CN1925843A - 生产单克隆抗体的方法和组合物 - Google Patents

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L·塔马金
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Abstract

本发明包括制备单克隆抗体的组合物和方法。本发明进一步包括复制免疫系统成分的载体，所述免疫系统成分特别是免疫突触的抗原呈递细胞(APC)元件。另外，本发明可以进一步包括合成的T细胞。

Description

生产单克隆抗体的方法和组合物
发明领域
本发明总的来说涉及免疫学。本发明进一步涉及生产单克隆抗体的方法和组合物，和体外生产这种抗体的方法。
发明背景
将所需试剂导入特异性靶细胞长时间以来对科学家来说已是一种挑战。试剂特异性靶向的挑战是使生物靶细胞得到足够量的试剂或正确试剂，而不使生物其余部分过多暴露于所述试剂。递送特异性试剂的非常希望的靶是免疫系统。免疫系统是包括很多具有不同活性的不同类型细胞的复杂的身体反应系统。一部分免疫系统的活化通常由于系统的其他相关部分不需要的活化而引起各种反应。目前，没有通过靶向免疫系统特异性成分产生特别希望的反应的令人满意的方法或组合物。
免疫系统是包括各式各样成分的复杂的身体相互作用系统，所述成分包括细胞和细胞因子，它们与来自身体内部和身体外部的刺激相互作用。除直接作用以外，免疫系统的反应也受到身体其他系统的影响，包括神经、呼吸、循环和消化系统。
免疫系统的一个众所周知方面是它对侵入生物、体内细胞改变或由接种疫苗呈递的外来抗原产生反应的能力。对免疫系统的这种活化产生反应的一些第一类型细胞是吞噬细胞和天然杀伤细胞。吞噬细胞除其他细胞外包括单核细胞、巨噬细胞和多形核嗜中性白细胞。这些细胞通常与外来抗原结合，内在化它并常常破坏它。它们也产生介导其他免疫反应的可溶分子，所述免疫反应如炎症反应。天然杀伤细胞可以识别并破坏某些病毒感染的胚胎和肿瘤细胞。免疫反应的其他因子包括补体途径，它能够独立应答外来抗原或与细胞或抗体一起作用。
对于接种很重要的免疫系统的一个方面是免疫系统对特定病原体或外来抗原的特异性反应。反应的一部分包括对于所述外来抗原的“记忆”的确立。第二次接触后，记忆功能允许对外来抗原产生更快和通常更大的反应。淋巴细胞与其他细胞和因子一起在记忆功能和反应中起着重要作用。
通常，人们认为对抗原的反应包括体液反应和细胞反应。体液免疫反应是由非细胞因子介导的，该因子是由细胞释放的且发现在血浆或细胞内流体中可能游离或可能不游离。免疫系统体液反应的主要成分是由B淋巴细胞产生的抗体介导的。由细胞相互作用产生细胞介导的免疫反应，所述细胞包括抗原呈递细胞和B淋巴细胞(B细胞)和T淋巴细胞(T细胞)。
免疫反应能力的最广泛利用的一个方面是单克隆抗体的生产。20世纪70年代中期单克隆抗体(Mab)技术的来临提供了有价值的新治疗和诊断工具。研究人员和临床医师首次可以使用能够与预定抗原部位结合和具有各种免疫效应功能的无限量均一抗体。目前，生产单克隆抗体的技术是本领域熟知的。
这些单克隆抗体被认为在医学和诊断学中拥有巨大前景。不幸的是，由于单克隆抗体治疗中所固有的问题，基于这些蛋白的治疗产品的开发受到了限制。例如，大多数单克隆抗体是从小鼠得到的，且因此，不能很好固定人补体。当用于人时，它们也缺乏其他重要的免疫球蛋白功能特征。
使用单克隆抗体最大的缺点是非人单克隆抗体当注射给人患者时具有免疫原性的事实。注射外来抗体后，患者增加的免疫反应可能相当强烈。免疫反应导致外来抗体的迅速消除，从而在初步治疗后，基本上消除抗体的治疗效用。不幸的是，一旦免疫系统对外来抗体起反应而致敏，用相同或不同非人抗体的随后治疗可能无效或甚至危险。
小鼠可以容易地用外来抗原免疫以产生许多高亲和力抗体。然而，由于小鼠抗体在人体中的呈递，鼠抗体导入人将引起人抗小鼠抗体(HAMA)反应的产生。在患者中使用鼠抗体通常限于数天或数周的期限。更长的治疗时间段可能引起过敏反应。此外，一旦患者中发展了HAMA，它就常常阻止用于诊断或治疗目的的鼠抗体的未来的使用。
为克服HAMA反应的问题，研究人员已尝试了修饰非人抗体的几个方法，以使得它们像人的。这些方法包括小鼠/人嵌合、人源化和灵长类动物源化(primatization)。制备更像人抗体的早期工作使用组合兔和人抗体。抗体的蛋白亚单位，兔Fab片段和人Fc片段通过蛋白二硫键相连形成新人工蛋白分子或嵌合抗体。
已经使用重组分子生物技术来产生嵌合抗体。使用重组DNA技术构建编码小鼠抗体可变轻链和重链结构域和人抗体轻链(LC)和重链(HC)恒定结构域的DNA序列之间的基因融合，以允许嵌合抗体表达。这些嵌合抗体含有很多非人氨基酸序列并且对人具有免疫原性。暴露于这些嵌合抗体的患者产生人-抗嵌合体抗体(HACA)。HACA针对鼠V区，且还可以针对重组嵌合抗体中存在的新V区/C区(恒定区)接头。
为了克服嵌合抗体的免疫原性呈现的一些限制，使用分子生物学技术来产生人源化或重构抗体。编码鼠单克隆抗体的抗原结合部分或互补决定区(CDRs)的DNA序列通过分子学方式嫁接到编码人抗体重链和轻链构架的DNA序列上。人源化Mabs比嵌合Mabs含有更大百分比的人抗体序列。包含大约90％人抗体和10％小鼠抗体的最终产物在人抗体上含有小鼠结合部位。为了保留正确的形状和由此保留对靶抗原的结合亲和力，它还含有来自小鼠Mab向人源化Mab构架的某些氨基酸置换。
在实践中，用鼠CDRs简单置换人CDRs不足以产生保留原始鼠抗体特异性的有效人源化抗体。有在人可变区中包含少量决定性鼠抗体残基的另外需求。这些残基的特性取决于原始鼠抗体和受体人抗体两者的结构。正是这些鼠抗体残基的存在有助于在患者中产生HACA反应，从而引起单克隆抗体的迅速清除和过敏反应的担忧。
将另一个技术，称作重修表面(resurfacing)技术，用于人源化小鼠抗体。重修表面包括在一种方法中用人抗体表面替换小鼠抗体表面，所述方法比其他人源化技术更快和更有效。这个技术提供了通过仅仅人源化重组体Fv V区表面上可接近的那些氨基酸，使鼠单克隆抗体重设计以类似人抗体的方法。鼠单克隆抗体的重修表面可以维持重构形式的原始小鼠单克隆抗体的抗体亲抗原性，因为保留了天然的构架-CDR相互作用。这些抗体也有由于它们的小鼠来源而具有抗原性的问题。
其他技术使用灵长类动物，而不是小鼠的序列来人源化Mabs。这个方法的基本原理称作灵长类动物源化，是灵长类动物抗体可变区中的大部分序列与人的序列无法区分。治疗类风湿性关节炎和严重哮喘的灵长类动物源化抗CD4 Mabs正在开发。然而，这些Mabs对于患者的免疫系统仍然是外来蛋白并引起免疫反应。
在避免对外来蛋白的免疫反应的努力中，各种制备仅含有人抗体成分的人Mabs的方法正在开发。一个方法是分离天然产生抗所需抗原的抗体的人B细胞克隆并使其在三体瘤(trioma)细胞培养系统中生长。因为人抗体仅仅抗对宿主是外来的抗原，所以人B细胞无一产生抗人抗原的抗体。因此，这个方法对产生抗人蛋白抗原的Mabs无用。
产生人Mabs的两个其他方法是噬菌体展示和转基因小鼠的使用。噬菌体展示技术利用人制备抗任何可能结构的抗体的能力。这个技术使用来自很多个体的抗体基因来产生大的噬菌体抗体文库，每个噬菌体都在其表面展示功能性抗体可变结构域。从这个文库，根据它们结合所需抗原的能力选择单个可变结构域。通过分子生物学技术，将具有所需结合特征的抗体可变结构域和能最好地满足潜在人治疗产物的恒定结构域组合产生Mab。这个技术仍缺乏抗原特异性。噬菌体文库无法含有针对任何和所有所需抗原的每个结合区。它还可能含有缺乏特异性的结合区。因此，这个技术可能需要相当大的工程以使抗体亲和力增加至有效水平。
转基因小鼠也用于产生“人”抗体。转基因小鼠是通过用人免疫球蛋白基因座取代小鼠免疫球蛋白基因座而产生的。这个方法可能提供优于噬菌体展示技术的优点，因为它利用小鼠体内亲和力成熟机构。
产生人或人样Mabs的所有当前技术都不足以提供对所述抗原是抗原特异性的物种特异性抗体。嵌合抗体具有保留鼠抗体特异性和刺激人Fc依赖性补体固定和细胞介导的细胞毒性的优点。然而，这些嵌合抗体的鼠可变区仍可以引起HAMA反应，因此限制了嵌合抗体作为诊断和治疗剂的价值。
疫苗可能针对任何外来抗原，无论其来自另一种生物、改变的细胞，还是正常“自身”细胞中诱导的外来属性。外来抗原的施用途径可以帮助确定产生的免疫反应类型。例如，将抗原递送至粘膜表面，如经口接种活脊髓灰质炎病毒，刺激免疫系统以产生粘膜表面的免疫反应。注射抗原到肌肉组织常常促进长效IgG反应的产生。
疫苗通常可以分为两个类型，全疫苗和亚单位疫苗。全疫苗可以由已被灭活或减毒或杀死的病毒或微生物产生。活减毒疫苗具有模拟足以触发类似于对野生型生物的反应的免疫反应的自然感染的优点。这种疫苗通常提供高水平的保护，尤其是如果通过自然途径施用，且一些疫苗可能仅需要一剂即可给予免疫性。一些减毒疫苗的另一个优点是它们提供群体成员间人到人的传递。然而，这些优点与几个缺点相抵。一些减毒疫苗具有有限的保存期限和在热带环境中不易贮藏。还有一种可能性，即苗将回复到毒性野生型生物，从而引起有害甚至危及生命的疾病。减毒疫苗的使用在免疫缺陷状态，如AIDS和妊娠中禁忌。
杀死的疫苗是更安全的，因为它们无法回复毒力。它们在运输和贮藏过程中通常更稳定并适于在无免疫应答的患者中使用。然而，它们比活减毒疫苗低效，从而通常需要一剂以上。另外，它们不提供群体成员间人到人的传递。
亚单位疫苗的生产需要关于疫苗应针对的微生物或细胞的表位的知识。设计亚单位疫苗中的其他考虑是亚单位的大小和亚单位多好地代表了全部微生物菌株或细胞。由于在生产全细菌疫苗中遭遇的问题和与使用它们相关的副作用，开发细菌疫苗的当前焦点已转变为亚单位疫苗的生产。这种疫苗包括基于Vi荚膜多糖的伤寒疫苗和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)的Hib疫苗。
因为与减毒疫苗的使用相关的安全考虑和杀死的疫苗的低功效，本领域需要增强疫苗功效的组合物和方法。本领域还需要增强免疫系统的组合物和方法，它们刺激体液和细胞介导的反应。本领域进一步需要免疫反应的选择性调节和操纵免疫系统的各种成分以产生所需的反应。另外，对于更迅速的活化反应，需要可以促进和扩大免疫反应的方法和组合物。对用仅一剂就能提供保护的疫苗接种人和动物群体的能力的需要增加。
需要的是将特异性试剂的递送仅靶向至靶细胞的组合物和方法。这种组合物和方法应该能把治疗剂有效递送至靶细胞。还需要的是在体外和体内系统两者中都可以使用的组合物和方法。
还有对单克隆抗体的组合物和生产它们的改进方法的普遍需要。有对生产对预定抗原具有亲和力的人抗体的方法的具体需要。这些人免疫球蛋白应该以适于治疗和诊断制剂的方式容易地和经济地生产。
发明概述
本发明包括制备物种特异性抗原特异性单克隆抗体的组合物和方法，所述单克隆抗体优选IgG单克隆抗体。本发明进一步包括复制免疫系统元件的载体，所述免疫系统元件特别是免疫突触的抗原呈递细胞(APC)元件。优选的载体任选包含将负载抗原的II类主要组织相容性(MHC)蛋白、共刺激蛋白B7和结构蛋白胞内粘着蛋白(I-CAM)结合在胶态金属载体表面上。这种载体复制三维方向(3-Dorientation)的APC(图3)，从而产生能够活化CD4+T细胞以使免疫的B细胞抗体反应成熟的合成抗原呈递细胞(sAPC)。
本发明进一步包括载体，其包括合成的CD4+T细胞(sTc)和合成的生发中心(sGC)。在一个实施方案中，合成的CD4+T细胞包含与CD40配体和细胞因子结合的胶态金属载体。在另一个实施方案中，合成的生发中心包含与B淋巴细胞刺激物结合的胶态金属载体；增加B细胞抗体对体外免疫的反应效率和特异性的BlyS和CD30L/受体系统。虽然不希望受任何具体理论的限制，在一个实施方案中，抗原与B细胞生长因子的物理并列通过表面IgM抗原受体提高了人TNF抗原的摄取和诱导更强的B细胞反应。在相同B细胞上并列这些信号进一步提高了体外引起抗原特异性B细胞反应的能力。
本发明包括制备合成的免疫成分元件的方法。在此教导了制备模拟免疫系统成分功能的载体组合物的方法。本发明还包括治疗免疫系统相关疾病和病理的方法。接种方法也包括在本发明中。
附图简述
图1提供了免疫突触的示意图。
图2提供了活化的CD4+T细胞引起的初次抗体应答分化的示意图。
图3A提供了胶态金合成抗原呈递细胞的示意图。图3B提供了胶态金合成T细胞的示意图。图3C提供了胶态金合成生发中心的示意图。
图4提供了单一颗粒sAPC不能形成功能性免疫突触的示意图。
图5提供了产生多个颗粒胶态金sAPC的示意图。
图6提供了描绘多个细胞因子与相同胶态金颗粒结合的图。
图7是靶向巨噬细胞(图7A)、树突细胞(图7B)和B细胞(图7C)的EGF链霉抗生物素蛋白金的一系列照片。
图8提供了对各种体外刺激起反应的细胞的免疫反应性的图。
图9A提供了胶态金颗粒自动装配到EIA板的固体支持体上的示意图。1＝EIA板；2＝抗人TNF的鼠Mab；3＝人TNF(蓝方框)；4＝与链霉抗生物素蛋白TNF结合的32nm胶态金；5＝生物素化的BSA；6＝17nm链霉抗生物素蛋白胶态金；7＝生物素化的人IL-6；8＝缀合碱性磷酸酶的兔抗人IL-6。
图9B提供了与IL-1或TNF结合的胶态金颗粒自动装配到四臂PEG-硫醇主链的示意图(Sun Bio，Inc.)。
图10A提供了图9A中颗粒产生的免疫反应性信号的图。
图10B提供了图9B中颗粒产生的免疫反应性信号的图。
图11提供了胶态金/TNF结合装置的示意图。
图12提供了离子强度对冻干后的胶态金TNF载体稳定性的作用的图。
图13提供了在低离子强度溶液中TNF结合胶态金的模型的示意图。
图14提供了在高离子强度溶液中TNF结合胶态金的模型的示意图。
发明详述
参考在此包括的下列具体实施方案的详细说明可以更容易理解本发明。尽管已经参考其某些实施方案的详情描述了本发明，但并不意味应认为这种详情作为本发明范围的限制。在此提及的参考文献全文以其全部内容并入此处作为参考，包括美国临时申请序号60/526,360。
本发明包括产生抗原特异性、物种特异性IgG单克隆抗体的方法和组合物。本发明包括包含复制抗原呈递细胞(APC)、T细胞和体液免疫反应生发中心元件的天然存在和/或合成载体的方法和组合物。
本发明包括模拟免疫反应任何元件或阶段的载体。免疫反应是由各种类型细胞识别外来抗原发起的，主要是巨噬细胞或其他抗原呈递细胞。这引起淋巴细胞活化，尤其是特异性识别特定外来抗原的淋巴细胞，并导致免疫反应发展和可能的外来抗原消除。覆盖针对外来抗原消除的免疫反应的是引起辅助功能、刺激物功能、抑制因子功能和其他反应的复杂相互作用。免疫系统的反应能力必须在刺激和抑制的多个部位小心地控制，否则反应将不发生、过度反应或在消除后不停止。
对外来抗原起反应的识别期由外来抗原与免疫细胞上特异性受体的结合组成。这些受体通常在接触抗原前就存在。识别还可以包括通过巨噬细胞样细胞或通过血清或体液内因子识别进行的与抗原的相互作用。
在活化期，淋巴细胞经历至少两次重大改变。它们增殖，从而引起抗原特异性淋巴细胞克隆的扩展和反应的扩大，且抗原刺激的淋巴细胞子代分化为效应细胞或存活的、易于对再次暴露于抗原起反应的记忆细胞。有提高这个反应的许多扩大机制。
在效应期，活化的淋巴细胞执行可以引起抗原消除或建立疫苗反应的功能。这种功能包括细胞反应，如调节、辅助、刺激物、抑制因子或记忆功能。许多效应功能需要细胞和细胞因子的联合参与。例如，抗体与外来抗原结合并通过血液嗜中性白细胞和单核吞噬细胞提高它们的吞噬作用。补体途径被活化，并可能参与除触发其他身体反应如发热之外的微生物的裂解和吞噬作用。
在对抗原的免疫反应中，免疫细胞通过直接的细胞与细胞的接触或间接的细胞与细胞(因子介导的)通讯而彼此相互作用。例如，T细胞、巨噬细胞、树突细胞和B细胞之间的相互作用是有效免疫反应必需的。抗原呈递细胞(APC)通过将加工的抗原和其他活化信号呈递给B和T细胞而活化它们。活化的T细胞辅助控制免疫反应并参与外来生物的除去。辅助T细胞引起细胞变成更好的效应细胞，如辅助细胞毒性T细胞前体发育为杀伤细胞，辅助B细胞产生抗体，和辅助增加其他细胞，如巨噬细胞的功能。活化的B细胞分裂并产生抗原特异性抗体和记忆B细胞。包含在免疫反应中的细胞还分泌细胞的因子或细胞因子，它们提高吞噬细胞的功能、刺激炎性反应和影响各种细胞。
这些细胞的反应还包括反馈环。巨噬细胞和其他单核吞噬细胞，或APCs活跃吞噬抗原以呈递给B和T细胞并且淋巴细胞的细胞因子可以提高这种活性。巨噬细胞还产生细胞因子，所述细胞因子除别的活性外可刺激T细胞增殖和分化，征募其他炎性细胞，特别是嗜中性白细胞，和负责很多炎症的全身效应，如发热。一个这种细胞因子，称为白细胞介素-12，对细胞介导的免疫的发展特别重要。
树突细胞也是APCs，其启动免疫反应。有许多不同类型的树突细胞，包括皮肤的淋巴样树突细胞和郎格汉斯细胞。它们遍及身体，且尤其是在脾、淋巴结、扁桃体、淋巴集结和胸腺中可以发现它们。它们是不规则形状的细胞，其不断伸展和收缩树状(树状的)突起。它们在免疫系统中的作用之一是诱导和调节B和T细胞活化和分化。它们是细胞毒性T细胞发育、B细胞引起的抗体形成和一些多克隆反应如氧化性有丝分裂发生的有力辅助细胞。它们还刺激T细胞释放细胞因子白细胞介素-2。
接种疫苗的重要武器是B淋巴细胞或B细胞提供的对抗原的反应。B细胞代表约5至15％的循环淋巴细胞。B细胞产生免疫球蛋白，IgG、IgM、IgA、IgD和IgE，其可以释放到体液、随附着的蛋白分泌或插入B细胞的表面膜中。这种固定的免疫球蛋白充当特异性抗原受体。在对抗原的反应中，这些免疫球蛋白受体在B细胞上特异性部位交联。这个过程被称为加帽，随后是免疫球蛋白的内在化和降解。在APCs中，所述APCs可能包括B细胞，抗原片段与MHC结合并最终在APC表面上表达。
B浆细胞产生并分泌可以结合外来蛋白、多糖、脂质或胞外或细胞结合形式的其他化学物质的抗体分子。单个浆细胞产生的抗体对于一个抗原是特异性的。分泌的抗体结合抗原并触发促进它们破坏的机制。
1975年，Kohler和Milstein(Kohler，G.，和Milstein，C.，Nature(London).1975.volume 256：pp-495)描述了从免疫的小鼠脾脏分离的产生抗体的B细胞与攻击性增殖的小鼠骨髓瘤细胞融合的方法。此生成的杂交细胞即杂交瘤具有两个亲本细胞的特征。在它继续生长和增殖过程中，它产生并分泌大量抗体。通过一系列系统的细胞稀释，可以分离产生单一特异性的抗体-单克隆抗体(Mab)的遗传单一的杂交瘤细胞。
最普通程序要求单克隆抗体的产生从免疫动物开始。排入局部淋巴结或脾的抗原活化原初 B细胞以产生IgM抗体。这些活化的B细胞用抗原活化的CD4+T细胞呈递以诱导类别转换。类别转换的特征是抗体产生类型由IgMs至IgGs的改变(Kuby，J.，Immunology Third Edition 1997.eds Allen D.，pp-205-213)。分泌抗体的B细胞淋巴细胞分离自免疫的动物的淋巴结或脾，并与物种特异性骨髓瘤细胞融合。然后允许融合细胞生长而产生抗原特异性IgG抗体。在筛选过程中，根据它们的治疗潜力选择阳性融合克隆。
用外来抗原可以容易地免疫小鼠以产生广谱的高亲和力抗体。然而，由于外来蛋白在体内的呈递，将鼠抗体引入人引起人抗小鼠抗体(HAMA)的产生。鼠抗体在患者中的使用通常限于数天或数周。而且，一旦HAMA在患者中发展，它常常妨碍鼠抗体的其他诊断或治疗目的的未来应用。
这个技术在动物中的早期成功激励科学家们在20世纪80年代扩展这个观念并试图生产人单克隆抗体。然而，从动物外推到人充满了困难。第一个障碍是抗原特异性B细胞的缺乏。标准单克隆抗体方法要求这些细胞从已免疫的动物收获，这种方法通常不适用于人。由于下列事实，这个问题更加复杂，(i)没有活化的B细胞的现成来源；(ii)外周血中存在的免疫活性B细胞的贫乏，和(iii)不能从人受试者获得淋巴结或脾。这些因素激励开发各种体外策略以产生人单克隆抗体。虽然最初的结果显示了巨大的前景，但是不能完全重建体内抗体反应事件的顺序最终引起该技术失败，并且这个技术方法基本上已经被弃用。
体外生产抗体的第一个障碍是原初人B细胞淋巴细胞转化至活化的B细胞的转化率相对低。过去，解决这项挑战被证明是困难的，即使当使用回忆抗原如破伤风毒素(Butler等人，J.Immuol.1983.volume 130：PP-165)来诱导人外周血B细胞淋巴细胞的初次抗体应答时也如此。本发明包括制备活化引起抗体产生途径的载体的方法。本发明还包括天然存在或合成的载体的组合物。这种载体包含结合多个B细胞配体的胶态金平台。
已经描述过受体/配体对交联以加强生物学反应的许多实例(Carroll，K.，Prosser，E.，和Kennedy，R.Hybridoma 1991.10：229-239)。本发明包括增加对体外免疫的B细胞抗体反应效率和特异性的胶态金属的载体。不希望被任何特定理论限制，据信抗原与B细胞生长因子的物理并列可以提高抗原通过表面IgM抗原受体的摄取，并诱导更强的B细胞反应。还有改善的抗原加工和呈递。相同B细胞上并列具有这些信号提高了体外引发抗原特异性B细胞反应的能力。
在一个实施方案中，成分特异性免疫刺激分子和/或MHC蛋白和/或抗原可以与胶态金属平台直接结合或可以通过结合基团成员与胶态金属平台结合。这种结合基团可以包括免疫成分上存在的或被合成地添加到其上的游离巯基或吡啶基。本发明的优选实施方案包括胶态金属作为能够与结合基团成员结合的平台，成分特异性免疫刺激剂或MHC蛋白或抗原与所述平台结合以产生合成的APC。在可供选择的优选实施方案中，结合基团是链霉抗生物素蛋白/生物素，且成分特异性免疫刺激剂是细胞因子。本发明的实施方案也可以包括以稍不特异的方法结合抗原、或MHC蛋白或成分特异性免疫刺激剂，其中不使用结合配偶体，如使用聚阳离子或蛋白。照此，本发明预期使用本领域技术人员已知的相互作用分子，如聚阳离子元件，包括但不限于聚赖氨酸、硫酸鱼精蛋白、组蛋白或脱唾液酸糖蛋白。
结合对的成员包括本领域技术人员已知的任何这种结合对，包括但不限于抗体-抗原对、酶-底物对；受体-配体对；和链霉抗生物素蛋白-生物素。新的结合配偶体可以是特别设计的。结合配偶体的基本要素是结合对之一与另一个结合对成员之间特异性结合，从而结合配偶体能够特异连接。结合成员的另一个所需要素是每个成员都能够结合或被结合到整合分子或靶向分子。
本发明的组合物包含胶态金属、抗原和成分特异性免疫刺激剂。可选择地，本发明的组合物包含胶态金属、MHC蛋白、抗原和成分特异性免疫刺激剂。成分特异性免疫刺激剂可以包括可以用于治疗应用的生物活性剂，或者成分特异性免疫刺激剂可用于检测方法。在另外的实施方案中，一个或多个成分特异性免疫刺激剂与胶态金属混合、缔合或直接或间接结合。混合、缔合和结合包括共价和离子键和允许衍生的PEG或衍生的聚-1-赖氨酸、成分特异性免疫刺激剂和其他成分彼此之间和与胶态金属颗粒之间长期或短期缔合的其他更弱或更强缔合。
在又一个实施方案中，该组合物也可以包括与胶态金属混合、缔合或结合的一个或多个靶向分子。靶向分子可以直接或间接与金属颗粒结合。间接结合包括通过分子如聚赖氨酸或其他整合分子的结合，或与同时结合靶向分子和金属溶胶或与金属溶胶结合的另一个分子的分子的任何缔合。
特别感兴趣的是检测剂，如可用于显现或检测螯合的胶态金属载体的染料或放射性材料。预期荧光、化学发光、热敏、不透明的、珠子、磁性和振动材料也可以用作与本发明组合物中胶态金属缔合或结合的可检测剂。
体外原初人B细胞产生初次抗体应答仅代表人抗体反应体外重建的第一步。来自免疫的人B细胞的初级抗体反应引起IgM抗体分泌。称为抗原呈递细胞(APCs)的第二类淋巴样细胞也使抗原内在化。一旦被内在化，这些细胞将蛋白抗原加工为片段，该片段然后在结合两个主要组织相容性复合体(MHCs)之一的细胞表面上表达。这些细胞对于抗体类别转换很重要。
在此介绍了免疫系统反应的当前学说。本发明不局限于在此描述的机制，而是可以在多个方法中起作用，不被在此描述的任何特定理论所限制。依赖于微环境，表达与II类MHC分子结合的抗原的APCs活化CD4+T细胞的两个亚型之一。这些细胞亦称为辅助T细胞，执行必要的辅助功能以促进细胞或体液(抗体)免疫反应。TH1CD4+细胞促进细胞免疫反应，而CD4+细胞的TH2亚型与分泌IgM的B细胞相互作用以启动类别转换过程。
APC活化CD4+TH2T细胞随着被称为免疫突触的两细胞半裂(bicellular cleft)形成而发生(Wulfing C，Sumen C，Sjaastad MD，Wu LC，Dustin ML，Davis MM.Nat Immunol 2002.31：42-7)。免疫突触的形成包括APC上信号传导和结构配体与T细胞上它们各自的受体的相互作用和重排以形成允许这两个细胞之间联系和信号传导的三维(3-D)桥(图1)。APC和T细胞之间的抗原信号传导通过MHC/抗原复合体与T细胞受体复合体的结合而发生，同时免疫突触的结构完整性由APC上的ICAM(胞内粘附分子)、LFA-3和CD72分别与T细胞上的LFA-1、CD2和CD5受体的相互作用来维持。免疫突触的成功形成引起CD4+T细胞表达被称为CD40配体的B细胞刺激分子。
免疫突触的形成可以发信号使T细胞变成有活性或无活性的(无反应性的)。哪个反应被启动取决于APC上B7分子提供给T细胞的共刺激信号强度。B7分子可以与T细胞上的B7受体分子CD28或CTLA4相互作用。这些B7受体在它们在T细胞表面上的密度以及它们对B7分子的亲和力方面不同。CD28对B7的亲和力比CTLA4更低，但是在T细胞表面上以高得多的密度存在。B7与CD28受体的结合向T细胞发送活化信号，而CTLA4结合B7诱导T细胞无反应性(Kuby，J.，Immunology Third Edition 1997.eds Allen D.，PP.213-218)。因此，免疫突触中呈递过多B7将确保T细胞被活化。活化的CD4+/CD40+T细胞与分泌IgM的B细胞形成突触。T细胞上CD40配体与B细胞上CD40受体的相互作用引起分泌IgM的B细胞经历类别转换以产生IgGs(图2)。
本发明包括制备能够活化CD4+T细胞的sAPCs、以及能使免疫的B细胞或无限增殖化B细胞的抗体反应成熟的合成CD4+T细胞(sTc)和合成生发中心(sGC)的方法。本发明的组合物包含能够活化T细胞的胶态金属载体和引起免疫的或无限增殖化B细胞成熟的载体。例如，载体可能具有与胶态金属载体表面缔合的负载抗原的II类主要组织相容性(MHC)蛋白、共刺激蛋白B7和结构蛋白胞内粘附分子(ICAM)。这个载体复制三维方向APC(图3)并且起着能够活化CD4+T细胞以使免疫的B细胞的抗体反应成熟的合成抗原呈递细胞(sAPC)的作用。sAPC的一个实施方案包括胶态金属单个颗粒上的全部成分。sAPC的另一个实施方案包括与胶态金的单独颗粒结合的免疫突触的组成蛋白，其在体外自动装配形成sAPC。
包括合成抗原呈递细胞(sAPC)的本发明方法和组合物包含容易得到和可以“从冰箱中拉出”并用于操纵人抗体反应的组合物。因此本发明包括疾病和免疫相关机能障碍和病理的治疗方法。胶态金属组合物对变量提供控制，该变量负责启动、维持和调节免疫反应(下调或上调)，如颗粒大小、每个颗粒结合的蛋白量、蛋白在颗粒上运动的灵活性，以及颗粒的三维装配，确保sAPC的可重复控制。
本发明的载体组合物可用于体外生产单克隆抗体。这种单克隆抗体可用在多种疾病的治疗方法中。本发明的载体组合物还可以用于制备改善的疫苗组合物。
在疫苗疗法中，使用特别设计用来刺激人免疫系统细胞和体液反应的合成免疫原的组合物。通过产生用于呈递抗原和刺激特异细胞的特异性合成细胞免疫元件，能够实现更可预测和有效的疫苗反应。
本发明包括联合疫苗和DNA疫苗。联合疫苗的实例是百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)毒素及其表面的菌毛血凝素。在DNA疫苗接种中，给患者施用编码蛋白抗原的核酸，该核酸然后被转录、翻译和以一些形式表达，以产生对抗原的强烈、长期的体液和细胞介导的免疫反应。
通过使用佐剂可以非特异性地增强疫苗产生的免疫反应。这些是化合物或载体成分，如脂质体、乳剂或微球体的异质组，具有几个不同的作用机理。本发明的方法包括使用疫苗来预防疾病和治疗癌症。
除癌症之外，许多疾病是由免疫系统介导的，且本发明包括这种疾病的治疗方法，其通过施用包含能够刺激免疫系统及其成分的胶态金属载体的有效量组合物来实现。该疾病包括克罗恩病、银屑病、炎性肠病、成人呼吸窘迫综合征、变态反应、湿疹、鼻炎、荨麻疹、过敏反应、移植排斥(如肾脏、心脏、胰腺、肺脏、骨和肝脏移植)、风湿性疾病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、血清阴性的脊椎关节炎疹、Sjogren氏综合征、系统性硬化病、多发性肌炎、皮肌炎、1型糖尿病、获得性免疫缺损综合征、手足口病、Hashimoto氏甲状腺炎、Graves氏病、Addison氏病、多内分泌自身免疫病、肝炎、硬化性胆管炎、原发性胆汁性肝硬变、恶性贫血、乳糜泻、抗体介导的肾炎、肾小球性肾炎、Wegener氏肉芽肿病、微观多动脉炎、结节性多动脉炎、天疱疮、疱疹样皮炎、白癜风、多发性硬化、脑脊髓炎、Guillain-Barre综合征、重症肌无力、Lambert-Eaton综合征、巩膜、巩膜外层、葡萄膜炎、慢性粘膜皮肤念珠菌病、Bruton氏综合征、婴儿期一过性低丙种球蛋白血症、骨髓瘤、X连锁高IgM综合征、Wiskott-Aldrich氏综合征、共济失调-毛细血管扩张症、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少症、自身免疫性嗜中性白细胞减少症、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、淀粉样变性、慢性淋巴细胞性白血病或非何杰金氏淋巴瘤。
本方法通过靶向用于活化的特殊免疫成分来增强疫苗有效性。使用包含与胶态金属和抗原缔合的成分特异性免疫刺激剂的组合物。疫苗当前可得的疾病实例包括但不限于霍乱、白喉、嗜血杆菌属、甲型肝炎、乙型肝炎、流行性感冒、麻疹、脑膜炎、流行性腮腺炎、百日咳、天花、肺炎球菌性肺炎、脊髓灰质炎、狂犬病、风疹、破伤风、结核、伤寒、水痘-带状疱疹、百日咳和黄热病。
施用途径和用于将抗原递送至免疫系统的载体组合是设计所需免疫反应中的有效工具。本发明包括方法和组合物，其包含各种载体或与递送试剂缔合的载体，所述递送试剂如可以提供长期释放免疫刺激性载体组合物的脂质体、微胶囊或微球体。这些递送系统作用就象容纳载体和向免疫系统缓慢释放它的内部贮库。例如，脂质体可以充满包含载体的组合物，所述载体包含与胶态金属缔合的抗原和成分特异性免疫刺激剂。
抗原/成分特异性免疫刺激剂/金属复合物缓慢从脂质体释放并被免疫系统识别为外来的，和成分特异性免疫刺激剂所针对的特殊成分活化免疫系统。成分特异性免疫刺激剂的存在更迅速活化免疫反应级联，且免疫反应更迅速和更特异地产生。
本发明中预期的其他方法和组合物包括使用抗原/成分特异性免疫刺激剂/胶态金属复合物，其中胶态金属颗粒具有不同的大小。成分特异性免疫刺激剂的顺序施用可以通过使用这些不同大小的胶态金属颗粒以一剂施用来完成。一剂将包括与抗原复合的四个独立的成分特异性免疫刺激剂，且每个都具有不同大小的胶态金属颗粒。因此，同时施用将提供免疫成分的顺序活化以产生更有效疫苗和对群体的更大保护。顺序活化的这种单剂施用的其他类型可以通过不同大小胶态金属颗粒和脂质体组合或充满不同大小胶态金属颗粒的脂质体来提供。
如上所述的这种疫苗接种系统的使用在提供可以以一剂施用的疫苗中很重要。一剂施用在治疗动物群体如家畜或野生动物群体中很重要。一剂施用在治疗保健不力的群体如穷人、无家可归的、乡村居民或没有充分保健的发展中国家的人中很重要。在所有国家中，很多人无法使用预防型保健，如接种疫苗。传染病，如结核的重现增加了对可以一次给予并仍提供持久有效保护的疫苗的需要。本发明的组合物和方法提供了这种有效保护。
在此使用的术语“胶态金属”包括任何不溶于水的金属颗粒或金属化合物以及非金属来源的胶体，如分散在液体或水中的胶态炭(水溶胶)。可用于本发明的胶态金属实例包括但不限于周期表IIA、IB、IIB和IIIB族的金属，以及过渡金属，特别是VIII族金属。优选金属包括金、银、铝、钌、锌、铁、镍和钙。其他合适的金属还可以包括下列所有它们的各种氧化态：锂、钠、镁、钾、钪、钛、钒、铬、锰、钴、铜、镓、锶、铌、钼、钯、铟、锡、钨、铼、铂和钆。优选金属以离子形成(优选来源于合适的金属化合物)提供，例如Al3+、Ru3+、Zn2+、Fe3+、Ni2+和Ca2+离子。优选的金属是银，特别是在硼酸钠缓冲液中，其具有大约0.1％至0.001％的浓度，和最优选大约0.01％溶液。另一个优选金属是金，特别是Au3+形式。特别优选形式的胶态金是HAuCl4(OmniCorp，South Plainfield，NJ)。这种胶态银溶液的颜色是黄色的，且胶体颗粒可以是1至100纳米。这种金属离子可以单独或以与其他无机离子的复合体存在。
本发明中可以使用任何抗原。本发明中有用的抗原实例包括但不限于白细胞介素-1(“IL-1”)、白细胞介素-2(“IL-2”)、白细胞介素-3(“IL-3”)、白细胞介素-4(“IL-4”)、白细胞介素-5(“IL-5”)、白细胞介素-6(“IL-6”)、白细胞介素-7(“IL-7”)、白细胞介素-8(“IL-8”)、白细胞介素-10(“IL-10”)、白细胞介素-11(“IL-11”)、白细胞介素-12(“IL-12”)、白细胞介素-13(“IL-13”)、脂质A、磷脂酶A2、内毒素、葡萄球菌肠毒素B、百日咳毒素、破伤风毒素和其他毒素、I型干扰素、II型干扰素、肿瘤坏死因子(TNF-α或b)、转化生长因子-β(“TGF-β”)、淋巴毒素、移动抑制因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(“CSF”)单核细胞-巨噬细胞CSF、粒细胞CSF、血管上皮生长因子(“VEGF”)、血管生成素、转化生长因子(“TGF-α”)、热激蛋白、表皮生长因子(“EGF”)、血型的碳水化合物部分、Rh因子、成纤维细胞生长因子和其他炎性和免疫调节蛋白、核苷酸、DNA、RNA、mRNA、有义、反义、癌细胞特异性抗原；如MART、MAGE、BAGE、和热激蛋白(HSPs)；突变体p53；酪氨酸酶；粘蛋白，如Muc-1、PSA、TSH、自身免疫抗原；免疫治疗药如AZT；和血管生成和抗血管生成药如血管抑素(angiostatin)、内皮抑素(endostatin)、碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子和前列腺特异性抗原和促甲状腺素。
成分特异性免疫刺激剂可以是作用于免疫系统任何分子或化合物，例如增加APC刺激B细胞产生抗体的能力的任何分子。成分特异性免疫刺激剂的实例包括但不限于抗原、胶态金属、佐剂、受体分子、核酸、免疫原性蛋白和辅助细胞因子/免疫刺激剂、药物、化疗剂和载体。
本发明中可以使用任何类型的药剂。例如，抗炎药如类固醇和非类固醇抗炎药、可溶受体、抗生素、止痛剂、COX-2抑制剂。特别感兴趣的化疗剂包括下列非限制性实例，紫杉醇、紫杉醇、紫杉烷(taxanes)、长春灭瘟碱、长春新碱、阿霉素、无环鸟苷、顺铂、氨甲蝶呤、光辉霉素和他克林。
这些成分特异性免疫刺激剂可以单独或联合使用。它们可以以游离状态或以复合物使用，如与胶态金属组合。
本发明中有用的成分特异性免疫刺激剂实例包括但不限于白细胞介素-1(“IL-1”)、白细胞介素-2(“IL-2”)、白细胞介素-3(“IL-3”)、白细胞介素-4(“IL-4”)、白细胞介素-5(“IL-5”)、白细胞介素-6(“IL-6”)、白细胞介素-7(“IL-7”)、白细胞介素-8(“IL-8”)、白细胞介素-10(“IL-10”)、白细胞介素-11(“IL-11”)、白细胞介素-12(“IL-12”)、白细胞介素-13(“IL-13”)、脂质A、磷脂酶A2、内毒素、葡萄球菌肠毒素B和其他毒素、I型干扰素、II型干扰素、肿瘤坏死因子(“TNF-α”)、Flt-3配体、转化生长因子-β(“TGF-β”)淋巴毒素、移动抑制因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(“CSF”)、粒细胞-巨噬细胞CSF、粒细胞CSF、血管上皮生长因子(“VEGF”)、血管生成素、转化生长因子(“TGF-α”)、热激蛋白、血型的碳水化合物部分、Rh因子、成纤维细胞生长因子和其他炎性和免疫调节蛋白、核苷酸、DNA、RNA、mRNA、有义、反义、癌细胞特异性抗原；如MART、MAGE、BAGE、和热激蛋白(HSPs)；突变体p53；酪氨酸酶；自身免疫抗原；免疫治疗药，如AZT；和血管生成和抗血管生成药，如血管抑素、内皮抑素、碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子(VEGF)和前列腺特异性抗原和促甲状腺激素。
对本发明有用的佐剂包括但不限于热杀死的丁酸分枝杆菌(M.Butyricum)和结核分枝杆菌(M.Tuberculosis)。核苷酸的非限制性实例是DNA、RNA、mRNA、有义和反义。免疫原性蛋白的实例包括但不限于KLH(Keyhole Limpet Cyanin)、甲状腺球蛋白和含有佐剂和在基因中编码的抗原部分的融合蛋白。
成分特异性免疫刺激剂可以使用已知的基因疗法以它们的核酸形式递送，且在翻译后产生它们的作用。活化免疫成分如抗原的另外元件可以同时或顺序递送，从而使得细胞翻译的成分特异性免疫刺激剂和外部添加的元件协同工作以特异性靶向免疫反应。
特别优选的实施方案提供了使用包含试剂的载体组合物活化免疫反应的方法，该试剂包含与成分特异性免疫刺激剂结合的特异性抗原。这种方法有效并可以在体外或体内使用。在此使用的成分特异性免疫刺激剂意思指对于免疫系统的成分如B或T细胞是特异性的，而且能够影响所述成分，从而使得该成分在免疫反应中具有活性的试剂。成分特异性免疫刺激剂可能能够影响免疫系统的几个不同成分，且这种能力可以用于本发明的方法和组合物中。该试剂可以是天然存在的或可以通过分子生物学技术或蛋白受体操作来产生或修饰。
免疫反应中成分的活化可以引起免疫反应其他成分的刺激或抑制，从而导致免疫反应的全面刺激或抑制。为便于表达，在此描述了免疫成分的刺激，但是应当理解术语刺激预期了所有免疫成分的反应，包括但不限于刺激、抑制、排斥和反馈活性。
受影响的免疫成分可以具有多种活性，从而引起抑制和刺激或反馈机制的启动或抑制。本发明不限于在此详述的免疫反应实例，而是预期免疫系统所有方面的成分特异性作用。
免疫系统每个成分的活化可以是同时的、顺序的或其任何组合。在本发明方法的一个实施方案中，多个成分特异性免疫刺激剂同时施用。在这个方法中，用多个分开的制剂同时刺激免疫系统，每个制剂包含含有成分特异性免疫刺激剂的载体组合物。优选，该载体组合物包含与胶态金属缔合的成分特异性免疫刺激剂。更优选，该组合物包含与同一大小颗粒或不同大小颗粒的胶态金属和抗原缔合的成分特异性免疫刺激剂。最优选，该组合物包含与同一大小颗粒或不同大小颗粒的胶态金属、抗原和PEG或PEG衍生物(优选硫醇-PEG(PEG(SH)n))或衍生聚-1-赖氨酸(优选聚-1-赖氨酸硫醇(PLL(SH)n)))缔合的成分特异性免疫刺激剂。
成分特异性免疫刺激剂为单个免疫成分提供特异性刺激的上调的影响。例如，白细胞介素-1β(IL-1β)特异性刺激巨噬细胞，而TNF-α(肿瘤坏死因子α)和Flt-3配体特异性刺激树突细胞。热杀死的丁酸分枝杆菌和白细胞介素-6(IL-6)是B细胞的特异性刺激物，且白细胞介素-2(IL-2)是T细胞的特异性刺激物。包含这种成分特异性免疫刺激剂的载体组合物分别提供巨噬细胞、树突细胞、B细胞和T细胞的特异性活化。例如，当施用包含成分特异性免疫刺激剂IL-1β的载体组合物时，巨噬细胞被活化。优选组合物是与胶态金属缔合的IL-1β，且最优选组合物是与胶态金属和抗原缔合的IL-1β，以为所述抗原提供特异性巨噬细胞反应。载体组合物可以进一步包含靶向分子、整合分子、PEGs或衍生的PEGs。
免疫反应的许多元件可能是对抗原的有效免疫反应必需的。同时刺激的方法的实施方案是施用四个分开的成分特异性免疫刺激剂的组合物制剂，所述成分特异性免疫刺激剂包含1)用于巨噬细胞的IL-1β，2)用于树突细胞的TNF-α和Flt-3配体，3)用于B细胞的IL-6和4)用于T细胞的IL-2。每个成分特异性免疫刺激剂载体组合物可以以本领域技术人员已知的任何途径施用，并且可以使用相同途径或不同途径，这取决于期望的免疫反应。
在本发明方法和组合物的另一个实施方案中，单个免疫成分顺序活化。例如，这个顺序活化被分为两个阶段，致敏阶段(primer phase)和免疫阶段。该致敏阶段包括刺激APCs，优选巨噬细胞和树突细胞，而免疫阶段包括刺激淋巴细胞，优选B细胞和T细胞。在两个阶段的每一个内，单个免疫成分的活化可以是同时的或顺序的。对于顺序活化，优选活化方法是施用引起巨噬细胞，随后是树突细胞，继之以B细胞，之后是T细胞活化的载体组合物。最优选方法是联合顺序活化，包括施用引起巨噬细胞和树突细胞同时活化，随后是B细胞和T细胞同时活化的载体组合物。这是启动免疫系统几个途径的多个成分特异性免疫刺激剂的方法和组合物的实例。
试剂与金属溶胶结合的一个方法包括下列步骤，尽管仅仅为了清楚目的，公开的方法提及单一试剂TNF与金属溶胶胶态金的结合。使用允许胶态金溶胶中的颗粒和蛋白溶液中TNF之间相互作用的装置。该装置的示意图在图11显示。这个装置通过将混合室减至小体积，使未结合的胶态金颗粒与待结合的蛋白TNF的相互作用最大化。这个装置使大体积金溶胶与大体积TNF的相互作用能够在小体积T形连接器中发生。相反，向大体积胶态金颗粒添加小体积蛋白不是确保蛋白与金颗粒均一结合的优选方法。向大体积蛋白添加小体积胶态金的相反方法也不是。实际上，胶态金颗粒和蛋白TNF通过从两个大储库抽出胶态金颗粒和TNF蛋白的单个蠕动泵被施加到T形连接器中。为进一步确保适当的混合，一字排列式混合器就位于T形连接器的下游。混合器有力地混合胶态金颗粒和TNF，两者都以大约1L/分钟的优选流速通过连接器流动。
在与试剂混合前，使用1N NaOH将金溶胶的pH调至pH 8-9。调节金溶胶pH的优选方法使用100mM TRIS，以调节胶态金溶胶pH至pH 6。重构高度纯化冻干的重组人TNF。稀释TNF的优选方法是在用100mM TRIS调至pH 6的水中。在将溶胶或TNF添加至它们各自的储库之前，用夹关闭连接容器和T形连接器的管。将等体积胶态金溶胶和TNF溶液添加到合适储库中。溶液中活化剂的优选浓度为约0.01至15μg/ml，并可以根据试剂与金属溶胶颗粒的期望比率而改变。溶液中TNF的优选浓度为0.5至4μg/ml，且对于TNF-胶态金组合物的最优选TNF浓度是0.5μg/ml。
一旦将溶液适当加载到它们各自的储库，则打开蠕动泵，将试剂溶液和胶态金溶液抽取到T形连接器中，通过一字排列式混合器，通过蠕动泵和进入收集瓶。在收集瓶中搅拌混合溶液以温育另外一小时。
在包含PEG(无论衍生与否)的组合物中，制备这种组合物的方法包括下列步骤，尽管仅仅为了清楚目的，公开的方法提及将PEG硫醇添加至金属溶胶组合物中。可以使用下列步骤制备任何PEG、衍生的PEG组合物或任何大小的PEG组合物或包含几个不同PEGs的组合物。15分钟温育后，将硫醇衍生的聚乙二醇(PEG)溶液添加至胶态金/TNF溶胶。本发明预期使用具有任何衍生基团的任何大小的PEG，尽管优选的衍生的PEGs包括mPEG-OPSS/2,000、mPEG-OPSS/5,000、mPEG-OPSS/10,000、mPEG-OPSS/12,000、mPEG-OPSS/20,000、mPEG-OP(SS)2/2,000、mPEG-OP(SS)2/3,400；mPEG-OP(SS)2/8,000、mPEG-OP(SS)2/10,000、硫醇-PEG-硫醇/2,000、mPEG-硫醇5,000和mPEG-硫醇10,000、mPEG-硫醇12,000、mPEG-硫醇20,000(Sun-BIO Inc.)。优选的PEG是mPEG-硫醇5000，其在水中浓度为150μg/ml，pH 5-8。因此，将10％v/v的PEG溶液添至胶态金-TNF溶液中。将金/TNF/PEG溶液温育另外15分钟。
在优选方法中，TNF和PEG-硫醇部分同时与胶态金纳米颗粒(nanoparticle)结合。在这个方法中，使用100mM TRIS碱将胶态金纳米颗粒pH调至6.0。类似地，使用100mM TRIS溶液将水的pH调至6.0。TNF和PEG-硫醇(20,000)分别在后一溶液中稀释至5和15μg/ml的终浓度。胶态金纳米颗粒和TNF/PEG-硫醇溶液都加载到它们各自的储库并通过T形连接器和一字排列式混合器结合，其中使用蠕动泵通过T形连接器抽取每种溶液。结合15分钟后，将人血清清蛋白(在水中为200μg/ml)添加至胶态金/TNF/PEG-硫醇溶液并温育另外15分钟。
使胶态金/TNF/PEG溶液顺序超滤通过50-100K MWCO渗滤柱体。用ELISA测量50-100K保留物和渗透物的TNF浓度，以确定与金颗粒结合的TNF量。
渗滤后，添加冷冻保护剂如甘露糖醇20mg/ml；和/或人血清清蛋白5mg/ml的组合物并将样品在-80℃冷冻。将样品冻干至干燥并在真空下密封，随后重构和分析重构的样品中存在的游离和与胶态金结合的TNF的量。
本发明的组合物可施用于体外和体内系统。体内施用可以包括直接应用于靶细胞或这种施用途径，包括但不限于适于经口、直肠、经皮、眼(包括玻璃体内或intracameral)、鼻、局部(包括口腔和舌下)、阴道或肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内、真皮内、气管内和硬膜外)施用的制剂。优选方法包括经口或注射途径施用本发明有效量的包含载体的组合物。
该制剂可以方便地存在于单位剂型中并可以用传统制药技术制备。通过使金属溶胶载体和药物载体或赋形剂缔合而制备药物制剂组合物。通常，制剂的制备方法是组合物与液体载体或细碎的固体载体或两者均匀和密切缔合，然后，如果需要，使产品成形。
通过下列实施例进一步阐明本发明，不应将实施例解释为以任何方式强加于其范围的限制。相反，应明确地认识到，可以求助于各种其他实施方案、改动和其等同方案，在阅读这里的说明书之后，本领域技术人员可得到这些实施方案、改动和其等同方案的提示，但不背离本发明精神和/或所附权利要求的范围。
                     实施例
                     实施例1
                   胶态金的制备
使用Frens和Horisberger描述的反应制备胶态金溶胶(Frens，G.Nature Phys.Sci.1972，241，20-22，和Horsiberger，M.Biol.Cellulaire.1979.36：253-258)。在这个反应中，通过添加柠檬酸钠使HAuCl4形式的离子金还原成Au0纳米颗粒。一般，将2.5ml 4％氯金酸(水中)溶液添至1L去离子水中。有力搅拌溶液并加热至滚沸。通过添加1％柠檬酸钠溶液启动还原反应。颗粒大小受添加至反应的柠檬酸盐量的控制。例如通过分别添加40、15和7.5ml柠檬酸盐溶液形成17、32和64nm颗粒。添加柠檬酸盐后，允许溶液沸腾和混合另外45分钟。冷却后，使溶胶通过0.22μm灭菌过滤器过滤并在室温下贮藏直到使用。
胶态金溶胶的生产已从1.0L按比例增大到10L。使用UV-VIS波长扫描、动态光散射和差速离心技术检查这些颗粒的平均粒度和均一性。制备的颗粒具有在它们预测大小10％以内常规测量的平均粒度并显示出1.03-1.12或更低的多分散性测量值。
                         实施例2
                 增加免疫活性B细胞的数目
为了增加用于免疫的免疫活性B细胞的数目，从全血或棕黄层单元分离II类MHC限制的表面IgM+/sIgD+人B细胞。包被了抗IgM、抗IgD和抗CD19抗体的磁珠分离B细胞群。用细胞因子白细胞介素-7处理sIgM+/sIgD-不成熟B细胞，以募集另外的B细胞(Sudo，T.，Ito，M.，Ogawa，Y.，Iizuka，M.，Kodoma，H.，Kunisasa，T.，Hayashi，S.C.，Ogawa，M.，Sakai，K.，Nishikawa，S.，Nishkawa，S.C.J.Exp.Med.1989.170：333-338)。已表明这种处理使这些B细胞成熟，如通过sIgM+/sIgD-B细胞表型转换为sIgM+/sIgD+B细胞显示的。使用FACS分离法纯化这些分离的细胞至接近均一性。
TNF与载体如KLH或甲状腺球蛋白(参见下面的讨论)缀合提高人TNF的抗原性。TNF:KLH抗原与含有B细胞靶向/活化剂如白细胞介素-6(IL-6)的胶态金颗粒表面结合。IL-6是已知刺激抗体从免疫的B细胞合成的细胞因子。在相同金颗粒上具有两个部分确保了B细胞接受KLH:TNF抗原信号以及IL-6信号以活化抗体反应。
                     实施例3
                初次抗体应答的鉴别
对治疗抗体的生产关键的是类别转换过程。来自免疫的人B细胞的初次抗体应答引起IgM抗体分泌。称为抗原呈递细胞(APCs)的第二类淋巴样细胞也使抗原内在化。一旦被内在化，这些细胞就将蛋白抗原加工为片段，该片段在结合两个主要组织相容性复合体(MHCs)之一的细胞表面上表达。
依赖于微环境，表达与II类MHC分子结合的抗原的APCs活化CD4+T细胞的两个亚型之一。这些细胞亦称辅助T细胞，执行必要的辅助功能以促进细胞或体液(抗体)免疫反应。TH1CD4+细胞促进细胞免疫反应，而CD4+细胞的TH2亚型与分泌IgM的B细胞相互作用以启动类别转换过程。
APC活化CD4+TH2T细胞随着被称为免疫突触的两细胞半裂形成而发生。免疫突触的形成包括APC上信号传导和结构配体与T细胞上它们各自受体的相互作用和重排以形成允许这两个细胞之间联系和信号传导的三维(3-D)桥(图1)。APC和T细胞之间的抗原信号传导通过MHC/抗原复合体与T细胞受体复合体的结合而发生，同时免疫突触的结构完整性由APC上的ICAM、LFA-3和CD72分别与T细胞上的LFA-1、CD2和CD5受体的相互作用来维持。免疫突触的成功形成引起CD4+T细胞表达被称为CD40配体的B细胞刺激分子。
免疫突触的形成可以发信号使T细胞变成有活性或无活性的(无反应性的)。哪个反应被启动取决于APC上B7分子提供给T细胞的共刺激信号强度。B7分子可以与T细胞上的B7受体分子CD28或CTLA4相互作用。这些B7受体在它们在T细胞表面上的密度以及它们对B7分子的亲和力方面不同。CD28对B7的亲和力比CTLA4更低，但是在T细胞表面上以高得多的密度存在。B7与CD28受体的结合向T细胞发送活化信号，而CTLA4结合B7诱导T细胞无反应性(Kuby，J.，Immunology Third Edition 1997.eds Allen D.，pp-213-218)。因此，免疫突触中呈递过多B7将确保T细胞被活化。
在这个过程中，免疫的人B细胞经历免疫球蛋白基因重排，以产生高度特异性的高亲和力IgG抗体。
这个载体最初从MHC、B7和ICAM蛋白在胶体金颗粒表面上装配。免疫突触的呈递是三维方向的，以允许这个载体成功触发CD4+T-细胞以以MHC限制性方式表达CD40配体。
还任选使用表达CD40配体的sTc，联合各种细胞因子和其多个分子对治疗性mAb发出关键亲和力成熟信号的合成生发中心来启动这个过程。
                        实施例4
             具有间隔臂的sAPC/sTc/sGC的产生
这个sAPC建立在用于结合生物素化形式的MHC、B7和ICAM蛋白的链霉抗生物素蛋白胶态金颗粒上。这个单个颗粒sAPC具有更大的柔性，因为组成蛋白通过形成生物素-抗生物素蛋白桥的生物素化间隔臂与胶态金颗粒间接结合。类似地，可以使用与它们各个成分与胶态金属系链的类似策略产生sTc和sGCs。
                        实施例5
                自动装配的APCs/sTcs/sGCs
开发了自动装配的合成APCs。每个APC蛋白与不同胶态金颗粒结合产生免疫突触蛋白的复杂基质。为指导这个sAPC装配，制备定点分子支架以更好三维定向各种颗粒。图5所示的是这个自动装配的sAPC的表示。每个颗粒亚单位制剂允许单个颗粒结合多个试剂。为了阐明的目的，II类MHC分子与还结合链霉抗生物素蛋白的32nm胶态金颗粒结合。sAPC剩余的两个亚单位B7和ICAM与17nm颗粒结合。如同MHC颗粒，ICAM亚单位含有链霉抗生物素蛋白-停靠位点。为了装配这个颗粒，使用生物素化人血清清蛋白将ICAM和MHC颗粒连接在一起。为完成载体的装配，使用二硫醇化的聚乙二醇将MHC和B7颗粒连接在一起。
在这个模型中，免疫突触的形成通过T细胞受体/膜重排而发生。这个载体也可以与固体支持体台如EIA板结合。这个支架允许两个胶态金靶向的抗原和sAPCs存在于相同基质中。结果，原初B细胞免疫后，sAPC可以活化CD4细胞以表达CD40配体并因而诱导类别转换。
通过改变与CD40L/细胞因子或BLYS/CD30L的结合配偶体，产生了自动装配的合成T细胞或合成生发中心。
                     实施例6
              蛋白与胶态金颗粒的结合
蛋白与胶态金颗粒的结合受到胶态金溶胶和蛋白溶液pH的影响。在最适pH下，蛋白与胶态金颗粒表面结合并防止它们被盐沉淀。通过溶胶颜色从红色变为黑色容易地证明了胶态金的盐诱导沉淀作用。测定描述的每个蛋白的pH结合最适值，所述蛋白包括MHC、B7、ICAM、IL-6和KLH:TNF抗原。例如，如下所述步骤概述了MHC分子与胶态金颗粒结合的方法。类似步骤将用于确定每个其他蛋白的结合条件。
通过用1N NaOH将1ml等分试样的胶态金的pH从4调至11测定MHC与胶态金结合的pH结合最适值。将100μl等分试样的每种金溶液置于微量离心管并与1ng MHC蛋白温育30分钟。然后向每管添加100μl 10％NaCl溶液。pH结合最适值定义为允许MHC蛋白与胶态金颗粒结合，同时防止盐诱导的沉淀作用的pH。
除确定pH结合最适值之外，对每个蛋白进行饱和结合分析。对于这个试验，胶态金颗粒pH将被如上所述调至pH结合最适值。随后向100μl等分试样的胶态金中添加递增量的(0.025-5ng蛋白)MHC蛋白。结合30分钟后，将各个等分试样以10,000rpms离心以与结合胶态金的蛋白分开。分析上清液和胶态金沉淀中每个级分中存在的MHC蛋白相对量。
                      实施例7
            结合的MHC蛋白的质量的定量
为了定量与每个金颗粒结合的MHC蛋白的质量，开发定量EIAs进行MHC和B7蛋白的测量。ICAM的EIAs已经可从市场上买到。通过开发每个蛋白的竞争性结合的EIA来定量测量MHC和B7蛋白。使用pH 9.6的碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液将市场上可买到的B7和MHC蛋白的抗体(两个抗体都可从Research Diagnostics，Inc.得到)包被在EIA板上。产生MHC和B7参考标准物，以提供1.56ng/ml至500ng/ml的剂量范围。将这些标准物添加至含有MHC或B7蛋白的特异性抗体的EIA板。将结合胶态金的样品添加至EIA板中的其他指定孔中。
各种蛋白的浓度通过建立样品中存在的蛋白或标准物和生物素化形式分子对抗体位点的竞争性结合反应来测定。用链霉抗生物素蛋白碱性磷酸酶检测生物素化配体。添加底物后，样品中存在的分析物的质量和显色的颜色量之间产生相反的关系。
                      实施例8
              多个蛋白与相同颗粒的结合
为了增加体外免疫的效率和特异性，需要多个化学性质不同的蛋白结合到单个胶态金颗粒表面上。证明了三个不同蛋白细胞因子(IL-1、IL-6和TNF)与相同胶态金颗粒的结合。每个细胞因子在特殊的pH下与胶态金结合。
如上面所证明的，分别确定了IL-1在6至8的pH下结合胶态金，而IL-6在8至11的pH下结合。将在水中含0.25ng/ml三种细胞因子的溶液与胶态金溶胶在pH 8下混合。取出样品并将剩余溶液pH调至11。每个pH改变前，收集另外的样品。将两个样品离心，且将生成的胶态金沉淀重悬于PBS中。
为证明相同金颗粒上存在全部三种细胞因子，向包被了TNF的单克隆抗体的EIA板添加各种沉淀。结合后，洗涤板，并使指定孔与缀合碱性磷酸酶的兔抗IL-1、IL-6或TNF温育。洗涤后，向每孔添加底物以启动显色。图6中呈现的数据表明由于pH结合最适值重叠，pH 8时，IL-1和TNF都存在于颗粒上。然而，极少的IL-6信号可以被检测到。增加pH到11允许IL-6结合这些颗粒。
                   实施例9
             嵌合载体靶向特异细胞
使EGF和链霉抗生物素蛋白与相同32nm胶态金颗粒结合。样品被分成三个等分试样以进行第二/靶向分子的结合。一个样品与生物素化IL-1结合，另一个与生物素化GM-CSF结合，且第三个与生物素化IL-6结合。结合生物素化配体后，将样品离心以除去任何游离试剂，并将胶态金沉淀添加至Ficoll分离的人白细胞。培养8天后，用数字摄影术证明各种胶态金载体的摄取。
通过使用生物素化IL-1、生物素化GM-CSF或生物素化IL-6进行靶向，使EGF链霉抗生物素蛋白金靶向巨噬细胞(图7A)、树突细胞(图7B)和B细胞(图7C)。每个图中的黑色染色(用红色箭标突出显示)代表各种胶态金载体的摄取。
如在图7中可以看到的，各种胶态金/细胞因子嵌合体不同地靶向免疫系统的各种细胞元件。黑色染色(用箭标突出显示)代表胶态金颗粒，其已被各种免疫细胞内在化和聚集。这些数据表明IL-1将胶态金EGF靶向巨噬细胞，而GM-CSF将嵌合体靶向树突细胞，且IL-6将载体靶向B细胞。
                     实施例10
                 人淋巴细胞的免疫
这些载体可用于从分离的淋巴细胞产生初次免疫反应。通过密度离心从全血收集白细胞。用甲状腺球蛋白缀合的TNF/IL-6胶态金载体处理这些细胞。细胞每2天接受胶态金载体脉冲，共八天。最后脉冲后，将细胞培养另外5天。收集上清液并用直接EIA检测人抗人TNF(IgM/IgD和IgG联合)抗体的存在。如图8中可以看到的，嵌合cAU甲状腺球蛋白TNF具有最高的免疫密度。
                      实施例11
            免疫人B细胞和树突细胞以表达II类MHC
使用增加体外人淋巴细胞免疫效率的两个不同方法。首先，TNF与免疫原性载体，如甲状腺球蛋白、钥孔血蓝蛋白或鼠血清清蛋白偶联提高TNF的免疫原性。使用标准EDC/NHS和戊二醛(gluteraldehyde)方法进行载体：TNF缀合。其次，它们与含有细胞特异性靶向试剂的胶态金颗粒偶联增加这些抗原的特异性。为将抗原递送靶向于B细胞，使载体：抗原复合体与包含IL-6的胶态金颗粒结合。为将载体抗原递送靶向于树突细胞，使载体：抗原复合体与包含GM-CSF的胶态金颗粒结合。
这些载体最初用于免疫原初MHC限制的人B细胞和树突细胞，以产生II类MHC抗原。这些相同的载体后来用于从新的或复制组的原初B细胞诱导初次抗体应答。免疫方案包括用各种载体顺序免疫B细胞和树突细胞。结果，B细胞和树突细胞遇到载体一次，而TNF抗原遇到三次。
                    实施例12
               B细胞产生II类MHC蛋白
为引起人B细胞产生II类MHC蛋白，将106个表面IgM+/IgD+人B细胞铺在24孔板上并在1.5ml AIM V培养基中培养。铺平板后二十四小时，用与IL-6靶向的胶态金载体结合的THYRO:TNF抗原脉冲细胞。两天后，用IL-6载体靶向的KLH:TNF载体脉冲细胞。培养另外两天后，用第三个载体：TNF抗原MSA:TNF免疫细胞。将细胞温育另外三至七天并通过FACS分析检测II类MHC表达的存在。可供选择地，可以用胶态金抗原同时脉冲细胞。
类似的步骤用于脉冲树突细胞以表达II类MHC蛋白。用与GM-CSF靶向的胶态金载体结合的TNF：载体抗原免疫这些细胞。使用包被了抗CD34的磁珠从外周血分离树突细胞前体。体外扩展这些细胞，这通过在补充了1000ng/ml GM-CSF和100ng/ml IL-4的AIMV无血清培养基中培养它们来实现。通过用于探测CD1a和空II类MHC分子的FACS分析证实它们成熟后，用10ng/ml TNF脉冲使细胞分化为成熟树突细胞。用GM-CSF靶向的胶态金TNF抗原免疫这些成熟的树突细胞。检测负载抗原的II类MHC蛋白复合物，这通过FACS或用链霉抗生物素蛋白缀合的藻红蛋白(Research DiagnosticInc.)检测系统检测的生物素化抗原肽的原位分析来实现。
                 实施例13
       用于II类MHC抗原分离方法的发展
分离MHC的方法使用“一般的”非MHC相容性血液样品。这些MHC分子用于限定胶态金颗粒上蛋白的pH和饱和最适值。一旦限定了，这些方法就适于从免疫的MHC限制的血液库中纯化负载抗原的MHC。
使用Sette描述的方法进行一般的和负载抗原的人II类MHC的分离(Sette等人，J.Immunol.1992.148：844)。简言之，将来自非HLA匹配的人全血的棕黄层以108个细胞/ml的最小密度冷冻，并进行超声处理以破裂细胞。使这些细胞悬浮于含2％Renex、150mM NaCl、5mM EDTA和2mM PMSF的50mM TRIS-HCl、pH 8.5的缓冲液中。通过离心除去大的微粒，包括核(10000×g 20分钟)。然后将细胞溶解产物在通过使抗人II类MHC分子的鼠抗体(ResearchDiagnostics Inc.)与蛋白A/G琼脂糖珠结合制备的亲和柱上分级分离。使溶解产物通过该柱至少5次，以使MHC蛋白与固定的抗体的结合最大化。用含10mM TRIS-HCl pH 8.0/0.1％Renex的10柱体积缓冲液洗涤该柱，随后用含1％正辛基葡糖苷(n-ocytlglucoside)的5柱体积PBS另外洗涤。使用具有1％正辛基葡糖苷，pH 11.5的50mM二乙胺盐水缓冲液从柱洗脱II类MHC蛋白。洗脱后，立即通过添加2M甘氨酸、pH 2.0中和每个级分。使含II类MHC分子的级分等分试样并以25μg等分试样冻干。
                   实施例14
                人B7.1分子的产生
用重组DNA技术制备人共刺激分子B7.1。基因作为市场上可买到的瞬时表达载体系统(InVivogen Inc.)的一部分来提供。为构建体提供允许从质粒构建体分离活性基因的合适限制位点。使用限制性内切酶NcoI和NheI从pORF宿主质粒分离人B-7.1基因。这个双酶切消化导致两个线性化DNA片的形成。一个基因片段由B-7.1基因(893bp)组成，而另一个片段(3210bp)组成p-ORF质粒的辅助基因。在1％琼脂糖凝胶上分级分离基因片段并用溴化乙锭染色显色。从凝胶切下条带并使用QuiaQuick凝胶提取树脂纯化。将纯化的线性化基因插入杆状病毒表达系统(CloneTech Inc.)，所述表达系统在强CMV启动子的控制下。根据厂家说明书和条件，将杆状病毒整合的基因转染入SF9昆虫细胞系。106个B7转染的NOS细胞将在生物反应器中扩展。用亲和层析处理培养基和细胞溶解产物，其中使用预先固定在A蛋白/G琼脂糖凝胶柱的抗人B7.1蛋白的鼠单克隆抗体(Research DiagnosticsInc)。
                        实施例15
         合成的抗原呈递细胞的产生：单个颗粒sAPC
为使初次抗体应答成熟，有能力的sAPC必须诱导引起抗体类别转换的CD4T细胞/B细胞相互作用。通过结合胶态金单个颗粒上免疫突触蛋白开发第一个sAPC。检测这个载体以及链霉抗生物素蛋白胶态金核心上建立的一个载体活化CD4+T细胞的能力。
一旦分离了免疫突触的成分并将其纯化至均一，它们就与胶态金颗粒结合以开发单个颗粒sAPC。使用两个策略开发这些APCs。第一个策略包括免疫突触成分(即负载肽的MHC、B7和ICAM分子)与胶态金颗粒的直接结合。尽管不希望受限制，但人们相信每毫升金将结合250ng每种蛋白/毫升胶态金溶胶。
第一个支架装配在EIA板表面上。该材料包括包被了人TNF的单克隆抗体的EIA板；32nm TNF/链霉抗生物素蛋白胶态金嵌合体；生物素化BSA：17nm链霉抗生物素蛋白胶态金载体；生物素化人IL-6、缀合碱性磷酸酶的兔抗人IL-6。将各种成分装配入支架，如图9A描绘的。这个研究的对照简单地为32nm颗粒，无支架构建于其上的TNF停靠位点。如图10A表示，当全部支架分子块料存在时，产生强信号。仅通过省去TNF停靠位点，不形成支架，且结果无信号产生。
免疫突触蛋白与胶态金单个颗粒的直接结合导致颗粒表面上蛋白的严格定向。为了增加sAPC上这些蛋白运动的灵活性，开发可替换的单个颗粒sAPC。这种单个颗粒sAPC是在结合生物素化形式的MHC、B7和ICAM蛋白的链霉抗生物素蛋白胶态金平台上开发的。该蛋白通过经由间隔臂连接蛋白的生物素残基与链霉抗生物素蛋白金颗粒结合。
使用几个生物素化试剂如NHS-生物素(Pierce Chemical Co.)使蛋白生物素化。这个试剂在蛋白和生物素部分之间放置1.35nm的间隔臂。可供选择地，使用NHS-LC-LC-生物素使蛋白生物素化。这个试剂在蛋白和生物素残基之间放置3.05nm的间隔壁。这种间隔臂促进蛋白运动以促进配体结合。这个增添的灵活性提高了蛋白完成适当的三维定向和与CD4+T细胞形成有功能的免疫突触的能力。
                   实施例16
               自动装配的sAPC的产生
多颗粒sAPC在免疫突触形成过程中将具有自动定向的灵活性。灵活性是装配用于将颗粒连接在一起的部分的直接结果。接头可以是烷、蛋白和聚乙二醇(PEG)，以允许最大的载体功能性。
使用包含四个末端游离硫醇的四臂聚乙二醇(10,000MW)主链装配第二个支架(图9B中所示)。这个接头用于连接与IL-1或TNF结合的胶态金单个颗粒。连接后，将制剂离心并使用仅用IL-1单克隆抗体包被的EIA板测定两种蛋白。结合后，洗涤板并使用连接IL-1或TNF多克隆抗体的酶进行检测。类似地，图9B中描述的载体只有在在接头存在下才对两种蛋白产生信号(图10B)。没有接头时，仅观察到背景色。
为进一步增加sAPC的灵活性，将成分蛋白装配在不同胶态金颗粒上。将这些颗粒装配入支架系统，以产生能够诱导CD4+T细胞活化的sAPC。溶液中可以使用多颗粒sAPC，或如图9A和9B所示提供EIA板上固体支持体。
MHC、B7和ICAM蛋白与如前所述的不同胶态金颗粒结合。通过各种支架分子物理地连接颗粒。“连接”分子的功能是提供免疫突触形成中胶态金单个颗粒的更大灵活性。无论sAPC作为独立颗粒还是作为与固体表面结合的部分基质提供，都发生这个灵活性。
第一个添加物由修饰的二硫醇烷部分组成。烷二硫醇的功能是通过形成硫醇-金键使胶态金单个颗粒结合在一起。在生物传感器开发中，已使用这些部分在玻璃载玻片表面上建立自动装配的金结构(Mirkin，C.A，Letsinger，R.，Mucic，R.C.，和Storhoff，J.J.Nature.1996.382 607-609)。硫醇基允许烷部分直接与胶态金颗粒表面结合。市场上可买到的烷硫醇试剂的实例包括：1，5戊烷二硫醇、1，6己烷二硫醇和癸烷二硫醇(Sigma Chemical Company)。
作为烷二硫醇的替换物，也使用各种大小的2、3和4臂聚乙二醇(SunBio，Walnut Creek，CA)。这些聚合物的每个臂都具有游离硫醇基，其用于通过形成金-硫醇结合而结合胶态金单个颗粒。这些试剂提供在水中完全溶解度的另外优点。
免疫突触的多个蛋白部分与胶态金单个颗粒或多个颗粒结合使得能够产生合成的抗原呈递细胞(sAPC)，所述抗原呈递细胞能够驱动引起免疫人B细胞中类别转换的细胞事件。
                    实施例17
           sAPC刺激CD4+T细胞以表达CD40配体
测试单个颗粒和自动装配的sAPCs诱导MHC限制的CD4+T细胞表达CD40配体的能力。随后，将0.1至10μg负载抗原的MHC(在sAPC上呈递)添加至在AIM V培养基中生长的106个II类限制的CD4+T细胞中。该刺激发生在IL-4和IL-10存在下，其驱动CD4+T细胞的TH2亚型产生。sAPC刺激4、12和24小时后，收集CD4细胞并用FITC标记的小鼠抗人CD40配体抗体染色并用FACS进行分析。
在CD4+T细胞活化过程中，如前文所述免疫新的一组MHC限制的B淋巴细胞(即未用于分离MHC的细胞)，以产生抗原特异性IgM抗体。使用以前描述的靶向的TNF抗原免疫MHC限制的B细胞。检测抗原特异性IgMs和从它们各自的细胞产生CD40配体后，将活化的CD4+T细胞添加到分泌IgM的B细胞。通过检测人抗人TNFIgGs来监控类别转换。使IgG阳性克隆与如下所述的K6H6/B5小鼠人异源骨髓瘤(heteromyeloma)细胞系融合。
                     实施例18
             抗体检测和B细胞的无限增殖化
组合来自阳性孔的所有细胞，离心一次，用PBS洗涤，并与2×106个小鼠/人异源骨髓瘤K6H6/B5细胞组合。异源骨髓瘤细胞系K6H6/B5(可通过ATCC得到)是这些人淋巴细胞的理想融合配偶体，因为这些癌细胞是抗体的非分泌者且可以获得，没有专利限制。使用用PEG的标准融合方案融合人和骨髓瘤细胞。使用传统的HAT/HT选择方案选择成功融合的细胞。使用直接ELISA检测生长的克隆的TNF特异性人IgG抗体的产生。将显示抗原识别的那些克隆按比例增加至T-75瓶中，在这点冷藏所有克隆并如下所述检测它们的上清液中的中和抗体的活性。
                    实施例19
               TNF生物活性的中和
使用充分表征的WEHI 164生物测定法检测TNF抗体中和TNF生物活性的能力。简言之，TNF剂量依赖性抑制这些细胞的体外增殖。为了这个生物测定，将5000个WEHI细胞铺平板在24孔组织培养簇中。向板中指定孔添加TNF(15.6pg/ml至500pg/ml)。为了测定人单克隆抗体中和TNF作用的能力，在1μg每种TNF单克隆抗体存在下，制备相同标准剂量范围的TNF标准物。将各种处理的细胞培养5天，并使用Coulter计数器确定细胞数目。
                    实施例20
   离子强度对结合胶态金的TNF的冻干稳定性的影响
将如图11所示的胶态金结合装置用于将TNF与如前所述的胶态金纳米颗粒结合。结合后，将30K PEG-硫醇以50μg/ml添加至pH 9的去离子水溶液中。
为了检测离子强度对TNF-胶态金键稳定性的影响，向容纳TNF溶液的容器中添加各种量的盐(1×标准磷酸缓冲盐水形式；PBS)。PBS终浓度从0至0.325％的标准PBS变化。结合和渗滤后，向样品中添加冷冻保护剂(甘露糖醇20mg/ml；人血清清蛋白5mg/ml)。随后将样品等分试样为1ml样品并在-80℃冷冻。冷冻后，将样品冻干至干燥并在真空下密封。
随后，用1ml去离子水重构样品，并用1％PEG-1450/水溶液稀释十倍。将样品离心，以使结合胶态金的TNF与游离TNF分离。用EIA分析胶态金沉淀和上清液两者的TNF浓度。这些研究的数据在表I中示出。
表1.在不存在盐的情况下制备的冻干胶态金TNF的释放特征
                                总TNF百分比
胶态金沉淀                      68
上清液                          32
表I表明32％的TNF是从冻干后载体中释放的。在重复研究中，我们观察到多达50％的蛋白是冻干后释放的。
                    实施例21
增加离子强度对冻干的胶态金-TNF药物稳定性的影响
通过添加0.25×溶液(77.25毫渗透压摩尔/kg)来修饰在3mMTRIS溶液中预先稀释至0.5μg/ml TNF终浓度的TNF溶液。溶液如上文所述结合。结合后，添加如上文所述的30K PEG-硫醇和冷冻保护剂并在-80℃冷冻样品。如上文所述冻干样品，随后重构和分析重构的样品中存在的游离和与胶态金结合的TNF的量。这些研究的数据在图12中示出。
如在图2可以看出的，增加离子强度显著提高冻干过程中载体的稳定性。盐效应是剂量依赖性的。如表II所示，在添加到TNF的盐量降低时，冻干后更多蛋白被释放。
表II.盐浓度对载体冻干后TNF释放的影响
盐浓度               0      4.5    19.3    46.5    77.25
(毫渗透压摩尔/kg)
释放百分比           40     30     10      6       6
在不存在盐的情况下结合TNF导致一部分TNF结合在离子双层中，而不是直接结合在金颗粒上(图13)。冻干过程中，溶剂化离子层的水丧失，且因此重构后，这些载体释放与离子云结合的一部分TNF。通过添加盐来增加离子强度，离子层收缩/破坏(图14)并允许全部TNF直接与颗粒表面结合。冻干后，这个制剂的全部TNF与颗粒表面结合。
上面引用的全部专利、出版物和摘要的全部内容都在此并入作为参考。应该理解前文仅仅涉及本发明的优选实施方案，而且其中可以进行许多改动或变更，而不背离下列权利要求中限定的本发明的精神和范围。

Claims (31)

1.一种载体组合物，其包含合成的APC，其中合成的APC包含胶态金属、抗原和成分特异性免疫刺激剂。
2.权利要求1的载体组合物，其中所述成分特异性免疫刺激剂包括抗原、胶态金属、佐剂、受体分子、核酸、免疫原性蛋白、辅助细胞因子/免疫刺激剂、药物、化疗剂或载体。
3.权利要求1的载体组合物，其中所述成分特异性免疫刺激剂包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、脂质A、磷脂酶A2、内毒素、葡萄球菌肠毒素B、I型干扰素、II型干扰素、肿瘤坏死因子(TNF-α)、Flt-3配体、转化生长因子(TGF-β)、淋巴毒素、移动抑制因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(CSF)、单核细胞-巨噬细胞CSF、粒细胞CSF、血管上皮生长因子(VEGF)、血管生成素、转化生长因子(TGF-α)、热激蛋白、血型的碳水化合物部分、Rh因子、成纤维细胞生长因子、炎性和免疫调节蛋白、核苷酸、DNA、RNA、mRNA、有义、反义、多核苷酸、癌细胞特异性抗原、突变体p53、酪氨酸酶、粘蛋白、自身免疫抗原、免疫治疗药、血管生成或抗血管生成药。
4.权利要求3的成分特异性免疫刺激剂，其中所述癌细胞特异性抗原是MAGE、BAGE或MART。
5.权利要求3的成分特异性免疫刺激剂，其中所述粘蛋白是MUC-1、PSA或TSH。
6.权利要求1的载体组合物，其中所述胶态金属包括胶态金、胶态银、胶态铁、胶态铝或胶态铂。
7.权利要求1的载体组合物，进一步包含药物可接受成分，所述成分包括赋形剂、缓冲液或载体。
8.权利要求1的载体组合物，进一步包含佐剂，其中所述佐剂包括脂质体、乳剂、微球体、可生物降解的聚合物和聚苯乙烯、明矾、热杀死的丁酸分枝杆菌和结核分枝杆菌、百日咳毒素和破伤风毒素、或LPS和葡萄球菌肠毒素B。
9.权利要求1的载体组合物，其中所述载体进一步包含共刺激蛋白。
10.权利要求1的载体组合物，其中所述载体进一步包含主要组织相容性复合体。
11.权利要求1的载体组合物，其中所述载体进一步包含生发中心。
12.权利要求1的载体组合物，其中所述载体进一步包含结构蛋白。
13.权利要求1的载体组合物，进一步包含靶向分子、整合分子、PEG、衍生的PEG、聚-L-赖氨酸或衍生的聚-L-赖氨酸、生物素-抗生物素蛋白、双功能PEG或双功能聚合物。
14.权利要求13的载体组合物，其中所述双功能PEG包含硫醇和生物素。
15.权利要求13的载体组合物，其中所述聚-L-赖氨酸包含硫醇和生物素。
16.权利要求1的载体组合物，其中合成的APC是冻干的并且在施用前被贮藏一段时间。
17.一种体外生产单克隆抗体的方法，其包括：a)将抗原、成分特异性免疫刺激剂与胶态金属混合或结合以形成合成的APC；和b)体外刺激来自人的免疫细胞以活化免疫细胞，以产生对合成的APC的初次反应；其中合成的APC包含抗原、成分特异性免疫刺激剂和胶态金属；和c)使活化的免疫细胞无限增殖化；和d)选择产生单克隆抗体的细胞。
18.权利要求17的方法，进一步包含主要组织相容性复合体。
19.权利要求17的方法，进一步包含生发中心。
20.一种包含完全人蛋白的抗原特异性、人特异性单克隆抗体，其由下述方法制备：
a)体外刺激来自人的免疫细胞以活化免疫细胞，以产生对合成的APC的初次反应；其中合成的APC包含抗原、成分特异性免疫刺激剂和胶态金属；和
b)使活化的免疫细胞无限增殖化；和
c)选择产生单克隆抗体的细胞。
21.一种影响免疫反应的方法，其包括施用包含至少一种胶态金属颗粒、抗原和至少一种成分特异性免疫刺激剂的组合物。
22.一种增强疫苗功效的方法，其包括施用包含至少一种胶态金属颗粒、抗原和至少一种成分特异性免疫刺激剂的组合物。
23.一种治疗疾病和免疫相关机能障碍和病理的方法，其包括给人或动物施用治疗有效量的包含合成的APC的载体组合物，其中所述合成的APC包含至少一种胶态金属、抗原和成分特异性免疫刺激剂。
24.权利要求23的方法，其中所述胶态金属颗粒具有不同的大小。
25.权利要求24的方法，其中施用成分特异性免疫刺激剂、抗原和不同大小的胶态金属颗粒包括将成分特异性免疫刺激剂、抗原和不同大小的胶态金属颗粒作为一剂同时施用。
26.权利要求23的方法，其中该方法在治疗疾病中用于刺激或抑制免疫成分，其中所述疾病是癌症、实体肿瘤癌、克罗恩病、乳腺癌、银屑病、炎性肠病、成人呼吸窘迫综合征、变态反应、鼻炎、湿疹、荨麻疹、过敏反应、移植排斥、风湿性疾病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、血清阴性的脊椎关节炎疹、Sjogren氏综合征、系统性硬化病、多发性肌炎、皮肌炎、I型糖尿病、获得性免疫缺损综合征、Hashimoto氏甲状腺炎、Graves氏病、Addison氏病、多内分泌自身免疫病、肝炎、硬化性胆管炎、原发性胆汁性肝硬变、恶性贫血、乳糜泻、抗体介导的肾炎、肾小球性肾炎、Wegener氏肉芽肿病、微观多动脉炎、结节性多动脉炎、天疱疮、疱疹样皮炎、银屑病、白癜风、多发性硬化、脑脊髓炎、Guillain-Barre综合征、重症肌无力、Lambert-Eaton综合征、巩膜、巩膜外层、葡萄膜炎、慢性粘膜皮肤念珠菌病、Bruton氏综合征、婴儿期一过性低丙种球蛋白血症、骨髓瘤、X连锁高IgM综合征、Wiskott-Aldrich氏综合征、共济失调-毛细血管扩张症、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少症、自身免疫性嗜中性白细胞减少症、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、淀粉样变性、慢性淋巴细胞性白血病或非何杰金氏淋巴瘤。
27.权利要求23的方法，进一步包含主要组织相容性复合体。
28.一种多颗粒自动装配的合成的APC，其包含至少两个胶态金属、抗原和至少一个成分特异性免疫刺激剂，其中所述多颗粒合成的APC是使用支架分子装配的，且其中所述支架分子包括生物素化的间隔臂、烷接头、蛋白、聚乙二醇、衍生的PEG、多臂PEG或硫醇化聚-L-赖氨酸。
29.权利要求28的多颗粒自动装配的合成的APC，其中所述胶态金属颗粒具有不同的大小。
30.权利要求28的多颗粒自动装配的合成的APC，进一步包含靶向分子和整合分子。
31.权利要求28的方法，进一步包含主要组织相容性复合体。
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