CN109369781A - 一种麒麟菜抗氧化四肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种麒麟菜抗氧化四肽及其应用，属于降血压寡肽技术领域，该麒麟菜抗氧化四肽由SEQ ID No:1的氨基酸序列组成，抗氧化四肽通过酶解麒麟菜蛋白获得，其制备方法包括：麒麟菜藻蛋白的制备、麒麟菜藻蛋白的酶解、麒麟菜抗氧化寡肽的制备。上述麒麟菜抗氧化四肽在制备抗氧化相关的药物、保健产品、特殊医用食品和化妆品中的应用。本发明抗氧化四肽具有较强的自由基清除能力，且能显著提高人脐静脉内皮细胞(HUVEC)模型的SOD和GSH‑PX的水平，降低MDA的含量，应用于制备抗氧化相关的药物、保健产品、特殊医用食品和化妆品中。

Description

一种麒麟菜抗氧化四肽及其应用
技术领域
本发明属于抗氧化寡肽技术领域，具体涉及一种麒麟菜抗氧化四肽及其应用。
背景技术
抗氧化肽是最重要的生物活性化之一，也是迄今为止研究最为广泛的生物活性肤口。抗氧化化的主要作用包括抑制生物大分子过氧化和清除体内过量的自由基。与传统天然抗氧化剂Vc、Ve相比，具有更强的抗氧化持续性、稳定性。对于衰老、疾病或不健康状态所产生过量的超氧阴离子、哲自由基等，通过摄入抗氧化化可减少这些自由基的攻击。研究表明，抗氧化肽常常与其它生物活性有一定的相关性，包括免疫调节、抗肿瘤、降胆固醇等，在制药领域中，抗氧化化常做为生物药品的佐剂，为药物的体内作用机制提供多靶向位点，克服了某些单视向药物稳定性差、作用期内复发率高等缺点心。因此，抗氧化化的深入开发对现代医学的发展也具有一定的推动作用。抗氧化化在食品领域中也有着重要的应用价值，在食品加工与贮藏期间能有效抑制食品中脂质过氧化、营养和风味物质破坏，有效提局食品的货架期。抗氧化肽的来源主要有生物体内存在的天然抗氧化肽、食源性蛋白水解产生的天然抗氧化肽和人工合成抗氧化肽。人工合成抗氧化肽是以氨基酸或小肽为原料，采用固液相合成或在合成酶的催化作用下定向合成抗氧化肽。合成抗氧化肽会对人体产生毒副作用，因此开发天然抗氧化肽是研究的重要方向。
麒麟菜(Eucheuma muricatum)，红藻纲，红翎菜科。藻体呈圆柱形或扁平，紫红色，具刺状或圆锥形突起，基部有盘状固着器。属于热带和亚热带海藻，分布以赤道为中心并向南北伸延。中国见于海南岛、西沙群岛及台湾等地沿海。目前，海藻多肽的研究主要集中在蓝藻中的螺旋藻和红藻中的紫球藻及紫菜等，而对麒麟菜多肽的研究报道较少。研究证明藻蛋白具有抗氧化、抗肿瘤、调节免疫功能等多种生物活性。然而，蛋白质稳定性较差，易发生沉淀和变性，进而导致生物活性的丧失；且蛋白质分子量较大，不易于人体的消化吸收，从而限制了藻蛋白在保健品和药品领域的进一步开发利用。利用酶解方式可以释放存在于蛋白质氨基酸长链中的生物活性肽，从而发挥其特有的生物活性。因此，酶解麒麟菜藻蛋白获取活性肽以提升蛋白的利用率和活性价值，对麒麟菜的深度综合开发利用具有重要意义。目前以麒麟菜为原料，利用酶解技术制备麒麟菜抗氧化肽的工艺研究处于空白阶段。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有较强的自由基清除能力，且能显著提高人脐静脉内皮细胞(HUVEC)模型的SOD和GSH-PX的水平，降低MDA的含量的麒麟菜抗氧化四肽，其应用于制备抗氧化相关的药物、保健产品、特殊医用食品和化妆品中。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
本发明提供一种由SEQ ID No:1的氨基酸序列组成的麒麟菜抗氧化四肽。该麒麟菜抗氧化寡肽Tyr-Ala-Val-Thr(YAVT)麒麟菜四肽Tyr-Ala-Val-Thr(YAVT)具有较强的自由基清除能力，且能显著提高人脐静脉内皮细胞(HUVEC)模型的SOD和GSH-PX的水平，降低MDA的含量。因此，Tyr-Ala-Val-Thr(YAVT)具有良好的抗氧化活性。
其中，抗氧化四肽通过酶解麒麟菜蛋白获得，具有抗氧化活性。
抗氧化四肽的DPPH自由基、ABTS自由基和超氧自由基的EC50值分别为1452±10.09μM、41.46±2.153μM和0.57±0.16mM。
抗氧化四肽的ESI-MS测定分子量为452.38Da。
本发明还提供一种麒麟菜抗氧化四肽的制备方法，包括麒麟菜藻蛋白的制备、麒麟菜藻蛋白的酶解、麒麟菜抗氧化寡肽的制备；具体为：
麒麟菜藻蛋白：取麒麟菜粉末，按照料液比1g:100mL加入去离子水浸泡8～12h后，在室温下下用频率50～60kHz超声提取30～60min，提取液离心，取上清液加入硫酸铵至饱和度达到10％的，充分搅拌20～25min，冷冻离心，取上清液继续加入硫酸铵使之饱和度达到60％，充分搅拌20～25min，冷冻离心，沉淀透析、冻干，即为麒麟菜藻蛋白；
麒麟菜藻蛋白的酶解：取麒麟菜藻蛋白，按料液比1g:10～15mL加入蒸馏水，调节pH值至6.5～7.5，加入麒麟菜藻蛋白重量0.5～1.5％木瓜蛋白酶，50～60℃酶解4～6h，灭酶，冷却至室温，离心，上清液即麒麟菜藻蛋白酶解液
麒麟菜抗氧化寡肽的制备：将麒麟菜藻蛋白酶解液经截留分子量为1kDa和3kDa超滤膜进行分级，MW<1kDa部分配成80～100mg/mL溶液，按照体积比1mL:10～15mL加入到装有大孔吸附树脂柱中，洗脱，收集乙醇洗脱部分，冻干，经凝胶柱层析和反相高效液相色(RP-HPLC)纯化，得到麒麟菜抗氧化四肽。
作为优选，所述的步骤1)中的麒麟菜为红藻纲红翎菜科麒麟菜(Eucheumamuricatum)。
作为优选，所述步骤3)的大孔树脂为D101；
作为优选，所述步骤3)的凝胶柱层析和RP-HPLC纯化的具体过程为：
凝胶柱层析：将上述离子交换层析酶解物溶于双蒸水配成浓度为50～70mg/mL的溶液，于4℃、10,000～12,000r/min离心10～15min，上清液按照体积比1mL:10～15mL加入到葡聚糖凝胶Sephadex G-25层析柱中，用超纯水进行洗脱，根据280nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，抗氧化活性最强组分为凝胶层析酶解物；
RP-HPLC纯化：将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成20～30μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化，根据各组分抗氧化活性筛选获得抗氧化四肽Tyr-Ala-Val-Thr(YAVT)，分子量为452.38Da。
再优选，RP-HPLC条件为：进样量15～20μL；色谱柱Kromasil C18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：35％乙腈；洗脱速度1.0～1.5mL/min；紫外检测波长215nm。
本发明还提供一种麒麟菜抗氧化四肽在制备抗氧化相关的药物、保健产品、特殊医用食品和化妆品中的应用。
本发明还提供一种药物组合物，其包含有效量的权利要求1或2或3中的抗氧化四肽，和药学可接受的载体，该药物组合物为用于治疗或预防老化和/或自由基引发导致的各种疾病。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明所提供的麒麟菜抗氧化寡肽Tyr-Ala-Val-Thr(YAVT)麒麟菜四肽Tyr-Ala-Val-Thr(YAVT)具有较强的自由基清除能力，且能显著提高人脐静脉内皮细胞(HUVEC)模型的SOD和GSH-PX的水平，降低MDA的含量。因此，Tyr-Ala-Val-Thr(YAVT)具有良好的抗氧化活性，可用于抗氧化相关的药品、保健产品，以及特殊医用食品的开发。
本发明采用了上述技术方案提供一种麒麟菜抗氧化四肽及其应用，弥补了现有技术的不足，设计合理，操作方便。
附图说明
图1是本发明实施例1中不同麒麟菜藻蛋白酶解产物的DPPH自由基清除活性；
图2是本发明实施例1中麒麟菜藻蛋白ZD60酶解产物超滤组分的DPPH自由基清除活性；
图3是本发明实施例1中大孔吸附树脂处理后的ZDT-I酶解物的Sephadex G-25凝胶过滤层析结果；
图4是本发明实施例1中Sephadex G-25凝胶过滤层析所得的组分的DPPH自由基清除活性；
图5是本发明实施例1中凝胶层析组分GD-Ⅱ的反相高效液相色潜(RP-HPLC)分离纯化结果；
图6是本发明实施例1中抗氧化寡肽Peak 4的纯度分析；
图7是本发明实施例1中抗氧化四肽对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的增殖作用的影响；
图8是本发明实施例1中抗氧化四肽对HUVEC细胞氧化损伤的保护作用；
图9是本发明实施例1中不同浓度的抗氧化四肽对氧化损伤的HUVEC细胞中SOD水平的影响；
图10是本发明实施例1中不同浓度的抗氧化四肽对氧化损伤的HUVEC细胞中GSH-PX水平的影响；
图11是本发明实施例1中不同浓度的抗氧化四肽对氧化损伤的HUVEC细胞中MDA水平的影响。
具体实施方式
下面，结合具体实施例对本发明一实施方式的一种麒麟菜抗氧化四肽及其应用作进一步说明。
实施例1：
一种由SEQ ID No:1的氨基酸序列组成的麒麟菜抗氧化四肽。该麒麟菜抗氧化寡肽Tyr-Ala-Val-Thr(YAVT)麒麟菜四肽Tyr-Ala-Val-Thr(YAVT)具有较强的自由基清除能力，且能显著提高人脐静脉内皮细胞(HUVEC)模型的SOD和GSH-PX的水平，降低MDA的含量。因此，Tyr-Ala-Val-Thr(YAVT)具有良好的抗氧化活性。
其中，抗氧化四肽通过酶解麒麟菜蛋白获得，具有抗氧化活性；其DPPH自由基、ABTS自由基和超氧自由基的EC50值分别为1452±10.09μM、41.46±2.153μM和0.57±0.16mM；其ESI-MS测定分子量为452.38Da。
一种麒麟菜抗氧化四肽的制备方法，包括麒麟菜藻蛋白的制备、麒麟菜藻蛋白的酶解、麒麟菜抗氧化寡肽的制备；具体为：
1)麒麟菜藻蛋白：取麒麟菜粉末，按照料液比1g:100mL加入去离子水浸泡12h后，在室温下下用频率53kHz超声提取45min，提取液离心，取上清液加入硫酸铵至饱和度达到10％的，充分搅拌25min，7000r/min下，冷冻离心15min；收集蛋白沉淀ZD10；上清液继续加入硫酸铵使之饱和度达到60％，充分搅拌25min，7000r/min下，冷冻离心15min，收集蛋白沉淀ZD60；蛋白沉淀ZD10和ZD60透析、冻干，即为麒麟菜藻蛋白；
2)麒麟菜藻蛋白的酶解：取麒麟菜藻蛋白ZD10和ZD60，按料液比1g:10mL加入蒸馏水各配置5份溶液，按照表1调不同溶液的温度和pH后，按照酶用量1.0％分别向蛋白溶液中加入胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶，对麒麟菜藻蛋白ZD10和ZD60酶解4h，酶解液于95℃水浴中加热15min，然后在10,000r/min离心10min，收集上清液，测定不同溶液的DPPH自由基清除活性(如图1所示，其中*表示P<0.05)，麒麟菜藻蛋白ZD60的木瓜蛋白酶解液的DPPH自由基清除活性最高，所以麒麟菜藻蛋白的酶解选用木瓜蛋白酶；
表1五种蛋白酶的酶活力及最适温度和pH
项目 最适温度/℃ 最适pH 酶活力/(u/g)
胃蛋白酶 37 2.1 300000
木瓜蛋白酶 55 7.0 500000
碱性蛋白酶 50 8.0 160000
中性蛋白酶 40 7.0 50000
胰蛋白酶 50 8.0 200000
3)麒麟菜抗氧化寡肽的制备：将麒麟菜藻蛋白ZD60酶解液经截留分子量为1kDa和3kDa超滤膜进行分级，得ZDT-I(MW<1kDa)、ZDT-II(1kDa<MW<3kDa)和ZDT-III(＞3kDa)三个组分，测定其DPPH自由基清除活性(如图2所示，其中*表示P<0.05)，超滤组分ZDT-I的自由基清除活性最强。然后将ZDT-I配成100mg/mL溶液，按照体积比1mL:10mL加入到装有D101大孔吸附树脂柱中，先用2～3柱体积洗脱，然后用2～3柱体积95乙醇洗脱，收集乙醇洗脱部分，冻干，经凝胶柱层析和反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化，得到麒麟菜抗氧化肽，利用氨基酸序列分析仪和质谱测定其结构，纯化的具体过程为：
①凝胶柱层析：将上述大孔吸附树脂处理后的ZDT-I酶解物溶于双蒸水配成浓度为50mg/mL的溶液，于4℃、12000r/min的条件下离心20min，然后将离心上清液按照体积比1mL:20～25mL加入到葡聚糖凝胶Sephadex G-25层析柱中，用超纯水进行洗脱，根据280nm下的吸光度曲线收集洗脱组分(GD-I，GD-II，GD-III，GD-IV)(如图3所示)，测定其DPPH自由基清除活性(如图4所示，其中*表示P<0.05)，GD-Ⅱ显示出最强的自由基清除活性；
②RP-HPLC纯化：将上述凝胶层析酶解物GD-Ⅱ用双蒸水配成40～50μg/mL的溶液，利用RP-HPLC(进样量20μL；色谱柱Kromasil C18(250mm×4.6mm，5μm)进行纯化，根据抗氧化活性制备抗氧化寡肽Peak 4(如图5所示)。
③抗氧化寡肽结构的测定：抗氧化寡肽Peak 4经RP-HPLC检测为单一峰(如图6所示)，利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Tyr-Ala-Val-Thr(YAVT)，ESI-MS测定分子量为452.38Da。
将制得的麒麟菜抗氧化寡肽Tyr-Ala-Val-Thr(YAVT)进行活性评价，自由基清除结果表明Tyr-Ala-Val-Thr(YAVT)对DPPH自由基、ABTS自由基和超氧自由基具有较强的清除作用，EC50值分别为1452±10.09μM、41.46±2.153μM和0.57±0.16mM。细胞水平实验表明：Tyr-Ala-Val-Thr(YAVT)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的增殖作用无显著影响(如图7所示)，对H2O2氧化损伤的HUVEC细胞具有显著地保护作用(如图8所示，其中###P<0.001 vsControl组；**P<0.01vs模型组)，且能显著提高人脐静脉内皮细胞(HUVEC)模型的SOD(如图9所示，###P<0.001 vs Control组；***P<0.001，*P<0.05vs模型组)和GSH-PX(如图10所示，###P<0.001 vs Control组；***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05vs模型组)的水平，降低MDA的含量(如图11所示，###P<0.001 vs Control组；***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05vs模型组)。因此，Tyr-Ala-Val-Thr(YAVT)具有良好的抗氧化活性。
上述的步骤1)中的麒麟菜为红藻纲红翎菜科麒麟菜(Eucheuma muricatum)。
一种麒麟菜抗氧化四肽在制备抗氧化相关的药物、保健产品、特殊医用食品和化妆品中的应用。
一种药物组合物，其包含有效量的权利要求1或2或3中的抗氧化四肽，和药学可接受的载体，该药物组合物为用于治疗或预防老化和/或自由基引发导致的各种疾病。
实施例2：
为了提高麒麟菜抗氧化四肽的产率，一种麒麟菜抗氧化四肽的制备方法的优化方案为：
麒麟菜藻蛋白的制备步骤为：取麒麟菜粉末，按照料液比1g:100mL加提取溶剂浸泡8～12h后，在室温下下用频率50～60kHz超声提取20min，提取液离心，取上清液加入硫酸铵至饱和度达到10％的，充分搅拌20～25min后，在7000r/min的条件下冷冻离心10～15min；取上清液继续加入硫酸铵使之饱和度达到60％，充分搅拌20～25min后，在7000r/min的条件下冷冻离心10～15min，沉淀透析、冻干，即为麒麟菜藻蛋白。提取溶剂为浓度为0.3％(W/V)CaCl2溶液，其中含有CaCl2重量2.8％的乳酸依沙吖啶和15.8％的硝酸钾。上述提取溶剂中合适浓度的钙离子使得细胞能够比较容易的吸收和释放物质，即细胞通透性变大，细胞壁变薄，有利于蛋白流出，有助于超声波法破壁处理蓝藻细胞，同时在蛋白质分子结构中，钙离子影响其电荷分布与分子构象，导致蛋白质分子充分与钙离子结合，在这些改变的作用下，蛋白质分子的吸附行为得到提高，乳化液的稳定性也有明显提升，藻蛋白在钙溶液的条件下保持稳定状态。超声有效作用区域为一环形，在提取罐的周壁存在形成超声空白区的隐患，CaCl2溶液中乳酸依沙吖啶和硝酸钾的存在能够通过范德华力吸附在细胞壁表面，进而破坏细胞壁的多糖类物质，产生细小的裂孔，促进麒麟菜藻细胞快速吸水，撑破细胞壁，即使在超声空白区也能使藻细胞内的蛋白类物质溶出，不影响超声波提取麒麟菜藻蛋白的效率，同时能够大大减少超声波提取的时间，节约能耗。此外能够促进溶出的藻蛋白分子中氢键与水结合速度，在藻蛋白表面迅速形成水化膜，避免蛋白质在超声波的影响下变性，提高藻蛋白在提取溶剂中的稳定性，最终提高麒麟菜藻蛋白的得率。其余和实施例1相同。
测定实施例1和实施例2制备的麒麟菜藻蛋白含量：
采用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量是一种染料结合法，考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，在488nm处有最大光吸收；当它与蛋白质结合后变为蓝色，结合物的最大光吸收在595nm处。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右达到平衡，反应迅速；结合物在室温下1h内保持稳定，在5-20min，颜色的稳定性最好；试剂配制与操作简便快捷，干扰物质少，反应非常灵敏，可测定微克级蛋白质含量。
蛋白质标准曲线制作：准确称100mg取牛血清白蛋白置于100ml容量瓶中，定容后充分混匀，为蛋白质标准溶液；分别吸取2、4、6、8、10ml蛋白质标准溶液至100ml容量瓶中，定容并混匀，得到浓度分别为20、40、60、80、100μg/ml的牛血清蛋白质溶液；取6支具塞试管分别作为1-6号，1号中加入1ml蒸馏水作为空白对照，2-6号中分别加入浓度为20、40、60、80、100μg/ml的牛血清蛋白溶液1ml，每支试管中再分别加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂，充分混匀，放置2min后测定各管溶液在595nm下的光吸收值。
样品中蛋白质含量的测定：吸取适当浓度样品液1ml于带刻度试管，加入5ml考马斯亮蓝G-250蛋白试剂，充分混匀后放置2min，测其在595nm处光密度值；通过标准曲线方程计算样品液中蛋白质含量。
实施例1和实施例2藻蛋白的得率分别为：2.34％和2.86％，实施例1的酶解效果好于实施例2，这说明CaCl2溶液中乳酸依沙吖啶和硝酸钾的存在能够提高麒麟菜藻蛋白的得率。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。
序列表
<110> 浙江海洋大学
<120> 一种麒麟菜抗氧化四肽及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 4
<212> PRT
<213> 麒麟菜(Eucheuma muricatum)
<400> 2
Tyr Ala Val Thr
1

Claims (10)

1.一种由SEQ ID No:1的氨基酸序列组成的麒麟菜抗氧化四肽。
2.根据权利要求1所述的一种麒麟菜抗氧化四肽，其特征在于：所述抗氧化四肽通过酶解麒麟菜蛋白获得，所述抗氧化四肽具有抗氧化活性。
3.根据权利要求2所述的一种麒麟菜抗氧化四肽，其特征在于：所述抗氧化四肽的DPPH自由基、ABTS自由基和超氧自由基的EC50值分别为1452±10.09μM、41.46±2.153μM和0.57±0.16mM。
4.根据权利要求1或2或3所述的一种麒麟菜抗氧化四肽，其特征在于：所述抗氧化四肽的ESI-MS测定分子量为452.38Da。
5.权利要求1-4任一项所述的一种麒麟菜抗氧化四肽的制备方法，其特征在于：包括麒麟菜藻蛋白的制备、麒麟菜藻蛋白的酶解、麒麟菜抗氧化寡肽的制备；
所述麒麟菜藻蛋白的制备步骤为：取麒麟菜粉末，按照料液比1g:100mL加入去离子水浸泡8～12h后，在室温下下用频率50～60kHz超声提取30～60min，提取液离心，取上清液加入硫酸铵至饱和度达到10％的，充分搅拌20～25min，冷冻离心，取上清液继续加入硫酸铵使之饱和度达到60％，充分搅拌20～25min，冷冻离心，沉淀透析、冻干，即为麒麟菜藻蛋白。
6.根据权利要求5所述的一种麒麟菜抗氧化四肽的制备方法，其特征在于：所述麒麟菜藻蛋白的酶解步骤为：取麒麟菜藻蛋白，按料液比1g:10～15mL加入蒸馏水，调节pH值至6.5～7.5，加入麒麟菜藻蛋白重量0.5～1.5％木瓜蛋白酶，50～60℃酶解4～6h，灭酶，冷却至室温，离心，上清液即麒麟菜藻蛋白酶解液。
7.根据权利要求5所述的一种麒麟菜抗氧化四肽的制备方法，其特征在于：所述麒麟菜抗氧化寡肽的制备步骤为：将麒麟菜藻蛋白酶解液经截留分子量为1kDa和3kDa超滤膜进行分级，MW<1kDa部分配成80～100mg/mL溶液，按照体积比1mL:10～15mL加入到装有大孔吸附树脂柱中，洗脱，收集乙醇洗脱部分，冻干，经凝胶柱层析和反相高效液相色纯化，得到麒麟菜抗氧化四肽。
8.权利要求1-8任一项所述的一种麒麟菜抗氧化四肽在制备抗氧化相关的药物、保健产品、特殊医用食品和化妆品中的应用。
9.一种药物组合物，其包含有效量的权利要求1或2或3中的抗氧化四肽，和药学可接受的载体。
10.根据权利要求1-8任一项所述的一种麒麟菜抗氧化四肽的应用，其特征在于：所述药物组合物为用于治疗或预防老化和/或自由基引发导致的各种疾病。
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