CN109021072B - 一种红毛藻抗氧化肽及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种红毛藻抗氧化肽及其制备方法，以红毛藻为原料，通过制备红毛藻粉、提取红毛藻蛋白、制备红毛藻多肽、分离纯化、冷冻干燥，得到所述红毛藻抗氧化肽，此抗氧化肽的氨基酸全序列为：GDPSVLEDCR。利用本发明的方法提取的红毛藻抗氧化肽的含盐量低、蛋白提取率高、纯度高，且本发明补足了现有技术中关于红毛藻多肽的研究空白，为下一步色谱分离获得更纯的红毛藻抗氧化肽提供了方便条件。

Description

一种红毛藻抗氧化肽及其制备方法
技术领域
本发明涉及海洋藻类有效成分精制加工技术领域，具体是一种红毛藻抗氧化肽及其制备方法。
背景技术
生物活性肽(bioactive peptides)是来源于细菌、真菌或动植物的具有重要生理功能的一类生物活性物质。生物活性肽不仅具有多种显著的生理功能，如神经调节、激素作用、兔疫调节、抗血栓、抗高血压、降胆固醇、抑菌、抗病毒、抗癌、抗氧化作用等；而且具结构简单，稳定性强，容易被人体直接吸收和安全的特性，因此近年来成为生物活性物质研究领域的热点。
目前，制备活性肽的方法主要有酶解法、微生物发酵法、化学合成法等。酶解法因生产条件温和、安全性较高、且可得到特定功能的活性肽等优点，己成为从蛋白质中释放生物活性肽的最常用方法。酶法制备生物活性肽的研究多见于动物源多肽，植物源多肽的研究相对较少。在植物抗氧化活性肽研究方面，已有不少研究者通过蛋白酶水解小麦，玉米，荞麦，大豆，米糠等多种植物蛋白，得到了具有较高抗氧化活性及部分其他活性的多肽。但由于藻类生活于海洋之中，生活条件更为复杂，可能形成与陆生植物不一样的蛋白结构和生物活性。因此，藻类多肽具有更多潜在的研究价值，对其研究有利于深入开发利用藻类，改变藻类的生产结构和运用价值。
红毛藻(Bangia fusco-purpurea Lyngb.)，属红藻门、红毛菜纲、红毛菜目，是中国东南沿海的特产。红毛藻是一种营养极其丰富、高蛋白低脂肪的海藻，具有较高的食用价值和药用价值，有滋补祛火、补血降压、防止心血管疾病等功用，对提高人体免疫力、增强人们体制也有很好效果，迄今为止，尚未见红毛藻多肽研究的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种红毛藻抗氧化肽及其制备方法，该抗氧化肽具有良好的DPPH自由基清除能力。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种红毛藻抗氧化肽，是由10个氨基酸组成，所述多肽的氨基酸序列为：GDPSVLEDCR。
一种红毛藻抗氧化肽的制备方法，包括以下步骤：（1）红毛藻粉制备；（2）红毛藻蛋白提取；（3）红毛藻多肽制备；（4）红毛藻多肽的分离纯化；（5）红毛藻多肽液的冷冻干燥。
所述步骤（1）中红毛藻粉的具体制备方法为：将红毛藻挑选去除杂物，于60℃下干燥4小时，然后经高速粉碎机粉碎，过60目筛，装袋备用。
所述步骤（2）中红毛藻蛋白提取的具体方法为：称取红毛藻粉，按照质量体积比1:20的比例加入纯水，并充分搅拌溶胀，调节pH至10，于超声功率480w超声辅助提取20分钟，再50℃恒温浸提50分钟， 4000r/min离心10分钟，取上清液调节pH至4.5，室温静置60分钟后4000r/min离心15分钟，去上清，沉淀冷冻干燥，即得毛藻蛋白。
所述步骤（3）中红毛藻多肽制备的具体方法为：以DPPH自由基清除率作为判别指标，采用正交试验获得最佳酶解条件；称取红毛藻蛋白，加10倍的纯水溶解，加木瓜蛋白酶，酶底比[E]/[S]为650-1850U/g，调pH至4.0-8.0、酶解温度30-70℃，酶解时间30-150min，酶解结束后升温至100℃灭酶5min，得到红毛藻多肽酶解液，冷藏备用。
所述步骤（4）红毛藻多肽的分离纯化的具体方法为：用截留分子量2000Da的超滤膜制备分子量小于2000Da的红毛藻多肽溶液；将多肽溶液60℃真空浓缩后冷冻干燥，得到分子量小于2000Da的红毛藻多肽；将分子量小于2000Da的红毛藻多肽用Sephadex G-15凝胶层析进行分离，即得到所述红毛藻抗氧化肽。
本发明的优点在于：
本发明采用碱性法超声辅助提取红毛藻蛋白，含盐量低，蛋白提取率高。等电点法分离蛋白，获得的蛋白含小分子化合物少，纯度高，使用木瓜蛋白酶制备红毛藻抗氧化肽，以DPPH自由基的清除率作为酶解条件的判别指标，获得的酶解条件能更精准的用于红毛藻抗氧化肽的制备。采用截留分子量2000Da的超滤膜制备红毛藻多肽，为下一步色谱分离获得更纯的红毛藻抗氧化肽提供了方便条件。根据红毛藻多肽分子量大小的不同采用不同的色谱分离方式，所得到的红毛藻多肽纯度更高。
附图说明
图1为酶解温度对酶解效果的影响。
图2为酶解时间对酶解效果的影响。
图3为pH对酶解效果的影响。
图4为酶底比对酶解效果的影响。
图5 为Sephadex G-15凝胶层析分离纯化图。
具体实施方式
下面根据附图和优选实施例详细描述本发明，本发明的目的和效果将变得更加明白，以下结合附图和实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例 1
将红毛藻挑选去除杂物于60℃下干燥4小时，然后经高速粉碎机粉碎，过60目筛，装袋备用。称取红毛藻粉10.00g，按照质量体积比1:20加入纯水并充分搅拌溶胀，调节pH为10，于超声功率480w超声辅助提取20分钟，再恒温50℃浸提50分钟， 4000r/min离心10分钟，取上清液调节pH为4.5，室温静置60分钟后4000r/min离心15分钟，去上清沉淀冷冻干燥得红毛藻蛋白备用。
以酶解液对DPPH自由基的清除率为指标进行各因素对红毛藻蛋白酶解多肽抗氧化效果的影响。称取红毛藻蛋白，加10倍的纯水溶解，加木瓜蛋白酶，酶底比[E]/[S]为1250U/g，调pH6.0、温度55℃酶解120min，升温至100℃灭酶5min，得到红毛藻多肽酶解液冷藏备用。
1.温度对酶解效果的影响
调节酶解温度为30-70℃，保持其它条件不变，研究酶解温度对酶解效果的影响。从图1可以看出，在30℃到50℃，随着温度的上升清除率逐渐上升，在50℃时清除率达到最大，因此确定正交试验的温度范围为45℃到55℃。
2.时间对酶解效果的影响
调节酶解时间为30-150min，保持其它条件不变，研究酶解时间对酶解效果的影响。从图2可见，酶解时间从30min到90min，酶解液对DPPH自由基的清除率有显著的提高，而后缓慢下降。酶解时间的延长，正交试验的时间段选择60min，90min，120min。
3. pH对酶解效果的影响
调节酶解pH为4.0-8.0，保持其它条件不变，研究pH对酶解效果的影响。由图3可知，在pH4.0到pH6.0之间，随着pH的上升清除率呈线性提高，在pH6.0到pH7.0之间，清除率迅速下降，而后下降速度趋于平缓。酶的活力与体系的pH值密切相关，因为酶解没有进行到底，所以直接决定着酶解产物的性质。因此选择pH5.5、6.0、6.5为正交试验的三个水平。
4.酶底比[E]/[S]对酶解效果的影响
调节酶底比[E]/[S]为650-1850U/g，保持其它条件不变，研究酶底比对酶解效果的影响。由图4可知，在酶底比为650U/g到1250U/g之间，随着酶底比的增加，酶解液对DPPH自由基的清除率逐渐提高，在1250U/g达到最大清除率，而后开始缓慢下降，但在酶底比为950U/g到1550U/g这个区间，酶底比的改变对清除率的影响程度小于温度40℃到60℃，pH5.0到pH7.0之间对清除率的影响程度，而时间又是一个重要的研究因素，所以酶底比可以作为一个固定因素进行设定，其取值为1250U/g。
5.红毛藻蛋白酶解条件的优化
红毛藻蛋白酶解条件优化的L9（34）正交实验结果如表1，根据实验结果进行方差分析，分析结果见表2、表3。
表1 L9（34）正交试验表
Figure 323284DEST_PATH_IMAGE001
表2 正交试验结果及分析
Figure 606498DEST_PATH_IMAGE002
表3 方差分析表
Figure 537283DEST_PATH_IMAGE003
由表2的极差分析可知，红毛藻蛋白酶解的最佳条件组合为A3B3C2，即温度55℃，时间120min，pH6.0；各因素对蛋白酶解的影响大小依次为C>A>B，即pH（C）的影响最大，温度（A）次之，时间（C）影响最小。通过3的方差分析发现，区组间的实验结果无显著性差异，所以平行试验所得结果可信；温度、时间、pH对木瓜蛋白酶酶解红毛藻蛋白的影响是极显著的；此外，模型误差不显著，说明3个试验因素间交互作用不明显。
实施例2
1、最优酶解条件验证
取三个50mL离心管，均加入1.000g红毛藻蛋白，10mL蒸馏水和酶底比[E]/[S]为1250U/g的木瓜蛋白酶，然后利用正交试验所得最佳酶解条件：温度55℃，时间120min，pH6.0进行酶解。三次实验所得酶解液按进行DPPH自由基清除率测定，结果为（87.46±0.76）%（n=3），见表4。验证实验所得清除率均大于表2中的任何一个实验组，所以A3B3C2为木瓜蛋白酶酶解红毛藻蛋白的最佳条件组合。
表4 最优酶解条件验证
Figure 679682DEST_PATH_IMAGE004
2、超滤浓缩
用截留分子量2000Da的超滤膜制备分子量小于2000Da的红毛藻多肽溶液。红毛藻多肽溶液60℃真空浓缩后冷冻干燥，得到分子量小于2000Da的红毛藻多肽。测定所得到的多肽的DPPH自由基清除能力及超氧阴离子自由基清除能力，实验结果见表5。
表5 超滤法分离分子量小于2000Da的红毛藻多肽
Figure 255414DEST_PATH_IMAGE005
3、Sephadex G-15凝胶层析分离纯化
将超滤得到的分子量小于2000Da的红毛藻多肽用Sephadex G-15凝胶层析分离，玻璃层析柱 40cm×2.6cm 层析填料Sephadex G-15，流动相纯水，流速1.5ml/min，每管10mL收集。获得大分子量的组分A和相对小分子量的组分B，见图5。收集合并组分B的收集管，进行浓缩液相色谱确定组分纯度，测序结果表明此红毛藻多肽的氨基酸序列为GDPSVLEDCR。
多肽结构采用美国Thermo 公司的液相色谱-四级杆-飞行时间质谱（LC-Q-TOF-Ms/Ms）技术进行测定。采用甲醇和水作为体系的流动相，将样品溶解于超纯水中，过0.22μm微孔滤膜后上样10μL，以0~40%的甲醇流动相进行线性洗脱40 min，检测波长为220nm。质谱采用正离子模式下进行扫描。收集样品的质谱图，通过MaxQuant1.5.2.8 与多肽质谱谱库进行对照。
测定所得到的多肽的DPPH自由基清除能力及超氧阴离子自由基清除能力，实验结果见表6。
表6红毛藻多肽活性测定
Figure 704718DEST_PATH_IMAGE006
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 泉州师范学院
<120> 一种红毛藻抗氧化肽及其制备方法
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Gly Asp Pro Ser Val Leu Glu Asp Cys Arg
1 5 10

Claims (1)

1.一种红毛藻抗氧化肽，其特征在于：所述肽的氨基酸序列为：GDPSVLEDCR。
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