CN114790445B - 一种cd4-cd8-nkt细胞制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种CD4‑CD8‑NKT细胞制备方法及其应用，本发明采用皮肤成纤维细胞、角质细胞替代胸腺上皮细胞建立胸腺类器官，驯化CD4‑CD8‑NKT细胞，使其只具有免疫调节活性，不具有抗肿瘤活性；阻滞了TNF‑α分泌，使CD4‑CD8‑NKT高分泌IFN‑γ，有效的抑制IL‑6、TNF‑α的合成；结果表明上述CD4‑CD8‑NKT细胞功能和分泌因子定向，稳定。

Description

一种CD4-CD8-NKT细胞制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及细胞培养领域，尤其涉及一种可有效抑制IL-6、TNF-α炎性因子合成的CD4-CD8-NKT细胞的制备方法和应用。
背景技术
NKT细胞(CDl d-dependent natural killer-like T cells)作为一类新型的免疫调节细胞，其主要特征为T细胞受体(Tea) 基因表达的恒定性、CDld的限制性以及细胞因子产生的迅速、高水平性。NKT细胞是一群高效的免疫调节细胞，具有保守的高度特异性，NKT细胞具有双向免疫调节特征，可以广泛的调节一系列免疫反应。
肝脏中CD4-CD8-NKT细胞主要表现为抗肿瘤活性，而胸腺中CD4-CD8-NKT细胞表现为免疫调节的活性，并且产生IFN-γ。而IFN-γ可抑制IL-6的合成。不同的微环境决定了NKT细胞不同的细胞功能。基于FoxN1同时表达于皮肤成纤维细胞、角质形成细胞和胸腺上皮细胞中。胸腺上皮细胞和皮肤成纤维细胞、角质形成细胞都能在角质细胞生长因子的作用下增殖，皮肤角质层的部分角蛋白也与髓质胸腺上皮细胞的赫氏小体相同。本发明采用皮肤成纤维细胞、角质形成细胞替代胸腺上皮细胞建立胸腺类器官，可以避克不同种属生物的免疫排斥。
IL-6 可诱导B淋巴细胞分化和产生抗体，介导类风湿性关节炎（RA）患者产生自身抗体和类风湿因子。在关节囊局部，IL-6 活化内皮细胞使之释放 IL-8 和单核细胞趋化因子，并高表达黏附分子，加强白细胞向炎性部位聚集。IL-6 还可刺激滑膜细胞增殖，加强破骨细胞活性，最终导致关节血管翳形成。IL-6 与 IL-1 共同作用使基质金属蛋白酶产量增加，导致关节软骨的破坏。这是 IL-6 在类风湿性关节炎（RA）发病中的重要机制。而TNF-α介导作用在类风湿性关节炎（RA）疾病发生发展中起重要的免疫调节，血清中异常升高TNF-α可能起主导作用。
研究表明类风湿性关节炎(RA)患者体内的NKT细胞数量比健康人明显减少，而类风湿性关节炎(RA)患者IL-6、TNF-α血清水平明显高于健康人。提高NKT细胞数量并阻断IL-6 、TNF-α合成可减轻类风湿性关节炎(RA)症状。
由于NKT细胞亚群种类多，不同CD1d-NKT细胞激活剂的选择，微环境的影响因素及APC的效率差异都会影响NKT对免疫的调控。不同优化条件，NKT免疫调控不同，分泌细胞因子类型不同，适应的疾病也不相同。目前NKT体外培养不具有精准调控免疫反应，涵盖多型NKT，既有抗肿瘤效应也具有免疫调节活性，同时分泌Th1、Th2、Th1/Th2型多种因子，易造成免疫紊乱。
发明内容
本发明克服现有技术不足，提供了一种可有效抑制IL-6、TNF-α炎性因子合成的CD4-CD8-NKT细胞的制备方法和应用。
本发明的第一个方面是提供一种可有效抑制IL-6、TNF-α炎性因子合成的CD4-CD8-NKT细胞的制备方法，其中所述的方法包括如下步骤：
1）、胸腺类器官构建
1.1培养皮肤来源成纤维细胞；
1.2培养皮肤来源的角质细胞；
1.3 3D培养：将步骤1.1获得的成纤维细胞与步骤1.2获得的角质细胞结合到细胞外基质（ECM）的支架上，旋转生物反应器中培养五天，直到细胞在基质上达到汇合，离心收集3D细胞；此步骤离心收集到的3D细胞在结构和功能上都类似胸腺器官，可模拟胸腺环境工作，此步骤收集的3D细胞称为胸腺类器官。
2）、CD4-CD8-NKT细胞分选：外周血获得PBMC后利用流式细胞仪分选获得CD4-CD8-NKT细胞；
3）、阻滞TNF-α分泌：向步骤2获得的CD4-CD8-NKT细胞添加Lenalidomide(CC-5013)；
4）、胸腺微环境驯化CD4-CD8-NKT细胞：将步骤1.3得到的胸腺类器官与步骤3）得到的CD4-CD8-NKT细胞用无血清免疫细胞培养液重悬培养；
5）扩增培养并收集CD4-CD8-NKT细胞。
在一个具体的实施例中，所述的方法获得的CD4-CD8-NKT细胞高分泌IFN-γ，阻滞TNF-α分泌以及抑制IL-6的合成。
在一个具体的实施例中，所述的方法中，步骤3）中添加Lenalidomide(CC-5013)终浓度为1μM~10μM，优选1μM。
在另外一个具体的实施例中，步骤4）的悬浮培养过程之前，还包括利用CD122抗体包被培养瓶的步骤；优选的，所述的包被为用D-PBS溶液将CD122抗体加入培养瓶内，CD122浓度20~100ng/ml，优选50ng/ml，37℃避光包被12小时。
在另外一个具体的实施例中，步骤4）的悬浮培养过程还包括在培养瓶中加入5%自体血清、100IU/ml ~1000IU/ml ，优选500IU/ml 的IL-27和100IU/ml ~1000IU/ml ，优选500IU/ml 的 IL-12，置于二氧化碳培养箱（37℃、5.0% CO2、饱和湿度）中培养。
在另外一个具体的实施例中，步骤5）的细胞扩增培养过程中，视细胞生长情况补加含有100IU/ml ~1000IU/ml ，优选500IU/ml 的IL-27和100IU/ml ~1000IU/ml ，优选500IU/ml 的 IL-12的免疫细胞培养液。
在另外一个具体的实施例中，所述的步骤5）中细胞的培养时间为10-15天，优选为14天。
本发明的第二个方面是提供由本发明的第一个方面所述的方法制备获得的CD4-CD8-NKT细胞。
本发明的第三个方面提供本发明的第一个方面制备获得的或第二个方面提供的CD4-CD8-NKT细胞在制备调节免疫功能的产品中的应用。
在一个具体的实施例中，所述的调节免疫功能是指治疗由于免疫功能紊乱引起的关节疾病，优选类风湿性关节炎。
本发明的有益效果为：本发明公开了一种可有效抑制IL-6、TNF-α炎性因子合成的CD4-CD8-NKT细胞的制备方法和应用。采用皮肤成纤维细胞、角质细胞替代胸腺上皮细胞建立胸腺类器官，驯化CD4-CD8-NKT细胞，使其具有免疫调节活性，不具有抗肿瘤活性。阻滞了TNF-α分泌，使CD4-CD8-NKT高分泌IFN-γ，有效的抑制IL-6的合成。结果表明上述CD4-CD8-NKT细胞功能和分泌因子定向，稳定。
附图说明
图1 实施例CD4-CD8-NKT细胞流式检测结果；
图2 对照例1CD4-CD8-NKT细胞流式检测结果；
图3 对照例2CD4-CD8-NKT细胞流式检测结果；
图4 对照例3CD4-CD8-NKT细胞流式检测结果；
图5本发明的方法与3组对照例方法获得的细胞分泌细胞因子的量对比；
图6本发明的方法获得的细胞杀伤肿瘤细胞的效率；
图7对照例1方法获得的细胞杀伤肿瘤细胞的效率；
图8 对照例2方法获得的细胞杀伤肿瘤细胞的效率；
图9对照例3方法获得的细胞杀伤肿瘤细胞的效率；
图10本发明的方法与3组对照例方法获得的细胞抑制IL-6 、TNF-α合成量对比；
图11各组大鼠足爪肿胀评分及关节炎指数评分比较。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例，对本发明的具体实施方式和技术方案作进一步的详述，需明确：本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
实施例 1 一种可有效抑制IL-6、TNF-α炎性因子合成的CD4-CD8-NKT细胞
1、胸腺类器官构建
1.1成纤维细胞培养
1.1.1获取新鲜的皮肤，盐水反复冲洗。
1.1.2把组织块置于培养皿内，眼科剪反复剪切组织块成0.5－1mm3大小。用弯头吸管吸取组织块接种于9cm的TC处理的培养皿中，组织块间留约0.3－0.5cm的间距。
1.1.3加入2ml成纤维细胞培养液，置于二氧化碳培养箱（37℃、5.0% CO2、饱和湿度）中培养。
1.1.4待成纤维细胞爬出后，收集成纤维细胞，液氮保存、备用。
1.2角质细胞培养
1.2.1获取新鲜的皮肤，盐水反复冲洗。
1.2.2将皮肤组织转入培养皿中，用眼科剪和眼科镊修剪，尽量去除皮下组织，用锋利11号手术刀片将组织分切为2mm×10mm。
1.2.3将剪切好的组织放入15ml离心管中，加入4ml皮肤分离液，37℃，2.5h消化。
1.2.4将消化后的皮肤倒入培养皿中，用眼科镊将表皮和真皮仔细分离，避免把真皮组织带入表皮组织中。
1.2.5将分离的表皮放入离心管中，加入4ml表皮细胞分离液，37℃，消化10min；用含血清的培养液终止消化，用吸管反复吹打以获得单细胞悬液，过200目筛网以去除剩余残渣，收集滤液，离心去除消化液，用PBS清洗1次，用角质细胞培养液重悬接种。置于二氧化碳培养箱（37℃、5.0% CO2、饱和湿度）中培养。
1.2.6收集角质细胞。
1.3 3D培养
将1.1.4获得的成纤维细胞复苏与1.2.6获得的角质细胞结合到细胞外基质（ECM）的支架上，旋转生物反应器中培养五天，直到细胞在基质上达到汇合，离心收集细胞。
2、CD4-CD8-NKT细胞分选
2.1将新鲜的肝素抗凝的人外周血倒入离心管内，配平，700g/min 离心 20 min（降速最慢）。
2.2上述外周血离心后的细胞层加入1：1的D-PBS混匀，按与淋巴细胞分离液1：1的比例沿管壁缓慢加淋巴细胞分离液面上，并保持清楚的界面，以800g离心15min（缓升缓降）后，离心管中由上至下分为四层。
其中，第一层为D-PBS层，第二层为环状乳白色PBMC，第三层为透明分离液层，第四层为红细胞层。
2.3收集离心管中的第二层环状乳白色PBMC加入到一个50ml离心管中，补加生理盐水至50ml，600g离心10min，弃上清液，再用50ml生理盐水重悬细胞，500g离心10min，弃上清液，收集下层细胞。
2.4流式细胞仪分选，获得CD4-CD8-NKT细胞。
3、阻滞TNF-α分泌
向2.4获得的细胞中加入终浓度为1 μM的Lenalidomide(CC-5013)。
4、胸腺微环境驯化CD4-CD8-NKT细胞
4.1用D-PBS溶液将50ng/ml的CD122抗体加入培养瓶内，37℃避光包被12小时。
4.2取出预处理的培养瓶，弃去瓶中包被液，将步骤1.3得到的胸腺类器官与步骤3得到的CD4-CD8-NKT细胞用无血清免疫细胞培养液重悬，转移至培养瓶中，加入5%自体血清、500IU/ml IL-27和500IU/ml IL-12，置于二氧化碳培养箱（37℃、5.0% CO2、饱和湿度）中培养。
5、CD4-CD8-NKT细胞扩增
视细胞生长情况补加含有500IU/ml IL-27和500IU/ml IL-12的免疫细胞培养液。
6、CD4-CD8-NKT细胞收集
培养14天后，收集细胞。
对照例 1未胸腺类器官驯化的CD4-CD8-NKT
1、CD4-CD8-NKT细胞分选
1.1用D-PBS溶液将50ng/ml的CD122抗体加入培养瓶内，37℃避光包被12小时。
1.2将新鲜的肝素抗凝的人外周血倒入离心管内，配平，700g/min 离心 20 min（降速最慢）。
1.3上述外周血离心后的细胞层加入1：1的D-PBS混匀，按与淋巴细胞分离液1：1的比例沿管壁缓慢加淋巴细胞分离液面上，并保持清楚的界面，以800g离心15min（缓升缓降）后，离心管中由上至下分为四层。
其中，第一层为D-PBS层，第二层为环状乳白色PBMC，第三层为透明分离液层，第四层为红细胞层。
1.4收集离心管中的第二层环状乳白色PBMC加入到一个50ml离心管中，补加生理盐水至50ml，600g离心10min，弃上清液，再用50ml生理盐水重悬细胞，500g离心10min，弃上清液，收集下层细胞。
1.5流式细胞仪分选，获得CD4-CD8-NKT细胞。
2、阻滞TNF-α分泌
2.1向1.5获得的细胞中加入终浓度为1 μM的Lenalidomide(CC-5013)。
2.2取出预处理的培养瓶，弃去瓶中包被液，将步骤2.1得到的CD4-CD8-NKT细胞用无血清免疫细胞培养液重悬，转移至培养瓶中，加入5%自体血清、500IU/ml IL-27和500IU/ml IL-12，置于二氧化碳培养箱（37℃、5.0% CO2、饱和湿度）中培养。
3、CD4-CD8-NKT细胞扩增
视细胞生长情况补加含有500IU/ml IL-27和500IU/ml IL-12的免疫细胞培养液。
4、CD4-CD8-NKT细胞收集
培养14天后，收集细胞。
对照例2未阻滞TNF-α分泌的CD4-CD8-NKT
1、胸腺类器官构建
1.1成纤维细胞培养
1.1.1切取新鲜的皮肤，盐水反复冲洗。
1.1.2把组织块置于培养皿内，眼科剪反复剪切组织块成0.5－1mm3大小。用弯头吸管吸取组织块接种于9cm的TC处理的培养皿中，组织块间留约0.3－0.5cm的间距。
1.1.3加入2ml成纤维细胞培养液，置于二氧化碳培养箱（37℃、5.0% CO2、饱和湿度）中培养。
1.1.4待成纤维细胞爬出后，收集成纤维细胞，液氮保存、备用。
1.2角质细胞培养
1.2.1切取新鲜的皮肤，盐水反复冲洗。
1.2.2将皮肤组织转入培养皿中，用眼科剪和眼科镊修剪，尽量去除皮下组织，用锋利11号手术刀片将组织分切为2mm×10mm。
1.2.3将剪切好的组织放入15ml离心管中，加入4ml皮肤分离液，37℃，2.5h消化。
1.2.4将消化后的皮肤倒入培养皿中，用眼科镊将表皮和真皮仔细分离，避免把真皮组织带入表皮组织中。
1.2.5将分离的表皮放入离心管中，加入4ml表皮细胞分离液，37℃，消化10min；用含血清的培养液终止消化，用吸管反复吹打以获得单细胞悬液，过200目筛网以去除剩余残渣，收集滤液，离心去除消化液，用PBS清洗1次，用角质细胞培养液重悬接种。置于二氧化碳培养箱（37℃、5.0% CO2、饱和湿度）中培养。
1.2.6收集角质细胞。
1.3 3D培养
将1.1.4获得的成纤维细胞复苏与1.2.6获得的角质细胞结合到细胞外基质（ECM）的支架上，旋转生物反应器中培养五天，直到细胞在基质上达到汇合，离心收集细胞。
2、CD4-CD8-NKT细胞分选
2.1将新鲜的肝素抗凝的人外周血倒入离心管内，配平，700g/min 离心 20 min（降速最慢）。
2.2上述外周血离心后的细胞层加入1：1的D-PBS混匀，按与淋巴细胞分离液1：1的比例沿管壁缓慢加淋巴细胞分离液面上，并保持清楚的界面，以800g离心15min（缓升缓降）后，离心管中由上至下分为四层。
其中，第一层为D-PBS层，第二层为环状乳白色PBMC，第三层为透明分离液层，第四层为红细胞层。
2.3收集离心管中的第二层环状乳白色PBMC加入到一个50ml离心管中，补加生理盐水至50ml，600g离心10min，弃上清液，再用50ml生理盐水重悬细胞，500g离心10min，弃上清液，收集下层细胞。
2.4流式细胞仪分选，获得CD4-CD8-NKT细胞。
3、胸腺微环境驯化CD4-CD8-NKT细胞
3.1用D-PBS溶液将50ng/ml的CD122抗体加入培养瓶内，37℃避光包被12小时。
3.2取出预处理的培养瓶，弃去瓶中包被液，将步骤1.3得到的胸腺类器官与步骤2.4得到的CD4-CD8-NKT细胞用无血清免疫细胞培养液重悬，转移至培养瓶中，加入5%自体血清、500IU/ml IL-27和500IU/ml IL-12，置于二氧化碳培养箱（37℃、5.0% CO2、饱和湿度）中培养。
3、CD4-CD8-NKT细胞扩增
视细胞生长情况补加含有500IU/ml IL-27和500IU/ml IL-12的免疫细胞培养液。
4、CD4-CD8-NKT细胞收集
培养14天后，收集细胞。
对照例3传统培养方法
1、抗体包被
用D-PBS稀释0 .5μg/mLCD3和50μg/mLCS1单抗，并用稀释好的单抗包被T75培养瓶，置于4℃孵育过夜。
2、PBMC分离
2.1将新鲜的肝素抗凝的人外周血倒入离心管内，配平，700g/min 离心 20 min（降速最慢）。
2.2上述外周血离心后的细胞层加入1：1的D-PBS混匀，按与淋巴细胞分离液1：1的比例沿管壁缓慢加淋巴细胞分离液面上，并保持清楚的界面，以800g离心15min（缓升缓降）后，离心管中由上至下分为四层。
其中，第一层为D-PBS层，第二层为环状乳白色PBMC，第三层为透明分离液层，第四层为红细胞层。
2.3收集离心管中的第二层环状乳白色PBMC加入到一个50ml离心管中，补加生理盐水至50ml，600g离心10min，弃上清液，再用50ml生理盐水重悬细胞，500g离心10min，弃上清液，收集下层细胞。
3、NKT细胞培养
将分离后的细胞用无血清培养基重悬，转移至包被并用PBS清洗过的培养瓶中。并加入500IU/mLIL-2、100ng/mLα- GalCer、20ng/mLGLP-1和5%的自体血清。
4、NKT细胞的扩增培养
视细胞生长情况，补加无血清培养基，并加入500IU/mLIL-2、100ng/mLα- GalCer、20ng/mLGLP-1。
5、NKT细胞收集
培养第14天后，收集的NKT细胞。
实验例1 流式检测CD4-CD8-NKT比例
利用流式细胞仪检测实施例和3组对照例获得的CD4-CD8-NKT比例，实施例CD4-CD8-NKT 比例98.34%，对照组1 CD4-CD8-NKT 比例83.76%，对照组2 CD4-CD8-NKT 比例90.59%，对照组3 CD4-CD8-NKT 比例13.76%。结果可以看出实施例获得的CD4-CD8-NKT 细胞表达量均高于3组对照例。结果如图1-4所示。
实验例2 检测分泌细胞因子的情况
使用ELISA检测实施例与3组对照例所获得细胞上清中分泌产生的细胞因子情况。结果如图5所示。由图5中可以看出，实施例所获得CD4-CD8-NKT分泌细胞因子量IFN-γ高于对照3组，实施例未分泌TNF-α、IL-4、IL-10、IL-6炎性因子，对照3组均有炎性因子分泌。
实验例3 检测抗肿瘤细胞活性
1）计数肺癌细胞，并加入CFSE，使CFSE终浓度达到2uM,37度30分钟；
2）拿出后，1000rpm,5min,可隐约看到细胞染成黄色，PBS洗三次；
3）分别与实施例和4组对照例所获得的细胞混培，作用4-6小时；
4）将细胞混合液消化取出，洗二次，PI工作液5ul，避光30分钟后上流式检测；
5）CFSE，PI双阳性的细胞为被杀伤的肺癌细胞，除以肺癌细胞总数，即为杀伤率。
结果，实施例制备的 T细胞与肺癌细胞效靶比1：1时，T细胞杀伤率为0%；对照例1制备的 T细胞与肺癌细胞效靶比1：1时，T细胞杀伤率为37.84%；对照例2制备的 T细胞与肺癌细胞效靶比1：1时，T细胞杀伤率为49.58%；对照例3制备的 T细胞与肺癌细胞效靶比1：1时，T细胞杀伤率为61.73%；实施例不具有抗肿瘤活性，对照3组均有抗肿瘤活性。结果如图6-9所示。
实验例4检测抑制IL-6、TNF-α合成能力
1）造模及分组大鼠50只，雌雄各半，分为五组，即空白组、实施例、对照组1、对照组2、对照组3，每组10只，除空白组10只注射0.1mL生理盐水外，其余右后足跖注射完全弗氏佐剂0.1mL致炎，注射前用75%乙醇轻拭注射部位，造模一周天后检测RF阳性，证明造模成功，随机分为实施例、对照组1、对照组2、对照组3各10只。
2）干预方法空白组不予特殊处理；实施例与对照组1、对照组2、对照组3进行输注每组获得的CD4-CD8-NKT细胞。
3）血液采集2周后各组采血3mL，离心抽取血清，-20°C冰箱保存。
4）ELISA实验使用ELISA方法进行各组 TNF-α、IL-6 的测定，结果见图10。
5）各组肿胀及关节炎情况比较，结果见图11。
结果，实施例的TNF-α、IL-6 水平和空白组相同，对照3组 TNF-α、IL-6 水平均高于空白组，实施例有效抑制了 TNF-α、IL-6 的合成。实施例右后足爪肿胀评分及关节炎指数评分低于对照3组，实施例大鼠类风湿性关节炎症状得到很好的缓解，而对照3组症状均加重。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但是并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可做各种改动和修饰，以本领域技术人员结合所属领域的常规技术概括获得的均在本发明的范围之内。

Claims (10)

1.一种CD4-CD8-NKT细胞的制备方法，其中所述的方法包括如下步骤：
1）、胸腺类器官构建
1.1培养皮肤来源成纤维细胞；
1.2培养皮肤来源的角质细胞；
1.3 3D培养：将步骤1.1获得的成纤维细胞与步骤1.2获得的角质细胞结合到细胞外基质ECM的支架上，旋转生物反应器中培养五天，直到细胞在基质上达到汇合，离心收集3D细胞；此步骤离心收集到的3D细胞在结构和功能上都类似胸腺器官，可模拟胸腺环境工作，此步骤收集的3D细胞称为胸腺类器官；
2）、CD4-CD8-NKT细胞分选：外周血获得PBMC后利用流式细胞仪分选获得CD4-CD8-NKT细胞；
3）、阻滞TNF-α分泌：向步骤2）获得的CD4-CD8-NKT细胞添加Lenalidomide；
4）、胸腺微环境驯化CD4-CD8-NKT细胞：将步骤1.3得到的胸腺类器官与步骤3）得到的CD4-CD8-NKT细胞用无血清免疫细胞培养液重悬，培养；
5）扩增培养并收集CD4-CD8-NKT细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，所述的方法获得的CD4-CD8-NKT细胞高分泌IFN-γ，阻滞TNF-α分泌以及抑制IL-6的合成。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤3）中添加Lenalidomide终浓度为1μM~10μM。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤4）的重悬过程之前，还包括利用CD122抗体包被培养瓶的步骤。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述的包被具体为用D-PBS溶液将CD122抗体加入培养瓶内，CD122浓度20~100ng/ml，37℃避光包被12小时。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤4）的培养过程还包括在培养瓶中加入5%自体血清、100IU/ml ~1000IU/ml 的IL-27和100IU/ml ~1000IU/ml 的 IL-12，置于二氧化碳培养箱中共培养。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤5）的扩增培养过程中，视细胞生长情况补加含有100IU/ml ~1000IU/ml 的IL-27和100IU/ml ~1000IU/ml的 IL-12的免疫细胞培养液。
8.一种CD4-CD8-NKT细胞，其特征在于由权利要求1-7任一项所述的方法制备获得。
9.权利要求8所述的细胞在制备调节免疫功能的产品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的调节免疫功能是指治疗由于免疫功能紊乱引起的关节疾病。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001094553A1 (fr) * 2000-06-06 2001-12-13 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Methode d'amplification de lymphocytes t tueurs naturels
CN1489471A (zh) * 2000-12-25 2004-04-14 �Ƹ��� 训导的nkt细胞及其在免疫相关病症的治疗中的用途
CN101389349A (zh) * 2003-09-30 2009-03-18 恩佐治疗学股份有限公司 驯化的nkt细胞及其在治疗免疫相关病症中的应用
WO2019241400A1 (en) * 2018-06-12 2019-12-19 The Regents Of The University Of California Stem cell-engineered inkt cell-based off -the-shelf cellular therapy
CN113699107A (zh) * 2021-10-27 2021-11-26 东莞再立健生物科技有限公司 一种外周血nkt细胞培养液及培养方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001094553A1 (fr) * 2000-06-06 2001-12-13 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Methode d'amplification de lymphocytes t tueurs naturels
CN1489471A (zh) * 2000-12-25 2004-04-14 �Ƹ��� 训导的nkt细胞及其在免疫相关病症的治疗中的用途
CN101389349A (zh) * 2003-09-30 2009-03-18 恩佐治疗学股份有限公司 驯化的nkt细胞及其在治疗免疫相关病症中的应用
WO2019241400A1 (en) * 2018-06-12 2019-12-19 The Regents Of The University Of California Stem cell-engineered inkt cell-based off -the-shelf cellular therapy
CN112512536A (zh) * 2018-06-12 2021-03-16 加利福尼亚大学董事会 基于干细胞工程化inkt细胞的现成细胞疗法
CN113699107A (zh) * 2021-10-27 2021-11-26 东莞再立健生物科技有限公司 一种外周血nkt细胞培养液及培养方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
In vitro differentiation of natural killer T cells from human cord blood CD34+ cells;So-Youn Woo等;《British Journal of Haematology》;20030401;第121卷(第1期);第148-156页 *
不同细胞因子培养体系对CIK、NK及NKT细胞等诱导产率的影响;黎阳等;《中山大学学报(医学科学版)》;20030720;第24卷(第4期);第363-367页 *
利用胸腺类器官体外诱导小鼠T淋巴细胞分化;宫茂源等;《细胞与分子免疫学杂志》;20210818;第37卷(第08期);第679-686页 *

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