CN1444648A - 扩增自然杀伤t细胞的方法 - Google Patents
扩增自然杀伤t细胞的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1444648A CN1444648A CN01813425A CN01813425A CN1444648A CN 1444648 A CN1444648 A CN 1444648A CN 01813425 A CN01813425 A CN 01813425A CN 01813425 A CN01813425 A CN 01813425A CN 1444648 A CN1444648 A CN 1444648A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- cells
- alpha
- lymphopoiesis
- people
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000000581 natural killer T-cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 91
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 58
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 63
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 43
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims abstract description 31
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 claims abstract description 26
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims abstract description 21
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims abstract description 21
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 18
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 claims description 27
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 26
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 20
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 20
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 20
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 20
- 210000003995 blood forming stem cell Anatomy 0.000 claims description 20
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 20
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 14
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 12
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 9
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 claims description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 2
- 102100030703 Interleukin-22 Human genes 0.000 claims 3
- 108010074109 interleukin-22 Proteins 0.000 claims 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 abstract description 4
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 abstract description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 abstract 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 abstract 1
- VQFKFAKEUMHBLV-BYSUZVQFSA-N 1-O-(alpha-D-galactosyl)-N-hexacosanoylphytosphingosine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)N[C@H]([C@H](O)[C@H](O)CCCCCCCCCCCCCC)CO[C@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O VQFKFAKEUMHBLV-BYSUZVQFSA-N 0.000 description 28
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 18
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 16
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 16
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 9
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 9
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 7
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- 230000004044 response Effects 0.000 description 7
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 6
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 5
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 5
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 5
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 description 5
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 4
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 4
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 4
- 210000002568 pbsc Anatomy 0.000 description 4
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 4
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 3
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 3
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 3
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 3
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 3
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 3
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 3
- QTENRWWVYAAPBI-YCRXJPFRSA-N streptomycin sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@H]1O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@H]1O QTENRWWVYAAPBI-YCRXJPFRSA-N 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 102100036013 Antigen-presenting glycoprotein CD1d Human genes 0.000 description 2
- YDNKGFDKKRUKPY-JHOUSYSJSA-N C16 ceramide Natural products CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)N[C@@H](CO)[C@H](O)C=CCCCCCCCCCCCCC YDNKGFDKKRUKPY-JHOUSYSJSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 2
- 101000716121 Homo sapiens Antigen-presenting glycoprotein CD1d Proteins 0.000 description 2
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- CRJGESKKUOMBCT-VQTJNVASSA-N N-acetylsphinganine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCC[C@@H](O)[C@H](CO)NC(C)=O CRJGESKKUOMBCT-VQTJNVASSA-N 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- GZCGUPFRVQAUEE-UHFFFAOYSA-N alpha-D-galactose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O GZCGUPFRVQAUEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-UHFFFAOYSA-N alpha-D-glucopyranose Natural products OCC1OC(O)C(O)C(O)C1O WQZGKKKJIJFFOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000002617 apheresis Methods 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 229940106189 ceramide Drugs 0.000 description 2
- ZVEQCJWYRWKARO-UHFFFAOYSA-N ceramide Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)C(=O)NC(CO)C(O)C=CCCC=C(C)CCCCCCCCC ZVEQCJWYRWKARO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 229960003082 galactose Drugs 0.000 description 2
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000002650 habitual effect Effects 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 2
- 208000025113 myeloid leukemia Diseases 0.000 description 2
- VVGIYYKRAMHVLU-UHFFFAOYSA-N newbouldiamide Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)C(O)C(O)C(CO)NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC VVGIYYKRAMHVLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 102100035793 CD83 antigen Human genes 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000006168 Ewing Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 102100021260 Galactosylgalactosylxylosylprotein 3-beta-glucuronosyltransferase 1 Human genes 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102100039619 Granulocyte colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 1
- 108010068250 Herpes Simplex Virus Protein Vmw65 Proteins 0.000 description 1
- 101000946856 Homo sapiens CD83 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000894906 Homo sapiens Galactosylgalactosylxylosylprotein 3-beta-glucuronosyltransferase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 1
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 1
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 1
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 description 1
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 description 1
- 102000003810 Interleukin-18 Human genes 0.000 description 1
- 108090000171 Interleukin-18 Proteins 0.000 description 1
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 1
- 102000000646 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 1
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 1
- 102000000704 Interleukin-7 Human genes 0.000 description 1
- 108010062867 Lenograstim Proteins 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 1
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 1
- 101100094860 Mus musculus Slc22a6 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091008877 NK cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000010648 Natural Killer Cell Receptors Human genes 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 102000012740 beta Adrenergic Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010079452 beta Adrenergic Receptors Proteins 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 1
- 239000012830 cancer therapeutic Substances 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 230000007541 cellular toxicity Effects 0.000 description 1
- 201000010989 colorectal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 208000021045 exocrine pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 1
- 150000008195 galaktosides Chemical class 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 150000002339 glycosphingolipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 1
- 231100000652 hormesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 108040006849 interleukin-2 receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 229960002618 lenograstim Drugs 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003810 lymphokine-activated killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 230000001483 mobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 1
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 210000005132 reproductive cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- PXLIDIMHPNPGMH-UHFFFAOYSA-N sodium chromate Chemical class [Na+].[Na+].[O-][Cr]([O-])(=O)=O PXLIDIMHPNPGMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4613—Natural-killer cells [NK or NK-T]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K2035/124—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells the cells being hematopoietic, bone marrow derived or blood cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/515—Animal cells
- A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
- A61K2239/48—Blood cells, e.g. leukemia or lymphoma
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/22—Colony stimulating factors (G-CSF, GM-CSF)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
在一种能使淋巴细胞增殖和/或活化的细胞因子和α－糖基神经酰胺存在条件下，通过培养一种可以从人外周血获得的单核细胞组分而扩增人Vα24+自然杀伤T细胞，该外周血中的造血干细胞是被粒细胞集落刺激因子动员的。利用本方法扩增的含有人Vα24+自然杀伤T细胞的细胞组分可作为一种有效的癌症治疗剂。
Description
技术领域
本发明涉及一种用以扩增人Vα24+自然杀伤T(NKT)细胞的方法，以及由本方法获得的人Vα24+NKT细胞和一种包含人Vα24+NKT细胞的组分的应用。
背景技术
NKT细胞是成熟淋巴细胞中的一种独特亚群，其兼有NK细胞受体和T细胞受体(Annu.Rev.Immunol.，15，535-562，1997；J.Exp.Med.，182，633-638，1995)。鼠NKT细胞表达NK1.1和TCRαβ受体，并且在骨髓(J.Immunol.，145，3209-3215，1990)和肝脏(J.Exp.Med.，180，699-704，1994)中尤为密集。这种细胞表达的TCR所有组成成分非常有限(J.Exp.Med.，180，1097-1106，1994；Int.Immunol.，7，1157-1161，1995)，其中包括一种恒定的α链。这些结果暗示NKT细胞的配体是非多态的和非经典的MHC I类分子，这类分子表现出一种独特的经过TAP(抗原呈递相关转运蛋白)-非依赖性途径的特异性抗原呈递过程。最近的研究确定，一种MHC Ib类分子CD1d是NKT细胞的配体。新近报道，表达发生不包括N区的规范重排的恒定Vα24 JαQ TCR的人类T细胞与鼠Vα14-Jα281+ NKT细胞类似(J.Exp.Med.，180，1097-1106，1994)。此外，研究显示，在用α-半乳糖苷神经酰胺(α-GalCer)预处理的CD1d抗原呈递细胞(APCs)的刺激作用下，鼠Vα14-Jα281+细胞和人Vα24 JαQ TCR+NKT细胞可发生增殖。据报道，活化的NKT细胞表现出一种对多种肿瘤细胞系的穿孔素依赖性NK-样细胞毒性(Cancer Res.，59，5102-5105，1999)，以及抑制某些实验动物模型中的肿瘤转移(Pro.Natl.Acad.Sci.USA，95，5690-5693，1998)。
十九世纪八十年代，开展了大量的免疫疗法临床试验，包括在注射或不注射细胞因子的条件下，所进行的LAK(淋巴因子动员性杀伤)细胞疗法和TIL(肿瘤浸润性淋巴细胞)疗法试验。然而，在临床效果方面，这些临床试验的结果显示这些细胞疗法缺乏前景，因为没有发现明显的临床疗效。十九世纪九十年代，在鉴定人类癌症免疫应答的分子成分方面取得了重要进步。目前，一些不同的免疫疗法正被用于临床试验，如树突状细胞(DC)疗法和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)疗法。
如上所述，与T细胞、B细胞和NK细胞等其他淋巴样细胞不同，NKT细胞的特征在于其共表达NK受体和一种恒定的T细胞受体。已知这种新的淋巴细胞系能产生大量的白细胞介素4(IL-4)和γ干扰素(IFN-γ)，并且表现出强的杀肿瘤活性。因此，NKT细胞的这种功能对癌症的免疫疗法非常重要，并且利用这些细胞的能力期望代表一种新的免疫疗法。已开展了一些先体外后体内扩增Vα24+NKT细胞的研究(Cancer Res.，59，5102-5105，1999；Immunology，99，229-234，2000)。然而，甚至从脐带血中也很难获得足够量的这种细胞以实现免疫治疗。
发明内容
本发明的目的是提供一种方法，用以产生足够量的Vα24+NKT细胞。本发明的另一个目的是提供Vα24+NKT细胞和适用于细胞疗法的包含Vα24+NKT细胞的细胞组分，其中的细胞疗法是指一种通过使用细胞来治疗疾病的方法。
本发明人发现一种方法，该方法通过使用α-糖基神经酰胺，用以从一种单核细胞组分中获得足够量的Vα24+NKT细胞，该单核细胞组分可从外周血中获得，该外周血中的造血干细胞由粒细胞集落刺激因子(G-CSF)所动员(G-PBSCs)。
该单核细胞组分包括DCs和T细胞、单核细胞、B细胞、NK细胞、NKT细胞、粒细胞等。当α-糖基神经酰胺作用于该组分时，α-糖基神经酰胺被呈递到DC的CD1d分子上，并且由于细胞因子的分泌，使得Vα24+NKT细胞、NK细胞等发生增殖。当单核细胞组分是从外周血中获得，该外周血中的造血干细胞由G-CSF所动员时，NKT细胞会发生更为有效的增殖，并且单核细胞组分会引起更强的免疫应答。此外，与从没有G-CSF动员的外周血中获得的单核细胞组分(PBMCs)比较，在IL-2和α-糖基神经酰胺存在条件下，通过培养可以从造血干细胞由G-CSF所动员的外周血中获得的单核细胞组分(G-PBSCs)，所促成的NKT细胞的扩增更为持久。
本发明基于这些发现而得以完成，并且提供一些扩增方法和产生方法(包括利用这些方法所获得的细胞和细胞组分)，以及用于治疗癌症试剂，如下所述：
(1)一种用以扩增人Vα24+NKT细胞的方法，该方法包括在一种影响淋巴细胞增殖和/或活化的细胞因子以及α-糖基神经酰胺存在的条件下，培养可以从人外周血中获得的单核细胞组分(G-PBSCs)，该外周血中的造血干细胞由G-CSF所动员。
(2)一种根据(1)的方法，其中影响淋巴细胞增殖和/或活化的细胞因子包括IL-2。
(3)一种用以产生人Vα24+NKT细胞的方法，该方法包括在一种影响淋巴细胞增殖和/或活化的细胞因子以及α-糖基神经酰胺存在的条件下，培养可以从人外周血中获得的单核细胞组分(G-PBSCs)，该外周血中的造血干细胞由G-CSF所动员，以及从培养细胞中分离人Vα24+自然杀伤T细胞。
(4)一种根据(3)的方法，其中影响淋巴细胞增殖和/或活化的细胞因子包括IL-2。
(5)一种用以产生一种包含人Vα24+NKT细胞的细胞组分的方法，该方法包括在一种影响淋巴细胞增殖和/或活化的细胞因子以及α-糖基神经酰胺存在的条件下，培养可以从人外周血中获得的单核细胞组分(G-PBSCs)，该外周血中的造血干细胞由G-CSF所动员。
(6)一种根据(5)的方法，该方法进一步包括在肿瘤抗原存在的条件下，培养那些通过在IL-2和α-糖基神经酰胺存在的条件下培养而获得的细胞。
(7)一种根据(5)或(6)的方法，其中影响淋巴细胞增殖和/或活化的细胞因子包括IL-2。
(8)一种用于治疗癌症的试剂，该试剂含有作为一种活性成分的由(3)或(4)中定义的方法所获得的人Vα24+自然杀伤T细胞。
(9) 一种用于治疗癌症的试剂，该试剂含有作为一种活性成分的由(5)-(7)中任一项定义的方法所获得的含有人Vα24+自然杀伤T细胞的一种细胞组分。
此外，本发明还提供一种治疗癌症的方法，包括将有效量的人Vα24+NKT细胞或包含人Vα24+NKT细胞的细胞组分给药于需要癌症治疗的患者，其中的人Vα24+NKT细胞是由(3)或(4)中定义的方法获得的，而包含人Vα24+NKT细胞的细胞组分则是由(5)至(7)中定义的任一方法获得的。此外，本发明提供由(3)或(4)中定义的方法所获得的人Vα24+NKT细胞或由(5)至(7)中定义的任一方法所获得的包含人Vα24+NKT细胞的细胞组分在制造用于癌症治疗的试剂中的用途。
附图简述
图1显示来自PBMCs和G-PBSCs的反应于IL-2和α-GalCer所扩增得到的Vα24+NKT细胞的典型流式细胞术概图。左图：培养后，中图：有α-GalCer，右图：无α-GalCer。
图2显示当在存在α-GalCer和100U/ml IL-2的条件下培养PBMCs或G-PBSCs12天时，培养前和培养后Vα24+NKT细胞的数量。
图3显示α-GalCer活化的Vα24+NKT细胞的FACS图。在存在α-GalCer和100U/ml的IL-2的条件下培养PBMCs或G-PBSCs12天，并且分析了培养细胞的表型。
图4显示α-GalCer活化的Vα24+NKT细胞的抗肿瘤细胞毒活性。利用51Cr释放测定法来检测对Molt-4T淋巴瘤(1×104；左图)和K562髓细胞性白血病(1×104；右图)的细胞毒性。
图5显示来自PBMCs和G-PBSCs的反应于IL-2和α-GalCer所扩增得到的Vα24+NKT细胞的数量的逐日变化。
实施本发明的最佳方式
以下将详细描述本发明。
本发明所述的扩增方法和产生方法的特征在于在一种影响淋巴细胞增殖和/或活化的细胞因子以及α-糖基神经酰胺存在的条件下，培养可以从人外周血中获得的单核细胞组分(G-PBSCs)，该外周血中的造血干细胞由G-CSF所动员。
制备G-PBSCs的方法，例如，采用以下方法。
当将G-CSF以2-16μg/kg/日的剂量经皮下给药于癌症患者5-10天时，作为造血干细胞指数的CD34+细胞的数量和粒细胞-巨噬细胞集落形成单位(CFU-GM)就会增加，并且大约从第5-6天起，它们都显示出最大值。因此，起始G-CSF给药后的4-12天，通过血浆分离置换法来收集含有外周血干细胞的细胞组分(粗制G-PBSCs)。再通过进一步使用密度梯度离心等方法从其中制备一种单核细胞组分(G-PBSCs)。此外，还可以通过类似方法从健康个体中制备G-PBSCs。
从外周血中获得的单核细胞组分主要包含单核细胞和粒细胞，如单核细胞和淋巴细胞(T细胞、B细胞、NK细胞和NKT细胞)，并且从其中去除了红细胞和血小板。
一般而言，来自健康个体的外周血含有0.02％的造血干细胞。与此相比，来自健康个体并且通过G-CSF的给药引起动员的外周血中，造血干细胞的含量增加至约0.5-1％，而来自癌症患者并且在化疗后通过G-CSF的给药引起动员的外周血中，造血干细胞的含量增加至约2-7％。因此，与从造血干细胞不由G-CSF动员的外周血中获得的单核细胞组分相比，从造血干细胞由G-CSF动员的外周血中获得的单核细胞组分含有更多的造血干细胞。
如果在培养基中加入能影响淋巴细胞增殖和/或活化的细胞因子以及α-糖基神经酰胺，在惯用的培养条件下就可以培养PBSCs。影响淋巴细胞增殖和/或活化的细胞因子以及α-糖基神经酰胺的加入量和培养时间应能有效地使Vα24+NKT细胞扩增。尽管依据所加入的影响淋巴细胞增殖和/或活化的细胞因子的不同会有所变化，但是通常细胞因子的浓度为50-200U/ml，α-糖基神经酰胺的浓度通常为10-200ng/ml，并且培养时间为2-40天。通过利用流式细胞仪对荧光抗体染色的细胞进行分析可以测定Vα24+NKT细胞的扩增情况。
α-糖基神经酰胺是一种神经鞘糖脂，其中由半乳糖、葡萄糖等构成的糖链通过α-键与神经酰胺结合。其实例包括WO 93/05055(1993年3月18日公开)、WO 94/02168(1994年2月3日公开)、WO 94/09020(1994年4月28日公开)、WO 94/24142(1994年10月27日公开)和WO 98/44928(1998年10月15日公布)所公开的那些内容。具体地说，优选的是(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-吡喃半乳糖基)-N-二十六醇基-2-氨基-1，3，4-十八烷醇。
影响淋巴细胞增殖和/或活化的细胞因子的实例包括IL-2、IL-7、IL-15、IL-12和IL-18。可以仅使用一种细胞因子或将两种或多种细胞因子结合使用。优选使用的细胞因子包括IL-2，即，IL-2或IL-2与另一种细胞因子的组合。
关于用于培养的培养基，应提到补加了10％胎牛血清(FCS)的RPMI-1640，其中包含2mM L-谷氨酰胺、1％丙酮酸、2％碳酸氢盐、100U/ml青霉素，以及100U/ml链霉素。
培养单核细胞组分，其中的造血干细胞如上文所述经G-CSF动员，这种方法与采用相同方式但不经G-CSF动员的PBMCs培养情况相比，可以使Vα24+NKT细胞的数量显著增加。
在以前的使用LAK细胞和TILs的临床试验中，将10×1010-11个效应细胞给予患者。根据本发明，不同的是，例如，从经G-CSF完成动员的外周血中平均收集8-40×109个单核细胞，将所收集的细胞在IL-2和α-糖基神经酰胺存在条件下培养12天后，就可以获得1×109-10个自体Vα24+NKT细胞。所得细胞的数量与以前临床研究中所用细胞数量相当，并且可有效的用于临床免疫疗法。
因此，根据本发明的扩增方法，已知具有杀灭多种类型肿瘤能力的Vα24+NKT细胞可有效地增殖以达到实用程度。同样，使用本发明的生产方法获得的含有Vα24+NKT细胞的细胞组分也能引起强免疫应答。
在本发明的生产方法中，在培养那些通过在影响淋巴细胞增殖和/或活化的细胞因子以及α-糖基神经酰胺存在的条件下培养而获得的细胞后，优选在一种肿瘤抗原存在条件下培养细胞。
如果培养基中加入了肿瘤抗原，就可以在培养PBSCs的惯用条件下完成肿瘤抗原存在条件下所进行的培养。肿瘤抗原的加入量和培养时间当充分，使得细胞组分包含的DCs有效地诱导CTL，该细胞组分通过在影响淋巴细胞增殖和/或活化的细胞因子以及α-糖基神经酰胺存在条件下培养获得。尽管依据肿瘤抗原类型的不同会有所变化，但是通常肿瘤抗原的浓度为10-10000μg/ml，培养时间为2-14天。确定CTL诱导的方法可以有前体频率分析(Sharrock CE et al.：Immunology Toda 11：281-286，1990)、ELISPOT方法(Pass Hetal.：Cancer J Sci Am 4：316-323，1998)，以及四聚物方法(RomeroP et al.，J Exp Med 188：1641-1650，1998)等。
通过在肿瘤抗原存在条件下进行培养，细胞组分中的CTL被诱导，因此，该细胞组分也可以引起对肿瘤抗原的特异性免疫应答。
实现从培养细胞中分离Vα24+NKT细胞的方法可以是一些常用方法，如磁珠法。
本发明用以治疗癌症的试剂包括，作为活性成分的通过本发明的方法获得的人Vα24+NKT细胞或一种包含人Vα24+NKT细胞的细胞组分。
通过本发明的生产方法获得的人Vα24+NKT细胞应能强效地引起肿瘤抗原特异性免疫应答，并同时清除肿瘤细胞。
在影响淋巴细胞增殖和/或活化的细胞因子以及α-糖基神经酰胺存在条件下，与通过培养不经G-CSF动员的单核细胞组分PBMCs所得到的细胞组分比较，通过本发明的生产方法获得的包含人Vα24+NKT细胞的细胞组分中，NKT细胞的扩增更为持久。
此外，在肿瘤抗原存在条件下，通过进一步实施培养所获得的包含人Vα24+NKT细胞的细胞组分能通过该组分中的DCs诱导CTL从而引起肿瘤抗原特异性免疫应答。也就是说，该细胞组分既可以通过扩增人Vα24+NKT细胞而有效地引起非肿瘤抗原特异性免疫应答，又可以引起肿瘤抗原特异性免疫应答。据报道，依据肿瘤组织部分(即，肿瘤细胞)的不同，主要组织相容性抗原(MHC)的表达水平也不同。由于能引起两种免疫应答，该细胞组分中的肿瘤抗原特异性CTL应能攻击表达MHC的肿瘤细胞，并且非肿瘤抗原特异性NKT细胞应能攻击低水平表达MHC或不表达MHC的肿瘤细胞。因此，将该实施方案的细胞组分应用于癌症治疗是很有利的。
因此，将由本发明所述产生方法获得的人Vα24+NKT细胞或含有人Vα24+NKT细胞的细胞组分作为癌症治疗剂的一种活性成分是很有利的。
在联合独立分离自另一种细胞群的经肿瘤抗原处理而活化的DC s的条件下，由本发明的生产方法获得的人Vα24+NKT细胞可以用于细胞疗法，如癌症治疗。获得活化DCs的方法有，用GM-CSF和IL-4或IL-3处理包含在PBSCs中的单核细胞，或者是用GM-CSF或IFNα处理CD34阳性造血干细胞。
本发明用于治疗癌症的试剂的给药途径可包括静脉内给药、皮下给药、皮内给药和淋巴节内给药。试剂的形式可包括一种在生理盐水或林格氏液等中的悬浮液。依据给药途径不同，给药量也不同，如果是皮下给药，剂量为0.1-5ml，或者，如果是静脉内给药，剂量可高达300ml。Vα24+NKT细胞的给药量通常以每平方米体表面积给药105-1010个细胞。所需治疗的疾病可包括多发性骨髓瘤、淋巴瘤、白血病、乳腺癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌、黑素瘤、肾癌、肝癌，以及胰腺癌等。此外，本发明的试剂还适用于病毒性疾病，如CML和HIV。
根据本发明，通过使用α-糖基神经酰胺可先体外后体内地产生大量的自体Vα24+NKT细胞。该细胞数量之大足以使其满足用于临床领域的要求。此外，培养的Vα24+NKT细胞显示出对肿瘤具有强杀肿瘤活性，无论该肿瘤是否表达MHC。在本发明中，与PBMCs比较，通过α-糖基神经酰胺的刺激，G-PBSCs显示出在体外非常有效地扩增人Vα24+NKT细胞的能力。无论是来自健康个体还是癌症患者，G-PBMCs都能扩增至相同的程度。
实施例
下文将结合实施例以详细描述本发明。
实施例1.人Vα24+NKT细胞的扩增
(1)PBMCs的制备和G-PBSCs的制备
来自健康个体的400ml全血制备出的血沉棕黄层(粗制PBMCs)由日本红十字血液中心提供。含有PBSCs的细胞组分(粗制G-PBSCs)来自经过化疗的患者，并且这些患者在化疗后接受G-CSF以100-250μg/人/天的剂量经皮下给药6-10天(表1)，方法是在最后一次注射G-CSF后2-24小时内，用COBE SpectraTM细胞分离器(LAKE WOOD，CO USA 80215)来完成血浆分离置换法(造血干细胞：生物学和治疗学应用。Levit DJ，Mertelsmann R(eds)，Marcel Dekker，Inc.，New York，1995，611-630)。
使用Lymphosepal密度梯度培养基(Immuno-BiologicalLaboratories Gunm，Japan)从所获得的粗制PBMCs和粗制G-PBSCs中制备出单核细胞组分(分别称为“PBMCs”和“G-PBSCs”)。
表1.患者特征
| 编号 | 年龄 | 性别 | 疾病 | 化疗 | G-CSF |
| 678910 | 938433227 | MFFMF | 尤因肉瘤乳腺癌卵巢癌NSGCT乳腺癌 | VCR/CPM/ADMADM/DTXTaxol/CDDPVP16/CDDPADM/DTX | 利诺司啶 100μl利诺司啶 100μl利诺司啶 250μl利诺司啶 100μl利诺司啶 100μl |
NSGCT：非-精原细胞瘤性生殖细胞肿瘤
Vα24+NKT细胞的体外活化和扩增
在100U/ml IL-2和100ng/mlα-糖基神经酰胺的存在条件下，用RPMI-1640培养基培养(1)中所得的PBMCs和G-PBSCs，该RPMI-1640中补加了2mM L-谷胺酰胺、1％丙酮酸、2％碳酸氢盐、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素(GIBCO BRL)。37℃条件下，在含有5％CO2的水-汽饱和空气中孵育这些细胞。分别在第0天(d0)和第12天(d12)检测这些培养细胞的数量和特性。所用的α-糖基神经酰胺是由KirinBeer Kabushiki Kaisha制备的，即(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-吡喃半乳糖基)-N-二十六醇基-2-氨基-1，3，4-十八烷醇；被称为“α-半乳糖基神经酰胺”。
按照如下方法，用FACScan血细胞计数器(Becton Dickinson，Sunyvale，CA)来进行培养细胞的流式细胞术。异硫氰酸荧光素(FITC)偶联的抗Vα24(C15)、藻红蛋白(PE)偶联的抗Vβ11(C21)、PE偶联的抗CD3、PE偶联的抗CD56、PE偶联的抗CD83和PE偶联的抗CD8来自Immunotech(Marseilelles Cedex，France)。FITC偶联的PE偶联的抗CD161、PE偶联的抗IL-2Rβ、PE偶联的抗HLA-DR和PE偶联的抗CD4来自Becton Dickinson。PE偶联的抗CD86来自Pharmingen(San Diego，CA)。PE偶联的抗CD57来自SIGMA(SaintLouis，Missouri)，并且用作为同种型对照。收集培养细胞并以1×105/ml的密度重悬于10％胎牛血清(FCS)-RPMI1620培养基中。用MRX-150高速冷冻微量离心机(TOMY SEIKO CO.，LTD.Tokyo，Japan)以2000rpm的转速离心3分钟，将这些细胞重悬于50μl含有1μl上述抗体的PBS中，4℃孵育30分钟。然后用PBS清洗细胞两次，再重悬于PBS中，并且在进行分析之前4℃贮存。显示为FSC、SSC、FL-1的数据是指Vα24或CD4，显示为FL-2的数据是指Vβ11、CD8、CD3。
Vα24+NKT细胞在第0天和第12天之间的变化显示在图1中。来自PBMCs的Vα24+NKT细胞反应于IL-2和α-糖基神经酰胺而扩增。来自由五位不同供体提供的一系列PBMCs的数据显示在表2中。尽管在第0天时Vα24+NKT细胞占总细胞数量的0.03-0.14％，但这一百分比在第12天增加了1.4-6.1倍。对于来自G-PBSCs的Vα24+NKT细胞，第12天的扩增显示出32-1414倍的增加量(图1，表3)。这一扩增比在PBMCs中观测到的扩增高出至少10倍(图2)。图3显示Vα24+NKT细胞在第12天的表型。这些细胞中，超过98％的细胞表达TCR Vβ11，73.33％的细胞表达CD4或CD8，而小于5％的Vα24+NKT细胞分别表达CD57、CD83、IL-2Rβ和HLA-DR(图3)。此外，尽管源于PBMCs的Vα24+NKT细胞的数量在第12天后逐渐减少，但是源于G-PBSCs的Vα24+NKT细胞直到培养的第30天仍继续扩增(图5)。表2.由α-GalCer引起的来自正常PBMCs的Vα24+NKT细胞的扩增
| 编号 | d0 NTK％(细胞数量) | D12 NKT％(细胞数量) | α-GalCer(+)/(-) | d12/d0 | |
| α-GalCer(+) | α-GalCer(-) | ||||
| 12345 | 0.12(6000)0.14(7000)0.06(3000)0.10(5000)0.03(1500) | 6.58(24346)0.19(9500)0.3(18300)0.66(20328)0.18(2376) | 0.03(1575)0.26(9152)0.06(4440)0.18(4554)0.11(1089) | 15.51.04.14.52.2 | 4.11.46.14.11.6 |
d0：第0天，d12：第12天
α-GalCer(+)：有α-GalCer，α-GalCer(-)：无α-GalCer表3.由α-GalCer引起的来自正常G-PBSCs的Vα24+NKT细胞的扩增
| 编号 | d0 NTK％(细胞数量) | D12 NKT％(细胞数量) | α-GalCer(+)/(-) | d12/d0 | |
| α-GalCer(+) | α-GalCer(-) | ||||
| 678910 | 0.04(2000)0.02(1000)0.03(1500)0.02(1000)0.10(5000) | 3.21(64200)22.6(1414375)2.05(51660)8.49(314130)4.73(520300) | 0.02(560)0.04(2100)0.01(252)0.05(1595)0.04(5120) | 114.6673.5205.0196.9101.6 | 32.11414.434.4314.1104.1 |
d0：第0天，d12：第12天
α-GalCer(+)：有α-GalCer，α-GalCer(-)：无α-GalCer
此外还确证了来自健康个体的G-PBSCs能以与来自癌症患者的G-PBSCs相同的程度进行扩增。
从上述结果可清晰的看出，通过使用G-PBSCs，经过短期培养就可以产生至少108个Vα24+NKT细胞。
实施例2评定Vα24+NKT细胞对人肿瘤细胞的细胞毒活性
用FACS Vantage细胞分类系统从第12天的培养细胞中纯化出人Vα24+NKT细胞，并且对这些细胞对肿瘤细胞的细胞毒活性和这些细胞的细胞因子产生活性，均加以评定。
利用以下靶细胞系对α-GalCer活化的Vα24+NKT细胞的细胞毒性进行了三次重复测定，这些靶细胞系为：Molt-4淋巴瘤细胞系和K562髓细胞性白血病细胞系(ATCC，Pockville，MD)。以每1×106个细胞用100μl Ci铬酸钠(NEN Life Science Products，Inc.，BostonMA02118)来标记靶细胞1小时。将纯化的α-GalCer活化的Vα24+NKT细胞或Vα24-NKT细胞作为效应细胞，并按指定的效应细胞(E)/靶细胞(T)比将这些细胞接种到圆底96孔板中的51Cr标记的每个靶细胞上。在5％CO2的条件下，37℃培养6小时后，用γ计数器对裂解的靶细胞所释放的放射性进行计数。由公式(样品的cpm-本底cpm)/(最大cpm-本底cpm)×100来计算特异裂解百分比。由仅有靶细胞的上清液来计算本底cpm，并通过往靶细胞中加入1M HCl来计算最大释放量。以三次计算的平均值加上标准差的形式来表示数据(图4)。
发现超过78％的培养细胞表达恒定的Vα24+/Vβ11+TCR。如图4所示，这些细胞对K562肿瘤细胞和Molt-4肿瘤细胞表现出强细胞毒活性。
用磁性细胞分类仪从单核细胞中分离出CD14+细胞。为了获得来源于单核细胞的DCs，在50ng/ml重组人(rh)GM-CSF、1000U/ml rhIL-4和500U/ml rhTNF-α(SIGMA，St Louis，MO)存在的条件下，用RPMI-1640培养基培养这些细胞，该RPMI-1640中补加了2mM L-谷胺酰胺、1％丙酮酸、2％碳酸氢盐、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素(GIBCO BRL，Gaithersburg)以及10％FCS(DainipponPharmaceutical Co.，Ltd.)。37℃条件下，在含有5％CO2的水-汽饱和空气中孵育这些细胞。挑选出的Vα24+NKT细胞与来自同一供体的源自单核细胞的DCs一起孵育24小时。用ELISA系统(DIACLONE，BESANCON，FRANCE)测定培养液上清中的IFN-γ和IL-4。
在自体的来自单核细胞的DCs存在条件下，进行48小时培养后，用ELISA测定Vα24+NKT细胞的细胞因子分泌。同时，还确定了Vα24+NKT细胞分泌IFN-γ，但Vα24+NKT细胞分泌IL-4却不能确定。
工业实用性
根据本发明，经过短期培养就可以产生大量的Vα24+NKT细胞。此外，还可以获得一种细胞组分，其中的Vα24+NKT细胞可进行扩增。通过使用全部组分，预期可得到一种能引起广泛免疫应答的细胞疗法，而用传统细胞疗法不能实现这个目的。
Claims (9)
1.一种用以扩增人Vα24+自然杀伤T细胞的方法，该方法包括在一种影响淋巴细胞增殖和/或活化的细胞因子以及α-糖基神经酰胺(α-GlyCer)存在的条件下，培养可以从人外周血中获得的单核细胞组分(G-PBSCs)，该外周血中的造血干细胞由粒细胞集落刺激因子所动员。
2.根据权利要求1的方法，其中影响淋巴细胞增殖和/或活化的细胞因子包括白介素2。
3.一种用以产生人Vα24+自然杀伤T细胞的方法，该方法包括在一种影响淋巴细胞增殖和/或活化的细胞因子以及α-糖基神经酰胺存在的条件下，培养可以从人外周血中获得的单核细胞组分(G-PBSCs)，该外周血中的造血干细胞由粒细胞集落刺激因子所动员，以及从培养细胞中分离人Vα24+自然杀伤T细胞。
4.根据权利要求3的方法，其中影响淋巴细胞增殖和/或活化的细胞因子包括白介素2。
5.一种用以产生一种包含人Vα24+自然杀伤T细胞的细胞组分的方法，该方法包括在一种影响淋巴细胞增殖和/或活化的细胞因子以及α-糖基神经酰胺存在的条件下，培养可以从人外周血中获得的单核细胞组分(G-PBSCs)，该外周血中的造血干细胞由粒细胞集落刺激因子所动员。
6.根据权利要求5的方法，该方法进一步包括在肿瘤抗原存在的条件下，培养那些通过在影响淋巴细胞增殖和/或活化的细胞因子和α-糖基神经酰胺存在的条件下培养而获得的细胞。
7.根据权利要求5或6的方法，其中影响淋巴细胞增殖和/或活化的细胞因子包括白介素2。
8.一种用于治疗癌症的试剂，该试剂含有作为一种活性成分的由权利要求3或4中定义的方法所获得的人Vα24+自然杀伤T细胞。
9.一种用于治疗癌症的试剂，该试剂含有作为一种活性成分的由权利要求5-7中任一项定义的方法所获得的含有人Vα24+自然杀伤T细胞的一种细胞组分。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000169430 | 2000-06-06 | ||
| JP169430/2000 | 2000-06-06 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1444648A true CN1444648A (zh) | 2003-09-24 |
Family
ID=18672294
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN01813425A Pending CN1444648A (zh) | 2000-06-06 | 2001-06-05 | 扩增自然杀伤t细胞的方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20040009594A1 (zh) |
| EP (1) | EP1288291A4 (zh) |
| KR (1) | KR20030032961A (zh) |
| CN (1) | CN1444648A (zh) |
| AU (1) | AU2001262697A1 (zh) |
| WO (1) | WO2001094553A1 (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008138214A1 (fr) * | 2007-05-09 | 2008-11-20 | Yu Wang | Procédé d'activation et d'expansion de lymphocytes à efficacité élevée et son système de culture |
| CN109642214A (zh) * | 2016-04-28 | 2019-04-16 | 国立研究开发法人理化学研究所 | 用于有效活化nkt细胞的技术 |
| CN109844100A (zh) * | 2016-09-01 | 2019-06-04 | 株式会社理研免疫再生医学 | 制备天然杀伤t(nkt)细胞刺激性树突细胞的方法及制备含有nkt细胞刺激性树突细胞和nkt细胞的细胞组合物的方法 |
| CN112424343A (zh) * | 2018-07-10 | 2021-02-26 | 南克维斯特公司 | 从脐带血产生cik nkt细胞 |
| CN117511868A (zh) * | 2023-12-06 | 2024-02-06 | 承德合润生物科技有限公司 | 一种实现iNKT细胞快速扩增的方法 |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE536185T1 (de) | 2001-03-26 | 2011-12-15 | Dana Farber Cancer Inst Inc | Verfahren zur abschwächung von reaktionen auf hautreizende mittel |
| ATE539757T1 (de) * | 2004-11-02 | 2012-01-15 | Univ Leland Stanford Junior | Verfahren zur hemmung von nkt-zellen |
| US20090068210A1 (en) * | 2007-07-09 | 2009-03-12 | Munshi Nikhil C | Immunotherapy for hematological malignancies |
| EP2058388A1 (en) * | 2007-10-05 | 2009-05-13 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Non-conventional NKT cells for use in cancer therapy |
| WO2009048071A1 (ja) * | 2007-10-09 | 2009-04-16 | Riken | イヌｎｋｔ細胞の検出方法および検出用核酸 |
| WO2010110734A1 (en) * | 2009-03-26 | 2010-09-30 | Avaris Ab | Expansion of nk cells |
| KR101715468B1 (ko) * | 2015-03-31 | 2017-03-13 | 서울대학교산학협력단 | 활성화 b 세포를 이용한 항원 특이적 세포 독성 t 세포 제조 방법 및 그 용도 |
| CN106434556B (zh) * | 2016-11-22 | 2019-10-11 | 上海新长安生物科技有限公司 | 一种体外诱导扩增i型nkt细胞的方法 |
| CN110283786A (zh) * | 2019-06-25 | 2019-09-27 | 中国医学科学院血液病医院（血液学研究所） | 一种高效体外扩增培养具有高杀伤力的自然杀伤性t细胞的方法 |
| CN112877365A (zh) * | 2021-01-19 | 2021-06-01 | 因诺伟(北京)生物医疗科技有限公司 | 一种外周血造血干细胞采集物来源的嵌合抗原受体t细胞的制备及应用 |
| CN114790445B (zh) * | 2022-06-22 | 2022-09-02 | 北京荟科柘生物科技有限公司 | 一种cd4-cd8-nkt细胞制备方法及其应用 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US583719A (en) * | 1897-06-01 | Johann carl wilhelm ferdinand tiemann | ||
| US5198334A (en) * | 1989-07-21 | 1993-03-30 | Terumo Corporation | Protection of natural killer cell cytolytic activity in peripheral blood mononuclear cells |
| DE69828603T2 (de) * | 1997-04-10 | 2005-12-29 | Kirin Beer K.K. | Verwendung von a-Glycosylceramiden zur Herstellung eines therapeutischen Mittels zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten |
| JP3619853B2 (ja) * | 1999-11-26 | 2005-02-16 | 独立行政法人理化学研究所 | ナチュラルキラー細胞の増殖方法 |
-
2001
- 2001-06-05 AU AU2001262697A patent/AU2001262697A1/en not_active Abandoned
- 2001-06-05 KR KR1020027016567A patent/KR20030032961A/ko active IP Right Grant
- 2001-06-05 EP EP01936857A patent/EP1288291A4/en not_active Withdrawn
- 2001-06-05 WO PCT/JP2001/004746 patent/WO2001094553A1/ja not_active Application Discontinuation
- 2001-06-05 CN CN01813425A patent/CN1444648A/zh active Pending
- 2001-06-05 US US10/297,407 patent/US20040009594A1/en not_active Abandoned
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008138214A1 (fr) * | 2007-05-09 | 2008-11-20 | Yu Wang | Procédé d'activation et d'expansion de lymphocytes à efficacité élevée et son système de culture |
| CN109642214A (zh) * | 2016-04-28 | 2019-04-16 | 国立研究开发法人理化学研究所 | 用于有效活化nkt细胞的技术 |
| US11744860B2 (en) | 2016-04-28 | 2023-09-05 | Riken | Technology for efficient activation of NKT cells |
| CN109844100A (zh) * | 2016-09-01 | 2019-06-04 | 株式会社理研免疫再生医学 | 制备天然杀伤t(nkt)细胞刺激性树突细胞的方法及制备含有nkt细胞刺激性树突细胞和nkt细胞的细胞组合物的方法 |
| CN112424343A (zh) * | 2018-07-10 | 2021-02-26 | 南克维斯特公司 | 从脐带血产生cik nkt细胞 |
| CN117511868A (zh) * | 2023-12-06 | 2024-02-06 | 承德合润生物科技有限公司 | 一种实现iNKT细胞快速扩增的方法 |
| CN117511868B (zh) * | 2023-12-06 | 2024-06-11 | 承德合润生物科技有限公司 | 一种实现iNKT细胞快速扩增的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20030032961A (ko) | 2003-04-26 |
| EP1288291A1 (en) | 2003-03-05 |
| WO2001094553A1 (fr) | 2001-12-13 |
| EP1288291A4 (en) | 2004-05-12 |
| US20040009594A1 (en) | 2004-01-15 |
| AU2001262697A1 (en) | 2001-12-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Morris et al. | NKT cell–dependent leukemia eradication following stem cell mobilization with potent G-CSF analogs | |
| US20180223257A1 (en) | Method for the induction and expansion of natural killer cells derived from peripheral blood mononuclear cells | |
| Morris et al. | Stem cell mobilization with G-CSF analogs: a rational approach to separate GVHD and GVL? | |
| US9925220B2 (en) | Method of expanding double negative T cells | |
| JP5577472B2 (ja) | 単球増殖剤、単球増殖用培地、単球の製造方法、樹状細胞の製造方法、及び樹状細胞ワクチンの製造方法 | |
| CN1444648A (zh) | 扩增自然杀伤t细胞的方法 | |
| CN1990044A (zh) | 人体免疫活性细胞dccik抗肿瘤细胞制剂的制备方法及应用 | |
| Blazar et al. | Flt3 ligand (FL) treatment of murine donors does not modify graft-versus-host disease (GVHD) but FL treatment of recipients post-bone marrow transplantation accelerates GVHD lethality | |
| Wang et al. | Cooperation of CD4+ T cells and CD8+ T cells and release of IFN-γ are critical for antileukemia responses of recipient mice treated by microtransplantation | |
| US9597356B2 (en) | Method for treating cancers with dendritic killer cells and pharmaceutical composition comprising the same | |
| TW202206591A (zh) | 體外增殖自然殺手細胞及自然殺手t細胞之方法 | |
| CN115896016B (zh) | 培养组合物及其在培养免疫细胞中的应用 | |
| US20140010793A1 (en) | Method for Treating Cancers with Dendritic Killer Cells and Pharmaceutical Composition | |
| EP0348290B1 (en) | Method of producing activated killer monocytes and method of monitoring their tumoricidal acivity | |
| CN110585427B (zh) | 提高机体免疫力的组合物及在抗成人t细胞白血病或鼻咽癌中的应用 | |
| KR102032384B1 (ko) | 제대혈 단핵세포에서의 자연살해세포의 제조 방법 | |
| KR20220036287A (ko) | 고순도 및 고효율의 자연살해세포 제조방법 및 이의 용도 | |
| KR102300846B1 (ko) | 면역 활성 개선용 조성물 및 이의 방법 | |
| KR102495647B1 (ko) | 건강한 사람의 면역세포 배양액을 이용한 nk 세포의 함량을 증진시키는 방법 | |
| EP1871872B1 (en) | Method for activating cd8 t cells | |
| JP2004248504A (ja) | Ｔｈ２型またはＴｈ１型にシフトしたナチュラルキラーＴ細胞の増幅方法 | |
| CN116135969A (zh) | 从外周血中扩增及产生细胞因子诱导的杀伤细胞群的方法 | |
| KUMMET | BENDAMUSTINE CONDITIONING REDUCES GVHD WHILE MAINTAINING GVL IN MURINE MHC-MISMATCHED HEMATOPOIETIC CELL TRANSPLANTATION | |
| CN115058393A (zh) | 一种包被刺激物、培养试剂盒和自然杀伤细胞的培养方法 | |
| Gatza et al. | Adjuvant IL-15 does not enhance the efficacy of tumor cell lysate-pulsed dendritic cell vaccines for active immunotherapy of T cell lymphoma |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |