CN1489471A - 训导的nkt细胞及其在免疫相关病症的治疗中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在需要这种治疗的哺乳动物被试者中对免疫相关病症治疗的方法。该方法包含用适当的方法处理该被试者中NK T细胞群体的步骤，对NK T细胞群体的该处理导致调节Th1/Th2平衡偏向抗炎症细胞因子生产细胞。对NK T细胞群体的处理可通过用适当的方法使该细胞缺失或者通过对NK T细胞的来自体内的训导(education)而进行，从而训导的NK T细胞具有调节Th1/Th2平衡偏向抗炎症细胞因子生产细胞的能力。本发明进一步涉及在哺乳动物被试者中治疗免疫相关病症的药物组合物。这些组合物包含作为有效成分的来自体内的训导的NK T细胞。本发明进一步提供了来自体内的训导的NK T细胞及其在免疫相关病症的治疗中的用途。

Description

训导的NK T细胞及其在免疫相关病症 的治疗中的用途
发明领域
本发明涉及治疗方法的领域、组合物及其在哺乳动物被试者中对免疫相关病症的治疗中的用途。更具体而言地，本发明的方法和组合物涉及对被试者中NK T细胞群体的处理，该处理导致调节Th1/Th2细胞平衡偏向抗炎症细胞因子生产细胞，并且涉及它们在肠和免疫相关病症以及恶性肿瘤的治疗中的用途。
为了更充分地描述本申请所属的技术领域的情况，在本申请中引用或鉴定的所有专利、专利申请、专利出版物、科学论文等都特此整体引用作为参考。
发明背景
免疫系统负责对抗潜在有害介质的防御的主要部分。然而，该系统可变成与自身抗原敌对的，且导致自身免疫病症如肠炎。这些病症可理解为促炎(Th1)和抗炎(Th2)细胞因子的平衡紊乱。
对免疫反应的克服趋向于涉及普遍的免疫抑制，该免疫抑制经常导致不合需要的副作用。因而，需要有可选择的策略以诱导抗原特异性免疫抑制。免疫耐受性可通过两类机制来诱导。称为“隐性”的第一类涉及大多数免疫细胞的克隆的无细胞免疫反应性或缺失，其中这些免疫细胞能够对抗原起反应[Matzinger，P.等人，Ann.Rev.Immunol.12：991-1045(1994)；Qin，S.等人，Science 259：974-977(1993)]。可选择地，在“显性”类型的耐受性中，负的免疫调节淋巴细胞可作为耐受性程序的结果而形成。与克隆缺失或无细胞免疫反应性相反，有限数目的这些淋巴细胞的存在可减量调节更大数目的效应细胞。
免疫系统在肠炎发病机理中的作用
肠炎(IBD)是常见的胃肠病症，该病症可理解为免疫反应的Th1-促炎和Th2-抗炎亚型之间的平衡紊乱的结果[Strober，W.等人，ImmunolToday 18：61-64(1997)；Neurath，M.等人，J.Exp.Med.183：2605-2616(1996)]。
伴随IBD有几个肠外的表现形式，例如：自身免疫现象；免疫复合物在目标器官损害中起作用；和免疫抑制剂如糖皮质激素、硫唑嘌呤、氨甲蝶呤和环孢菌素[Podolsky，D.K.等人，New Engl.J.Med.，325：928-935(1991)；Strober，W.等人，In Clinical Immunology，Mosby，St.Louis.R.R.Rich，Editor，1401-14281-2(1995)]。IBD患者具有对抗结肠细胞和几种不同细菌抗原的抗体。这些抗原由于上皮损害的结果而可以接近免疫系统[Hibi，S.等人，Clin.Exp.Immunol.54：163-168(1983)；Das，K.M.等人，Gastroenterology 98：464-69(1990)]。T细胞介导的免疫的异常，包括对T细胞刺激物的同时无细胞免疫反应性和减少的反应性，也描述于这些患者中[Chiba，M.等人，Gut，22：177-182(1981)；Raedler，A.等人，Clin.Exp.Immunol.60：518-526(1985)]。此外，鉴定了粘膜细胞介导的免疫的变化，该变化包括粘膜IgG细胞增加的浓度和T细胞亚群中的改变，提示抗原的刺激[Dasgupta，A.等人，Gut 35：1712-17(1994)；Takahashi，F.等人，J.Clin.Invest.76：311-318(1985)]。感染、免疫或毒性损害后目标抗原的暴露导致粘膜免疫细胞的活化，该活化产生引起粘膜炎症反应的细胞因子[Neurath，M，等人，J.Exp.Med.，183：2605-2616(1996)]。促炎细胞因子如IFNγ的分泌使得粘膜透性增加并已描述于IBD动物模型中[Strober，W.等人，Immunol.Today 18：61-64(1997)]。相似地，在这些动物中可探测到由IL1和IL6介导的胶原蛋白合成的增加[Strober，W.等人，如上]。已经通过将正常的CD45RB T细胞从Balb/C小鼠过继转移到CB-17 scid小鼠中而建立了Th1-介导的肉芽肿性结肠炎模型。显示来自CD45RB的CD4细胞当与CD45RB群体一起注射时可预防疾病。该预防可通过添加针对TGFβ1的抗体而逆转[Sadlack，B.等人，Cell 75：253-261(1993)；Powrie，F.等人，Immunity 1：553-562(1994)]。
肠炎中的Thl/Th2平衡紊乱
CD4和CD8淋巴细胞两者均可归类为生产IL-2和IFNγ的Th1细胞，或者生产IL-4和IL-10的Th2细胞。免疫系统对外源和自身抗原反应的方式是两个反应亚型之间平衡的结果[Weiner，H.L.等人，Immunol.Today 18：335-343(1997)；Adorini，L.等人，Immunol.Today 18：209-211(1997)；Rabbani等人，欧洲专利出版物No.EP1149586A1(在2001年4月27日申请)，此处引用作为参考]。Th1类型的反应涉及几种自身免疫和慢性炎症病症如IBD的发病机理[Adorini，L.等人，(1997)如上；Mizoguchi，A.等人，J.Exp.Med.183：847-856(1996)]。因而人中实验性结肠炎和IBD可理解为促炎Th1-型和抗炎Th2-型细胞因子之间的平衡紊乱。最近在动物和人两者中已显示抗炎细胞因子如IL10可减量调节Th1-介导的细胞因子的促炎作用，因此减轻免疫介导的病症[Mizoguchi，A.等人，(1996)如上；Madsen，K.L.等人，Gastroenterology 113：151-159(1997)；Van Deventer Sander，J.等人，Gastroenterology 113：383-389(1997)]。
改善免疫介导的病症的口服耐受性诱导
口服耐受性是公认的诱导抗原特异性外周免疫反应性减低的程序[Weiner，H.L.等人，(1997)如上；Weiner，H.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：10762-10765(1994)；Roy-Chowdury等人，InternationalPublication No.WO 98/37917(在1998年2月26日申请)，此处引用作为参考]。在动物和人两者中已显示口服抗原以预防或减轻几种自身免疫病症如胶原蛋白诱导的关节炎、色素膜炎、糖尿病和实验性变应性脑脊髓炎[Esbjorn，T.等人，Int.Arch.Allergy Immunol.113：219-223(1997)；Von Herrath，M.G.等人，J.Clin.Inves.98：1324-1331(1996)；Hancock，W.等人，Am.J.Path.147：1193-1197(1993)；Weiner，H.L.等人，Science 261：1321-1324(1993)]。
对 高剂量抗原的肠暴露通过抗原特异性T细胞的克隆失活而诱导耐受性，而 低剂量抗原的供给诱导调节细胞分泌因子，该因子抑制抗原特异性效应细胞的生成[Weiner，H.L.等人，(1997)如上]。在动物和人两者中，耐受性诱导是与Th2/Th3类型免疫反应相关的，该免疫反应导致免疫抑制细胞因子如IL10、IL4和TGFβ1的分泌[Weiner，H.L.等人，(1997)如上]。涉及对多重密切相关抗原的反应性的旁观者效应(bystander effect)显示在几个模型中对口服耐受性诱导起作用[Weiner，H.L.等人，(1997)如上；Carvalho，B.A.等人，Scand J.Immunol.45：276-281(1997)]。当调节细胞在由供给的抗原触发后分泌非抗原特异性的细胞因子，它们可在该供给的抗原所处的微环境中抑制炎症。尽管该程序很好地确立为免疫耐受性诱导的方法，但精确的机制尚未发现。已发表了有冲突的结果，如抗原是否必须加工和/或吸收，以及蛋白质变性是否是耐受性诱导所必需的[Carvalho，B.A.等人，(1997)如上；Blanas，E.等人，Science 274：1707-1709(1996)]。
抗原呈递需要将整个蛋白质呈递到肠中，然而蛋白质加工和吸收也包含于耐受性诱导或其通过肠后(post-gut)机制的维持中[Carvalho，B.A.等人，(1997)如上]。已经认为肠壁上皮细胞、派伊尔斑、肠系膜淋巴结或肠外细胞可介导免疫耐受性诱导[Strober，W.等人，(1997)如上]。然而，口服抗原也可引起抗原决定部位特异性免疫[Carvalho，B.A.等人，(1997)如上；Blanas，E.等人，(1996)如上]。实际上，在肠壁中，主要在派伊尔斑中可发现与在口服耐受性化后出现的免疫抑制细胞因子分泌细胞(如分泌TGFβ的Th3细胞)一起的第二细胞群，该细胞群分泌促炎细胞因子(如IFNγ)[Weiner，H.L.等人，(1997)如上]。口服抗原引起肠粘膜中IFNγ介导的局部促炎反应以及全身性TGFβ和IL4-介导的抗炎反应。与来自口服耐受性化的动物的脾细胞相反，肠提取的淋巴细胞不能将耐受性转移到首次用于实验的动物中[Strober，W.等人，(1997)如上；Weiner，H.L.等人，(1997)如上]。因而，口服耐受性诱导需要免疫原性和耐受原性细胞群体之间的平衡，具有从Th1(和促炎细胞因子的分泌)到Th2(和抗炎细胞因子的分泌)免疫反应的变化。
其他人和本发明者已显示口服耐受性可用于预防或减轻模型系统中实验性结肠炎，该模型系统采用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)处理的小鼠[Madsen，K.L.等人，Gastroenterology 113：151-159(1997)；Trop，S.等人，Hepatology 27：746-755(1999)]。对结肠炎提取的蛋白质的口服耐受性的诱导减量调节了抗结肠免疫反应，因而改善了免疫介导的结肠炎。抑制性淋巴细胞通过诱导从促炎到抗炎免疫反应的变化而介导耐受性[Madsen，K.L.等人，(1997)如上；Trop，S.等人，如上]。
肝在免疫耐受性诱导中的作用
很久以来即认为肝参与免疫调节功能。肝是体内最大的网状内皮器官，且其细胞的几个亚群参与抗原呈递和/或加工[Callery，M.P.等人，J.Surg.Res.46：391-394(1989)；Nakano，Y.等人，Surgery 111：668-676(1992)；Yu，S.Y.等人，Surgery 116：229-234(1994)]。
门腔静脉分流术或肝巨嗜细胞功能的阻塞已在几个动物模型中排除了口服耐受性的诱导[Callery，M.P.等人，(1989)如上；Nakano，Y.等人，(1992)如上；Yu，S.Y.等人，(1994)如上]。
在进行了门腔静脉分流术的慢性肝疾病的人中发现对肠内菌群的抗体效价升高了[Crispe，N.等人，Immun.Today 11：236-245(1996)；Ilan，Y等人，Gastro 114：260(1998)]。
已显示供体细胞的门静脉给予促进同种特异性反应性减低[Crispe，N.等人，(1996)如上]。因而，肝是通过对特定的细胞或肽亚群的第一遍清除而诱导外周免疫耐受性所必需的。
肝关联的淋巴细胞
成人肝含有几个参与其免疫调节功能的细胞亚群。发现肝巨嗜细胞在对抗抗原通过门循环进入肝的第一线防御中是重要的。抗原活化的肝巨嗜细胞具有抗原呈递、吞噬作用，且通过分泌细胞因子展示了杀伤性质。这些细胞也诱导趋化性和淋巴细胞聚集[Crispe，N.等人，(1996)如上]。此外，成人肝含有多潜能干细胞，该干细胞引起了包括胸腺和胸腺外T细胞、有粒白细胞和红细胞类谱系细胞的多细胞谱系[Crispe，N.等人，(1996)如上]。实际上，T细胞可在成人肝中进行胸腺外分化[Collins C.等人，Eur.J.Immunol.26：3114-3118(1996)]。
肝看来是T细胞2个群体的聚会地点，该T细胞由源自胸腺的具有高TCR(TCRhigh)的T细胞和胸腺外具有中等TCR(TCRint)的T细胞组成。T细胞的第一类群也已知为主流T细胞，含有较少的CD4+和CD8+细胞群体和CD4-CD8-双阴性(DN)细胞的大群体的混合物，该混合物不表达NK细胞标记或IL2Rβ，且紧密地连接到循环T细胞库中[Crispe，N.等人，(1996)如上]。许多DN细胞表达B细胞标记B220，对该标记的诱导导致将细胞程序死亡的T细胞运输到肝中[Crispe，N.等人，(1996)如上；Ilan，Y等人，(1998)如上；Collins，C.等人，(1996)如上；Garcia-Barcina，M.等人，Immunol 82：95-8(1994)；MacDonald，R.H.等人，J.Exp.Med.182：633-638(1995)]。已知为可选择的T细胞的肝T细胞第二亚群为CD4+或CD4-8-和CD16-、表达αβTCRint，和包括NKR-P1、Ly-49A和IL2受体β-链的已知NK受体[Garcia-Barcina，M.等人，(1994)如上；MacDonald，R.H.等人，(1995)如上；Bendelac，A.等人，Curr.Opin.in Immunol.7：367-374(1995)]。多数肝IL2Rβ+TCRint细胞为NK1.1+。这些细胞在通过外周淋巴样器官循环的库中是稀少的。然而，这些细胞的小群体存在于胸腺髓质、脾和骨髓中。TCRintIL2Rβ+NK1.1+细胞通过原始途径(primordial pathway)、胸腺和胸腺外替代途径分化，而不是通过常规的胸腺途径分化，且可在切除胸腺动物的肝中发育[MacDonald，R.H.等人，(1995)如上；Bendelac，A.等人，(1995)如上；Takahashi，M.等人，J.Immunol.156：2436-2442(1996)；Doherty，D.G.等人，Hepatology 26：445A(1997)]。它们的功能不是常规T细胞任何亚群的特征，而是包括细胞毒性和B细胞辅助的元件。在初次活化时，它们释放大量源自Th1和Th2两者的多种细胞因子[MacDonald，R.H.等人，(1995)如上；Bendelac，A.等人，(1995)如上；Takahashi，M.等人，(1996)如上；Doherty，D.G.等人，(1997)如上]。它们也对IL12起反应并生产IFNγ，两者均为Th1细胞因子，从而诱导抗肿瘤和抗微生物的效应细胞[Takahashi，M.等人，(1996)如上；Doherty，D.G.等人，(1997)如上]。此外，在肝中这些细胞响应于IL12和TNFα而繁殖，并可在外周缺失过程中活跃地参与对主流T细胞的致命打击[Takahashi，M.等人，(1996)如上；Doherty，D.G.等人，(1997)如上]。
本发明的目的之一是确定NK1.1+淋巴细胞在外周免疫耐受性诱导中、在通过脾细胞过继转移的耐受性和/或炎症的诱导中，特定地在保持免疫原性和耐受原性淋巴细胞亚群之间的平衡中的作用。本研究的结果首次显示NK1.1+淋巴细胞在免疫介导的病症中起双重作用。在“耐受化的环境”中，它们通过在抗炎方向改变Th1/Th2范例来诱导和/或维持免疫反应性减低。另一方面，在“非耐受化的环境”中，它们支持促炎的范例。本发明的这个和其他目的将随描述的进展而变得更清楚。
发明概述
在第一个方面，本发明涉及在需要这种治疗的哺乳动物被试者中对免疫相关病症治疗的方法，该方法是通过用适当的方法在该被试者中处理NK T细胞群体而实现的，对NK T细胞群体的该处理导致调节Th1/Th2细胞平衡偏向抗炎细胞因子生产细胞。
在一个优选实施方案中，本发明涉及通过缺失该细胞而处理NK T细胞群体的方法。作为特别优选的实施方案，对NK T细胞群体的缺失可通过向被试者给予治疗有效量的组合物而进行，该组合物包含特异性地识别NK T细胞的抗体作为有效成分。可选择地，NK T细胞群体的缺失可通过来自体内的除去法来进行，这使用了由特异性识别NK T细胞的抗体包被的珠子。
在一个可选择的优选实施方案中，本发明涉及在哺乳动物被试者中治疗免疫相关病症的方法，该方法包含通过来自体内的对该NK T细胞的训导而处理NK T细胞群体，从而该训导的NK T细胞具有调节Th1/Th2平衡偏向抗炎细胞因子生产细胞的能力。
一个特别优选的实施方案涉及在哺乳动物被试者中治疗免疫相关病症的方法，该方法包含以下步骤：
a.从该被试者中获得NK T细胞；
b.来自体内训导在步骤(a)中获得的NK T细胞，从而结果所得的训导的NK T细胞具有调节Th1/Th2平衡偏向抗炎细胞因子生产细胞的能力；和
c.将在步骤(b)中获得的训导的NK T细胞再次引入被试者。调节Th1/Th2平衡偏向抗炎细胞因子生产细胞从而导致IL4和IL10中任何一个与IFNγ之间的数量比例的增加。
更特定地，对NK T细胞的来自体内的训导可通过在下面任何一个存在时培养这些细胞而进行：
a.与要治疗的免疫相关病症有关联的抗原或其任意组合；
b.耐受化的或非耐受化的患相同的免疫相关病症的患者的或来自该被试者的至少一种肝关联细胞；
c.至少一种细胞因子或粘着分子；和
d.上述(a)、(b)和(c)的任何一个的组合。
本发明的方法可选择地进一步包含在被试者中引起对免疫相关病症的免疫反应的增量或减量调节的步骤，优选地通过口服耐受性化。
使根据本发明的方法的来自体内的训导NK T细胞通过过继转移而再次引入到治疗的被试者中。
另一个优选实施方案涉及本发明的方法，其中的免疫相关病症是肠炎(IBD)。更具体而言地，该疾病可为克罗恩病。
在另一个特别优选的实施方案中，本发明的方法想要治疗选自黑素瘤、癌、淋巴瘤和肉瘤的恶性肿瘤。为此目的，为了增加有利的抗肿瘤免疫，NK T细胞可在增强促炎的免疫反应的方向上进行处理。
在另外一个特别优选的实施方案中，本发明的方法想要治疗人类患者。
作为第二个方面，本发明涉及在哺乳动物被试者中治疗免疫相关病症的治疗组合物。本发明的该组合物包含来自体内的训导自身NK T细胞作为有效成分，该细胞能够调节Th1/Th2细胞平衡偏向抗炎细胞因子生产细胞。这些训导的自身NK T细胞介导IL4和IL10中任何一个与IFNγ之间的数量比例的增加。本发明的组合物可选择地进一步包含药学可接受的载体、稀释剂、赋形剂和/或添加剂。
在一个优选实施方案中，包含于本发明的治疗组合物中的训导的自身NK T细胞在其用于本发明的组合物中之前，是在下面任何一个存在时来自体内培养的：
a.与该免疫相关病症有关联的抗原或其任意组合；
b.耐受化的或非耐受化的患该免疫相关病症的患者的或来自要治疗的被试者的至少一种肝关联细胞；
c.至少一种细胞因子或粘着分子；和
d.上述(a)、(b)和(c)的任何一个的组合。
在一个优选实施方案中，本发明的治疗组合物想要治疗哺乳动物被试者中，具体而言地为人中的肠炎症疾病，且更特定地为治疗克罗恩病。
在另一个优选实施方案中，本发明的治疗组合物想要治疗选自黑素瘤、癌、淋巴瘤和肉瘤的恶性肿瘤。
在另外一个优选实施方案中，本发明涉及治疗免疫相关病症的治疗组合物。该组合物包含特异性地识别NK T细胞的抗体作为有效成分。
在一个实施方案中，本发明的治疗组合物可用于治疗肠炎，如克罗恩病。
在另一个实施方案中，本发明的治疗组合物可用于治疗选自黑素瘤、癌、淋巴瘤和肉瘤的恶性肿瘤。为此目的，为了增加有利的抗肿瘤免疫，NK T细胞可在增强促炎免疫反应的方向上进行处理。
作为第三个方面，本发明涉及训导的自身NK T细胞在制造治疗组合物中的用途，该治疗组合物用于在患免疫相关病症的哺乳动物被试者中调节Th1/Th2平衡偏向抗炎细胞因子生产细胞。
在一个特别优选的实施方案中，本发明涉及来自体内训导的自身NKT细胞在制造治疗组合物中的用途，该治疗组合物用于治疗哺乳动物被试者中的免疫相关病症。该训导的自身NK T细胞能够调节Th1/Th2细胞平衡偏向抗炎细胞因子生产细胞，并因而介导IL4和IL10中任何一个与IFNγ之间的数量比例的增加。
在一个特别优选的实施方案中，本发明涉及来自体内训导的自身NKT细胞在制造治疗组合物中的用途，该治疗组合物用于治疗哺乳动物被试者中的肠炎症疾病，具体而言地为在人类患者中，且尤其是治疗克罗恩病。
在另一个特别优选的实施方案中，本发明涉及来自体内训导的自身NK T细胞在制造治疗组合物中的用途，该治疗组合物用于治疗恶性肿瘤，更特定地为治疗黑素瘤、癌、淋巴瘤和肉瘤。
本发明进一步地提供了来自体内的自身NK T细胞，以用于在需要这种治疗的哺乳动物被试者中治疗免疫相关病症。该训导的NK T细胞是在下面任何一个存在时来自体内培养的：
a.与该免疫相关病症有关联的抗原或其任意组合；
b.耐受化的或非耐受化的患该免疫相关病症的患者的或所述被试者的至少一种肝关联细胞；
c.至少一种细胞因子或粘着分子；和
d.上述(a)、(b)和(c)的任何一个的组合。
在本方面的另一个优选实施方案中，本发明涉及来自体内训导的自身NK T细胞在需要这种治疗的哺乳动物被试者中治疗免疫相关病症中的用途。
在另一个优选实施方案中，本发明涉及特异性识别NK T细胞的抗体在制造治疗组合物中的用途，该治疗组合物用于在患免疫相关病症的哺乳动物被试者中对NK T细胞群体的处理，更特定地为使该NK T细胞群体缺失。
NK T细胞群体的缺失导致调节Th1/Th2细胞平衡偏向抗炎细胞因子生产细胞。
在一个特别优选的实施方案中，本发明涉及特异性识别NK T细胞的抗体在制造治疗组合物中的用途，该治疗组合物用于治疗哺乳动物被试者中的免疫相关病症。
在一个特定的实施方案中，该免疫相关病症可为肠炎症疾病，如克罗恩病。在另一个特定的实施方案中，该免疫相关病症可为恶性肿瘤，如黑素瘤、癌、淋巴瘤和肉瘤。
附图简述
图1A-1B：实验性结肠炎中耐受化对肠粘膜的组织学评估的影响
图1A：表示来自非耐受化小鼠的远端结肠组织(最后10cm)的石蜡切片。
图1B：表示来自耐受化小鼠的远端结肠组织(最后10cm)的石蜡切片。
切片用苏木精-伊红染色。供给源自小鼠的CEP导致实验性结肠炎的显著减轻，这由炎症反应和粘膜损害的显著减少来证明(B组，图1B)。相反地，在供给了BSA的非耐受化的小鼠中观察到严重的结肠炎(A组，图1A)。
图2：NK1.1+淋巴细胞增加了耐受化的小鼠中的CD4+IL4+/CD4+IFNγ+比例
从所有组的小鼠中收获脾细胞和肝关联淋巴细胞(LAL)(2.5×106脾细胞和0.5×106LAL)，并在CEP和APC存在时培养72小时。在下面的柱形图中概括的流式细胞仪分析已显示伴随口服耐受性诱导的NK1.1-LAL的缺失与非-NK1.1缺失的耐受化小鼠相比(E组，白色柱)，降低了CD4+IL4+/CD4+IFNγ+比例(B组，黑色柱)。对照的NK1.1-缺失组(F组，黑色柱)与非NK1.1-缺失组(C组，白色柱)相比具有降低的CD4+IL4+/CD4+IFNγ+比例。缩写：EXP.GR.＝实验组，rat.＝比例，CEP＝结肠炎提取的蛋白质，n-dep.＝非缺失的，NK1.1-dep.(NK1.1-缺失的)，cont.＝对照。
图3：NK1.1+淋巴细胞在具有实验性结肠炎的非耐受化的小鼠中降低了CD4+IL4+/CD4+IFNγ+比例
与耐受性组相反，NK1.1-缺失在具有实验性结肠炎的非耐受化的小鼠(N-CEP)中具有相反的作用。与非-NK1.1缺失的非耐受化组(A组，白色柱)相比，CD4+IL4+/CD4+IFNγ+比例在NK1.1-缺失的非耐受化组(D组，黑色柱)中增加了。缩写：EXP.GR.＝实验组，rat.＝比例，CEP＝结肠炎提取的蛋白质，n-dep.＝非缺失的，NK1.1-dep.(NK1.1-缺失的)，cont.＝对照。
图4：IL4和IFNγ在从不同的实验组中分离的淋巴细胞中的表达
该图表示确定IL4和IFNγ表达的流式细胞仪分析的代表性结果。IL4和IFNγ在分离的淋巴细胞中的表达，该分离的淋巴细胞分别来自B和E组耐受化的NK1.1非缺失和缺失小鼠，及A和D组非耐受化的NK1.1非缺失和缺失小鼠。在设置了5×104的小淋巴细胞门控后，数据以点状图显示。点状图下的数字代表染色的细胞的百分数。
不同的实验组由B、E、A和D显示。缩写：EXP.GR.＝实验组。
图5：体外抗原暴露对具有实验性结肠炎的耐受化和非耐受化小鼠中CD4+IL4+/CD4+IFNγ+比例的影响
为了评估疾病定向抗原对CD4+IL4+/CD4+IFNγ+比例的影响，从所有组(B、E、A、D、C、F)的小鼠中收获脾细胞和肝关联淋巴细胞(2.5×106脾细胞和0.5×106LAL)，并在Con A(伴刀豆凝集素A)存在以及CEP和APC不存在(白色柱)时培养12小时。流式细胞仪分析已显示CD4+IL4+/CD4+IFNγ+比例在B和E组及在对照的C和F组中耐受化的小鼠中显著降低，而在A和D组中非耐受化(n-CEP)的小鼠中显著增加。
在抗原不存在时对NK1.1缺失作用的评估显示与在抗原存在时(黑色柱)描述的相似的作用。从B组耐受化的小鼠收获的淋巴细胞揭示与E组中耐受化的NK1.1缺失小鼠相比显著更高的CD4+IL4+/CD4+IFNγ+比例。相反地，在不存在疾病定向抗原时，NK1.1缺失在来自A和D组的非耐受化的小鼠中诱导了CD4+IL4+/CD4+IFNγ+比例的增加。缩写：EXP.GR.＝实验组，rat.＝比例，CEP＝结肠炎提取的蛋白质，n-CEP.＝非耐受化的。
图6：不同实验组中的IL4和IFNγ水平
从两组各三份中收集上清液流体，且对于来自所有耐受化和非耐受化组(不同的组以A、B、C、D、E、F显示)的所有小鼠测量了细胞因子水平。IL4和IFNγ水平是通过“三明治”ELISA进行测量的。耐受化的小鼠表明有从Th1到Th2免疫反应细胞因子分泌的变化。这些小鼠(B组)表明IL4水平的增加和IFNγ水平的降低。相反地，来自非耐受化组(A、E和F组)的小鼠显示高的IFNγ和低的IL4水平。缩写：EXP.GR.＝实验组。
图7：NK1.1-缺失对IL12水平的影响
从两组各三份中收集上清液流体，且对于来自所有耐受化和非耐受化组(不同的组以A、B、C、D、E、F显示)的所有小鼠测量了细胞因子水平。NK1.1-缺失导致CEP-供给的组(分别为E和B组)中IL12水平的增加，但在非-CEP供给的组(A和D组)中具有相反的作用。缩写：EXP.GR.＝实验组。
图8A-8B：实验性结肠炎中耐受化对肠粘膜的组织学评估的影响。
图8A：表示来自非耐受化小鼠的远端结肠组织(最后10cm)的石蜡切片。
图8B：表示来自耐受化小鼠的远端结肠组织(最后10cm)的石蜡切片。
切片用苏木精-伊红染色。供给源自小鼠的CEP导致实验性结肠炎的显著减轻，这由炎症反应和粘膜损害的显著减少来证明(H组，图8B)。相反地，在供给了BSA的非耐受化的小鼠中观察到严重的结肠炎(G组，图8A)。
图9：NK1.1+淋巴细胞在耐受化的小鼠中增加了CD4+IL4+/CD4+IFNγ+比例
从所有组的小鼠中收获脾细胞和肝关联淋巴细胞(2.5×106脾细胞和0.5×106LAL)，并在CEP和APC存在时培养72小时。不同的实验组以G’、H’、I’、J’、K’和L’显示。流式细胞仪分析已显示伴随口服耐受性诱导的NK1.1-LAL缺失与非-NK1.1缺失的耐受化小鼠(K’组)相比降低了CD4+IL4+/CD4+IFNγ+比例(H’组)。对照的NK1.1-缺失组(L’组)与非NK1.1-缺失组(I’组)相比具有降低的CD4+IL4+/CD4+IFNγ+比例。NK1.1+淋巴细胞在具有实验性结肠炎的非耐受化小鼠中降低了CD4+IL4+/CD4+IFNγ+比例。与耐受化组相反，NK1.1-缺失在具有实验性结肠炎的非耐受化的小鼠中具有相反的作用。与非NK1.1缺失的非耐受化组(G’组)相比，CD4+IL4+/CD4+IFNγ+比例在NK1.1缺失的非耐受化组(J’组)中增加了。缩写：EXP.GR.＝实验组，rat.＝比例。
图10：IL4和IFNγ在从不同的实验组中分离的淋巴细胞中的表达
该图表示确定IL4和IFNγ表达的流式细胞仪分析的代表性结果。IL4和IFNγ在分离的淋巴细胞中的表达，该分离的淋巴细胞来自耐受化的NK1.1非缺失和缺失小鼠，及非耐受化的NK1.1非缺失和缺失小鼠。在设置了5×104的小淋巴细胞门控后，数据以点状图显示。点状图下的数字代表染色的细胞的百分数。显示了代表性结果。实验组(EXP GR)。
不同的实验组由G、H、I和J显示。缩写：EXP.GR.＝实验组，rat.＝比例。
图11：由于NK1.1的肝淋巴细胞细胞毒性
在这些研究中YAC-1细胞以100∶1～10∶1的E∶T比例用作目标细胞。来自非耐受化的非-NK1.1缺失小鼠的受体(H’组)与其他的组相比几乎不显示溶胞作用。来自G’组中非耐受化的NK1.1缺失小鼠的受体分别显示比H’组更高的溶胞作用。来自I’组中NK1.1缺失CEP供给小鼠的受体显示比J’组中非NK1.1缺失小鼠更低的溶胞作用。来自对照组的受体对于L’组和K’组小鼠分别具有23％对22.47％的细胞毒性。不同的实验组以G’、H’、I’、J’、K’和L’显示。缩写：EXP.GR.＝实验组。
图12：不同实验组中的细胞因子水平
从两组各三份中收集上清液流体，且对于来自所有耐受化和非耐受化组的所有小鼠测量了细胞因子水平。IL4、IL10和IFNγ水平是通过“三明治”ELISA进行测量的。耐受化的小鼠表明有从Th1到Th2免疫反应细胞因子分泌的变化。这些小鼠(H组)表明IL4、IL10水平的增加和IFNγ水平的降低。相反地，来自非耐受化组(G、J、K组)和对照组I的小鼠显示高的IFNγ和低的IL10水平。从H组中耐受化的小鼠中收获的淋巴细胞与在耐受化的K组中的NK1.1缺失小鼠相比揭示了显著更高的IL4、IL10水平和更低的IFNγ水平。相反地，NK1.1缺失在抗原不存在时在来自G和J组的非耐受化小鼠中诱导了IFNγ的增加和IL4、IL10水平的降低。不同的实验组以G、H、J和K显示。缩写：EXP.GR.＝实验组。IL4和IL10以黑色柱显示，而IFNγ以白色柱显示。
发明详述
NK1.1 T细胞可参与通过细胞因子分泌和/或杀伤来保持抗炎和促炎淋巴细胞之间的平衡，并可参与T辅助细胞分化的决定[Arase，H.等人，Eur.J.Immunol.23：307-310(1993)；Yoshimoto，T.等人，J.Exp.Med.179：1285-1295(1994)，MacDonald，H.R.等人，J.Exp.Med.182：633-638(1995)，Seder，R.A.等人，Annu.Rev.Immuno.12：635-673(1994)，Yoshimoto，T.等人，Science 270：1845-1847(1995)]。对于NK1.1T细胞活化鉴定了多个信号转导通路。假定NK1.1+T细胞不是稳定极化的，且在不同的触发后，TCR的参与触发了Th1和Th2细胞因子两者从这些细胞中的分泌[Bendelac，A.等人，Annu.Rev.Immunol.15：535-562(1997)；Arase，H.等人，J.Immunol.151：546(1993)；Kawamura，T.等人，J.Immunol.160：16-19(1998)，Chen，H.等人，J.Immunol.159：2240-2249(1997)；Arase，H.等人，Eur.J.Immunol.23：307-310(1998)；Yoshimoto，T.，J.Exp.Med.179：1285-1295(1994)；MacDonald，H.R.，J.如上，(1995)]。NK1.1R或IL12R参与可选择性地促进Th1分泌范例[Bendelac等人，(1997)如上；Arase，H.等人，J.Exp.Med.183：2391-2396(1996)；Hayakawa，T.等人，J.Exp.Med.176：269-274(1992)]。
如上所述，NK1.1+ T细胞在免疫调节中起复杂的作用。在本发明中描述的结果显示NK1.1 T淋巴细胞在调节免疫介导的实验性结肠炎中起双重作用。一方面，口服耐受性诱导后的NK1.1 T淋巴细胞的缺失阻止了耐受性的过继转移，然而它显著地降低了IL4对由CD4+细胞分泌的IFNγ之间的数量比例。另一方面，在非耐受化的小鼠中NK1.1 T淋巴细胞的缺失减轻了结肠炎并显著地增加了由CD4+分泌的IL4对由CD4+分泌的IFNγ之间的数量比例。
在第一个方面，本发明因而涉及在需要这种治疗的哺乳动物被试者中治疗免疫相关病症的方法。本发明的该方法包含通过适当的方法在被试者中处理NK T细胞群体的步骤。对NK T细胞群体的处理导致针对Th1/Th2细胞平衡的调节并使其向抗炎细胞因子生产细胞的生产变化。应该强调的是任何免疫调节可减量或增量调节免疫反应。该调节进一步是由被试者免疫系统的不同成分介导的。这种成分是如细胞免疫反应元件、体液免疫反应元件和细胞因子。
在一个优选实施方案中，对NK T细胞群体的处理是通过使该细胞群体缺失而进行的。NK T细胞群体的缺失可通过如给予被试者治疗有效量的组合物而进行，该组合物包含特异性识别NK T细胞的抗体作为有效成分。该特定的方法包含多克隆以及(优选地)单克隆抗体的使用。
抗蛋白质的多克隆抗体的生成描述于《免疫学当前规程》(CurrentProtocols in Immunology)，Wiley and Sons Inc.的第2章中。单克隆抗体可通过与永生化的B细胞在有利于杂交细胞生长的条件下融合而从来自免疫接种的动物的脾或淋巴结的B细胞制备，其中的动物特别是大鼠或小鼠。为使鼠B细胞融合，细胞系Ag-8是优选的。生成单克隆抗体的技术描述于许多文章和教科书中，如上述的《免疫学当前规程》(Current Protocols in Immunology)的第2章。这些动物的脾或淋巴结细胞可以与蛋白质免疫接种的动物的脾或淋巴结细胞相同的途径用于生成单克隆抗体，如在其第2章中所描述的。在生成单克隆抗体中所用的技术进一步地描述于Kohler和Milstein，Nature 256：495-497(1975)和USP 4,376,110中。
术语“抗体”意思包括完整的分子及其片段，如Fab和F(ab’)2，它们能够结合抗原。Fab和F(ab’)2片段缺乏完整抗体的Fc片段，在循环中可更快地清除，且具有比完整的抗体更低的非特异性组织结合[Wahl等人，J.Nucl.Med.24：316-325，(1983)]。应理解的是本发明中有用的Fab和F(ab’)2和其他抗体片段可根据在此处为完整的抗体分子公开的方法而用于NK T细胞的选择性缺失。这种片段一般是用如木瓜蛋白酶(以制备Fab片段)或胃蛋白酶(以制备F(ab’)2片段)的酶通过蛋白水解切割来制备的。
如果抗体能够特异性地与抗原反应，其中该抗原是在这个具体而言的例子中由该细胞表达的细胞外标记分子，从而将该分子结合到抗体上，则称该抗体“能够特异性地识别”确定的细胞。
“抗原”是能够由抗体结合的分子或分子的部分，它此外能够诱导动物产生能够结合该抗原的抗原决定部位的抗体。一个抗原可具有一个或多个抗原决定部位。术语“抗原决定部位”意思指任何分子中能够被抗体结合且也可由该抗体识别的那部分。抗原决定部位或“抗原决定簇”通常由分子的化学活性表面基团群(grouping)组成，如氨基酸或糖侧链，且具有特定的三维结构特征以及特定的带电特征。
作为选择地，NK T细胞群体的缺失可通过来自体内的来进行，这使用了由特异性识别NK T细胞的抗体包被的珠子。在去除法程序中，从处理的被试者中获取全血，并立即分离为血浆、红细胞和白细胞。通过使用NK T细胞标记的特异性抗体使NK T细胞从白细胞群体中缺失，而将其他的血液成分同步地转移回处理的被试者中。
NK1.1+T细胞上的NK1.1分子充当导致IFNγ而不是IL4生产的受体[Arase，H.等人，J.Exp.Med.183：2391-2396(1996)；Seder，R.A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：10188-92(1993)]。当用糖基磷脂酰肌醇锚定的蛋白质或LPS配体刺激时，NK1.1 T细胞变为IFNγ生产细胞，抑制Th2细胞分化并抑制IgE的反应[Cui，J.等人，J.Exp.Med.190(N-6)：783-792(1999)]。外源的IL2根据NK1.1R-P1交联增加了IFNγ的生产[Arase，H.等人，(1996)如上]。NK1.1+T细胞通过体内抗-CD3刺激后迅速的大量IL4分泌而参与CD4+T细胞的分化[Yoshimoto，T.等人，Science 270：1845-7(1995)]。CD1-限制的NK1.1T细胞群体对于抗-CD3-诱导的早期IL4爆发是基本的[Seder，R.A.，Annu.Rev.Imm.12：635-673(1994)]。已显示细菌LPS可通过来自肝巨嗜细胞的IL-12的生产而活化NK1.1+细胞，并随后诱导IFNγ的生产[Ma，X.等人，J.Exp.Med.183：147-157(1996)]。树突细胞和NK和/或T淋巴细胞之间的细胞间接触导致细胞的细胞溶解活性和IFNγ生产的基本增加[De-Moraes，L.等人，Eur.J.Immunol.28：1507-1515(1998)]。IL18和白细胞功能关联的抗原-1可在肝中NK1.1+T细胞的累积及其细胞毒性活性中起作用[Sakamoto，Y.等人，J.Immunol.103(5pt2)：445-51(1999)]。已认为NK1.1+T细胞在抗原呈递中起作用，这可能是它们影响T细胞反应的另一个途径[Seki，S.等人，J.Immunol.V 147：1214-1221(1991)]。前面已显示该亚类细胞具有高水平的自身杀伤性[Crispe，N.等人，Immun.Today 11：236-245(1996)；Kawamura，T.等人，J.Immunol.160：16-19(1998)；Dohert，D.G.等人，J.Hepatology28：59A(1998)]。由LAL的Fas表达导致活化的Fas表达T细胞的死亡[Dohert，D.G.等人，(1998)如上；Johnsson，J.R.等人，Hepatology26：269A(1997)；Doherty，D.G.等人，Hepatology 26：445A(1997)]。因而可能的是在耐受化的环境中，NK1.1 T细胞除其IL4-介导的抗炎细胞因子分泌之外可参与杀伤敏化的促炎细胞，然而在非耐受化的环境中，它们在除其IFNγ分泌之外可参与杀伤抗炎细胞。IL4和IL12两者都增加了NK1.1 T细胞的细胞毒性潜能[Hashimoto，W.等人，J.Immunol.154：4333-4340(1995)；Ballas，Z.K.等人，J.Immunol.150：17-30(1993)]。在炎症中有一个IL12/IFNγ回路在平衡免疫反应中起作用[Ma等人(1996)如上]。IL12增加IFNγ分泌以及NK1.1+T细胞的细胞溶解性和增殖[Cui等人，(1999)如上；Bendelac等人，(1997)如上；Arase等人，(1996)如上；De-Moraes等人，(1998)如上；Neurath，M.F.等人，J.Exp.Med.，182：1281-1290(1995)]。
因此，作为可选择的最优选实施方案，本发明涉及在哺乳动物被试者中治疗免疫相关病症的方法。该方法包含通过来自体内的该NK T细胞的训导而对NK T细胞群体进行处理，从而训导的NK T细胞具有调节Th1/Th2平衡和使该平衡向抗炎细胞因子生产细胞的生产改变的能力，以及将该训导细胞给于该被试者。该调节导致IL4和IL10中任何一个对IFNγ之间的数量比例的增加(整个说明书中也可指CD4+IL4、IL10/CD4+IFNγ比例)。在免疫相关病症中，该比例根据疾病的严重性而降低并在恢复过程中增加。因此，应理解的是IL4和IL10中任何一个对IFNγ之间的数量比例的改变应与 治疗前水平相关。
术语“CD4+IL4”指由CD4+细胞生产的IL4，“CD4+IL10”指由CD4+细胞生产的IL10，且“CD4+IFNγ”指由CD4+细胞生产的IFNγ。在本发明中所用的术语“CD4+IL4 IL10/CD4+IFNγ比例”指在优选地由CD4+细胞生产的IL4和IL10之间及在优选地由CD4+细胞生产的IFNγ之间的数量比例。定义这些细胞因子的每一种的数量的定量测量是如在实施例(实验程序)中描述的进行的。
一个特别优选的实施方案涉及在哺乳动物被试者中治疗免疫相关病症的方法。该治疗方法包含以下步骤：
a.从该被试者中获得NK T细胞；
b.来自体内训导在步骤(a)中获得的NK T细胞，从而结果所得的训导的NK T细胞具有调节Th1/Th2细胞平衡偏向抗炎细胞因子生产细胞的能力；和
c.将在步骤(b)中获得的训导的NK T细胞再次引入该被试者。调节Th1/Th2平衡偏向抗炎细胞因子生产细胞，从而导致IL4和IL10中任何一个与IFNγ之间的数量比例的增加。
通过上述的细胞去除方法，NK T细胞可从骨髓、肝、脾或子宫获得，但也可从外周血液中获得。
更特定地，对NK T细胞的来自体内的训导可通过在下面任何一个存在时培养这些细胞而进行：
a.至少一种与对要治疗的免疫相关病症的旁观者抗原决定部位有关联的抗原或其任意组合；
b.耐受化的或非耐受化的患相同的免疫病症的患者的或来自要治疗的该被试者的至少一种肝关联细胞或其任意组合；
c.至少一种细胞因子、粘着分子或其任意组合；和
d.上述(a)、(b)和(c)的任何一个的组合。
应该理解NK T细胞也可通过上述方法的任何一种而在体内训导，它们可在对同种异型的抗原决定部位或抗原的暴露之前或其后的任何时间点进行调节。
在一个特殊的实施方案中，对NK T细胞的来自体内的训导可通过在抗原存在时培养这些细胞而进行，该抗原与要治疗的免疫相关病症相关联。这些抗原可为从患该免疫相关病症的供体患者中获取的同种异型抗原、异源抗原、自身抗原和重组制备的抗原或其任意组合。
这些抗原对于被试者可为天然的或非天然的。它们可为天然的或合成的、修饰的或未修饰的、完整的或其片段。该片段可源自作为片段的合成或通过消化或其他方式的修饰而从较大的实体创建片段。这种抗原包含但不局限于蛋白质、糖蛋白、酶、抗体、组织相容性决定簇、配体、受体、激素、细胞因子、细胞膜、细胞成分、病毒、病毒成分、病毒载体、非病毒载体、完整细胞、组织或器官。该抗原可由单一分子或各种单独分子的混合物组成。该抗原可自身存在于病毒表面、细胞表面、膜、基质或复合物中或与受体、配体、抗体或任何其他结合配偶体缀合。这种抗原可单独引入到被试者中或与可进一步有利于摄取、稳定性、反应性或寻靶的介质一起引入。
聚合作用和降解、碎粒(fractionation)和化学修饰都能够在潜在的免疫反应方面改变特殊抗原的性质。这些小的区段、片段或抗原决定部位也可分离或合成。
作为非限制性的例子，这种抗原可为源自身体提取物的不同抗原的组合，如在实施例7中用作来自体内训导的CEP。
本发明的方法进一步包含重组制备的抗原。重组抗原的制备包含本领域中众所周知的一般分子生物学技术的使用。这种技术包括如将想要的抗原克隆入适当的表达载体中。
在此处所用的“载体”包含质粒、病毒、噬菌体、整合型DNA片段和其他载体，这些使得DNA片段能够整合入宿主的基因组中。表达载体一般是含有想要的基因或其片段及可操作地连接的遗传控制元件的自身复制的DNA或RNA构建体，这些遗传控制元件被适当的宿主识别并影响想要的基因的表达。这些控制元件能够在适当的宿主中影响表达。通常，遗传控制元件可包括原核启动子系统或真核启动子表达控制系统。这一般包括转录启动子、控制转录开始的可选择的操纵基因、增高RNA表达水平的转录增强子、编码适当的核糖体结合位点的序列、RNA剪接点、结束转录和翻译的序列等等。表达载体通常含有允许载体独立于宿主细胞而复制的复制起点。
载体此外可包括适当的限制酶切位点、抗生素抗性或其他用于选择含有载体的细胞的标记。质粒是最普遍使用的载体形式，但提供相当的功能且是或变为本领域公知的其他载体形式也适合于此处的使用。参见如Pouwels等人，克隆载体：实验室手册(Cloning Vectors：a LaboratoryManual)(1985 and supplements)，Elsevier，N.Y.；和Rodriquez等人(eds.)载体：分子克隆载体及其用途的综述(Vectors：a Survey ofMolecular Cloning Vectors and their Uses)，Buttersworth，Boston，Mass(1988)，此处引用作为参考。
最近已建议肝是T细胞破坏的主要位点，且在自身免疫的小鼠lpr/lpr的肝中这一过程有缺陷，T细胞可以从肝向外周淋巴组织渗漏[Crispe，N.等人，Immunol.Review，174：47-62(2000)]。肝在T细胞分化中起作用。CD3-CD4+/CD8+TCRβ细胞和CD3-4-TCRβ+细胞可通过与肝实质细胞进行培养而从CD4-8-TCRβ无胸腺裸骨髓细胞中生成[Mabuchi，A.等人，J.Leukocyte Biology，63：575-583(1998)]。因此，在另一个特殊的实施方案中，对NK T细胞的来自体内的训导可通过在肝关联细胞存在下培养这些细胞而进行。这些细胞可为如肝巨嗜细胞、星形细胞、肝内皮细胞、肝关联干细胞或任何其他的肝相关淋巴细胞。
在本发明中也涉及在外周淋巴细胞存在时共培养NK T细胞，其中外周淋巴细胞来自患相同的免疫相关病症或治疗的被试者的耐受化或非耐受化的患者。为了从被试者中获得淋巴细胞，具体而言地为从人类被试者中，通过细胞去除法从被试者中获取血液，通过该程序获得了大量的白细胞，而其他血液成分则同步地转移回被试者。
如在实施例7中所描述的，对NK T细胞的来自体内的训导可通过使NK T细胞与CD4或CD8细胞共培养而进行。这些细胞优选地获得自耐受化的被试者(受到作为口服耐受化的CEP的小鼠)。
在另一个特殊的实施方案中，对NK T细胞的来自体内的训导可通过在细胞因子如IL4、IL10、TGFβ、IFNγ、IL12和IL15存在时，或在粘着分子如整合蛋白、选择蛋白和ICAM存在时培养细胞而进行。
虽然IL12通过NK1.1 T细胞对IFNγ诱导发挥作用，但IFNγ反过来可有利于IL12的调节[Ma等人，(1996)如上]。来自患急性GVHD的小鼠的胸腺淋巴细胞的细胞溶解活性在NK1.1+细胞缺失后显著地降低[Neurath等人，(1995)如上]。胸腺中IL12生产的瞬时增加发生在患急性GVHD的小鼠胸腺中NK1.1+T细胞的增加之前[Neurath等人，(1995)如上]。据报道IL12可诱导患急性GVHD的小鼠胸腺中NK1.1+T细胞的增加[Onoe，Y.等人，Immunology 95：248-256.(1998)]。最近显示抗-IL12抗体在转基因动物中增强口服耐受性，并与增加的TGFβ分泌相关联[Marth，T.等人，J.Immunol.157：2348-2357(1996)]。显示IL12和TNFα两者在实验性结肠炎的免疫发病机理中均起重要的作用[Bragger，M.S.H.等人，Gut 34：1705(1998)；Parronchi，P.等人，Am.J.Pathol.150：823(1997)]。单核细胞/巨嗜细胞的IL12生产在维持TNBS诱导的结肠炎中是基本的，并是Th1-介导的炎症反应所必需的[Kuhn，R.等人，Cell 75：263-274，(1993)；Sellon，R.K.等人，Immun.66：5224-5231(1998)；Neurath等人(1995)如上；Marth，T.等人，J.Immunol.157：2348-2357(1996)]。
抗IL12的抗体取消了慢性的TNBS诱导的结肠炎[Neurath等人(1995)如上]。因此，IL12可通过NK1.1+T细胞活化而在疾病发病机理中起支配作用。可能的是该亚类淋巴细胞的活化诱导了IFNγ分泌，并伴随非耐受化的小鼠中Th1免疫的改变[Arase等人(1996)如上；Bleicher，P.A.等人，Science 250：679-682(1990)；Kitamura，H.等人，J.Exp.Med.189：1121-1127(1999)]。
在实验性结肠炎中存在IL12时N1.1+T细胞可为潜在的IFNγ生产者[Cui等人，(1999)如上；Bendelac等人，(1997)如上；Arase等人(1996)如上；De-Moraes等人，(1998)如上]。本发明的结果认为IFNγ是独立于IL12通路而由NK1.1 T细胞通过NK1.1R在炎症状态下分泌的。这可由IFNγ触发的IL12生产与IL12诱导的经由IL12R的IFNγ分泌伴随。相反地，在抗炎耐受化的状态下，NK1.1 T细胞是由增加的IL4分泌活化的。实际上，来自非耐受化的NK1.1-缺失小鼠的淋巴细胞过继转移增量调节了抗炎Th2细胞因子。可能的是不同的刺激物确定了细胞因子反应的类型。
因而，趋化因子或其他介质可决定NK1.1+T细胞功能和它们在不同的免疫学环境中影响Th1/Th2范例的途径。
在一个特别优选的实施方案中，如上述来自体内训导的NK T细胞可再次引入到治疗的被试者中。这可通过称为过继转移的方法来实现。用于转移的特殊训导NK T细胞可优选地源自被试者(自身转移)。不排除同基因的或非同基因的供体(非自身转移)。转移细胞的贮藏、生长或扩增可发生于体内、来自体内或体外。
转移前细胞在体内贮藏、生长或扩增的方法是本领域从业者众所周知的。当想要用于转移的训导NK T细胞从供体中获得时，这些细胞也可经历如上所述的体内或体外的贮藏、生长或扩增。
细胞治疗可通过如静脉内的注射或通过任何上面所述的方法来进行。给予的时间和模式都不是本发明的限制。除了其他本领域技术人员公知的要考虑的因素之外，细胞治疗方式可考虑这些因素如训导细胞可能的细胞毒性、疾病的阶段和患者的状况而容易地进行调整。
本发明的方法可选择地进一步包含在治疗的被试者中引起对免疫相关病症的免疫反应的增量或减量调节的步骤。减量调节反应可通过向该被试者给予源自患该免疫相关病症的同种异型供体的，异源来源的和自身来源的成分、细胞、组织或器官，及免疫功能等价物或其任意组合而实现。
本发明提供给予非天然的活性化合物而不发生减少这种治疗的效力的免疫反应的危险，不论这种治疗是瞬时的还是这种治疗是在长的时期内重复进行的。因而本发明提供了这些非天然活性化合物的有效生物学功能，而不受身体免疫反应的干扰。这可通过使用如在本发明中提供的免疫调节来实现，其中该免疫调节可用作瞬时或短期治疗的整体免疫抑制和/或为了长期治疗通过耐受化而实现，其中所述耐受化由对免疫反应的调节提供。在一些情况下，两种或多种这种免疫调节方式的组合可为有利的。这种治疗可在给予该非天然的活性化合物之前和/或之中采用。
在一个特定的优选实施方案中，该成分、细胞、组织或器官可以以单剂量给予，或者可选择地以多剂量给予。这些成分、细胞、组织或器官可通过单一的给予途径或可选择地通过至少两个不同的给予途径而给予。
该成分可直接给予要治疗的被试者，或者依赖于化合物的大小，值得做的是在给予前将它们与载体进行缀合。治疗制剂可以以任何常规的剂量制剂来给予。制剂一般包含至少一种如上所述的活性成分以及一种或多种其可接受的载体。
在与其他成分相容且不有害于患者的意义上，每一种载体都应该是药物上和生理上可接受的。该制剂包括那些适于口、直肠、鼻或肠胃外(包括皮下的、肌内的、静脉内的和皮内的)给予的。该制剂可方便地以单位剂量形式存在并可由任何药剂学领域众所周知的方法制备。所有这些化合物的性质、可利用性和来源、以及施用(包括在被试者中产生想要的效果所必需的有效量)在本领域中是众所周知的，不需要在此处进一步描述。
更特定地，该成分、细胞、组织或器官可通过选自口的、静脉内的、肠胃外的、经皮肤的、皮下的、阴道内的、鼻内的、粘膜的、舌下的、局部的和直肠的给予及其任意组合来给予。优选地，这些成分、细胞、组织或器官是作为口服耐受性而口服的。
本发明方法的另一个优选实施方案涉及对肠炎(IBD)的治疗，更具体而言地为克罗恩病。对哺乳动物具体而言地为人被试者的克罗恩病的治疗包含以下步骤：
a.从该被试者中获得NK T细胞；
b.来自体内训导在步骤(a)中获得的NK T细胞，从而结果所得的训导的NK T细胞具有调节Th1/Th2细胞平衡偏向抗炎细胞因子生产细胞的能力；和
c.将在步骤(b)中获得的训导的NK T细胞再次引入该被试者。调节Th1/Th2平衡偏向抗炎细胞因子生产细胞导致IL4和IL10中任何一个与IFNγ之间的数量比例的增加。
尽管本发明的方法是特别想要治疗人的免疫相关病症的，但也包括其他的哺乳动物。通过非限制性举例，哺乳动物被试者包括猴、马、牛、犬、猫、小鼠、大鼠和猪。
为了治疗人患者，本发明的方法可利用特定亚型的NK T细胞来自体内的训导，该细胞是表达CD56标记的NK T细胞。对于小鼠，本发明的方法可利用特定亚型的NK1.1+T细胞来自体内的训导。本发明的实施例公开了使用小鼠模型的NK1.1+细胞的实验。应理解的是这些结果也可应用于人中表达CD56标记的NK T细胞。根据本发明对表达CD56标记的NKT细胞的来自体内的训导通过在下面任何一个存在时培养这些细胞实现：
a.至少一种与克罗恩病有关联的抗原；该抗原可为如来自患克罗恩病的供体的同种异型抗原、异源抗原、来自该患者的自身抗原和重组制备的抗原或其任意组合；
b.来自患克罗恩病的耐受化或非耐受化患者的或来自治疗的患者的至少一种肝关联细胞；这些细胞可为如肝巨嗜细胞、星形细胞、肝内皮细胞、肝关联干细胞或任何其他的肝相关淋巴细胞或其任意组合；
c.至少一种细胞因子如IL4、IL10、TGFβ、IFNγ、IL12和IL15，或粘着分子如整合蛋白、选择蛋白和ICAM或其任意组合；和
d.上述(a)、(b)和(c)的任何一个的组合。
根据本发明的方法，训导的NK T细胞是通过过继转移而再次引入到治疗的被试者中的。
本发明的方法也可选择地进一步包含在被试者中引起对发炎的肠的免疫反应的增量或减量调节。减量调节反应的引起可通过给予被试者如下成分而诱导，该成分可为从患克罗恩病的被试者发炎的肠中或从治疗的被试者的肠中提取的蛋白质。
该成分可为细胞、组织或器官或其部分，且它们可以以单一剂量或可选择地以多剂量给予。这些可通过单一的给予途径或可选择地通过至少两个不同的给予途径而给予。更特定地，该成分可通过选自口的、静脉内的、肠胃外的、经皮肤的、皮下的、阴道内的、鼻内的、粘膜的、舌下的、局部的和直肠的给予及其任意组合来给予。优选地，如在实施例中描述的，该成分是作为口服耐受性(CEP的口服引入)而口服的。
在另一个特别优选的实施方案中，本发明的方法想要治疗恶性肿瘤。在癌性的情况下，对NK T细胞的调节应该诱导促炎反应或增加抗肿瘤关联抗原的免疫。如在此处所用以描述本发明的，“癌”、“肿瘤”和“恶性肿瘤”都同等地涉及组织或器官的增生。如果组织是淋巴或免疫系统的一部分，那么恶性细胞可包括循环细胞的非实体瘤。其他组织或器官的恶性肿瘤可产生实体瘤。通常，本发明的方法和组合物可用于治疗非实体瘤和实体瘤。
本发明中涉及的恶性肿瘤可选自黑素瘤、癌、淋巴瘤和肉瘤。在本发明中有用的恶性肿瘤可包含但不局限于血液学恶性肿瘤(包括白血病、淋巴瘤和骨髓增生病)、再生不良性和再生障碍性贫血(病毒诱导的和自发性的)、骨髓异常增生综合症、所有类型的肿瘤相关病症(免疫介导的和自发性的)，及实体瘤(包括肺、肝、乳房、结肠、前列腺GI管、胰和Karposi)。
为了治疗患癌的哺乳动物被试者，本发明的方法所用的训导NK T细胞可通过多种途径给予。通过非限制性的例子，训导的细胞可在静脉内递送，或者递送入与实体瘤位置接近的体腔如腹膜内腔，或者直接注射入实体瘤中或其接近位置。
更进一步地，本发明提供了训导NK T细胞的方法。该训导可在下面任何一个存在时通过培养这些细胞实现：
a.至少一种与对要治疗的免疫相关病症的旁观者抗原决定部位有关联的抗原或其任意组合；
b.耐受化的或非耐受化的患相同的免疫病症的患者的或来自要治疗的该被试者的至少一种肝关联细胞或其任意组合；
c.至少一种细胞因子、粘着分子或其任意组合；和
d.上述(a)、(b)和(c)的任何一个的组合。
本发明的方法可与其他用于治疗癌的治疗方法组合。也预期的是可对那些已经由于疾病而免疫抑制的哺乳动物被试者进行该治疗。对患者或兽患者的免疫状况的评估是本领域技术人员易于确定的。
作为第二个方面，本发明涉及在哺乳动物被试者中治疗免疫相关病症的治疗组合物。本发明的该组合物包含来自体内的训导自身NK T细胞作为有效成分，该细胞能够调节Th1/Th2平衡偏向抗炎细胞因子生产细胞。这些训导的自身NK T细胞介导IL4和IL10中任何一个与IFNγ之间的数量比例的增加。
本发明的组合物可进一步包含药学可接受的载体、添加剂、稀释剂或赋形剂。适当的载体包括如磷酸盐缓冲的盐和具有5％HSA或PPF的盐。其他适当的载体是本领域技术人员众所周知的，且不是本发明的限制。相似地，一个本领域的技术人员易于选择其他想要的成分以包含于本发明的药物组合物中，且该成分不是本发明的限制。
在一个优选实施方案中，本发明药物组合物中训导的自身NK T细胞是在下面任何一个存在时来自体内培养的：
a.至少一种与要治疗的免疫相关病症有关联的抗原，该抗原可为来自患相同免疫相关病症的供体的同种异型抗原、异源抗原、来自治疗的患者的自身抗原和重组制备的抗原或其任意组合；
b.患免疫相关病症的耐受化或非耐受化患者的或治疗的患者的至少一种肝关联细胞，这些细胞可为肝巨嗜细胞、星形细胞、肝内皮细胞、任何其他的肝相关淋巴细胞及其任意组合；
c.至少一种细胞因子如IL4、IL10、TGFβ、IFNγ、IL12和IL15，或粘着分子如整合蛋白、选择蛋白和ICAM；和
d.上述(a)、(b)和(c)的任何一个的组合。
在一个优选实施方案中，本发明的治疗组合物想要治疗哺乳动物被试者中的肠炎症疾病，且更特定地为治疗克罗恩病。该组合物包含训导的自身NK T细胞作为有效成分，所述自身NK T细胞能够调节Th1/Th2细胞平衡偏向抗炎症细胞因子生产细胞。
本发明的治疗组合物中含有的训导的自身NK T细胞能够调节Th1/Th2细胞的平衡并使其向抗炎细胞因子生产细胞的生产改变。该平衡改变的结果是CD4+IL4+/CD4+IFNγ比例(IL4和IL10中任何一个与IFNγ之间的数量比例)的增加。该调节过程进一步是由被试者的免疫系统的不同成分介导的，如细胞免疫反应元件、体液免疫反应元件和细胞因子。
组合物中含有的自身NK T细胞的训导优选地是如上所述进行的。
在另一个优选实施方案中，本发明的治疗组合物想要治疗恶性肿瘤如黑素瘤、癌、淋巴瘤和/或肉瘤。在癌性的情况下，对在本发明的组合物中含有的NK T细胞的调节可诱导促炎反应或增加抗肿瘤关联抗原的免疫。
在另外一个优选实施方案中，本发明涉及治疗免疫相关病症的治疗组合物。该组合物包含特异性识别NK T细胞的抗体作为有效成分。本发明的组合物可进一步含有药物可接受的载体。适当的载体包括如磷酸盐缓冲的盐和具有5％HSA或PPF的盐。其他适当的载体是本领域技术人员众所周知的，且不是本发明的限制。相似地，一个本领域的技术人员易于选择其他想要的成分以包含于本发明的药物组合物中，且该成分不是本发明的限制。
在一个实施方案中，本发明的治疗组合物可用于治疗肠炎症疾病，如克罗恩病。为了治疗肠炎症疾病，且具体而言地为克罗恩病，口服药物组合物是有利的。口服可允许改善患者的状况，且无需全身性的免疫抑制或侵袭程序。
在另一个实施方案中，本发明的治疗组合物可用于治疗选自黑素瘤、癌、淋巴瘤和肉瘤的恶性肿瘤。
组合物剂量可为任何足够调节Th1/Th2平衡的量。技术人员应理解的是优选的剂量将遵照良好的实验实践和标准的医学实践而对患者个别地加以考虑。
如在此处所用的，“足够调节Th1/Th2平衡的量”指达到选择的结果所必需的量。例如，本发明的组合物的有效量将调节Th1/Th2平衡偏向抗炎细胞因子生产细胞。
本发明的组合物和方法可进一步提供对自身免疫疾病如胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)的治疗。
本发明的组合物可通过多种途径给予。通过非限制性例子，组合物可静脉内递送。
适用于注射用途的药物形式包括无菌水溶液或分散体和用于临时制备无菌注射型水溶液或分散体的无菌粉末。在所有情况下，该形式都必须是无菌的，且必须是具有容易的注射性的流体。它在制造和贮藏条件下必须是稳定的，且必须防止微生物如细菌和真菌的污染作用而保存。
防止微生物的作用可通过多种抗细菌和抗真菌试剂来完成，如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情况下，优选地是包括等渗试剂，如糖或氯化钠。注射型组合物的延长的吸收可通过在组合物中使用延迟吸收的试剂来达成，如单硬脂酸铝和明胶。
无菌的注射型溶液是通过以必需的量在适当的溶剂中使活性化合物与多种其他上面列举的所需成分混合并伴随过滤灭菌而制备的。通常，分散体是通过将多种灭过菌的活性成分掺入无菌的载体中制备的，该载体含有基本分散剂和来自那些上面所列举的必需的其他成分。
在用于制备无菌注射型溶液的无菌粉末的情况下，优选地制备方法是真空干燥和冰冻干燥技术，这些技术从其前面无菌过滤的溶液中产出了活性成分的粉末加任何额外想要的成分。
本发明的药物组合物通常包含缓冲试剂、调节其渗透性的试剂和可选择的一种或多种本领域公知的药物可接受的载体、赋形剂和/或添加剂。活性补充成分也可掺入到组合物中。该载体可为含有如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)、其适当的混合物和植物油的溶剂或分散剂。适当的流动性可通过例如使用包被物如卵磷脂、通过(在分散体的情况下)维持必需的颗粒大小和通过使用表面活性剂来维持。
如在此处所用的，“药物可接受的载体”包括任何和所有的溶剂、分散剂、包被物、抗细菌和抗真菌剂等。这种介质和试剂作为药物活性物质的使用是本领域众所周知的。除了与活性成分不相容的之外，任何常规介质或试剂都可以用在治疗组合物中。
作为第三个方面，本发明涉及训导的自身NK T细胞在制造治疗组合物中的用途，该治疗组合物用于在患免疫相关病症的哺乳动物被试者中调节Th1/Th2细胞平衡偏向优选的抗炎细胞因子生产细胞的生产。优选的用途是制造用于治疗哺乳动物被试者中肠炎症疾病的组合物，更特定地为人被试者中的克罗恩病。可选择地，训导的自身NK T细胞可用于治疗药物组合物的制备，该组合物用于治疗恶性肿瘤，如黑素瘤、癌、淋巴瘤和肉瘤。在癌性的情况下，对NK T细胞的调节可诱导促炎反应或增加抗肿瘤关联抗原的免疫。
本发明进一步地提供了来自体内训导的自身NK T细胞。该训导的NK T细胞已在下面任何一个存在时来自体内培养：
a.至少一种与该免疫相关病症有关联的抗原或其任意组合；
b.耐受化的或非耐受化的患该免疫相关病症的患者的或该被试者的至少一种肝关联细胞；
c.至少一种细胞因子或粘着分子；和
d.上述(a)、(b)和(c)的任何一个的组合。
更进一步地，本发明提供了本发明的来自体内训导的自身NK T，以用于在需要这种治疗的哺乳动物被试者中治疗免疫相关病症。
在本方面的另一个实施方案中，本发明涉及来自体内训导的自身NKT细胞在需要这种治疗的哺乳动物被试者中治疗免疫相关病症中的用途。
在另一个优选实施方案中，本发明涉及特异性识别NK T细胞的抗体在制造治疗药物组合物中的用途，该治疗药物组合物用于在患免疫相关病症的哺乳动物被试者中对NK T细胞群体的处理，特定地为使该NK T细胞群体在该被试者中缺失。应理解的是NK T细胞群体的缺失导致调节Th1/Th2细胞平衡偏向优选的抗炎细胞因子生产细胞的生产。该抗体可特别地用于制备用于在哺乳动物被试者中治疗免疫相关病症的治疗药物组合物，特定地为肠炎症疾病，如在人被试者中的克罗恩病。
在另一个特定的实施方案中，该免疫相关病症可为恶性肿瘤，如黑素瘤、癌、淋巴瘤和肉瘤。
虽然公开和描述了，但应该理解本发明不局限于特别的实施例、方法步骤和此处所公开的组合物，这是因为这种方法步骤和组合物可有些变化。也应该理解此处所用的术语仅仅是为描述特别的实施方案的目的而使用的，且不具有限制性，因为本发明的范围将仅受附加的权利要求和其等价物的限制。
必须注意的是，如在本说明书和附加的权利要求中所用的，单数形式“a”、“an”和“the”包括复数事物，除非内容中另外明显地表明。
贯穿本说明书和随后的实施例和权利要求，除非内容中另外需要，短语“包含”及变体将理解为包含规定的整体(integer)或步骤或整体或步骤组，但不排除任何其他的整体或步骤或整体或步骤组。
下面的实施例是由本发明者采用的以实现本发明的方面的代表技术。应该理解的是尽管这些技术是实践本发明的优选实施方案的范例，那些本领域的技术人员根据本公开内容将认识到可进行多种修改而不背离本发明的精神和预定范围。
实施例
I.
材料与方法
动物
从Harlan获得了正常近交2～4个月龄的C57BL雄性小鼠并饲养于Hadassah-Hebrew University Medical School的Animal Core。将小鼠用标准的实验室食物进行饲养并保持在12-小时的光照/黑暗周期中。
结肠炎的诱导
TNBS-结肠炎是通过1mg/小鼠如上所述溶解于100ml 50％的乙醇中的TNBS的直肠滴入法诱导的。[Collins，C.等人，Eur.J Immunol.26：3114-3118(1996)]。
口服抗原的制备和给予
从TNBS诱导的结肠炎的小鼠中去除结肠，切成小条，并机械地匀浆。在通过40mm的尼龙细胞滤过器过滤后，将完整的细胞旋转沉淀并去除。用蛋白质测定试剂盒(Biorad，Munich，德国)对蛋白质进行定量。将结肠炎提取的蛋白质(CEP)通过在11天中每隔一天用防止损伤的针引入到下面描述的实验组之中(总共5个剂量)。
NK1.1细胞缺失
NK1.1+细胞的缺失是如前面所述用小鼠抗小鼠NK1.1单克隆抗体(Serotec，Oxford，英国)来进行的[Kawamura，T.等人，J.Immunol.160：16-19(1998)]。在从供体小鼠中收获脾细胞之前将小鼠用50μg/天的IP注射36小时。
淋巴细胞的过继转移
在诱导结肠炎后14天将所有组的供体小鼠处死，且如上所述制备源自脾的淋巴细胞单一悬浮液[Weiner，H.等人，Annu.Rev.Immunol.12：809-837(1994)]。在移植前将细胞重悬于PBS中。将来自所有组的脾淋巴细胞移植到初次实验的受体小鼠中，且在24小时后用TNBS进行直肠激发。
对实验性结肠炎的耐受性诱导作用的评估
耐受性诱导的作用是通过监控结肠炎的如下参数来评估的：
结肠炎的临床评估
在研究的过程中每天都伴随腹泻。
结肠炎的宏观评分
结肠炎评估是在结肠炎诱导后14天用标准参数进行的[Madsen，K.L.等人，Gastroenterology 113：151-159(1997)；Trop，S.等人，Hepatology27：746-755(1999)]。
确定了4个宏观参数，即：结肠溃疡程度；肠和腹膜粘合；器壁的厚度和粘膜水肿的程度。每一个参数都是由两个有经验的不知情(blinded)检查者在0(完全正常)～4(最严重)的等级进行分级的。
组织学损害的分级
为进行炎症的组织学评估，将远端的结肠组织(最后10cm)去除并在10％的甲醛中固定。然后将来自每只小鼠的5个石蜡切片用标准技术以苏木精-伊红染色。结肠的显微横切面的炎症程度是半定量地从0～4分级的[Madsen等人，(1997)如上；Trop等人，Hepatology 27：746-755(1999)]。等级0：正常无炎症迹象；等级1：非常低水平的白细胞渗入；等级2：低水平的白细胞渗入；和等级3：具有高血管密度的高水平渗入，且肠壁加厚；等级4：具有杯形细胞丧失的跨壁渗入，高的血管密度，壁加厚，且正常肠结构破坏。该分级是由两个有经验的不知情检查者进行的。
NK1.1淋巴细胞在实验性结肠炎模型中对耐受性诱导的作用的评估
肝和脾淋巴细胞分离
如前文所述分离脾细胞并去除红细胞[Vicari，A.P.等人，Immunology Today 17(2)：71(1996)]。肝内淋巴细胞是在研究的末期从所有组的小鼠中分离的，方法如前文所述并具有一些改变[Vicari，等人，(1996)如上；Bleicher，P.A.等人，Science 250：679-682(1990)]。将下腔静脉在隔膜之上切割，且将肝用5ml冷的PBS冲洗直到它变为灰白的。将结缔组织和胆囊去除，将肝在冷的无菌PBS中置于10-ml的皿中。使肝和脾通过不锈钢的筛眼压碎(大小60，Sigma Chemical Co.，St.Louis MO)。将细胞悬浮液置于50ml的试管中3分钟，并在冷的PBS中洗涤2次(1,250xrpm进行10分钟)，然后去除残渣。使细胞重悬于PBS中，使细胞悬浮液通过用PBS预浸的尼龙筛眼，并收集未结合的细胞。在45ml PBS中洗涤细胞2次(室温1,250xrpm)。对于肝和脾淋巴细胞分离，将20ml的histopague 1077(Sigma Diagnostics，St.Louis，MO)在50-ml的试管中缓缓置于悬浮在7ml PBS的细胞下面。将该试管于室温于1,640rpm离心15分钟。将位于分界面的细胞收集、在50-ml的试管中稀释，并用冰预冷的PBS洗涤2次(1,250rpm进行10分钟)。大约回收了1×106细胞/小鼠肝。用锥虫蓝染色表明的生存力大于95％。脾细胞和肝关联淋巴细胞两者都从所有实验组的所有动物中分离了。
确定NK1.1+淋巴细胞缺失的流式细胞仪分析
在淋巴细胞分离之后，立即将三份2-5×104细胞/500μl的PBS放入与4ml 1％的BSA温育了10分钟的Falcon 2052试管中，并于1400rpm离心5分钟。将细胞与1∶20的FITC-抗小鼠NK1.1抗体(NKR-P1C，Pharmingen，USA)重悬于10μl FCS中，并在30分钟内每10分钟混合一次。将细胞用1％的BSA洗涤2次，并置于4℃直到进行读数。对于对照组，仅添加了5μl 1％的BSA。分析型细胞分选是用荧光激活细胞分选仪(FACSTAR plus，Becton Dickinson)在来自每一组的1×104细胞上进行的。只对活细胞进行计数，且将来自非抗体处理的淋巴细胞的背景荧光从获得的水平中扣除。对向前和侧面的分散设置门控以排除死细胞和红细胞。数据是用Consort 30双色轮廓图程序(Becton Dickinson，Oxnard，CA)或CELLQuest程序分析的。
脾细胞和肝关联细胞培养
从所有组(A’～F’)的小鼠中收获脾细胞和肝关联淋巴细胞，并培养在24孔的组织培养平板上。从所有研究组的每一只动物制备了三份并培养12小时。使淋巴细胞在1×106脾细胞/ml RPMI 1640的细胞皿上用Con A 2μg/ml和2μM莫能菌素(Biosource，CA)在5％中于37℃进行活化12小时，其中的Con A和莫能菌素是防止细胞因子从细胞释放所必需的。该RPMI培养基含有：10％FCS、200mM Hepes、100U青霉素和100Mg链霉素/ml、10mM Hepes IL2-10U/ml、CEP-50Mg/ml。该细胞包括2.5×106脾细胞和0.5×106LAL，具有2μM莫能菌素(Biosource，CA)。从两组中收集上清液流体用于通过ELISA的细胞因子测量，且淋巴细胞是通过上述的流式细胞仪分析的[Collins，C.等人，Eur.J.Immunol.26：3114-3118(1996)]。
细胞内染色和流式细胞术
从所有孔收获细胞并双重染色。将探测CD4+T-细胞群体(Th1和Th2细胞)的细胞外和细胞内染色如前文所述来使用，用到如下抗体：FITC缀合的抗CD4，且将PE-缀合的抗IL4 mAb用于探测CD4+IL4+细胞(PharMingen，San Diego，CA)。将FITC缀合的抗CD4和PE-缀合的抗IFNγ mAb用于探测CD4+IFNγ细胞(PharMingen，San Diego，CA)。所有程序均根据生产商的说明书来进行(IC sceen，Biosourceintracellular staining kit，CA)。淋巴细胞用流式细胞仪进行分析。
肝淋巴细胞细胞毒性测定
用于这些研究的目标细胞是YAC-1细胞，即一种通过采用具有10％FCS的补充RPMI而适合在组织培养中连续生长的淋巴瘤细胞系。制备YAC-1细胞用于NK测定是通过将它们以2×105细胞/ml的密度在25ml的烧瓶中接种并在24小时后将它们收集来完成的。将细胞悬浮并收集于50ml的试管中，并通过10分钟的离心(1250rpm)用培养基洗涤2次。该程序确保用51Cr的有效标记和由NK细胞溶解的高灵敏度。将目标细胞用51Cr(New Life Science，Boston MA，Gamidor，以色列)进行标记，并于37℃温育90分钟(在300μl RPMI培养基中200mCi/2×106细胞)。每10分钟人工混合细胞一次。温育后，加入3ml 20％的FCS RPMI，并再次于37℃温育30分钟。将细胞在RPMI 10％FCS中洗涤3次并计数。为了确定标记效率的程度，计数了100μl的细胞，且测量了0.6cpm/细胞的最小值。效应细胞是从来自上述A-H组的肝中分离的肝淋巴细胞。51Cr-释放测定是在Costar 96-孔平板上进行的。将100μl分级数目的效应细胞与100μl中5000个标记的目标细胞混合，效应细胞与目标细胞的比例(E∶T比例)为100∶1、50∶1和10∶1。每孔都含有总量为200μl的目标和效应细胞。对来自每一样品的每一比例检验了5个孔。为确定自发的释放，将具有相似数目的目标细胞的6个孔用100μl RPMI 10％FCS涂平板。为确定最大的释放，将100μl培养基上6个孔的目标细胞与100μl TritonX混合。将平板离心2分钟(500rpm)，随后于37℃在5％的CO2中温育4小时。然后将平板再次离心2分钟(500rpm)，将上清液收获并用γ计数器计数。结果表示为通过用下面方程计算的目标细胞特异性溶解的百分数：％细胞毒性＝测定的平均cpm-来自自发释放的cpm/来自用TritonX溶解的目标的cpm-来自自发释放的cpm×100。
细胞因子分泌
从两组各三份中收集上清液流体，且对于来自所有耐受化和非耐受化组的、NK1.1缺失的和非缺失的所有小鼠测量了细胞因子水平。IL4、IL10、IL12和IFNγ水平是用Genzyme Diagnostics试剂盒(GenzymeDiagnostics，MA，美国)根据生产商的说明书通过“三明治”ELISA进行测量的。结肠炎诱导10天后，在来自耐受化的和非耐受化的、NK1.1缺失和非缺失小鼠的5只小鼠中测量了血清水平。
体外训导实验
淋巴细胞的分离和分开
制备脾细胞并将其分成4个淋巴细胞亚型，即CD4+、CD8+、NK和树突细胞。细胞分离是用Magnetic Cell Sorting(MACS)完成的。将特定的微珠用于每个亚型的淋巴细胞：CD4和CD8微珠，及抗-NK珠(MiltenylBiotec，德国)。在淋巴细胞分离之后，立即将三份2-5×104细胞/500·l的PBS放入与4ml 1％的BSA温育了10分钟的Falcon 2052试管中，并于1400rpm离心5分钟。将细胞与1∶20的FITC-抗小鼠NK1.1抗体(NKR-P1C，Pharmingen，美国)在10μl FCS中重悬，并在30分钟内每10分钟混合一次。将细胞用1％的BSA洗涤2次，并置于4℃直到进行读数。对于对照组，仅添加了5μl 1％的BSA。分析型细胞分选是用荧光激活细胞分选仪(FACSTAR plus，Becton Dickinson)在来自每一组的1×104细胞上进行的。只对活细胞进行计数，且将来自非抗体处理的淋巴细胞的背景荧光从获得的水平中扣除。对向前和侧面的分散设置门控以排除死细胞和红细胞。数据是用Consort 30双色轮廓图程序(BectonDickinson，Oxnard，CA)或CELLQuest程序分析的。
脾细胞和肝关联淋巴细胞培养
从来自所有组的小鼠中收获脾细胞并培养于24孔的组织培养平板上。从所有研究组的每一只动物制备了三份并培养12小时。从两组中收集上清液流体用于通过ELISA的细胞因子测量。
实施例1
实验性结肠炎中的耐受性诱导作用
为了评估实验性结肠炎模型中耐受性诱导的作用，对每组由20只动物组成的6组小鼠进行了研究(表1)。在研究的第1日用TNBS(A、B、D和E组)或正常的盐(对照组C和F)直肠激发所有小鼠。从结肠炎诱导那日开始，在11日内每隔一天向所有组的小鼠进行供给(50μg/小鼠)。B和E组包括用结肠炎提取的蛋白质(CEP)供给的小鼠。向A、C、D和F组中的小鼠供给牛血清白蛋白(BSA，50μg/小鼠)。在结肠炎诱导后14日将所有组的小鼠处死。如上所述，在研究终止前36小时用抗-NK1.1抗小鼠单克隆抗体对D～F组的小鼠进行处理。A～C组的小鼠不是NK1.1-缺失的。
表1
实验组和对照组
 组 NK1.1缺失 供给的抗原  直肠激发
 A - BSA  TNBS
 B - CEP  TNBS
 C - BSA  NS
 D + BSA  TNBS
 E + CEP  TNBS
 F + BSA  NS
BSA：牛血清白蛋白
CEP：结肠炎提取的蛋白质
TNBS：2，4，6-三硝基苯磺酸
结肠炎的临床评估
在来自分别用小鼠-CEP或NK1.1-缺失供给的B和D组的耐受化小鼠中观察到腹泻的显著降低。相反地，来自A和E组的小鼠患有严重的腹泻，这些小鼠是用BSA供给或用小鼠-CEP或NK1.1-缺失供给的。对小鼠体重的探究揭示与A和E组的小鼠相比，在B和D组的耐受化小鼠中有统计学显著的体重增加(分别为13.5％和11.65％对3.2％和4.8％，p＜0.005)。
结肠炎的宏观分级
通过小鼠提取的源自结肠炎的蛋白质或NK1.1-缺失的供给而导致的口服耐受性诱导(B和D组)显著地减轻了结肠炎的宏观分级。检验的结肠炎宏观参数的分数为：结肠溃疡程度；肠和腹膜粘着；器壁的厚度和粘膜水肿的程度。与分别为非处理的对照和CEP-供给-NK1.1缺失的组A和E中的3.1±0.54和3.05±0.67相比，总的宏观分数在B和D组中分别为0.35±0.01和0.63±0.03(p＜0.005)。
组织学损害的分级
对肠组织的组织学评估显示与A和E组非耐受化的小鼠相比，在B和D组中耐受化的或NK1.1-缺失的小鼠中炎症反应和粘膜溃疡有显著的降低。在B和D组小鼠中，探测到了几乎正常的切片，或仅有最小的淋巴细胞渗入。相反地，在从非耐受化小鼠中获取的肠标本中观察到严重的炎症反应(等级3-4)(图1)。
实施例2
NK1.1+淋巴细胞在耐受化小鼠中增加了CD4+IL4+/CD4+IFNγ+比例而在具有实验性结肠炎的非耐受化小鼠中降低了CD4+IL4+/CD4+IFNγ+比例
耐受化小鼠
为了研究NK1.1+淋巴细胞在耐受化小鼠中的作用，从所有组的小鼠中收获脾细胞和肝关联淋巴细胞(2.5×106脾细胞和0.5×106LAL)，并在CEP和APC存在时培养72小时。流式细胞仪分析显示伴随口服耐受性诱导的NK1.1-缺失与非-NK1.1 LAL缺失的耐受化小鼠相比降低了CD4+IL4+/CD4+IFNγ+比例(分别在E和B组中的0.99±0.03对1.8±0.35 CD4+IL4+/CD4+IFNγ+，p＜0.005，图2)。对照NK1.1-缺失组(F组)揭示与非-NK1.1-缺失组C相比CD4+IL4+/CD4+IFNγ+比例的降低(分别对于C和F组为2.13±0.36对1.6±0.29)。
非耐受化小鼠
与耐受化组相反，NK1.1-缺失对具有实验性结肠炎的非耐受化小鼠具有相反的作用。与非-NK1.1-缺失的非耐受化组相比，CD4+IL4/CD4+IFNγ比例在NK1.1-缺失的非耐受化组中降低了(分别为A和D组中的0.74±0.06对0.56±0.05，p＜0.005，图3)。
耐受化和非耐受化小鼠之间CD4+IL4+/CD4+IFNγ+比例的比较揭示所有耐受化组中的较高比例。用TNBS处理且口服供给CEP的小鼠(B组)与供给BSA的非耐受化小鼠(A组)相比显示显著较高的比例。在A、B和C组中的CD4+IL4+/CD4+IFNγ+比例分别为：0.56±0.05、1.8±0.35和2.13±0.36(p＜0.005)。图4表示IL4和IFNγ在分离的淋巴细胞上表达的代表性结果，这些淋巴细胞分别来自B和E组耐受化的NK1.1非缺失和缺失小鼠，及A和D组非耐受化的NK1.1非缺失和缺失小鼠。
实施例3
体外致敏的作用和疾病定向抗原对具有实验性结肠炎的耐受化和非耐受化小鼠中CD4+IL4+/CD4+IFNγ+比例的作用
为了评估体外向疾病定向抗原的暴露对CD4+IL4+/CD4+IFNγ+比例的作用，从所有组的小鼠(列于表1中)中收获脾细胞和肝关联淋巴细胞(2.5×106)脾细胞和(0.5×106)LAL，并在Con A存在但CEP和APC不存在时培养12小时。对不存在抗原时NK1.1缺失的作用的评估与那些在抗原存在时发现的相似。与耐受化组E中NK1.1-缺失小鼠相比，从B组的耐受化小鼠中收获的淋巴细胞揭示显著较高的CD4+IL4+/CD4+IFNγ+比例(分别为0.7±0.02对1.1±0.02，p＜0.005)。相反地，NK1.1缺失在不存在抗原时在来自A和D组的非耐受化小鼠中诱导了CD4+IL4+/CD4+IFNγ+比例的增加(分别为1.21±0.03对0.96±0.01，p＜0.005，表2，图5)。这些结果认为免疫训导是在体内实现的，且不受体外的细胞-抗原温育的影响。
相似地，流式细胞仪分析显示CD4+IL4+/CD4+IFNγ+比例在B和E组的耐受化小鼠中和对照组C和F中显著降低了，而在A和D组的非耐受化小鼠中显著增加了(p＜0.005，图5)。
表2
NK1.1缺失和疾病定向抗原对CD4+IL4+/CD4+IFNγ+比例的作用
 组 耐受化的 NK1.1缺失 CD4+IL4+/CD4+IFNγ+比例(具耐受化的抗原)  CD4+IL4+/CD4+IFNγ+比例(无耐受化的抗原)
 A - - 0.56±0.05  0.96±0.01
 B + - 1.8±0.35  1.1±0.02
 C 初次实验 - 2.13±0.36  1.3±0.21
 D - + 0.74±0.06  1.21±0.03
 E + + 0.99±0.03  0.7±0.02
 F 初次实验 + 1.6±0.29  1.33±0.27
耐受化和非耐受化小鼠中细胞因子水平的变化
从两组各三份中收集上清液流体，且对于来自所有耐受化和非耐受化组的所有小鼠测量了细胞因子水平。IL4和IFNγ水平是通过“三明治”ELISA进行测量的。耐受化的小鼠表明从Th1到Th2免疫反应细胞因子释放的改变。这些小鼠(B组)表明IL4水平的增加和IFNγ水平的降低。相反地，来自非耐受化组(A、E组)的小鼠显示高的IFNγ水平和低的IL4水平。从B组的耐受化小鼠中收获的淋巴细胞揭示了与耐受化组E中NK1.1-缺失小鼠相比显著较高的IL4水平和较低的IFNγ水平(分别为24.4±1.4和14.1±0.4对22.6±0.7和189.8±8.4，图6)。相反地，NK1.1缺失在不存在抗原时在来自A和D组的非耐受化小鼠中诱导了IFNγ水平的增加和IL4水平的降低(分别为128.3±3.7和0.6±0.01对48.3±4.1和19.1±0.4，图6)。NK1.1缺失在CEP-供给的组中导致IL12水平的增加(对于E组分别为475±23.3对145±5.7，图7)，但在非-CEP供给的组中具有相反的作用(对于A组和D组分别为165±7.4和74±3.3)。
实施例4
实验性结肠炎中耐受性诱导对脾细胞过继转移的作用
为了评估耐受性诱导在实验性结肠炎模型中的作用，研究了6组每组由10只动物组成的供体小鼠(不同的组列于表3)。通过用TNBS的直肠激发在来自G～J组的小鼠中诱导了结肠炎。K和L组的对照小鼠是用正常的盐激发的。从结肠炎诱导那日开始，在11日内每隔一天向所有组的小鼠用50μg/小鼠进行供给。I和J组包括用结肠炎提取的蛋白质(CEP)供给的小鼠。向G、H、K和L组中的小鼠供给牛血清白蛋白(BSA，50μg/小鼠)。NK1.1缺失是如上所述在收获脾细胞前36小时在来自G、I和K组的小鼠中进行的。在结肠炎诱导后14日将所有组的小鼠处死。
也研究了每组由10只动物组成的受体小鼠组G’～L’。在0.5ml PBS中的1×106供体细胞静脉内注射之前24小时，用300拉德(rad)的全身辐射对受体小鼠进行了亚致死辐射。在细胞移植后24小时，用TNBS灌肠剂对所有小鼠进行了处理。结肠炎的临床的、宏观的和组织学的参数是如下文所述在结肠炎诱导后14日确定的。
表3
实验组和对照组
 组 NK1.1缺失 供给的抗原 直肠激发 脾细胞供体
 供体：
 G + BSA TNBS -
 H - BSA TNBS -
 I + CEP TNBS -
 J - CEP TNBS -
 K + BSA NS -
 L - BSA NS -
 G’ - - TNBS G
 H’ - - TNBS H
 I’ - - TNBS I
 J’ - - TNBS J
 K’ - - TNBS K
 L’ - - TNBS L
BSA：牛血清白蛋白
CEP：结肠炎提取的蛋白质
TNBS：2，4，6-三硝基苯磺酸
结肠炎的临床评估
在来自用小鼠CEP供给的J’组的耐受化小鼠的耐受化细胞的受体及在J组的耐受化小鼠中观察到腹泻的显著降低。相反地，来自H’组的非耐受化的脾细胞受体和来自H组用BSA供给的小鼠患有严重的腹泻。对小鼠体重的探究揭示与H和H’组的非耐受化小鼠相比，在J和J’组的耐受化小鼠中有统计学显著的体重增加(分别为10.8％和11.2％对5.7和5.5％，p＜0.005)。
来自G’组NK1.1缺失小鼠的脾细胞受体及其来自G组的供体患有与H和H’组的非耐受化小鼠相比较轻的腹泻。来自两组(G和G’)的小鼠显示体重的增加(分别为9.9％和10.2％对5.7％和5.5％，p＜0.005)。相反地，来自I’组NK1.1-缺失小鼠的脾细胞受体导致耐受性作用的丧失。在其供体(I组)中观察到了相似的作用。这些小鼠当与H和H’组相比时显示轻的腹泻，然而比非-NK1.1缺失的对照要严重。相似地，在两组小鼠中均未观察到体重的显著增加(与J和J’组的耐受化小鼠相比，对于I和I’组的小鼠分别为6.0％和5.1％，p＜0.005)。
来自K和L组的小鼠未用TNBS激发，且不显示疾病的临床证据。其体重分别增加了11.4％和12.3％。相反地，来自K’和L’组的小鼠发展了严重的腹泻，且其体重仅分别增加了4.5％和5.2％。
结肠炎的宏观分级
通过供给小鼠提取的源自结肠炎的蛋白质而导致的口服耐受性诱导(J组)和耐受化淋巴细胞的过继转移(J’组)显著地减轻了结肠炎的宏观分级。检验的结肠炎宏观参数的分数为：结肠溃疡程度；肠和腹膜粘着；器壁的厚度和粘膜水肿的程度。与分别为H和H’组的非耐受化小鼠的3.22±0.15和3.32±0.26相比，总的宏观分数在J和J’组中分别为0.31±0.24和0.3±0.25。来自G组的NK1.1缺失小鼠及其来自G’组的淋巴细胞受体显示疾病的减轻(分别为0.8±0.4和0.85±0.5)。相反地，来自I组的NK1.1缺失小鼠及其淋巴细胞受体(I’组)表明严重的结肠炎(分别为3.72±0.22和3.77±0.6，p＜0.005)。来自K’和L’组的小鼠显示严重结肠炎的证据(分别为3.4±0.29和3.27±0.22)。
组织学损害的分级
对肠组织的组织学评估显示在J和J’组的耐受化小鼠中炎症反应和粘膜溃疡有显著的减少，其组织学分数分别为1.8和1.7。在这些小鼠中，探测到了几乎正常的切片，或仅有最小的淋巴细胞渗入。相反地，在从具有组织学分数3.3和3.08(分别为H和H’组，p＜0.005，图8)的H和H’组非耐受化小鼠中获取的肠标本中观察到严重的炎症反应。在G组非耐受化的NK1.1-缺失小鼠及其脾细胞受体(G’组)中探测到了炎症反应和粘膜溃疡显著的减少。G和G’组的组织学分数分别为2.08和2。来自I组的NK1.1-缺失小鼠及其淋巴细胞受体(I’组)表明严重的结肠炎。I和I’组的小鼠的分数分别为2.9和2.5。K和L组未用TNBS进行直肠激发。来自K’和L’组的小鼠分别显示具有分数3.1和3的严重结肠炎的证据。
实施例5
NK1.1+淋巴细胞在耐受化小鼠中增加了CD4+IL4+/CD4+IFNγ+比例而在具有实验性结肠炎的非耐受化小鼠中降低了CD4+IL4+/CD4+IFNγ+比例
耐受化小鼠
耐受化和非耐受化受体小鼠之间CD4+IL4+/CD4+IFNγ+比例的比较揭示所有耐受化组中较高的比例。来自J’组的耐受化受体小鼠与H’中非耐受化小鼠相比显示了显著较高的比例。CD4+IL4+/CD4+IFNγ+比例分别为：2.16和0.55(p＜0.005)。
来自耐受化小鼠的淋巴细胞的过继转移增加了受体小鼠中的CD4+IL4+/CD4+IFNγ+比例。流式细胞仪分析已经显示与从耐受化的非缺失小鼠收获的脾细胞相比，来自NK1.1-缺失CEP供给的供体小鼠的脾细胞的过继转移降低了CD4+IL4+/CD4+IFNγ+比例(对于I’和J’组分别为0.58对2.16，p＜0.005，图9)
非耐受化小鼠
非耐受化淋巴细胞的过继转移降低了受体小鼠中的CD4+IL4+/CD4+IFNγ+比例。与耐受化组相反，NK1.1-缺失对具有实验性结肠炎的非耐受化小鼠具有相反的作用。流式细胞仪分析已经显示与从非耐受化的非NK1.1-缺失小鼠收获的脾细胞相比，来自NK1.1-缺失的非耐受化供体小鼠的脾细胞的过继转移增加了CD4+IL4+/CD4+IFNγ+比例(在G’和H’组中分别为1.7对0.55，p＜0.005，图9和表4)。图10表示IL4和IFNγ在分离的淋巴细胞上表达的代表性结果，这些淋巴细胞分别来自耐受化的NK1.1非缺失和缺失供体的受体，及来自非耐受化的NK1.1非缺失和缺失供体的受体(G’～J’组)。
表4
耐受化的和非耐受化的、NK1.1-缺失的和非缺失的脾细胞的过继转移对CD4+IL4+/CD4+IFNγ+比例的影响
 受体： 供体：  CD4+IL4+/CD4+IFNγ+比例
 G’ G  1.7
 H’ H  0.55
 I’ I  0.58
 J’ J  2.16
 K’ K  1.13
 L’ L  0.69
从对照淋巴细胞的过继转移
流式细胞仪分析已经显示与非NK1.1-缺失的供体小鼠相比，来自对照NK1.1-缺失小鼠的脾细胞的过继转移增加了CD4+IL4+/CD4+IFNγ+比例(在K’和L’组中分别为1.13对0.69，p＜0.005)。
实施例6
由于NK1.1的肝淋巴细胞细胞毒性
在这些研究中YAC-1细胞以100∶1、50∶1和10∶1的E∶T比例用作目标细胞。研究是用肝淋巴细胞进行的，该肝淋巴细胞分离自NK1.1缺失的和非缺失的耐受化和非耐受化小鼠的受体。来自非耐受化的非-NK1.1缺失小鼠的受体(H’组)与其他的组12.37％的溶胞相比几乎不显示细胞毒性作用(100∶1 E∶T，图11)。来自G’组中非耐受化的NK1.1缺失小鼠的受体显示比H’组更高的溶胞作用，分别为20.4％对12.37％的细胞毒性。来自I’组中NK1.1缺失CEP供给小鼠的受体显示比J’组中非NK1.1缺失小鼠更低的溶胞作用(分别为42.58％对46.98％的细胞毒性)。来自对照组的受体对于与L’组比较的K’组小鼠分别具有23.1％对22.47％的细胞毒性(p＜0.005，图11)。
细胞因子测定
从两组各三份中收集上清液流体，且对于来自所有耐受化和非耐受化组的所有小鼠测量了细胞因子水平。IL4、IL10和IFNγ水平是通过“三明治”ELISA进行测量的。耐受化的小鼠表明从Th1到Th2免疫反应细胞因子释放的改变。这些小鼠(H组)显示IL4、IL10水平的增加和IFNγ水平的降低。相反地，来自非耐受化组(G、J、K组)的小鼠显示高的IFNγ水平和低的IL10水平。从H组的耐受化小鼠中收获的淋巴细胞揭示了与耐受化组K中NK1.1-缺失小鼠相比显著较高的IL4、IL10水平和较低的IFNγ水平(分别为18.4±3.7、23.1±2.9和5.1±0.4对2.9±0.6、0.8±0.1和19.8±3.8，图12)。相反地，NK1.1缺失在不存在抗原时在来自G和J组的非耐受化小鼠中诱导了IFNγ水平的增加和IL4、IL10水平的降低(分别为24.3±3.7、3.1±0.9和4.6±0.4对18.3±1.1、3.2±0.1和2.1±0.4，图12)。
实施例7
NK T淋巴细胞的来自体内的免疫程序
如由前面实施例所显示的，通过供给小鼠提取的源自结肠炎的蛋白质而导致的口服耐受性的诱导与非耐受化小鼠相比显著地减轻了结肠炎的不同症状(结肠炎的宏观分级、严重的腹泻、炎症反应和粘膜溃疡)。
因此，本发明者进行了如下实验，目的在于确定NK T细胞的体外/来自体内免疫程序的可能性，这是通过检查来自体内训导的细胞具体而言地为NK细胞是否可减轻动物中不同的结肠炎症状，该动物患有诱导的结肠炎并且未接受任何口服耐受性治疗。
8个不同组合(CD4、CD8、脾细胞和树突细胞，如在表5中所列出的)的不同细胞亚型是从下面6个实验组的每一个来制备的：
1.从无结肠炎和无治疗(口服耐受性)的对照动物中收获的细胞。这些细胞来自体内地与BSA温育。
2.从具结肠炎和无治疗(口服耐受性)的对照动物中收获的细胞。这些细胞来自体内地与BSA温育。
3.从具结肠炎和通过口服耐受性治疗的动物中收获的细胞。这些细胞在体外与BSA温育。
4.从无结肠炎和无治疗(口服耐受性)的对照动物中收获的细胞。这些细胞来自体内地与CEP温育。
5.从具结肠炎和无治疗(口服耐受性)的对照动物中收获的细胞。这些细胞来自体内地与CEP温育。
6.从具结肠炎和通过口服耐受性治疗(口服耐受性)的动物中收获的细胞。这些细胞来自体内地与CEP温育。
表5：
细胞类型和组合的不同实验亚组
不同的亚组 细胞类型或细胞组合
A”组 CD4细胞
B”组 CD8细胞
C”组 脾细胞
D”组 树突细胞(DC)
E”组 NK T细胞
F”组 NK T+CD4
G”组 NK T+CD8
H”组 NK T+DC
应注意的是来自实验组1、2和3的细胞是在BSA存在时在体外温育的，并因此充当对照，而实验组4、5和6的细胞则在抗原(CEP)存在时在体外温育，并因此充当检验组。来自体内的训导是通过测量IL10由不同处理的细胞的分泌(与IFN·分泌相比较的)来检查的。
应理解的是不同的细胞类型或细胞组合(亚组A”～H”)是显示通过与抗原温育的来自体内训导的可行性的主要检验组，这些细胞类型或细胞组合从患有结肠炎的动物来制备，该结肠炎未被治疗(口服耐受性)但在CEP存在时在体外进行了温育(亚组5A”～5H”)。如由表6所示的，在疾病关联抗原存在时培养NK1.1+T细胞(E”5亚组)导致与由增加的IL10分泌所表明的耐受化细胞相似的细胞因子模式。
在CD4细胞和抗原的培养中观察到了相似的模式(亚组A”5)。这些结果显示通过将细胞向与疾病有关联的抗原暴露而成功地进行了来自体内的训导。然而，在抗原存在时多于一种细胞类型的组合减少了这种需要的作用，这是因为通过抗原的NK T训导被CD4、CD8或DC的添加防止(分别为F”5、G”5和H”5亚组)。
除通过与疾病关联抗原温育的NK T细胞来自体内训导的可行性之外，本发明者检查了NK T细胞与其他细胞类型的共培养是否导致由IL10升高的分泌所反映的预期来自体内的训导。如由表6所示的，只有从 耐 受化小鼠获得的NK T细胞和CD4或CD8细胞的组合导致IL10升高的分泌(分别为F3和G3亚组)。来自耐受化小鼠的NK T和CD4细胞以及使其来自体内地暴露于抗原具有相似的作用(F6亚组)，然而当检查了来自耐受化小鼠组合的NK T CD8时，抗原的存在显著地减少了IL10的分泌(G6亚组)。
然而，NK T细胞与树突细胞的共培养未能诱导任何检查的组合中的IL10分泌(H3至H6亚组)。
实验组和对照组
 组 TNBS结肠炎 分离的淋巴细胞  供给的抗原  平板中的抗原 IFN· IL10
 A″1 - CD4  BSA  BSA 4000 1450
 A″2 + CD4  BSA  BSA 36 200
 A″3 + CD4  CEP  BSA 0 53
 A″4 - CD4  BSA  CEP 0 0
 A″5 + CD4  BSA  CEP 0 270
 A″6 + CD4  CEP  CEP 0 66
 B″1 - CD8  BSA  BSA 4000 1500
 B″2 + CD8  BSA  BSA 0 305
 B″3 + CD8  CEP  BSA 50 165
 B″4 - CD8  BSA  CEP 0 0
 B″5 + CD8  BSA  CEP 0 54
 B″6 + CD8  CEP  CEP 0 98
 C″1 - 脾细胞  BSA  BSA 0 0
 C″2 + 脾细胞  BSA  BSA 230 160
 C″3 + 脾细胞  CEP  BSA 0 306
 C″4 - 脾细胞 BSA  CEP 0 0
 C″5 + 脾细胞 BSA  CEP 0 34
 C″6 + 脾细胞 CEP  CEP 0 420
 D″1 - DC BSA  BSA 240 120
 D″2 + DC BSA  BSA 4000 720
 D″3 + DC CEP  BSA 4000 920
 D″4 - DC BSA  CEP 0 0
 D″5 + DC BSA  CEP 140 170
 D″6 + DC CEP  CEP 30 280
 E″1 - NK T BSA  BSA 0 0
 E″2 + NK T BSA  BSA 0 52
 E″3 + NK T CEP  BSA 0 230
 E″4 - NK T BSA  CEP 0 14
 E″5 + NK T BSA  CEP 38 340
 E″6 + NK T CEP  CEP 0 60
 F″1 - NK T+CD4 BSA  BSA 0 15
 F″2 + NK T+CD4 BSA  BSA 150 0
 F″3 + NK T+CD4 CEP  BSA 0 360
 F″4 - NK T+CD4 BSA  CEP 29 28
 F″5 + NK T+CD4 BSA  CEP 0 0
 F″6 + NK T+CD4  CEP  CEP 0 300
 G″1 - NK T+CD8  BSA  BSA 18 98
 G″2 + NK T+CD8  BSA  BSA 0 12
 G″3 + NK T+CD8  CEP  BSA 0 350
 G″4 - NK T+CD8  BSA  CEP 0 0
 G″5 + NK T+CD8  BSA  CEP 0 0
 G″6 + NK T+CD8  CEP  CEP 0 19
 H″1 - NK T+DC  BSA  BSA 0 100
 H″2 + NK T+DC  BSA  BSA 4000 270
 H″3 + NK T+DC  CEP  BSA 0 98
 H″4 - NK T+DC  BSA  CEP 0 0
 H″5 + NK T+DC  BSA  CEP 0 0
 H″6 + NK T+DC  CEP  CEP 44 80
BSA：牛血清白蛋白
CEP：结肠炎提取的蛋白质
TNBS：2，4，6-三硝基苯磺酸
DC：树突细胞
本发明的实施例显示耐受化脾细胞向初次实验小鼠的过继转移诱导了耐受性，这是因为假定转移了Th2特异性记忆细胞。相反地，来自NK1.1缺失的CEP供给小鼠的淋巴细胞过继转移未能转移耐受性，且增量调节了炎症Th1介导的反应。发现NK1.1+T细胞快速地生产IL4，并在实验性变应性脑脊髓炎和在糖尿病NOD小鼠模型的自身免疫中起调节作用[Bendelac，A.等人，Annu Rev Immunol 15：535-562(1997)；Sakamoto，A.等人，J Allergy Clin Immunol 103(5 pt 2)：s445-51(1999)；Seki，S.等人，J Immunol 147：1214-1221(1991)]。然而，在口服耐受性诱导终止时的NK1.1 T细胞缺失与耐受化的非缺失NK1.1 T细胞小鼠相比影响了降低CD4+IL4+/CD4+IFNγ+比例的细胞因子分泌类型。本发明的结果认为NK1.1 T细胞可通过IFNγ促炎或通过IL4抗炎细胞因子分泌而影响免疫反应的Th1/Th2特点。在两种情况下，其影响远远大于常规的CD4+T细胞的影响[Chen，H.等人，J Immunol 159：2240-2249(1997)]。
此外，本发明者进一步显示NK T细胞的来自体内训导是可行的。因为NK T细胞在体外向疾病定向抗原的暴露使得训导这些细胞能够偏向抗炎IL10分泌模式。
总之，NK1.1+淋巴细胞在免疫调节和在使免疫反应在免疫原性或耐受原性方向转变中起双重作用。在其中它们变成活化的环境、不同类型的刺激或信号受体可确定其功能。值得注意的是参与独特的免疫调节机制的NK1.1+T细胞在免疫介导的病症中调节效应细胞的类型和Th1/Th2范例。
总之，NK1.1+淋巴细胞在免疫调节和在使免疫反应在免疫原性或耐受原性方向转变中起双重作用。在其中它们变成活化的环境、不同类型的刺激或信号受体可确定其功能。值得注意的是参与独特的免疫调节机制的NK1.1+T细胞在免疫介导的病症中调节效应细胞的类型和Th1/Th2范例。

Claims (55)

1.一种在需要这种治疗的哺乳动物被试者中对免疫相关病症治疗的方法，该方法是通过在该被试者中处理NK T细胞群体而实现的，其中对NK T细胞群体的该处理导致调节Th1/Th2细胞平衡偏向抗炎细胞因子生产细胞，该调节是由该被试者免疫系统的不同成分介导的。
2.根据权利要求1的方法，其中该成分选自细胞免疫反应元件、体液免疫反应元件和细胞因子。
3.根据权利要求1的方法，其中该处理是通过使该NK T细胞群体缺失而进行的。
4.一种根据权利要求1的在哺乳动物被试者中治疗免疫相关病症的方法，该方法包含以下步骤：
a.从该被试者中获得NK T细胞；
b.来自体内训导在步骤(a)中获得的NK T细胞，从而结果所得的训导的NK T细胞具有调节Th1/Th2细胞平衡偏向抗炎细胞因子生产细胞的能力；和
c.将步骤(b)中获得的训导的NK T细胞再次引入该被试者，从而导致IL4和IL10中任何一个与IFNγ之间的数量比例的增加，其中所述NK T细胞能够调节Th1/Th2细胞平衡偏向抗炎细胞因子生产细胞。
5.一种根据权利要求4的方法，其中步骤(b)的所述来自体内的训导可通过在下面任何一个存在时培养所述NK T细胞而进行：
a.与该免疫相关病症有关联的抗原或其任意组合；
b.耐受化的或非耐受化的患该免疫相关病症的被试者的或所述被试者的至少一种肝关联细胞；
c.至少一种细胞因子、粘着分子或其任意组合；和
d.上述(a)、(b)和(c)的任何一个的组合。
6.根据权利要求5的方法，其中该来自体内的训导是通过在与该免疫相关病症有关联的抗原存在时培养该NK T细胞而进行的。
7.根据权利要求6的方法，其中该抗原是从患该免疫相关病症的供体被试者中获取的同种异型抗原、异源抗原、自身抗原和重组制备的抗原中的任何一个及其任意组合。
8.根据权利要求5的方法，其中该肝关联细胞选自肝巨嗜细胞、星形细胞、肝内皮细胞、肝关联干细胞和任何其他的肝相关淋巴细胞。
9.根据权利要求5的方法，其中该细胞因子选自IL4、IL10、TGFβ、IFNγ、IL12、IL2、IL18和IL15。
10.根据权利要求5的方法，其中该粘着分子选自整合蛋白、选择蛋白和ICAM。
11.根据权利要求4的方法，其中该训导的NK T细胞是通过过继转移再次引入到该被试者中的。
12.根据权利要求4和8中任何一项的方法，可选择地进一步包含在该被试者中引起对免疫相关病症的免疫调节的步骤，这可通过向该被试者给予源自患该免疫相关病症的同种异型供体的、异源来源的和自身来源的成分、细胞、组织和/或器官，及免疫功能等价物或其组合而实现。
13.根据权利要求12的方法，其中该成分、细胞、组织或器官是口服的。
14.根据权利要求1～13中任何一项的方法，其中该免疫相关病症是肠炎(IBD)。
15.根据权利要求14的方法，其中该疾病是克罗恩病。
16.根据权利要求1～13中任何一项的方法，其中该免疫相关病症是选自黑素瘤、癌、淋巴瘤和肉瘤的恶性肿瘤。
17.根据权利要求14～16中任何一项的方法，其中该哺乳动物被试者是人类患者。
18.根据权利要求17的方法，其中该NK T细胞是表达CD56标记的NK T细胞。
19.一种在哺乳动物被试者中治疗免疫相关病症的治疗组合物，该组合物包含来自体内训导的自身NK T细胞作为有效成分，该细胞能够调节Th1/Th2细胞平衡偏向抗炎细胞因子生产细胞，所述组合物可选择地进一步包含药物可接受的载体、稀释剂、赋形剂和/或添加剂。
20.一种权利要求19的治疗组合物，其中该训导自身NK T细胞介导IL4和IL10中任何一个与IFNγ之间的数量比例的增加。
21.根据权利要求20的治疗组合物，其中该训导的自身NK T细胞可通过在下面任何一个存在时来自体内的培养而获得：
a.与该免疫相关病症有关联的抗原或其任意组合；
b.耐受化的或非耐受化的患该免疫相关病症的患者的或该被试者的至少一种肝关联细胞；
c.至少一种细胞因子或粘着分子；和
d.上述(a)、(b)和(c)的任何一个的组合。
22.根据权利要求21的治疗组合物，其中该训导的自身NK T细胞是在与该免疫相关病症有关联的抗原存在时通过来自体内的培养而获得的。
23.根据权利要求22的治疗组合物，其中该抗原是来自患该免疫相关病症的供体的同种异型抗原、异源抗原、来自该被试者的自身抗原和重组制备的抗原中的任何一个或其任意组合。
24.根据权利要求21的治疗组合物，其中该肝关联细胞选自肝巨嗜细胞、星形细胞、肝内皮细胞和任何其他的肝相关淋巴细胞。
25.根据权利要求21的治疗组合物，其中该细胞因子选自IL4、IL10、TGFβ、IFNγ、IL12和IL15。
26.根据权利要求21的治疗组合物，其中该粘着分子选自整合蛋白、选择蛋白和ICAM。
27.根据权利要求19～26中任何一项的治疗组合物，其中该免疫相关病症是肠炎症疾病。
28.根据权利要求27的治疗组合物，其中该肠炎症疾病是克罗恩病。
29.根据权利要求19～26中任何一项的治疗组合物，其中该免疫相关病症是选自黑素瘤、癌、淋巴瘤和肉瘤的恶性肿瘤。
30.训导的自身NK T细胞在制造治疗组合物中的用途，该治疗组合物用于在患免疫相关病症的哺乳动物被试者中调节Th1/Th2细胞平衡偏向抗炎细胞因子生产细胞。
31.训导的自身NK T细胞在制造治疗组合物中的用途，该治疗组合物用于治疗哺乳动物被试者中的免疫相关病症，该训导的自身NK T细胞能够调节Th1/Th2细胞平衡偏向抗炎细胞因子生产细胞。
32.根据权利要求30和31中任何一项的用途，其中该训导的自身NKT细胞介导IL4和IL10中任何一个与IFNγ之间的数量比例的增加。
33.根据权利要求32的用途，该用途是在制造根据权利要求19～26中任何一项的治疗组合物中的用途。
34.一种用于在需要这种治疗的哺乳动物被试者中治疗免疫相关病症的来自体内训导的自身NK T细胞。
35.根据权利要求34的训导的NK T细胞，其中该训导的NK T细胞在下面任何一个存在时进行来自体内的培养：
a.与该免疫相关病症有关联的抗原或其任意组合；
b.耐受化的或非耐受化的患该免疫相关病症的患者的或该被试者的至少一种肝关联细胞；
c.至少一种细胞因子或粘着分子；和
d.上述(a)、(b)和(c)的任何一个的组合。
36.根据权利要求35的训导的NK T细胞，其中该抗原是来自患该免疫相关病症的供体的同种异型抗原、异源抗原、该被试者的自身抗原和重组制备的抗原中的任何一个或其任意组合。
37.根据权利要求35的训导的NK T细胞，其中该肝关联细胞选自肝巨嗜细胞、星形细胞、肝内皮细胞和任何其他的肝相关淋巴细胞。
38.根据权利要求35的训导的NK T细胞，其中该细胞因子选自IL4、IL10、TGFβ、IFNγ、IL12和IL15。
39.根据权利要求35的训导的NK T细胞，其中该粘着分子选自整合蛋白、选择蛋白和ICAM。
40.根据权利要求35的训导的NK T细胞，其中该免疫相关病症是肠炎症疾病。
41.根据权利要求40的训导的NK T细胞，其中该肠炎症疾病是克罗恩病。
42.根据权利要求35的训导的NK T细胞，其中该免疫相关病症是选自黑素瘤、癌、淋巴瘤和肉瘤的恶性肿瘤。
43.来自体内训导的自身NK T细胞在需要这种治疗的哺乳动物被试者中治疗免疫相关病症的用途。
44.根据权利要求43的用途，其中该训导的自身NK T细胞是根据权利要求35～39中任何一项的。
45.一种治疗免疫相关病症的治疗组合物，该治疗组合物包含特异性识别NK T细胞的抗体作为有效成分。
46.根据权利要求45的治疗组合物，其中该免疫相关病症是肠炎症疾病。
47.根据权利要求46的治疗组合物，其中该肠炎症疾病是克罗恩病。
48.根据权利要求45的治疗组合物，其中该免疫相关病症是选自黑素瘤、癌、淋巴瘤和肉瘤的恶性肿瘤。
49.特异性识别NK T细胞的抗体在制造治疗组合物中的用途，该治疗组合物用于在患有免疫相关病症的哺乳动物被试者中处理NK T细胞群体。
50.根据权利要求49的用途，其中该处理是对该NK T细胞群体的缺失。
51.根据权利要求50的用途，其中该NK T细胞群体的缺失导致调节Th1/Th2细胞平衡偏向抗炎细胞因子生产细胞。
52.根据特异性识别NK T细胞的抗体的用途，用于制造治疗组合物，该治疗组合物用于在哺乳动物被试者中治疗免疫相关病症。
53.根据权利要求49～52中任何一项的用途，其中该免疫相关病症是肠炎症疾病。
54.根据权利要求53的用途，其中该肠炎症疾病是克罗恩病。
55.根据权利要求49～54中任何一项的用途，其中该免疫相关病症是选自黑素瘤、癌、淋巴瘤和肉瘤的恶性肿瘤。
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