CN105925652A - 一种仿生酶解生产小肽的方法 - Google Patents

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张斌
张士伟
陶少强
李玉峰
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products

Abstract

本发明公开了一种仿生酶解生产小肽的方法，本发明从粉碎过筛目数、加入量、和酶解温度、pH、酶的加入量等方面进行控制优化，胃蛋白酶和胰蛋白酶的加入量少，节约成本，同时，本发明中仿生酶解的产率高，利用胃蛋白酶和胰蛋白酶组合进行仿生酶解，得膏量是传统工艺的1.5‑2倍。另外，本发明通过超滤膜分离+电渗析+树脂柱层析相结合的技术，对仿生酶解技术进行分离提纯，活性肽的损失量<2％,相对分子质量小于2KD的小分子肽>80％。减少了对酶解得到的活性肽的损失，同时，小分子肽含量高，提高其使用价值。

Description

一种仿生酶解生产小肽的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种仿生酶解生产小肽的方法。
背景技术
传统营养学观点认为蛋白质营养就是氨基酸营养，物对蛋白质的需要即是对必需氨基酸和合成非必需氨基酸的需要。也就是说到达胃肠道的蛋白质必须水解成游离的氨基酸后才能被机体吸收利用。
但是当动物喂以按理想氨基酸模式配制的纯合日粮或低蛋白质氨基酸平衡日粮时，并不能获得最佳的生产性能。因此一些学者提出了动物对完整蛋白质本身或对肽有着特殊需要的观点，肽在蛋白质营养中的作用也越来越受到重视。
近年来的研究表明蛋白质在动物消化道中消化酶作用下的水解终产物大部分是2或3个氨基酸残基组成的小肽它们以完整形式被吸收进入循环系统从而被组织利用。
随着社会的发展和人们生活水平的普遍提高，以及人类生活方式的改变，健康产品的总体需求急剧增长。生物活性肽作为一种天然提取物，利用仿生酶解技术进行提取，不同于传统工艺的水提、醇提等传统工艺容易使蛋白质变性影响活性成分，具有功效高、人体吸收快等特点。
现有工艺中，由于后期精制纯化不完全，使得产品肽损失量大，脱盐率低，影响小肽产品的性质。
发明内容
本发明的目的在于提供一种仿生酶解生产小肽的方法，模拟人体消化过程，设置优化酶解参数，后续经过精制、纯化和富集工艺，肽量损失小、脱盐率高。
本发明提供的一种仿生酶解生产小肽的方法，包括以下步骤：
(1)原料磨粉，加水匀浆后，依次用胃蛋白酶和胰蛋白酶进行酶解，得到酶解液；
(2)将酶解液离心，取上清液，超滤，收集透过液；
(3)将透过液进行电渗析除盐；
(4)再进行层析柱纯化，然后减压浓缩，干燥，得到小肽。
步骤(1)中将原料磨粉具体为：将原料磨粉，过60-100目筛，优选的为80目。所述原料选自但不限于土鳖虫、阿胶、地龙、水蛭、猪皮。
步骤(1)中所述加水具体为：加水量为原料重量的10-20倍；优选的为10倍。
步骤(1)中所述依次用胃蛋白酶和胰酶进行酶解具体为：将加水匀浆后原料液，加入稀盐酸，调节pH至1.5-2，加入胃蛋白酶，于37-40℃下酶解0.8-1.5h；然后，加入氢氧化钠溶液调节pH为7.5-8，加入胰蛋白酶，于37-40℃下酶解3-4h，得到酶解液。
进一步的加入胃蛋白酶的质量为原料质量的0.5-1.5％；优选的为1％；加入的胰蛋白酶质量为原料质量的0.5-1.5％，优选的加入1％。所述氢氧化钠溶液的质量浓度为20％。
优选的，步骤(1)具体为：将原料磨粉，过80目筛，加入10倍重量的水匀浆，加入稀盐酸，调节pH至1.5-2，加入原料质量1％的胃蛋白酶，于40℃下酶解1h；然后，加入氢氧化钠溶液调节pH为7.5-8，加入原料质量1％的胰蛋白酶，于40℃下酶解3h，得到酶解液。
步骤(2)离心具体为：以4000-4500r/min离心10-15min,取上清液。
步骤(2)中超滤具体为：用截留相对分子质量为3KD的中空纤维膜进行超滤。
步骤(3)为：将透过液通过电渗析器，控制电流不超过2.5A，当脱盐率达到95％时，切断电源，用重蒸馏水冲洗管道至流出液无颜色。
优选的，步骤(3)具体为：将透过液以50L/h的流速通过电渗析器，循环进样，不接通直流电，15min后，测定样品液导电率，接通直流电，调节电压，控制电流不超过2.5A，当脱盐率达到95％时，切断电源，用重蒸馏水冲洗管道至流出液无颜色。
脱盐率＝(原水导电率-出水导电率)/原水导电率*100％。
进一步的，收集点渗析除盐液，70-80℃，-0.07～-0.08MPa条件下减压浓缩至500mL，测定得膏和总肽含量。
步骤(4)为：将将电渗析后的酶解液稀释后，利用DA-201C型大孔树脂柱层析，用水洗脱后，再用乙醇洗脱，收集脱液，减压浓缩、干燥，得到小肽。
优选的，步骤(4)具体为：在层析柱内装满DA-201C型大孔树脂，将电渗析后的酶解液稀释至原料重量10mg/L，调节pH为7.0，以1.5BV/h的流速上样，至上样液与柱体积1:1时停止上样，加水冲洗层析柱，收集洗脱液，每25ml测量一次电导率，至电导率与水的电导率相同时停止；再用体积浓度75％的5倍质量的乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩、干燥，得到小肽。
与现有技术相比，本发明从粉碎过筛目数、加入量、和酶解温度、pH、酶的加入量等方面进行控制优化，胃蛋白酶和胰蛋白酶的加入量少，节约成本，同时，本发明中仿生酶解的产率高，利用胃蛋白酶和胰蛋白酶组合进行仿生酶解，得膏量是传统工艺的1.5-2倍。另外，本发明通过超滤膜分离+电渗析+树脂柱层析相结合的技术，对仿生酶解技术进行分离提纯，活性肽的损失量<2％,相对分子质量小于2KD的小分子肽>80％。减少了对酶解得到的活性肽的损失，同时，小分子肽含量高，提高其使用价值。
说明书附图
图1为利用HPLC对本发明制备的小肽相对分子质量进行测试。
具体实施方式
实施例1
一种仿生酶解生产小肽的方法，包括以下步骤：
(1)土鳖虫磨粉，过80目筛，加10倍重量的水匀浆后，加入稀盐酸，调节pH至1.5-2，加入原料质量1％的胃蛋白酶，于40℃下酶解1h；然后，加入氢氧化钠溶液调节pH为7.5-8，加入原料质量1％的胰蛋白酶，于40℃下酶解3h，得到酶解液；
(2)将酶解液以4000-4500r/min离心10-15min,取上清液。，取上清液，用截留相对分子质量为3KD的中空纤维膜进行超滤，收集透过液；经过测试，过滤前总肽量19.24g；过滤后总肽量为19.02g，损失肽量1.1％，总肽量几乎不损失。
(3)将透过液以50L/h的流速通过电渗析器，循环进样，不接通直流电，15min后，测定样品液导电率，接通直流电，调节电压，控制电流不超过2.5A，当脱盐率达到95％时，切断电源，用重蒸馏水冲洗管道至流出液无颜色。收集电渗析除盐液，70-80℃，-0.07～-0.08MPa条件下减压浓缩至500mL，测定得膏和总肽含量。除盐前得膏率47.4％；除盐后得膏率38.8％；除盐前总肽含量42.3％；除盐后总肽含量50.4％。利用电渗析可以出去酶解液中大部分的氯化钠等无机盐类成分，提高生产产品的安全性。
(4)在层析柱内装满DA-201C型大孔树脂，将电渗析后的酶解液稀释至原料重量10mg/L，调节pH为7.0，以1.5BV/h的流速上样，至上样液与柱体积1:1时停止上样，加水冲洗层析柱，收集洗脱液，每25ml测量一次电导率，至电导率与水的电导率相同时停止；再用体积浓度75％的5倍质量的乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩、干燥，得到小肽。
步骤(4)乙醇洗脱后，分别测定原酶解液和水洗液的电导率，根据电导率和盐含量的关系进行推算，得到水洗液中盐含量占上样的酶解液的盐含量的99.1％，除盐效果显著。
利用HPLC对制备的小肽进行测定，如图1所示，相对分子质量如下表1：
峰号 保留时间(min) 面积百分比(％) 想对分子质量(Da)
1 11.675 4.01 3981.3
2 12.55 4.91 3073.8
3 12.95 2.93 2731
4 13.175 2.62 2555.2
5 13.958 6.72 2027.2
6 14.592 9.97 1680.7
7 15.803 41.75 1174.9
8 16.813 11.78 871.6
9 18.237 6.53 572.1
10 19.425 0.82 402.7
11 21.589 7.96 212.4
可以得到，本申请制备的小肽，通过分离提纯，相对分子质量小于2KD的小分子肽>80％。
实施例2
一种仿生酶解生产小肽的方法，包括以下步骤：
(1)阿胶磨粉，过80目筛，加15倍重量的水匀浆后，加入稀盐酸，调节pH至1.5-2，加入原料质量1.2％的胃蛋白酶，于37℃下酶解1.5h；然后，加入氢氧化钠溶液调节pH为7.5-8，加入原料质量1％的胰蛋白酶，于37℃下酶解4h，得到酶解液；
(2)将酶解液以4000-4500r/min离心10-15min,取上清液。，取上清液，用截留相对分子质量为3KD的中空纤维膜进行超滤，收集透过液；经过测试，过滤前总肽量19.24g；过滤后总肽量为19.02g，损失肽量1.1％，总肽量几乎不损失。
(3)将透过液以50L/h的流速通过电渗析器，循环进样，不接通直流电，15min后，测定样品液导电率，接通直流电，调节电压，控制电流不超过2.5A，当脱盐率达到95％时，切断电源，用重蒸馏水冲洗管道至流出液无颜色。利用电渗析可以出去酶解液中大部分的氯化钠等无机盐类成分，提高生产产品的安全性。
(4)在层析柱内装满DA-201C型大孔树脂，将电渗析后的酶解液稀释至原料重量10mg/L，调节pH为7.0，以1.5BV/h的流速上样，至上样液与柱体积1:1时停止上样，加水冲洗层析柱，收集洗脱液，每25ml测量一次电导率，至电导率与水的电导率相同时停止；再用体积浓度75％的5倍质量的乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩、干燥，得到小肽。
步骤(4)乙醇洗脱后，分别测定原酶解液和水洗液的电导率，根据电导率和盐含量的关系进行推算，得到水洗液中盐含量占上样的酶解液的盐含量的99.1％，除盐效果显著。

Claims (10)

1.一种仿生酶解生产小肽的方法，其特征在于，所述仿生酶解生产小肽的方法包括以下步骤：
(1)原料磨粉，加水匀浆后，依次用胃蛋白酶和胰蛋白酶进行酶解，得到酶解液；
(2)将酶解液离心，取上清液，用截留相对分子质量为3KD的中空纤维膜进行超滤，收集透过液；
(3)将透过液进行电渗析除盐；
(4)再进行层析柱纯化，然后减压浓缩，干燥，得到小肽。
2.根据权利要求1所述的仿生酶解生产小肽的方法，其特征在于，步骤(1)中将原料磨粉具体为：将原料磨粉，过60-100目筛。
3.根据权利要求1或2所述的仿生酶解生产小肽的方法，其特征在于，所述原料选自但不限于土鳖虫、阿胶、地龙、水蛭、猪皮。
4.根据权利要求1所述的仿生酶解生产小肽的方法，其特征在于，步骤(1)中所述加水具体为：加水量为原料重量的10-20倍。
5.根据权利要求1或2所述的仿生酶解生产小肽的方法，其特征在于，步骤(1)中所述依次用胃蛋白酶和胰酶进行酶解具体为：将加水匀浆后原料液，加入稀盐酸，调节pH至1.5-2，加入胃蛋白酶，于37-40℃下酶解0.8-1.5h；然后，加入氢氧化钠溶液调节pH为7.5-8，加入胰蛋白酶，于37-40℃下酶解3-4h，得到酶解液。
6.根据权利要求1或5所述的仿生酶解生产小肽的方法，其特征在于，步骤(1)中加入的胃蛋白酶的质量为原料质量的0.5-1.5％。
7.根据权利要求1或5所述的仿生酶解生产小肽的方法，其特征在于，加入的胰蛋白酶质量为原料质量的0.5-1.5％。
8.根据权利要求1所述的仿生酶解生产小肽的方法，其特征在于，步骤(2)中超滤具体为：用截留相对分子质量为3KD的中空纤维膜进行超滤。
9.根据权利要求1所述的仿生酶解生产小肽的方法，其特征在于，步骤(3)为：将透过液通过电渗析器，控制电流不超过2.5A，当脱盐率达到95％时，切断电源，用重蒸馏水冲洗管道至流出液无颜色。
10.根据权利要求1所述的仿生酶解生产小肽的方法，其特征在于，步骤(4)为：将将电渗析后的酶解液稀释后，利用DA-201C型大孔树脂柱层析，用水洗脱后，再用乙醇洗脱，收集脱液，减压浓缩、干燥，得到小肽。
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