活力大于10％峰的洗脱液。

10.根据权利要求7或8所述的制备工艺，其特征在于，所述冷冻干燥具体为真空冷冻干燥机，可以实现压缩机、冷阱和真空泵一体化设计，可实现手动、自动两种程序冻干；冷阱温度可达到-55℃，最大容量为8L，冻干量≥5L/24h；真空泵配有油雾过滤器，抽气率≥100L/min，真空度可达到≤1MPa。