CN117511868A - 一种实现iNKT细胞快速扩增的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种实现iNKT细胞快速扩增的方法，属于细胞生物学技术领域。该方法首先将获得的外周血单个核细胞接种于培养皿中，添加含有α‑Galcer，麒麟菜多肽和IL‑2的培养液；之后将细胞置于37℃，5％CO2的细胞培养箱进行培养；之后每3天添加新的含有α‑Galcer，麒麟菜多肽和IL‑2的培养液，调整细胞浓度为2×106/mL；培养12‑14天后，收集细胞，纯化得到iNKT细胞。使用本发明方法获得的iNKT具有高增殖能力和高杀伤活性。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学技术领域，尤其涉及一种实现iNKT细胞快速扩增的方法。
背景技术
iNKT细胞(invariant natural killer T cells)是体内数目较少但功能独特的一类T淋巴细胞亚群，仅占外周血T淋巴细胞的0.1-1％。它们同时表达T细胞受体(TCR)和天然杀伤(NK)细胞标志性受体CD161，因此兼具T淋巴细胞和NK细胞的一些功能，可以视为连接先天和后天免疫的桥梁细胞。
iNKT细胞通过其半变量TCR可识别脂质抗原，当接触到这些抗原时，可快速激活并大量分泌细胞因子，包括IFN-γ等，从而激活和调控T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞等效应细胞的免疫应答。此外，活化的iNKT细胞还可直接通过释放穿孔素和颗粒酶等细胞毒因子来杀伤目标细胞，如肿瘤细胞。因此，iNKT细胞通过产生细胞因子和直接细胞毒作用，在机体的抗肿瘤免疫应答、抗病毒感染、自身免疫调节等过程中发挥双重免疫调节作用。
然而，由于人体外周血中iNKT细胞含量非常低，因此采用现有的扩增方法难以快速获得大量并且高活性的iNKT细胞制剂。这最终影响了iNKT细胞在临床肿瘤免疫治疗中的疗效，导致抗肿瘤效果不理想。因此，解决iNKT细胞体外快速高效扩增是当前面临的核心技术难题。
发明内容
本发明目的在于提供一种实现iNKT细胞快速扩增的方法，从而实现iNKT细胞的快速扩增并且提高iNKT细胞的直接杀伤活性。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
首先，本发明提供了一种实现iNKT细胞快速扩增的方法，所述方法包括如下步骤：
(a)将获得的外周血单个核细胞接种于培养皿中，添加含有α-Galcer，麒麟菜多肽和IL-2的培养液；
(b)将细胞置于37℃，5％ CO2的细胞培养箱进行培养；
(c)每3天添加新的含有α-Galcer，麒麟菜多肽和IL-2的培养液，调整细胞浓度为2×106/mL；
(d)培养12-14天后，收集细胞，纯化得到iNKT细胞。
优选地，所述步骤(a)和步骤(c)中，所述培养液中α-Galcer的浓度为100ng/mL，所述麒麟菜多肽的浓度为100-2500μg/mL，所述IL-2的浓度为100U/mL。
优选地，所述麒麟菜多肽的浓度为500μg/mL；
优选地，所述麒麟菜多肽的制备方法包括如下步骤：
(a)选择新鲜的麒麟菜，去除残留杂质，并用清水清洗干净；
(b)将洗净的麒麟菜烘干至恒重；
(c)将烘干后的麒麟菜粉碎并过筛得到麒麟菜粉末；
(d)加入10倍量的蒸馏水，配置得到麒麟菜溶液A；
(e)加入1/100倍量的胰蛋白酶，调节温度为37℃，调节PH值为7.5，酶解3h，得到麒麟菜溶液B；
(f)将得到的麒麟菜溶液B在100℃加热10min，灭活蛋白酶，得到麒麟菜溶液C；
(g)将得到的麒麟菜溶液C置于高速离心机中，离心收集上清，得到麒麟菜溶液D；
(h)将麒麟菜溶液D使用5kDa超滤膜进行浓缩，收集滤过液；
(i)将滤过液冷冻干燥后，得到麒麟菜多肽。
其次，本发明提供了一种具有高增殖能力和高杀伤活性的iNKT细胞，所述iNKT细胞的获取方法如下：
(a)将获得的外周血单个核细胞接种于培养皿中，添加含有100ng/mL的α-Galcer，100-2500μg/mL的麒麟菜多肽和100U/mL的IL-2的培养液；
(b)将细胞置于37℃，5％ CO2的细胞培养箱进行培养；
(c)每3天添加新的含有α-Galcer，麒麟菜多肽和IL-2的RPMI1640培养液，调整细胞浓度为2×106/mL；
(d)培养12-14天后，收集细胞，纯化得到iNKT细胞。
优选地，所述麒麟菜多肽上述的麒麟菜多肽的制备方法制备得到。
其次，本发明提供了一种麒麟菜多肽在制备提高iNKT细胞的增殖能力的培养基中的应用，其特征在于，所述麒麟菜多肽由上述的麒麟菜多肽的制备方法制备得到。
优选地，所述培养基中麒麟菜多肽的浓度为大于等于100μg/mL。
优选地，所述培养基中麒麟菜多肽的浓度为大于等于100-2500μg/mL。
优选地，所述培养基中麒麟菜多肽的浓度为500μg/mL。
其次，本发明提供了一种麒麟菜多肽在制备提高iNKT细胞的细胞因子分泌能力的培养基中的应用，所述麒麟菜多肽由上述的麒麟菜多肽的制备方法制备得到；
所述细胞因子为IFN-γ；
优选地，所述培养基中麒麟菜多肽的浓度为大于等于100μg/mL。
优选地，所述培养基中麒麟菜多肽的浓度为大于等于100-2500μg/mL。
优选地，所述培养基中麒麟菜多肽的浓度为500μg/mL。
其次，本发明提供了一种麒麟菜多肽在制备提高iNKT细胞直接杀伤活性的培养基中的应用，所述麒麟菜多肽由上述的麒麟菜多肽的制备方法制备得到。
优选地，所述麒麟菜多肽通过提高iNKT细胞中穿孔素和颗粒酶B的基因表达来提高iNKT细胞的直接杀伤活性。
优选地，所述iNKT细胞直接杀伤活性为对于白血病细胞的直接杀伤活性。
优选地，所述培养基中麒麟菜多肽的浓度为大于等于100μg/mL。
优选地，所述培养基中麒麟菜多肽的浓度为大于等于100-2500μg/mL。
优选地，所述培养基中麒麟菜多肽的浓度为500μg/mL。
本发明的有益效果在于：
本发明发现采用本发明所制备的麒麟菜多肽处理后，能够显著提高iNKT细胞的增殖能力，并且能够显著提高iNKT细胞穿孔素和颗粒酶B的表达水平，增强细胞的直接杀伤作用；
同时，使用本发明所制备的麒麟菜多肽处理后的iNKT细胞分泌的细胞因子IFN-γ更多，从而可以增强iNKT细胞对于其他免疫细胞的激活调节；
而且，使用本发明所制备的麒麟菜多肽处理后的iNKT细胞对于白细胞细胞K562的杀伤活性明显增强。因此本发明提供了一种使用天然植物提取物快速获得功能增强的iNKT细胞的方法，从而可以使iNKT细胞在疾病免疫治疗中发挥更好的治疗效果。
附图说明
图1为不同培养方法获得的iNKT细胞A-D的增殖差异结果；
图2为不同培养方法获得的iNKT细胞A和C中颗粒酶B和穿孔素的表达差异；
图3为不同培养方法获得的iNKT细胞A和C分泌的IFN-γ的差异；
图4为不同培养方法获得的iNKT细胞A和C对于白血病细胞的杀伤活性差异。
具体实施方式
实施例1:制备外周血单个核细胞
(a)采集健康志愿者的外周静脉血5-10mL，使用EDTA抗凝后，3000rpm离心5min后，吸取上层血清；
(b)按照1:1的将PBS加入到剩余的细胞中，吹打混匀之后，使用滴管缓慢的将其加入到Ficoll-Paque分离液中；
(c)室温下2000r/min离心20min后，使用滴管小心吸取上、中层间的单核细胞并转移到新的离心管中；
(d)加入5倍以上体积的PBS洗涤后，1000r/min离心10min弃去上清；
(e)洗涤细胞2次，加入含10％FBS的RPMI1640培养液调整细胞浓度为2×106mL，得到外周血单个核细胞(PBMC)备用。
实施例2：制备麒麟菜多肽
(a)选择新鲜的麒麟菜，去除残留杂质，并用清水清洗干净；
(b)将洗净的麒麟菜切成细丝，放入烘干器中在50℃下烘干，烘干至恒重；
(c)将烘干后的麒麟菜使用研磨机粉碎，并过筛得到麒麟菜粉末；
(d)加入10倍量的蒸馏水，配置得到麒麟菜溶液A；
(e)加入1/100倍量的胰蛋白酶，调节温度为37℃，调节PH值为7.5，酶解3h，得到麒麟菜溶液B；
(f)将得到的麒麟菜溶液B在100℃加热10min，灭活蛋白酶，得到麒麟菜溶液C；
(g)将得到的麒麟菜溶液C置于高速离心机中，10000rpm离心30min，收集上清，得到麒麟菜溶液D；
(h)将麒麟菜溶液D使用5kDa超滤膜进行浓缩，收集滤过液；
(i)将滤过液放入冷冻干燥机中进行快速冷冻干燥后，得到麒麟菜多肽。
实施例3：对照组的iNKT细胞体外培养
(a)将实施例1得到的PBMC细胞接种于250mL培养瓶中，加入含有100ng/mL的α-Galcer和100U/mL的IL-2的RPMI1640培养液；
(b)将细胞置于37℃，5％ CO2的细胞培养箱进行培养；
(c)每3天添加新的含有100ng/mL的α-Galcer和100U/mL的IL-2的RPMI1640培养液，调整细胞浓度为2×106/mL。
实施例4：实验组A的iNKT细胞体外培养
(a)将实施例1的得到的PBMC细胞接种于250mL培养瓶中，加入含有100ng/mL的α-Galcer，100μg/mL的麒麟菜多肽和100U/mL的IL-2的RPMI1640培养液；
(b)将细胞置于37℃，5％ CO2的细胞培养箱进行培养；
(c)每3天添加新的含有100ng/mL的α-Galcer，100μg/mL的麒麟菜多肽和100U/mL的IL-2的RPMI1640培养液，调整细胞浓度为2×106/mL。
实施例5：实验组B的iNKT细胞体外培养
(a)将实施例1的得到的PBMC细胞接种于250mL培养瓶中，加入含有100ng/mL的α-Galcer，500μg/mL的麒麟菜多肽和100U/mL的IL-2的RPMI1640培养液；
(b)将细胞置于37℃，5％ CO2的细胞培养箱进行培养；
(c)每3天添加新的含有100ng/mL的α-Galcer，500μg/mL的麒麟菜多肽和100U/mL的IL-2的RPMI1640培养液，调整细胞浓度为2×106/mL。
实施例6：实验组C的iNKT细胞体外培养
(a)将实施例1的得到的PBMC细胞接种于250mL培养瓶中，加入含有100ng/mL的α-Galcer，2500μg/mL的麒麟菜多肽和100U/mL的IL-2的RPMI1640培养液；
(b)将细胞置于37℃，5％ CO2的细胞培养箱进行培养；
(c)每3天添加新的含有100ng/mL的α-Galcer，2500μg/mL的麒麟菜多肽和100U/mL的IL-2的RPMI1640培养液，调整细胞浓度为2×106/mL。
实施例7：纯化各组的iNKT细胞
(a)收集实施例3-6培养9d的细胞，300g离心后，使用PBS进行洗涤；
(b)按照400μL PBS重悬108个细胞的量加入PBS重悬细胞；
(c)每400μL重悬细胞加入100μL抗iNKT细胞磁珠(TCR Vα24-Jα18阳性)，混合均匀后，置于4℃冰箱中孵育15min；
(d)孵育结束后，每500μL加入1ml缓冲液洗涤细胞；
(e)1000r/min离心10min，按照500μL PBS重悬108个细胞的量加入PBS重悬细胞；
(f)采用LS柱再次进行磁珠分选，得到实施例3-6培养的iNKT细胞，分别命名为iNKT细胞A，iNKT细胞B，iNKT细胞C，iNKT细胞D，检测合格后备用。
实施例8：检测不同培养方法获得的iNKT的增殖能力
(a)将得到iNKT细胞A-D按照2×106/mL的密度接种到96孔细胞培养板中，每个孔加入100μL；
(b)每种细胞设置3个复孔，将96孔细胞培养板置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中进行培养；
(c)培养72h后，每孔加入10μL的CCK-8试剂，以iNKT细胞A作为对照计算iNKT细胞B-D的细胞增殖率差异。
从图1的结果中可以看出，相较于iNKT细胞A，iNKT细胞B的细胞增殖率为142.7±4.97，iNKT细胞C的细胞增殖率为202.9±5.68，iNKT细胞D的细胞增重率为202.1±5.98。
从上述结果可以看出，iNKT细胞B相较于iNKT细胞A提高了42.7％，增殖提高效果显著，说明在培养基中添加100μg/mL的麒麟菜多肽便可以显著的提高iNKT细胞的增殖能力；
iNKT细胞C相较于iNKT细胞A提高了102.9％，iNKT细胞D相较于iNKT细胞A提高了102.1％，说明在培养基中添加500μg/mL的麒麟菜多肽可以更加显著的提高iNKT细胞的增殖能力。但是，继续增加麒麟菜多肽的浓度，并没有进一步增加iNKT细胞的增殖能力。因此，本发明选择500μg/mL的麒麟菜多肽作为最佳浓度。
实施例9：检测iNKT细胞A和iNKT细胞C中穿孔素和颗粒酶B的基因表达水平
(a)将1×107的iNKT细胞A和iNKT细胞C离心后，收集细胞，加入1ml TRIZOL试剂提取细胞的RNA；
(b)测定RNA的浓度和纯度合格后，使用Takara逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA；
(c)以GAPDH为内参，按照PCR反应体系添加试剂，进行PCR扩增反应；
(c)琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物后，进行凝胶成像，结果如图2所示。
从图2可以看出，iNKT细胞C中的穿孔素和颗粒酶B基因表达水平明显高于iNKT细胞A，说明使用本发明所制备的麒麟菜多肽处理iNKT细胞后可以有效的提高iNKT细胞中穿孔素和颗粒酶B的表达，从而可以提高iNKT细胞的直接杀伤作用。
实施例10：检测iNKT细胞A和iNKT细胞C培养上清中的IFN-γ的含量
(a)将得到iNKT细胞A和iNKT细胞C按照2×106/mL的密度接种到96孔细胞培养板中，每个孔加入100μL；
(b)每种细胞设置3个复孔，将96孔细胞培养板置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中进行培养；
(c)培养72h后，离心收集上清，使用IFN-γ的ELISA试剂盒检测上清中的IFN-γ的含量，结果如图3所示。
从图3可以看出，在未使用靶细胞刺激的情况下，iNKT细胞A分泌的IFN-γ含量为4.79±0.46，iNKT细胞B分泌的IFN-γ含量为11.15±0.59；可以看出使用本发明所制备的麒麟菜多肽处理iNKT细胞后可以有效的促进iNKT细胞分泌细胞因子IFN-γ，来进一步激活T细胞等来发挥间接的免疫作用。
实施例11：iNKT细胞A和iNKT细胞C对于白血病细胞K562的杀伤左右
(a)将白血病细胞K562细胞制成5×105/ml的细胞悬液；
(b)按照20:1，10:1，5:1和2:1的效靶比分别加入iNKT细胞A和iNKT细胞C；
(c)将混合后的细胞接种于6孔培养板中，同时设置靶细胞自然组(LDH释放量为0)和靶细胞最大释放组(LHD释放量为100％)；
(d)将细胞培养板置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中，培养6h；
(e)培养结束后，离心收集上清，使用LDH检测LDH释放量，计算各效靶比的iNKT细胞的杀伤活性。
得到的结果如图4所示，2:1效靶比时，iNKT细胞A的杀伤率为51.89±4.37，iNKT细胞C的杀伤率为70.24±5.32；
5:1效靶比时，iNKT细胞A的杀伤率为59.52±4.97，iNKT细胞C的杀伤率为77.28±5.49；
10:1效靶比时，iNKT细胞A的杀伤率为61.37±4.49，iNKT细胞C的杀伤率为85.61±5.21；
20:1效靶比时，iNKT细胞A的杀伤率为63.61±4.92，iNKT细胞C的杀伤率为91.86±4.79。
上述的结果说明，使用本发明所制备的麒麟菜多肽处理iNKT细胞后可以有效的提高iNKT细胞对于白血病细胞的杀伤作用，尤其在高效靶比(20:1)下，麒麟菜多肽处理组iNKT细胞C的杀伤率高达91.86％，而对照组iNKT细胞A的杀伤率也只有63.61％，差异非常明显。
实施例12：一种实现iNKT细胞快速扩增的方法
(a)将获得的外周血单个核细胞接种于培养皿中，添加含有100ng/mL的α-Galcer，100-2500μg/mL的麒麟菜多肽和100U/mL的IL-2的RPMI1640培养液；
(b)将细胞置于37℃，5％ CO2的细胞培养箱进行培养；
(c)每3天添加新的含有100ng/mL的α-Galcer，100-2500μg/mL的麒麟菜多肽和100U/mL的IL-2的RPMI1640培养液，调整细胞浓度为2×106/mL；
(d)培养12-14天后，收集细胞，纯化得到iNKT细胞。
Claims (10)
1.一种实现iNKT细胞快速扩增的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(a)将获得的外周血单个核细胞接种于培养皿中，添加含有α-Galcer，麒麟菜多肽和IL-2的培养液；
(b)将细胞置于37℃，5％CO2的细胞培养箱进行培养；
(c)每3天添加新的含有α-Galcer，麒麟菜多肽和IL-2的培养液，调整细胞浓度为2×106/mL；
(d)培养12-14天后，收集细胞，纯化得到iNKT细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)和步骤(c)中，所述培养液中α-Galcer的浓度为100ng/mL，所述麒麟菜多肽的浓度为100-2500μg/mL，所述IL-2的浓度为100U/mL。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述麒麟菜多肽的制备方法包括如下步骤：
(a)选择新鲜的麒麟菜，去除残留杂质，并用清水清洗干净；
(b)将洗净的麒麟菜烘干至恒重；
(c)将烘干后的麒麟菜粉碎并过筛得到麒麟菜粉末；
(d)加入10倍量的蒸馏水，配置得到麒麟菜溶液A；
(e)加入1/100倍量的胰蛋白酶，调节温度为37℃，调节PH值为7.5，酶解3h，得到麒麟菜溶液B；
(f)将得到的麒麟菜溶液B在100℃加热10min，灭活蛋白酶，得到麒麟菜溶液C；
(g)将得到的麒麟菜溶液C置于高速离心机中，离心收集上清，得到麒麟菜溶液D；
(h)将麒麟菜溶液D使用5kDa超滤膜进行浓缩，收集滤过液；
(i)将滤过液冷冻干燥后，得到麒麟菜多肽。
4.一种具有高增殖能力和高杀伤活性的iNKT细胞，其特征在于，所述iNKT细胞的获取方法如下：
(a)将获得的外周血单个核细胞接种于培养皿中，添加含有100ng/mL的α-Galcer，100-2500μg/mL的麒麟菜多肽和100U/mL的IL-2的培养液；
(b)将细胞置于37℃，5％CO2的细胞培养箱进行培养；
(c)每3天添加新的含有α-Galcer，麒麟菜多肽和IL-2的RPMI1640培养液，调整细胞浓度为2×106/mL；
(d)培养12-14天后，收集细胞，纯化得到iNKT细胞。
5.根据权利要求4所述的iNKT细胞，其特征在于，所述麒麟菜多肽由权利要求3所述的麒麟菜多肽的制备方法制备得到。
6.一种麒麟菜多肽在制备提高iNKT细胞的增殖能力的培养基中的应用，其特征在于，所述麒麟菜多肽由权利要求3所述的麒麟菜多肽的制备方法制备得到。
7.一种麒麟菜多肽在制备提高iNKT细胞的细胞因子分泌能力的培养基中的应用，其特征在于，所述麒麟菜多肽由权利要求3所述的麒麟菜多肽的制备方法制备得到；
所述细胞因子为IFN-γ。
8.一种麒麟菜多肽在制备提高iNKT细胞直接杀伤活性的培养基中的应用，其特征在于，所述麒麟菜多肽由权利要求3所述的麒麟菜多肽的制备方法制备得到。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述麒麟菜多肽通过提高iNKT细胞中穿孔素和颗粒酶B的基因表达来提高iNKT细胞的直接杀伤活性。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述iNKT细胞直接杀伤活性为对于白血病细胞的直接杀伤活性。
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