JPS61104796A - モノクロ−ナル抗体の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規なハイブリドーマを形成し、該ハイブリ
ドーマをクローニングしてヒト型抗ＨＢｓモノクローナ
ル抗体を製造する方法に関する。

業　の利　　野 Ｂ型肝炎ウィルスは急性肝炎を起すのみならず、ウィル
スの持続感染により、肝機能不全や回復不能な慢性肝炎
をも引き起すという恐しい感染源である。更に時には肝
硬変からさらに肝癌にまで進行するともいわれておシ、
これに対する早急な対策の確立が切望されている。

Ｂ型肝炎ウィルスに対する関連抗体としては、主として
３種が知られている。すなわち、ウィルス表面抗原（Ｈ
Ｂｓ）に対する抗体、ウィルス粒子内部のコア抗原（Ｈ
Ｂｃ）に対する抗体およびコア抗原内に含まれるとされ
るｅ抗原（Ｅ（Ｂｅ）に対する抗体の３種である。

この中で抗ＨＢｓ抗体はＢ型肝炎つイｌレスに対する中
和活性を有しその感染防御効果を期待できることが近年
明らかにされてきた。

このようなり型肝炎ウィルス感染予防の目的で、抗ＨＢ
ｓ抗体製剤を、ヒトのＨＢｓ抗体陽性血漿を原料として
製造することがはかられている。しかしこのような血漿
に由来する特異抗体の製造において、原料面で制約があ
ること、従って原価的に高くなることなどが懸念される
。本発明はこのような問題点を克服し、解決せんとする
ものでるる。

従来技術 特公昭５９−２２７６号にはひ臓または淋巴節に見出さ
れるウィルス抗体生産性細胞とミエローマ細胞との融合
細胞バイブリドを調製し、該バイブリドを培養し、そし
てウィルス抗体を採取するというウィルス抗体の製造方
法が開示されている。しかるにここで対象とされるウィ
ルスはインフルエンザウィルスおよび狂犬病ウィルスで
あり、また本願の目的はマウスにウィルスを注射して、
該マウスのひ臓細胞による抗体産生を誘導させ、該ウィ
ルス抗体生産性ひ臓細胞とＭＯＰＣ−２１ラインに由来
スるＢＡＬＢ／Ｃミエローマセルクローンとの融合細胞
バイブリドを形成させるという、マウスとマウスの融合
ハイブリドーマである。

しかしながらこのようにして産生された抗体はマウス型
でかつマウス由来のものでめるという点に最大の難点が
１）、これが安全性に全く疑問を残さずにそのまま人体
に投与可能な抗体製剤となり得るかについて何らの保証
としては、たとえば特開昭５６−１５８７１８号に開示
されているが、この技術もマウス×マウスに由来するハ
イブリドマ細胞系であり、果してヒトに用いて有用な抗
体となシ得るか否かについては、上記と同様な懸念があ
る。

また抗ＨＢｓモノクローナルヒト型抗体の製造方法とし
ては、たとえば特開昭５８−７２５２６号が公知である
。これはＨＢｓ抗原を尿素、グアニジンのような蛋白変
性剤の存在下に加熱したものを免疫原として用いること
によりヒトＢ　ＩＪンバ細胞に対して該細胞による抗体
産生を刺激し、その後Ｅｐｓｔｅｉ、ｎ　Ｂａｒｒ　ウ
ィルスにより継代培養可能な増殖型に細胞を形質転換す
ることを最大の特徴とする。しかし本公報にはヒト製杭
ＨＢｓモノクローナル抗体の性状については具体的な開
示はなんらなされていない。

発明の目的 本発明者等はこのような従来技術の欠点を克服すべく、
長年にわたシ種々研究を重ねたのでりるが、ここにＨＢ
ｓ抗原で免疫されたヒトから得られたとトＢリンパ系細
胞をマウス骨髄腫細胞と融合せしめてハイブリドーマを
形成し、該ハイブリドーマをクローニングしてヒト型抗
ＨＢｓモノクローナ／”ＦＣ体（ｈＨＢｓＭＣＡ）を産
生ずる方法を完成するに至った。

かくして本発明は、前記のバイブリドーマを作成し、こ
れを培養してｈＨＢＳ　ＭＣＡを安定して連続的に産生
せしめることをその目的とするものである。

本発明にかかるｈＥ（Ｂｓ　ＭＣＡはハイブリドーマ由
来であるため、Ｂ型肝炎つイ／レス混入の危険性は皆無
である。そして一旦確立されたハイブリドーマは液体窒
素を用１バて長肋間保存することが可能であるため、い
つでも容易に培養増殖してｈＥ（ＢｓＭＣＡの量産を期
待することができる。従って原料確保の心配もなく、又
精製過程もそれ程腹維でなく、低コストで製造できる。

さらにモノクローナル抗体（ＭＣＡ）であるため、血漿
由来のＨＢｓ抗体に比して非常に高い特異性を有すると
いう特徴がある。まだマウス抗ＨＢｓ　ＭＣＡに比して
、ヒト型抗体であるため、ヒトの生体内に投与しても副
作用を示さないという利点を有する。以下このような利
点を有するヒト型ＭＣＡの製造方法について説明する。

発明の構成および効果 本発明はＢ型肝炎表面抗原に対するヒト型ＭＣＡを産生
ずるマウス×ヒトの融合ハイブリドーマを作成せしめる
ものである。

まずヒトにＢ型肝炎ワクチンを皮下投与してＨＢｓ抗原
に対する抗体を産生ずるＢリンパ系細胞を刺激するが、
対象とするヒトは高いＨＢＳ抗体価を有するヒトが望ま
しい。次にワクチン投与後２〜３週目に末梢血リンパ細
胞を採取しｉｎ　ＶｉｔｒＯで培養する。このときホー
クライードマイトジェン（ＰＷＭ　）の如きリンパ球浩
性化物質を用い、末梢血リンパ細胞を活性化する。この
ようにして得られたヒトＢ　ＩＪンパ系細胞を回収し、
マウス骨髄腫細胞（Ｘ６３−Ａｇ８−６．５．３又は他
ｔｙ）　ＭＯＰＣ−２１ライン）と融合剤を加えて融合
し、マウス×ヒトのハイブリドーマを形成せしめる。さ
らにｈＨＢｓ　ＭＣＡを連続的に産生せしめるために、
該ハイブリドーマをクローニングし、そのハイブリドー
マクローンをｉｎ　ｖｉｔｒ○で、あるいはヌードマウ
スなどの免疫不全動物の生体内で産生せしめるものであ
る。

なお以上の工程を更に詳述すれば、本発明の方法によれ
ば、まずヒトリンパ細胞の供給者はＨＢＳ抗体陽性であ
るヒトでるることが必須である。更にこれらのヒトが、
血中１０工Ｕ／？？Ｌ１以上のＨＢｓ抗体価を有するヒ
トであることが好ましい。そのため一つの目安として、
過去においてＢ型肝炎つィルスに感染した可能性のある
高い血中ＨＢｓ抗体価（たとえば０．１工ＴＪ／、、２
以上）を有する　ヒトであって、ＨＢｓワクチンを投与
しその１〜２週後の血中Ｅ（ＢＳ抗体価が１０工Ｕ／ｒ
ｒＬ１以上に上ったヒトが望ましい。もし、ワクチン投
与前の血中ＨＢｓ抗体価が全く検出されないヒトや、さ
らにはワクチン投与後の血中ＨＢｓ抗体価が１０工Ｕ／
ｎ′ＬＪ−未満のヒトの８９７８球を融合に使用する場
合には、ｈＨＢｓ　ＭＣＡを産生ずるマウス×ヒトの融
合にかかるハイブリドーマはきわめて得られにくい。

後、融合に用いる。

１１１１合方法は公知の如何なる方法で゛もよいが、融
合剤としてポリエチレングリコールなどを例示すること
ができる。

融合したハイブリドーマの選択は、たとえば３７°Ｃ１
５％Ｃ０２存在下でグルタミン添加ＲＰＭ１１６４０＋
１５％牛脂児血清＋Ｅ（ＡＴのようなＨＡＴ選択培地で
培養して達成される。

抗ＨＢＳ抗体を産生じているハイブリドーマは、ＨＢＥ
ｉ抗原感作ヒツジ赤血球を用いた受身赤血球凝集法（Ｐ
ＨＡ法）、工ｇＧ　、１ｇＭ等の抗体定量法、ラジオイ
ムノアッセイ等により測定して確認ができる。かくして
選別された抗ＨＢｓ抗体産生のマウス×ヒトのハイブリ
ドーマは限界希釈法によシ単−クローン化され、単一の
ヒト製杭ＨＢＳ抗体を産生ずる単一クローンとして確立
される。さらに安定な抗体産生クローンを確立するため
には、早い時期にこのクローニング操作を繰り返し行な
うことが必要である。

このようにして確立したｈＨＢｓ　ＭＣＡ産生のマウス
×ヒトのハイブリドーマクローンは、前述のＥ（ＡＴ培
地中あるいはヌードマウスなどの免疫不全動物の生体内
培養で継続して増殖させ、該ＭＣＡを産生させ続けるこ
とができる。

−例としてプリスタンで処理した免疫不全動物（ＢＡＬ
Ｂ／Ｃ由来ヌードマウス）に得られたクローンを腹腔内
接種し、３〜５週間後にその腹水の抗ＨＢＳ抗体を、Ｒ
工Ａ法で測定したところ、７匹中３匹から特異抗体が侍
られた。７ｈＨＢｓ　ＭＣＡの回収は、辿常の免疫グロ
ブリンの回収法でめる塩析法、ＤＥＡＥ−イオン交換ク
ロマトグラフィ法、ポリエチレングリコール分画法、ゲ
／Ｌ’　ｆ濾過法などや、ＨＢｓ仇原固定化ビーズを使
用したアフイニテイクロマトグラフイ法などを組合せて
、前記ハイプリド−マ培養上清やヌードマウス腹水等か
ら回収する。なお必要に応じてたとえば静注用免疫グロ
ブリン製剤の製造に用いられる公知の処理法（酸処理、
酵素処理、プラスミン処理、スルホン化剤処理、ホリエ
チレングリコール処理等）を施してもよい。精製抗ＨＢ
Ｓ抗体は４度調整し、適当な安定化剤等を添加し、除菌
ｔ濾過を行なって凍結乾燥するなど、常法に従って製剤
化することができる。

本発明により得られたマウス×ヒトハイブリドーマが産
生する抗ＨＢｓ　ＭＣＡの免疫グロブリンクラスは、ヒ
トエｇＧであることが、免疫沈降法により明らかとなっ
た。この抗体はウサギ抗マウスエｇ抗血清とは全く沈降
物を形成せず、ウサギ抗ヒ）　工ｇＧ抗血渭とのみ沈降
物を形成することから、該抗体はヒト型抗体でるると判
断される。さらに、本ＭＣＡが完全なヒト型ＭＣＡであ
ることを証明するために、免疫沈降法より感度の高いラ
ジオイムノアッセイ法を用いて精査をした。その結果前
記ＭＣ’Ａは放射標識ウサギ抗ヒトＩｇＧとは、抗体濃
度に直線的に反応するが、放射標識ウサギ抗マウスエｇ
Ｇとは全く反応が認められなかった。それ故該抗ＨＢｓ
ＭＣＡは完全なヒト型抗体であって、マウス、ヒトのキ
メラ抗体ではないことが明らかである。

さらに該ｈ　ＨＢｓ　ＭＣＡは、ＨＢｓ抗原感作ヒツジ
赤血球を用いた赤血球凝集反応の抑制試験（ＰＨＡ−１
，ｎ　ｈｉ　ｂｉｔｊ−ｏｎ　）により、Ｂ型肝炎つイ
ｌレス表面抗原のエピトープａ（Ｂ型肝炎ウィルスの共
通抗原決定基）を認諌するＭＣＡであることが判明した
。

ＨＢＳ抗原はすべてに共通な抗原決定基（エピトープ）
ａと２組の対立するエヒｉ・−７”　ｄ　。

ｙとｗ、ｒがあるために、ａｄｗ、ａｄｒＳａｙｗおよ
びａｙｒの４亜型に分けられるが、本究明で示した方法
によってａを認識するＭＣＡが得られる意義はきわめて
大きい。またこの技術によって他の抗原ｃｔ、　ｒ、　
ｙ、　ｗに対するＭＣＡを得ることは同様に可能である
。

なお本発明によシ得られた該ハイグリドーマは通常Ｏｉ
ｎ　ｖｉｔｒｏ培養で、７　ｐｇ／ｍノ（７ｐ　＃１５
Ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｒＬＪ　）の抗Ｅ（Ｂｓ特異抗体
産生を示し、その抗体価はＰＡＨ価２１２．５０国際単
位（工Ｕ）／７ｙＬＪ−であった。これらの値は十分実
用に適する値である。

また前記ハイブリドーマは倍加時間（ダブリングタイム
）３０時間であり、Ｑバンド、染色法によりヒト抗体の
γ鎖をコードするヒト第１４染色体を含んでいることが
判明している。

以上説明した方法によって製造された、ｈＨＢｓ　ＭＣ
Ａを産生ずるハイブリドーマは抗体産生等において安定
した性能を示し、本発明者等は少くとも１ケ年を経過し
ても何ら　異状が認められないことを確認している。

かくして本製造方法はその工程に無理がなく　確実に実
施できるとともに、本製造方法によって製造されたｈ　
ＨＢｓ　ＭＣＡは抗ウィルス剤、診断薬、ＨＢＥｉ抗原
稍製用等広範囲に利用できる。

ｐぎに実施例について述べるが、本発明の方法はこれに
限定されるものではない。

実施例 ■　免疫用抗原（ワクチン）の調製 Ｏ５ｔｅｐ　ＬＨＢｅ抗体陽性血漿を塩化カルシウムと
デキストラン硫酸で処理し、上清を１．２Ｍ硫安で塩析
した。遠心後上清に１．８Ｍになるように硫安を加えて
Ｅ（ＢＳ抗原を沈殿させた。これらの塩析により人血漿
成分を約８０％除去すると共に、約ＩＡｏ量にａｍした
。

Ｏ５ｔｅｐ　２．　　ＤＦＥＡＥ−セフ７ＣＩ−ズＧＬ
−６Ｂ（ファルマシア社製）ゲルを、イオン強度０．０
５　、ｐＥ（５，５の酢酸バッファーで十分平衡化した
後カラムに充填し、５ｔｅｐ　ｉで処理したＨＢＳ抗原
溶液を同バッファーで十分透析し、生じた沈殿物を遠心
で除いた後カラムにながした。溶出は塩化ナトリウムに
よるイオン強度ステップワイズにておこなった。

ＨＢｓ抗原の８０％は素通り画分に回収され、その精製
度合は出発材料に比べ１４倍に上昇した。この画分に混
在する血清蛋白としては、ｒ−グロブリンが大半である
。

Ｏ６ｔｅｐａＣＭ−セフ７ａ−スＣＬ−６Ｂ（ファルマ
シ７社製ンゲルをイオン強度０．０８、ｐＨ５，１の酢
酸バッファーで十分平衡化した後カラムに充填した。５
ｔｅｐ　２の素通シ画分を十分に同バッファーで透析し
、カラムにながした。溶出は塩化ナトリウムのステップ
ワイズでおこなった。

ＨＢｓ抗原の２４〜４８％は素通シ画分に回収され、精
製度合は１，５００倍に上昇した。

素通画分はＨＢｓ抗原が、−ＰＨＡ法で×１．０２４の
とき、キルダール法で蛋白濃度６１Ｆ／−Ｊであった。

また、血清成分はこの一分を１０〜１００倍濃縮しても
、免疫拡散法および免疫電気泳動法のいずれでも検出で
きなかった。

更に、稍ｇ　ＨＢ　ｓ抗原を家兄に対し高度免疫をして
得られた抗血清について、血清蛋白を調べてみると、弱
い沈降線がＮＨＳに対して４本観察された。

■　ヒｌ−ＩＪンパ細胞供給者の選別及び免疫まず高い
血中ＨＢＳ抗体価（０、■」ん以上）を有するヒトをＰ
ＨＡ法やラジオイムノアッセイ法（ＡＵＳＡＢ　ＨＢｓ
抗体測定用キッドニアポットラボラトリーズ社）で選別
するのが望−ましい。このヒトに上記ＨＢｓワクチン２
０μｔを皮下投与し、その約２週間後の血中ＨＢＥｉ抗
体価が少くともｌ０ＩＵ／ｍＪあるヒトを選別する。又
はＨＢｓワクチン投与後、末梢血リンパ球を採取し、生
体内及び試験管内で培養したその上渭中に抗ＨＢＳ抗体
が有意（０，０１Ｉ′Ｕ／ＬＡ以上）に検出されるヒト
を選別する。

ＨＢｓワクチンを投与後、１週、２週、３週経過後採取
した。これら末梢血リンパ細胞を各々マウス骨髄腫細胞
と融合せしめ、末梢血提供者とハイブリドーマの作成と
の相関関係の有無を調べた。

■　末梢血リンパ細胞の調製 ワクチン投与後一定計画に従って採取した末梢血はリン
パ球分離液で末梢血リンパ細胞を分離し、その１×１０
６細胞／−Ｌｌをグルタミン添加ＲＰＭ工１６４０＋１
５％牛脂児血清の完全培地に懸濁せしめ、２．５μト１
量のＰ、　Ｗ、　Ｍ。

を加え、３７°Ｃ，ＣＯ２存在下で４〜５日間培養し活
性化した。４〜５日経過後、培養上清中に抗ＨＢｓ抗体
の産生を確認し、そのリンパ細胞分画を集め、ＲＰＭ工
１工種６４０培地回洗浄し、同培地に再懸濁させた。な
お末梢血リンパ細胞分画の半分はＰ、Ｗ、　Ｍ、の刺激
なしでそのままマウス骨髄腫細胞との融合に使用し、Ｐ
、　Ｗ、　Ｍ、刺激の細胞融合に及ぼす効果を検討した
。なおリンパ細胞は末梢血４　Ｑ　ｍ　Ｊから約４Ｘ１
０７細胞が得られ、Ｐ、　Ｗ、　Ｍ、刺激分２×１０７
細胞個、未刺激分２×１０７細胞個を各４１回もしくは
２回の融合に使用した。

■　マウス骨髄腫細胞の調製 本発明に使用した骨髄腫細胞は、すでにケーラーら（Ｋ
ｄｈｌｅｒ　ｅｔ、ａｌ、　）がＮａｔｕｒｅ２５６．
４９５−４９７（１９７５）、ＦＪｕｒ、Ｊ、　工ｍｍ
ｕｎｏ１．　、旦、２９２（１９７６）に記載している
マウスＢＡＬＢ／Ｃ由来の骨髄肝細胞系で、特にその亜
株ＯＸ６３−Ａｇ８−ａ　５．３　オ！びＰ３−Ｘ６３
−Ａｇ８−Ｕｌで４る。これらをグルタミンＦＡ加ＲＰ
Ｍ工１６４０　＋　１５％牛脂児血清の完全培地にて増
殖培養し、融合直前に回収し、ＲＰＭ工１工種６４０培
地回洗浄し、同培地に再懸濁し融合に用いた。

■　ヒトリンパ細胞とマウス骨髄腫細胞との細胞融合 前記のヒトリンパ細胞懸濁液とマウス骨制腫細胞懸濁液
とを混合しくヒトリンパ和胞：骨°雌腫細胞＝１＝２の
割合にて）　１．５００　ｒ、ｐ。

ｍ、１０分間遠心分離したベレットに、Ｆ：ＮＰＭｉ１
６４０（白水製薬社製）で希釈した４５％ポリエチレン
グリコール液（ｐＨ７，６、分子ｆｆｉ　３，６５０）
１ｍ１を３７°Ｃにて１分間にわたって加えた。

３７°Ｃにて５分間静置した後、４ＱｍｆのＨＰＭ工１
６４０を６分間費して加え、細胞を静かに再懸濁し融合
を停止した。ついで細胞を１０分間１，０ＯＯｒ、１）
、ｍ遠心分離し、上清を吸引した後グルタミン添加ＲＰ
Ｍ工１６４０＋１５％牛脂児血清の完全培地に再懸濁せ
しめた。ヒトリンパ球濃度として５×１０５細胞個／ｍ
　Ｌ　、・骨髄腫細胞濃度として１×１０６細胞（固、
／；ＦＬＪ−の細胞濃度を得、これを９６穴マイクロプ
レート中に１００μ少穴として分注し、３７°Ｃ，５％
ＣＯ２存在下にて培養した。２４時間後、クルタミン添
加ＲＰＭ：［，１６４０＋　１５％牛脂児血清＋ＨＡＴ
のＨＡＴ選択培地ｉｏｏμｍを各穴に加えた。さらに２
４時間後および４８時間後と２回にわだシ、前記培養穴
の培地を前記ＨＡＴ選択培地と５０％培地交換した。つ
いで２〜３週間にわたり、５日ごとにＨＡＴ選択培地で
５０％培地交換を繰り返しだ。かくしてハイブリドーマ
が増殖し、ヌクリーニングアッセイができるまで培養を
唇続した。

■　ハイブリドーマのスクリーニングアッセイおよびク
ローニング ハイブリドーマの増殖が十分に犯行したことを確認する
ため、特異抗体を産生じているクローンを検出するスク
リーニングアッセイを行なった。まず抗体を産生じてい
る穴をラジオイムノアッセイ（ヒト抗体定量法）にて選
別し、さらにＨＢｓ特異抗体を産生じている穴を検出す
るために、ＡＵＳＡＢ　ＨＢｓ抗体検呂用キット　ラジ
オイムノアッセイを行なった。

このようにして選別したＨＢＳ特異抗体産生穴中のハイ
ブリドーマを限界希釈法にて単一クローン化を行なった
。クローンが各穴に増殖してきた後に、ＨＢｓ特異抗体
を産生じているクローンを検出するために、前記と同様
のラジオイムノアッセイを行なった。この操作を必要に
応じ、数回鎌り返して、安定なマウス×ヒトハイブリド
ーマを得た。このハイブリドーマクローンを順次拡張培
養し、ＨＡＴ＠択培地＋１０％ＤＭＳＯ（ジメチルスル
ホキシドの凍結用培地にて液体窒素中に凍結保存した。

■　ヒトリンパ細胞供給者の選別 本発明においては、ｈ　ＨＢｓ　ＭＣＡ　産生ハイブリ
ドーマを得るために、第１表に示すように供給者として
過去においてＢ型肝炎ウィルスに感染した可能性のある
高い血中ＨＢｓ抗体価（０．１工ル侃１以上）を有する
人を選別した。

これらの選別されたヒトにＨＢｓワクチンを投与し、そ
の１〜２週後の血中ＨＢｓ抗体価を測定した。ここでＨ
Ｂｓ抗体産生ハイブリドーマ生成効率が有意の値を示す
ヒトは１　０　Ｉｔ％ｆ以上であった。

第　　１　　表 ヒトリンパ細胞供給者選別の効果 註・国際単位（ＩＵ／ｍＪ．）はＡ　ＬＪ　Ｓ△１３を
用いて常法により決定した。

・ＨＢｓ抗体産生ハイブリドーマ生成効率（％）：　Ｈ
ＢＳ抗体陽性穴／全７・イブリドーマ生成穴×１００ また供給者のうちでワクチン投与後１週のリンパ細胞を
３７°Ｃ，５％ＣＯ２存在下、グルタミン添加ＲＰＭ工
１６４０＋１５％牛脂児血清の完全培地で７日間培養し
た培養上清のＨＢｓ抗体価が有意に高い（０，０１ＩＵ
／−ｎ４以上）供給者を選別することが好ましいことも
明らかとなった。

第　　２　　表 ヒｌ−ＩＪンパ細胞供給者選別の効果 註　ＮＤ：検出されない ■　リンパ細胞採取時期およびホークライードマイトジ
ェン添加 第１図はワクチン投与後１．２．３週経過後のＨＢＳ抗
体産生ハイブリドーマの生成効率を図示したものである
。この図からワクチン投与後２週日に生体から採取した
リンパ細胞がもつとも生成効率が高いことが知られる。

またリンパ芽球化能を有するＰ、　Ｗ、　Ｍ、を細胞融
合前に添加したものが、未添加のものに比して通常はる
かに高い生成効率を示すことから、Ｐ、　Ｗ、　Ｍ、の
ようなリンパ球浩性化物質の冷加がハイブリドーマの生
成に有効でりることか知られる。

■　ハイグリドーマの特性 ハイグリドーマは前述のＨＡＴ培地での培養ニテ、ＨＥ
ｓ抗体を７　μｉ１５　Ｘ　１０５ＭＢ胞（Ｗｍｌの割
合で産生じていることが抗体定量法によって確認された
。この特異抗体価は、ＨＢｓ抗原感作ヒツジ赤血球凝集
反応試＠ｐＨＡ価２１２、国際単位５０工明家を示した
。これらの組は高い血中ＨＢｓ抗体価を有する人の値と
ほぼ同等である。

本発明で見られた抗ＨＢｓＭＣＡは抗マウス免疫グロブ
リン抗血清とは全く反応せず、抗ヒトＩｇＧ抗血清との
み反応する。それ故該抗Ｅ（ＢｓＭＣＡの免疫グロブリ
ンクラスはヒト型のＩｇＧ抗体であることがわかった。

特異性については、第３表のＨＢｓ抗原感作ヒツジ赤血
球凝集抑制試験を行なった。

その結果該ｈ　ＨＢｓ　ＭＣＡは、ＨＢｓ抗原のサブタ
イプａｄｒ、ａｄｗ、ａｙｗすべてに吸収され、血球凝
集が駆出されることから、またあらかじめ特異性が決定
されているマウス抗ＨＢｓ　ＭＣＡのうち、エピトープ
ａを認識するＨＢ７−２と同様の反応パターンを示すこ
とから、該抗体はＨＢｓ抗原上のエピトープａを認識す
るＭＣＡであることが判明した。このことは、すべての
型のＢ型肝炎表面抗原と共通に反応するということであ
り、Ｂ型肝炎感染防御策としてきわめて有効でるること
が知られる。なお第３表中の数値は希釈係数である。

第　　３　　表 血球凝集抑制試験による、該抗Ｅ（’Ｂｓモノクローナ
ル抗体の特異性の決定 第２図はＨＢＳ抗原感作ポリスチレンビーズに各抗ＨＢ
ｓＭＣＡ又はポリクローナル［（ＢＳ抗体（血清由来）
を結合せしめ、これに〔１２５１〕ヒツジ抗ヒト工ｇＧ
１およびＣＩ］ヒツン抗マウスエｇ’Ｇを反応せしめた
ときの結果を示すものである。当該ハイブリドーマの産
生ずるＭＣＡは、［：　１２５工）ヒツジ抗・マウスＩ
ｇＧとは全く反応せず、（１２５１）ヒツジ抗ヒ）工ｇ
Ｇとのみ抗体の濃度に応じて顕著に反応している。また
対照例に示すヒト血清由来ヒトボリクローナ＃ＨＢＳ抗
体もほとんど同様の反応パターンを示し、他方の対照例
であるマウヌ抗ＨＢｓＭＣＡのＨＢ７−２の反応パター
ンとは明らかに異ることが知られる。以上の結果に基い
て、本発明で得られる抗ＨＢｓＭＣＡ　　は完全なヒト
抗体であり、マウス、ヒトのキメラ抗体ではないことが
推定される。

【図面の簡単な説明】

第１図は末梢血リンパ軸胞の採取時期とハイブリドーマ
生成効率の関係を示すグラフでめシ、横、１１１にワク
チン接種後の週を、縦軸にハイブリドーマ生成効率を示
す。 第２図はヒト製杭ＨＢＳモノクローナル抗体ととッジ抗
ヒトＩｇＧ及びヒツジ抗マウスエｇＧとの反応図でめる
。横軸に抗ＨＢｓモノクロー合うジオイムノアッセイ法
によるｃｐｍを示す。なお対照図はマウス型モノクロー
ナル抗体と、ヒト型ポリクローナル抗体についての反応
図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ＨＢｓ抗体陽性であるヒトから採取した末梢血リン
   パ細胞とマウス骨髄腫細胞とを融合してハイブリドーマ
   を形成し、該ハイブリドーマをクローニングしてなるモ
   ノクローナル抗体の製造方法。 ２、ＨＢＳ抗体陽性であるヒトが、好ましくは血中１０
   ＩＵ／ｍ１以上のＨＢｓ抗体価を有するヒトである前記
   第１項記載の方法。 ３、末梢血リンパ細胞に非特異的リンパ球 浩性化物質を添加して刺激培養後融合に用いる前記第１
   項記載の方法。 ４、骨髄腫細胞がマウスＢＡＬＢ／Ｃに由来し、特にＰ
   ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１又はＸ６３−Ａｇ８−６，５
   ，３である前記第１項記載の方法。 ５、ハイブリドーマをｉｎ　ｖｉｔｒｏで、特にヒポキ
   サンチン−アミノファリン−チミジンを含む培地で培養
   する前記第１項記載の方法。 ６、ハイブリドーマを免疫不全動物の生体 内で産生せしめる前記第１項記載の方法。