FI64952C - Foerfarande foer framstaellning av genetiskt stabila cellinjer - Google Patents
Foerfarande foer framstaellning av genetiskt stabila cellinjer Download PDFInfo
- Publication number
- FI64952C FI64952C FI781818A FI781818A FI64952C FI 64952 C FI64952 C FI 64952C FI 781818 A FI781818 A FI 781818A FI 781818 A FI781818 A FI 781818A FI 64952 C FI64952 C FI 64952C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- cells
- antibody
- virus
- mouse
- antibodies
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Virology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
1---»— -ί Μ KUULUTUSJULKAISU s a c\ r r\ M c')UTLAe(SNI^GSSKRIFT 64952 ''—'—' (51) K*A.Wa.3 C 12 Μ 5/00, A 61 K 39/42 SUOMI —FINLAND (71) Patenttihakemus —Patantanaftkning 7Ö1Ö18 (22) HikemtapiW*—AroÄknlnjadaj 07.06.78 ' (23) Alkuplly»—GUtlghetadag 07.06.78 (41) Tullut julklaelcal— ftlhrit offentllg 12 78 rekisterihallitut NihtMUprai ]. kuuLjulkAiaun * *«,
Patent· och registentyrelsen ' ' Amman uttagd odi utUkdftwi publicerad . xu. o j (32)(33)(31) utuoikeui —Begird prtoritet 13*06.77 USA(US) 806857 (71) The Wistar Institute, Thirty-Sixth Street at Spruce, Philadelphia, Pennsylvania 19101+, USA(US) (72) Hilary Koprovski, Wynnewood, Pennsylvania, Walter U. Gerhard,
Philadelphia, Pennsylvania, Carlo M.Croce, Philadelphia,
Pennsylvania, USA(US) (7*0 Leitzinger Oy (5*0 Menetelmä geneettisesti pysyvien solulinjojen valmistamiseksi -Förfarande för framställning av genetiskt stabila cellinjer Tämän keksinnön kohteena on menetelmä geneettisesti pysyvien solu-linjojen valmistamiseksi, jotka jatkuvasti pystyvät tuottamaan "in vivo"- tai väliaineviljemässä suuri määriä monoklonaalista virusvasta-ainetta, erityisesti influenssa- tai vesikauhuvirus-vasta-ainetta.
Virusten antigeeni-determinanteille spesifisten vasta-aineiden tuottaminen on tärkeä sekä immunoterapian että lääketieteellisen tutkimuksen kannalta. Monoklonaalisia vasta-aineita virusten antigeeni-determinanteille on tuotettu in vitro viruksella infektöitujen tujen pernasolujen viljelmissä. Pernan focin vasta-aineen tuotto viljelmässä on tähän mennessä kuitenkin heikentynyt 30 - 40 päivän kuluttua ja lakannut kokonaan 90 päivän kuluttua.
Olemme kehittäneet uuden vasta-aineiden tuottamismenetelmän uutta solulinjaa kasvattamalla, joka on geneettisesti pysyvä ja jota voidaan viljellä ja sub-viljellä jatkuvasti ja joka tuottaa suuria 2 64952 Γ määriä vasta-aineita viruksia ja niiden antigeeni-determinantteja vastaan.
Keksinnön mukaiselle mentelmälle on tunnusomaista se, että virus-vasta-ainetta muodostavia soluja ja niiden kanssa yhteensopivia myeloomasoluja, edullisesti hiiren soluja, fuusioidaan sinänsä tunnetusti hybridisoluiksi jolloin edullinen influenssavirusvasta-ainetta tuottava solui inja on tallennettu tunnuksella ATCC CL 189.
Nämä uudet solulinjat ovat (a) myeloomasolujen, so. luuytimen primääristen kasvainten pahanlaatuisten solujen, ja (b) virus-vasta-ainetta tuottavien solujen, parhaiten viruksella käsiteltyjen eläinten pernan tai imusolmukkeiden solujen, fuusio-soluhybridejä. Erityisen suositeltu solulinja on viruksella käsiteltyjen hiiren pernan solujen ja hiiren myeloomasolujen välinen fuusio-soluhybridi. Näitä solulinjoja voidaan ylläpitää oleellisesti äärettömästi viljely-väliaineessa, kuten selektiivisessä hypoksantiini-amino-pteriini-tymidiini-mediumissa, ja solulinjat tuottavat jatkuvasti viruksen antigeeni-determinanteille spesifisiä vasta-aineita.
Soluja voidaan kasvattaa myös in vivo histologisesti sopivassa eläimessä, jolloin eläimen seerumiin ja askiittinesteeseen kerääntyy suuria määriä vasta-aineita.
Myeloomasolut ovat itse sikäli ainutlaatuisia, että tällaiset solut pystyvät tuottamaan vasta-aineita, vaikkakin näiden vasta-aineiden spesifisyyttä ei vielä tunneta. Eläinlajit, joista myelooma- ja pernasolut ovat peräisin, eivät ole kriittisiä niin kauan kuin on mahdollista fuusioida toisen lajin solut toisen lajin solujen kanssa, so. hiiren ja rotan, rotan ja ihmisen. Kuitenkin on suositeltavaa käyttää samoja eläinlajeja myös myelooma- että virus-vasta-ainetta tuottavien solujen lähteenä. Erinomaisia tuloksia on saatu BALB/c-hiiren, joka on aiemmin immunisoitu viruksella, virus-vasta-ainetta tuottavien pernasolujen ja BALB/c-hiiren myeloomasolujen välisillä somaattisilla soluhybrideillä. Erityisen suositeltuja myeloomasoluja ovat MOPC-21 sukupolveksi kutsutut kloonin P3 x 63 Aq8 myeloomasolut, jotka Köhler et ai on esittänyt, Nature, Vo. 256, 395 - 397 (1975).
3 64952 Köhler et ai ovat aikaisemmin kuvanneet kirjallisuudessa, Nature, Voi. 256, 495-497 (1975) ja Eur. J. Immunol., Voi. 6, 511 - 519 (1976), BALB/c-pernasolujen ja BALB/c-myeloomasolujen fuusio-solu-hybridejä.
Nämä hybridit eivät kuitenkaan olleet peräisin viruksilla immunisoiduista hiiristä vaan lampaan punaisilla verisoluilla immunisoiduista hiiristä. Lampaan vasta-ainetta tuottavien punaisten verisolujen ja myeloomasolujen välille muodostuu helposti hybridejä, mutta Köhler'in et ai hybridien tuottamat vasta-aineet ovat spesifisiä lampaan punaisille verisoluille eikä niillä ole mitään vaikutusta viruksiin. Ennen tätä keksintöä ei tiedetty, voidaanko hybridejä muodostaa virus-vasta-ainetta tuottavien solujen ja myeloomasolujen välille.
Seuraavassa on esitetty menettely, jonka avulla voidaan valmistaa hybridisolujen solusukupolvi fuusioimalla BALB/c-hiiren, joka aiemmin on immunisoitu influenssaviruksella, pernasolut BALB/c-hiiren myeloomasolujen kanssa. Vaikkakin menetelmässä käytetään tiettyä influenssaviruskantaa, voidaan käyttää myös muita viruksia, kuten vesikauhu-, sikotauti-, vaccinia-virusta, influenssakantaa 6-94, simianvirusta 40, poliovirusta jne.
(a) Pernasolujen valmistaminen fuusiointia varten
Pernasolujen valmistamiseksi fuusiointia varten BALB/c-hiirille, joihin oli 2-3 kuukautta aikaisemmin injektoitu intraperitone-aalisesti 1250 hemagglutinaatioyksikköä puhdistettua influenssavirusta (A.PR/8/34 (HONI)), annettin laskimonsisäisesti homologista virusta 100 hemagglutinaatioyksikön suuruinen tehostusannos. Hiiret tapettiin 7 päivän kuluttua ja Gerhard'in et ai, Eur. J. Immunol., voi. 5, 720 - 725 (1975) menetelmällä valmistettiin pernasolusus-pensio. Punaiset verisolut liuotettiin inkuboimalla 15 minuuttia 4°C:ssa ammoniumkloridissä (0,83 %). Saatu solususpensio käsiteltiin sentrifugoimalla (800 x g) kerran lämmöllä inaktivoidun vasikanseerumin kanssa ja kerran proteiinia sisältämättömässä puskuroidussa (pH 7,2) mediumissa, RPMI 1640.
64952 (b) Myelooroasolujen valmistaminen fuusioimista varten
Dr. Cesar Milstein'in, Nature, Voi. 256, 495 - 497 (1975), kuvaamia BALB/c (P3 x 63 Ag8) myeloomasoluja, jotka olivat peräisin MOPC-21-sukupolvesta ja jotka olivat HPRT (E.C.2.4.2.8)-vajaita, pidettiin Eagle'n väliaineessa (minimal essential medium (MEM)), joka sisälsi 10 % vasikan sikiön ja 10 * hevosen seerumia. P3 x 63 Ag8 myelooma-solujen kasvu estettiin selektiivisesti hypoksantiini-aminopteriini-tymidiinimediumilla.
(c) Hybridien valmistaminen
Hybridit valmistettiin sekoittamalla kymmenen miljoona BALB/c p (P3 x 63 Ag8) myeloomasolua ja 10 pernasolua, jotka oli saatu viruksella infektoiduista BALB/c-hiiristä. Soluseosta sentrifuqoi-tiin 800 x g voimalla ja solut suspendoitiin uudelleen fuusioimista varten polyetyleeniglykoli-1000:n (PEG) 50-prosenttiseen liuokseen (paino/tilavuus), joka oli laimennettu seerumia sisältämättömään MEM-viljelyvMliaineeseen. Davidson'in et ai, Somat. Cell Genet.
2, 1977, 175 - 176, mukaisten fuusiointikäsittelyjen jälkeen poly-etyleeniglykoli laimennettiin ensin seerumia sisältämättömällä MEM-medlumilla ja sen jälkeen seerumilla, minkä jälkeen solut laitettiin viiteen 75 cm Falcon-pulloihin hypoksantiini-aminopteriini-tymidiini (HAT) selektiiviseen mediumiin. Viljelmiä inkuboitiin 37°C:ssa 95 % ilma/5 * CO2 kaasukehässä ja joka 7. - 10. päivä viljelymedium korvattiin osittain tuoreella HAT-medlumilla (1/2 - 1/3).
Sen jälkeen, kun viljelmiä, jotka oli valmistettu fuusioimalla PR8:lla immunisoitujen hiirien pernasoluja P3 x 63 Ag8 solujen kanssa, oli inkuboitu 10 - 15 päivää, yhdessä pullossa havaittiin solujen kasvua. Kaikki HAT-mediumissa esiintyvä kasvu on osoitus hiiren pernasolujen ja hiiren myeloomasolujen onnistuneesta hvbri-disoitumisesta. Näitä soluja, joita kutsutaan HK-PEG-l-soluiksi, kasvatettiin yhtäjaksoisesti HAT-mediumissa ia ne kloonattiin mikrolevyillä (Linbro) rajalaimennuksena. Muut neljä pulloa, joissa ei esiintynyt solujen kasvua, hävitettiin kolmen viikon kuluttua li 5 64952 fuusioimisesta. Solusukupolven viljelmä, josta käytetään nimitystä HK-PEG-1, on talletettu American Type Culture Collection-kokoelmaan tunnusnumerolla ATCC CL 189.
(d) Karyoloqinen analyysi
Kuten taulukossa 1 on esitetty, P3 x 63 Ag8 emäsolut sisälsivät keskimäärin 63 kromosomia ja BALB/c-pernasolut 40 kromosomia. HK-PEG-l-solujen 92 kromosomia on siis suurin piirtein kahden emäsolun kromosomien summa. Hybridikloonin HK-PEG-1 ja alikloonien karyologiaa seurattiin 2 kuukautta karyotoopin merkitsevästi muuttumatta.
Taulukko 1
Emä- ja hybridisolujen kromosomien lukumäärä
Solut Kromosomien keskimääräinen määrä solua kohti P3 x 63 Ag8 63* BALB/c-pernasolut 40 HK-PEG-1 92* ♦sisältää kaksi metasentristä leimauskromosomia.
(e) Hybridisoluilla valmistetun immunoglobuliinin analyysi HK-PEG-1 ja P3 x 63 Ag8 solujen viljelyliuosta analysoitiin radio-immuno-määrityksessä (RIA) PR8:n kanssa reagoivien immunoglobulii-nien (Ig) läsnäolon selvittämiseksi. P3 x 63 Ag8 tiedetään erittävän IgGl, k:ta. Kuten taulukosta 2 näkyy, p3 x 63 Ag8 viljelyliu-okset eivät sisältäneet anti-PR8 reaktiivisuutta omaavaa immuno-globuliinia. Sen sijaan HK-PEG-1 tuotti suuria määriä IgG-anti-PR8 vasta-aineita.
6 64952
Taulukko 2 HK-PEG-l-viljelmien tuottaman anti-PR8 vasta-aineen luokka RIA-menetelmässä RIA-menetelmässä havaittu CMP, antiseerumi tutkittu viljely- leimattu 125j:lla
liuos* Anti-F(ab')2 Anti-IgM Anti-IgA Anti-IgG
P3 x 53 Ag8 44 + 24** ND*** ND 185 HK-PEG-1 4255 ± 158*** 204 26 8335 * Keskiarvo viljelmistä, joissa solukonsentraatio on sama.
Analyysi suoritettiin viljelyliuoksen 15 jul (P3 x 63 Aq8) tai 7,5 pl (HK-PEG-1) rinnakkaisnäytteillä.
** 6 määrityksen keskiarvo + SE. Muut luvut: Kahtena rinnakkais- määrityksenä tehdyn RIA-määrityksen keskiarvo.
***ND = Ei määritetty.
Taulukon 3 arvot osoittavat, että hybridisolujen tuottamat virus-vasta-aineet (anti-PR) ovat spesifisiä PR8 antigeenin (hemaggluti-niini) suhteen. Tämä on ilmeistä funktionaalisista määrityksistä, joissa vasta-aineet (karkeasti noin 40 pm/ml) inhiboivat hemagglu-tiniinia (HI) mutta ei havaittavasti neuraminidaasia (NI).
Taulukko 3 HK-PEG-1 viljelmien tuottaman vasta-aineen aktiivisuus funktionaalisissa määrityksissä PR8 virusta vastaan HK-PEG-1 viljelmien in vitro HI-tiitteeri* NI-tiitteri* erittämä vasta-aine, väkevöity (log 10) (log 10) seostamalla ammoniumsulfaa- 2,98 < 1,00 tiliä** n 64952 ♦Hemagglutinaation inhibiitio (HI) ja neuraminidaasin inhibiitio (NI) PR8 virusta vastaan.
** 50 ml HK-PEG—1 viljelymediumia saostettiin ammoniumsulfaatilla 4°Cjssa 42 % (tilavuus/tilavuus) kyllästyksellä. Sakka dialysoi-tiin PBS vastaan ja väkevöitiin ultrasuodattamalla 0,6 ml:ksi. RIA-määrityksen perusteella tämä lopullinen näyte sisälsi 47 % viljely-mediumin lähtötilavuudesta olevasta antiviraalisesta vasta-aineesta, joten antiviraaliset vasta-aineet olivat väkevöityneet karkeasti ottaen 40-kertaisesti.
(f) Hybridisolujen klooni-alkuperä HK-PEG—1 viljelmän klooni-alkuperä testattiin kolmen, toisistaan riippumattoman kriteerin avulla: (i) HK-PEG-1 massaviljelmistä saatu väkevöity Ig (kts. taulukon 3 selitys) fokusoitiin isoelektrisesti, kuten on esitetty kuviossa 1, jolloin anti-PR8 vasta-aineet IgGl raskasketjuisen determinantin (determinanttien) kanssa kasautuivat rajoitetulla pH-alueella.
(ii) Radioimmuno-analyysissä testattiin vasta-aineen ristikkäis-reaktiivisuus eri viruksia vastaan, joiden tiedetään antigeenisestä muisuttavan PR8 ja sen havaittiin olevan PR8 hemagglutinii-nin (HA) determinantille spesifinen. 20 - 25 %:lla pernan PR8-käsittelyillä prekursori B-soluilla on kuitenkin tämä kantaspesi-finen anti-HA (PR8) reaktiivisuus. Vasta-aineen reaktiivisuus on siten yksinään jokseenkin heikko kriteeri HK-PEG-l-viljelmien monoklonaalisuuden määrittämiselle.
(iii) Jotta voitaisiin sulkea pois mahdollisuus, että antiviraa-lista vasta-ainetta tuottavat solut olisivat vain pieni osa hybri-disolujen populaatiosta, anti-PR8-vasta-aine ja sen spesifisyys määritettiin viljelyliuoksista, jotka olivat peräisin HK-PEG-1 hybridisukupolven kahdestatoista kloonista. Kuten taulukossa 4 on esitetty, kahdestatoista kloonista tuotti yksitoista kloonia anti-PR8-vasta-ainetta. Lisäksi nämä vasta-aineet olivat spesifisiä PR8-viruksen HA:n determinantin suhteen.
8 64952
Taulukko 4 HK-PEG-l-viljelmien kloonien tuottama anti-PR8-vasta-aine HK-PEG-l-viljelmän viljely - Anti-PR8 HA vasta-aineen konsen- liuos klooni n:o traatio* (pg/ml) 2 2 3 1,2 5 2,4 6 3,4 7 4,7 9 6,9 10 4,7 11 5,8 12 < 0,02 12 2,8 14a 2,7 14b 2,6 * Kvantitatiivinen RIA-määritys tehtiin 125l-anti-P(ab')2:lla (g) Hybridisolujen tuumorigeenisyys
Hybridisolujen tuumorigeenisyyden määrittämiseksi täyskasvuisten BALB/c-hiirien vatsaseinämään injektoitiin ihonalaisesti joko HK-PEG—1 (1 x 107) tai P3 x 63 Ag8 (1 x 107) soluja.
Kuten taulukossa 5 on esitetty, 5/5 hiirellä, jotka oli injektoitu HK-PEG-l-soluilla, ja 3/5 hiirellä, jotka oli injektoitu P3 x 63 Ag8 emäsoluilla, kehittyi siirrostuskohtaan kasvaimia 10 - 12 päivää istuttamisen jälkeen. Toisessa kokeessa 4/5 hiirelle kehittyi kasvaimia hybridisoluilla siirrostamisen jälkeen ja 3/5 hiirelle P3 x 63 Ag8-soluilla siirrostamisen jälkeen. Solujen i.p. injektoin-nin jälkeen (koe 3, taulukko 5) kasvainten havaittiin kasvavan massoina vatsakalvon ontelossa. Askiittinesteen muodostamiseksi hiiret oli injektoitava kasvainsoluilla, jotka oli suspendoitu uudelleen Freund'in apuaineeseen (complete Freund adjuvant). Neljännessä li 9 64952 kokeessa pristaanilla käsiteltyihin hiiriin kehittyi vesivatsa sen jälkeen, kun HK-PEG-1 kloonien soluja oli siirrostettu i.p.
Taulukko 5
Koe n:o Siirrostamis- Siirroste Hiirten suhde, joissa tapa kehittyi
Subkutaani kasvain ascites 1 subkutaani HK-PEG-1 5/5 ---* P3 x 63 Ag8 3/5 --- 2 subkutaani HK-PEG-1 4/5 --- P3 x 63 Ag8 3/5 --- 3 intraperito- HK-PEG-1 --- 3/3 neaalinen CFArssa HK-PEG-1 --- 0/3 4 intreperito- HK-PEG-1 cl 6 --- 4/4 neaalinen** HK-PEG-1 cl 7 --- 4/4 HK-PEG-1 cl 12 --- 4/4 * Yhtään kasvainta tai vesivatsaa ei ollut kehittynyt 30 päivässä siirrostamisen jälkeen.
** Pristaanilla iso-oktadekaanilla käsitellyt hiiret.
Näiden tutkimusten tulokset osoittavat, että hiiren myelooma- ja normaalien pernasolujen väliset hybridisolut käyttäytyvät kuten malignit emäsolut pahanlaatuisuuden pienentymättä.
Seerumista ja askiittinesteestä, jotka oli saatu kasvaimista kärsivistä hiiristä eri aikavälien jälkeen injektoinnista, määritettiin radio-immuno-analyysin avulla anti-PR8-vasta-aineen konsentraatio.
Tulokset on esitetty taulukossa 6.
10 64952
Taulukko 6
Anti-PR8-vasta-aineet seerumeissa ja askiittinesteissä, jotka on saatu HK-PEG-1 soluilla injektoiduista hiiristä
Koe mo Materiaalin saanto- Materiaalin Antiviraalisen vasta- aika päivinä injek- laatu aineen arvioitu kon- toinnin jälkeen sentraatio mg/ml 1 28 Seerumi 1,35
Seerumi 1,1
Seerumi 2,3 2 19 Seerumi 0,9
Seerumi 1,6
Seerumi** 1,2 ascites** 0,5 3 15 ascites 0,5 cl 6 ascites 0,45 cl 7 ascites < 0,002 cl 12 * Kvantitatiivinen RIA tehtiin ^5l-anti-F (ab*) 2.
** Samasta hiirestä.
Hiirien, jotka oli injektoitu subkutaanisti HK-PEG-l-soluilla (kokeet 1 ja 2), seerumit sisälsivät anti-PR8-vasta-aineita 1-3 mg/ml. Anti-PR8 vasta-aineita löydettiin myös hiirien, jotka oli injektoitu i.p. (koe 4) hybridisoluilla, askiittinesteestä, vaikkakin vasta-aineiden konsentraatio oli 3-4 kertaa alhaisempi kuin seerumissa.
Hiiristä, jotka kärsivät HK-PEG-1 kasvaimista, saadun seerumin elektroforeesi osoitti, että mukana oli kolme pääasiallisesti Iq- 64952 populaatiota: Yksi vastasi parenteraalista (P3 x 63 Aq8) IgGl:ä, yksi oli tunnusomainen IgGtlle ja kolmas oli kahden edellisen välillä. Sen määrittämiseksi, mihin immunoglobuliinien luokaan anti-viraalinen vasta-aine liittyi, kahdestakymmenestä pristaanilla käsitellystä hiirestä kerätty askiittineste poolattiin ja niistä erotettiin immunoglobuliinit. Erottaminen suoritettiin käyttämällä seuraavaa tekniikkaa.
Hiiristä kerätty askiittineste poolattiin ja pooli neutraloitiin fosfaatti-puskuroidulla suolaliuoksella (PBS) . 4°C:ssa lisättiin yhtä suuri tilavuus kyllästettyä ammoniumsulfaattia ja saostunut proteiini liuotettiin PBS-liuokseen ja dialysoitiin 0,01 M Tris-puskuria vasten pH-arvossa 8,0. Yön yli kestäneen dialyysin jälkeen muodostunut sakka liuotettiin uudelleen PBS-liuokseen ja saostettiin uudelleen dialysoimalla 0,01 M Tris-puskuria vasten pH-arvossa 8,0. Alkuperäisen dialysaatin pääliliuos absorboitiin DE-52 (Whatman) pylvääseen, joka oli tasapainoitettu 0,01 M Tris-puskurilla, pH-arvossa 8,0, ja eluoitiin käyttämällä suoraviivaista NaCl-gradi-enttia (0,05 - 0,15 M NaCl 0,01 M Tris-puskurissa, pH 8,0).
Sen jälkeen, kun IgG3 oli seostettu dialysoimalla 0,01 M Tris-puskuria vasten^elektroforeesin avulla havaittiin, että jäljelle jääneessä pääliliuoksessa ei ollut yhtä, ennen fraktiointia ascites-poolissa havaittua komponenttia. Kromatografoimalla tämä materiaali DE-52 (kuvio 2) pylvässä jäljelle jääneitä komponentteja ei saatu täysin eroamaan, mutta yksittäisten erien elektroforeesi osoitti, että mukana oli kaksi pääkomponenttia: Toinen vastasi parenteraalista (P3 x 63 Ag8) IgGl:ä ja toinen viittasi hybridi-Ig:en, joka on IgGl:N ja IgG3:n välillä ja jota myös löydettiin HK-PEG-l-kas-vaimista kärsivien hiirien seerumissa (kts. edellä).
Anti-PR8-vastainen konsentraatio määritettiin RlA:n avulla käyttämällä ^^5l-anti-F(ab')2:a 3a spesifinen anti-PR8-aktiivisuus laskettiin suhteena anti-PR8 (mg/ml)2lg (mg/ml), jolloin jälkimmäinen arvio perustui OD 280 mittaukseen olettaen, että hiiren Ig:n absorp-tiokyky (1 %, 1 cm) on 14,0. Spesifinen anti-PR8-aktiivisuus, joka määritettiin niukkasuolaisessa sakassa, oli karkeasti ottaen kaksi 12 64952 kertaa korkeampi kuin DE-52 kromatografiän anti-PR8-aktiivisuuden piikki (0,06 jakeessa 21). Näytteiden analysointi RTAsssa ^5I-anti-IgGl:lla osoitti, että noin 15 % anti-PR8-vasta-aineista niukkasuolaisessa sakassa ilmaisi Gl-determinantteja. Sen sijaan 1 I-anti-P(ab')2 kvantitasoi yhtä tehokkaasti vasta-PR8-vasta-aineet, DE-52 kromatografiän eri jakeissa.
Vesikauhu-viruksella suoritettiin lisää koesarjoja.
BALB/c-hiiret käsiteltiin rokotteella, joka sisälsi inaktivoitua vesikauhu-virusta (ERA-kanta), ja kuukautta myöhemmin niille annettiin samaa rokotetta intravenöösinä tehostesiirrosteena. Hiiret tapettiin 3 päivää tehosteen antamisen jälkeen ja hybridisolut muodostettiin fuusioimalla aikaisemmin kuvatulla tavalla pernasolut ja P3 x 63 Ag8 myeloomasolut. Suuri määrä hybridisoluista tuotti anti-vesikauhuvirus-vasta-aineita. Sen sijaan, kun hiiret tapettiin 10 päivää tehostesiirrosteen jälkeen, anti-vesikauhuvirus-vasta-aineita tuottavien hybridisolujen määrä oli varsin alhainen. Tällä menetelmällä valmistettiin taulukoissa 7, 8 ja 9 esitetyissä testeissä käytetyt hybridomat.
Seuraavissa testeissä käytetyt vesikauhu-virus-kannat ovat alalla tunnettuja kantoja. Esimerkiksi ERA-kanta on kuvattu, inter alia, DSA-patenteissa 3,423,505 ja 3,585,266. HEP-Flury on kuvattu, inter alia, USA-patentissa 2,768,114 ja SAD-kanta on kuvattu Can. J, of Microbiology, (5, 606 (1960) lehdessä. Käytetyt analyyttiset testit ovat myös alalla yleisesti tunnettuja.
52 hybridomaa, jotka tuottivat anti-vesikauhu-virus-vasta-aineita radio-immunomäärityksen (RIA) perusteella, testattiin kolmea erilaista vesikauhu-virus-kantaa vasten (ERÄ-, CVS- ja HEP-Flury-kannat). Lisäksi käytettiin neljää erilaista määritystä, so. virusneutralointia (VN), sytotoksisuustestiä (CT), membraanifluo-resenssia (M) ja nukleokapsidifluoresenssia (NC). Testien tulokset on esitetty taulukossa 7.
13 64952
Taulukko 7
Viruskantojen vastainen aktiivisuus eri määrityksissä
Hybri-domien
määrä ERA CVS HEP
_VN CT M NC VN CT M NC VN CT M NC
7_+ + + - + + + - + + + - 2_+ + + - + + + - + + + - 2_+ + + — + + + — — — — — 11_+ + + -- -- -4-4-+_ 2_+ + + + -- - + + + + + 2_+ + + + -- - + -- - + 1 + + + - 2_-ί + + -- - + + + + + 1 -------- + + + - 22_--- + -- - + -- - +
Kuten taulukko 7 osoittaa, vasta-aineet, jotka reagoivat yhden kannan kanssa, eivät ehkä reagoi toisen vesikauhu-virus-kannan kanssa. Kuten taulukosta 7 käy ilmi, 52:sta vesikauhu-vasta-aineita erittävästä hybridisolusta 9 reagoi virus-neutralointi-, sytotoksi-suus- ja membraani-immunofluoresenssi-määrityksissä kaikkien kolmen vesikauhuvirus-kannan- ERÄ-, CVS- ja HEP-kannan kanssa; viisitoista reagoi ERA- ja HEP-kantojen kanssa; kaksi ERA- ja CVS-kantojen kanssa; kolme vain ERA-viruksen ja yksi vain HEP-viruksen kanssa. Kaksikymmentäkahdeksan hybridiviljelmää tuotti vasta-aineita, jotka reagoivat kaikkien kolmen virus-kannan nukleokapsidien kanssa; ja näistä reagoi 23 ainoastaan nukleokapsidien eikä minkään muun viruskomponentin kanssa.
Vesikauhu-viruksen street- ja fixed-kantojen välistä antigeenisuh-detta analysoitiin käyttämällä kymmentä muuta, erilaista maantieteellistä alkuperää olevaa kantaa. Hybridomat valmistettiin kuten edellä on kuvattu käyttämällä ERA-kantaa. Taulukon 8 tulokset osoit- 14 64952 tavat, että vain yhden hybridoman (n:o 120) erittämät vasta-aineet neutraloivat fixed-kannan Kelev-viruksen ja vain kahden hybridoman erittämät vasta-aineet äskettäin löydetyn eteläafrikkalaisen street-viruksen (Duvenhage). Sen sijaan kaikki street-viruskannat näyttävät olevan ristikkäin reaktiivisia VN-määrityksessä paitsi AP-kanta, joka ei näytä reagoivan vasta-aineen n:o 193 kanssa. Hybridoma-vasta-aineiden havaittiin olevan melko heterogeenisia VN-määrityk-sissä käytettäessä viruksen fixed-kantoja. Esimerkiksi PM- ja CVS-kannat, jotka olivat molemmat peräisin Pasteur-kannasta, reagoivat eri tavoin kuin Pasteur-kanta ja ne reagoivat keskenään eri tavalla. Sen sijaan SAD-virus ja sen ERA-johdannainen reagoivat identtisellä tavalla samojen hybridomien erittämien vasta-aineiden kanssa. Epä-virulentin HEP-kannan havaittiin lopuksi olevan ristikkäisreaktii-vinen Kelev-kannan kanssa VN-määrityksessä käytettäessä n:o 120 vasta-aineita. Lisäksi kolmen muun hybridoman vasta-aineet neutraloivat kuitenkin HEP-kannan.
64952 15 ΊΤΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟ o
rH
:<C C
C iroo o in o in «h * * * «I * 4 * g
44 CQpHpHpHOOOOpHpHpHOOHO D
44 O' -H
4) >H >C
44 <U
iH E
u O O O O O O O O O O
Sflj ^ ^ ^ % fc * * ta * c :<o rorommmomomroiHCNjrno ·· E o ^J· pH ΑΛΛΟ $0 g σ in in o o oooomomin co O s h ^ ^ · h ^ ^ ^ ^ ^ ^ g
> I—lOCNCMi—irPlOCNfPltNtNi—IfMCHi—I O
iH OJ Ό
•H pH Λ iH
44 -H Ui
M CO XI
<C jc o o o o o o o o o o in >
Q) ψ k h h ^ W h s ^ V ,C
ui O^rnmmfnmoommcMtNfp. pH
ω C σ >
•ιΗ iH pH Λ Λ A A Λ ΑΛΛΑ -U
:co I 4-ΐ m ^ ac 4J o o o o o o o o in o o ·γί «h C ^ « k ^ k « « ^ % k Ui 4-i •iHomcomrofNcoommpHiNroo :co 10 o pH > iH pH pH Λ Λ Λ Λ Λ Λ u ιο c
00 Ui D
C 4J ο ο ο ο ο οιτοοο λ: O (I) D ^ ^ ^ h ^ Μ C 4)ρΗΓΡ)ΓΟΓΟΟΓΡ|ΓΟΟΓΟρΗ<Ν<ΝΓΡ|0 *.
it ή £ o c 3 i—I pH A A A ΛΑ Λ Λ Λ 41 pH aC 4) 3 > it
Λ pH
E- C C :CC
4) <0 4> m
•n pH C
OH h C
4-1 41 <0 4) C 4) C (0 « c c Λί -«-I io <; w> 4» i-i I <0 *σ K E > Uc σ' to toixtcQPiOS co m
3 CO O pH JS C
UI 44 c-3 Ph > C 4) •h m ai 4) to >«0iH pi H U > 41 I > a wcD^poihqa ui 3i a ffiuszboSSo o £ CO > 3
3 E > UI pH
CO O 44 3 MH
it ^ O 4)
•H ·Η :(0 4J 4J C
to Ui Ui O Q (0 4) tl JO tl H < 10 c
> > & CU ΙΛ CM <0 iH
C 3 -M iq :<0
CM CO H pH 10 10 I Ji CO
tl M H M 41 iH JC Ό :c0 Λϋ -h
IHIOCO to CO (QtOCiH-pC CO
t> tO CO < C <U<<IOClOtlli CO
41 iH C <0 tn CO CA(OC/Ot/OUlC0^4->MH CIO
pH 4J CO 2 D Pi PMPDC0Pi«W< 10 (0 o to c E ai
4) C CO C 10 pH
:c0 4-> CO :cc 4) M 0) c0 pH
« h K *J CO :c0 C cö cö A! 3C0C pH O
W4-> C ui E -h Ui ui CO 4JIh*h Cu :c0
41 C ao ·ή SZ E h h ft 4J -h g OC
CU iH to O 4) .C O O 41 4IOX 4-1 CO
30 M iC P H Pö US q K K H >i :<Ö
M pH tn pH
pH CO 44 <0 Ui Ό 41 ··
44 4) 4» E
iH 3 X U O
Ui 41 iH 44 O
WC [U CO S
16 64952
Soluissa, jotka oli infektoitu kaikilla viruksilla, esiintyi alkuperästä riippumatta sytoplasman sisäistä fluoresenssia sen jälkeen, kun ne oli fixattu ja asetettu alttiiksi hybridoman 104 (NC-määri-tys) tuottamille vasta-aineille, vaikkakaan yksikään viruksista ei reagoinut saman hybridoman kanssa VN-määrityksessä. Tämä vahvistaa, että vaikkakin hybridoma-vasta-aineet erottavat helposti fixed-vesikauhuviruskannat VN-, CT- ja MF-testeissä, vasta-aineet reagoivat kaikkien vesikauhu-viruskantojen kanssa NC-määrityksessä.
Taulukoissa 7 ja 9 esitetyt tulokset osoittavat, että anti-vesikau-huvirus-vasta-aineita tuottavat hybridisolut ovat erittäin hyödyllisiä tutkimustarkoituksissa ja analyyttisissä tarkoituksissa.
Hybridiviljelmät, jotka erittävät vesikauhu-viruksia neutraloivia vasta-aineita, suojaavat hiiriä vesikauhu-viruksen tappavalta vaikutukselta. BALB/c-hiiriin siirrostettiin ihonalaisesti hybridoma-viljelmien C-l ja B-l ja kloonin 110-5 soluja (kts. taulukko 9). Seerumissa, joka saatiin näistä hiiristä kaksi viikkoa C-l ja 110-5 hybridomalla siirrostamisen jälkeen, oli vesikauhu-vasta-aineiden konsentraatio 100 kertaa korkeampi kuin mediumissa, joka saatiin samojen hybridomien kudosviljemistä. 5 päivää hybridomien siirrostamisen jälkeen hiiret altistettiin intracerebraalisesti PM-vesikauhu-viruksen tappavalla annoksella. Kuten taulukosta 9 käy ilmi, hiiret, jotka oli siirrostettu hybridoma-viljemillä, jotka erittivät VN-vasta-ainetta, jäivät eloon virusaltistuksen jälkeen, kun taas hiiret, jotka saivat hybridomia, jotka eivät erittäneet VN-vasta-ainetta, eivät saaneet suojavaikutusta.
I! 17 64952
Taulukko 9
Hybridoma-vasta-aineiden hiiriä suojaava vaikutus vesikauhu-virus-altistusta vastaan
Hybridoma Siirrostettujen VN Suojan saaneiden hiirten solujen määrä määrä/altistettujen määrä C-l 5 x 106 + 6/6 110-5 5 x 105 + 9/10 5 x 104 + 6/6 B-l 5 x 106 - 0/6 - ei yhtään - 0/6 Tämän keksinnön mukainen solusukupolvi merkitsee hybridiviljelmää, jolla on sekä normaalien pernasolujen että myelooma-emäsolujen ominaisuuksia ja joka näyttää olevan peräisin yhdestä ainoasta fuusioitumistapahtumasta. Solut ovat luonteeltaan hybridejä, koska: (a) Solusukupolvea on kasvatettu useita kuukausia selektiivisessä HAT-medlumissa, joka inhiboi parenteraalisten P3 x 63 Ag8 myelooma-solujen kasvun mutta ei normaalien pernasolujen, jotka vuorostaan eivät luultavasti eläisi enempää kuin 4-5 viikkoa in vitro; (b) Hybridisolujen kromosomien lukumäärä on lähellä normaalin hiiren ja myelooma-emäsolujen kromosomien summaa; (c) HK-PEG-l-hybridi ei tuota ainoastaan IgGl, jota myös P3 x 63 Ag8 erittää, vaan myös IgG3 ja luultavasti hybridimolekyvlejä; ja (d) Hybridi tuottaa antiviraalisesti aktiivisia vasta-aineita, mitä P3 x 63 Ag8 ei sen sijaan tee.
Vaikkakin vasta-aineita tuotetaan parhaiten kasvattamalla hybridi-solusukupolvia in vitro, vasta-aineita voidaan muodostaa myös injektoimalla histologisesti yhteensopiva eläin hybridisolusukupolvella ja tuottamalla vasta-aineet in vivo. Esimerkiksi hiiret, jotka ovat T-- 18 64952 suhteellisen halpoja eläimiä, voidaan injektoida hiirestä peräisin olevalla vasta-ainetta tuottavilla soluilla talteenotettavien vasta-aineiden muodostamiseksi. Aikaisemmin tarkastellussa taulukossa 6 on esitetty tällaisissa olosuhteissa saadun vasta-aineen määrä.
Hybrideillä tuotetut vasta-aineet voidaan ottaa talteen normaalilla tekniikalla ja niitä voidaan käyttää analyyttisessä lääketieteellisessä tutkimuksessa virusantigeenien tunnistamiseen verinäytteissä ja viljely-mediumeissa. In vitro tuotetut vasta-aineet ovat homogeenisia ja erittäin spesifisiä virusantigeenille. Kun saatavissa on erilaisia homogeenisia vasta-aineita, joista kukin on erittäin spesifinen tietylle antigeenille, tutkijat voivat nopeasti määrittää antigeenin spesifisyyden ja/tai karakterisoida virusantigeenit. Lisäksi vasta-aineita voidaan antaa sairaille eläimille ja auttaa taudin torjumisessa.
Claims (6)
1. Menetelmä geneettisesti pysyvien solulinjojen valmistamiseksi, jotka jatkuvasti pystyvät tuottamaan "in vivo"- tai väliaine-viljemässä suuria määriä monoklonaalista virusvasta-ainetta, erityisesti influenssa- tai vesikauhuvirusvasta-ainetta, tunnettu siitä, että virusvasta-ainetta muodostavia soluja ja niiden kanssa yhteensopivia myeloomasoluia, edullisesti hiiren soluja, fuusioidaan sinänsä tunnetusti hybridisoluiksi, jolloin edullinen influenssavirusvasta-ainetta tuottava solu-linja on talletettu tunnuksella ATCC CL 189.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että virusvasta-ainetta tuottava solu on pernasolu.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että perna on hiiren perna ja myelooma on hiiren myelooma.
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hiiri on BALB/c-hiiri.
5. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että myelooma on P3 x 63 Ag8, joka on peräisin MOPC-21-linjasta.
6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että injektoidaan BALB/c-hiiri viruksella, jotta indusoitaisiin hiiren pernasolut muodostamaan vasta-ainetta, muodostetaan virusvasta-ainetta tuottavien pernasolujen ja M0PC-21-linjasta peräisin olevan, BALB/c-myeloomasolu-kloonin (P3 x 63 Ag8) fuusiosoluhybridi.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US80685777A | 1977-06-15 | 1977-06-15 | |
| US80685777 | 1977-06-15 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI781818A FI781818A (fi) | 1978-12-16 |
| FI64952B FI64952B (fi) | 1983-10-31 |
| FI64952C true FI64952C (fi) | 1984-02-10 |
Family
ID=25194989
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI781818A FI64952C (fi) | 1977-06-15 | 1978-06-07 | Foerfarande foer framstaellning av genetiskt stabila cellinjer |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (2) | JPS592276B2 (fi) |
| AU (1) | AU525724B2 (fi) |
| BE (1) | BE868099A (fi) |
| CA (1) | CA1103157A (fi) |
| CH (1) | CH640735A5 (fi) |
| DE (1) | DE2826075A1 (fi) |
| DK (1) | DK267378A (fi) |
| ES (1) | ES470729A1 (fi) |
| FI (1) | FI64952C (fi) |
| FR (1) | FR2394607A1 (fi) |
| GB (1) | GB2000186A (fi) |
| IL (1) | IL54908A (fi) |
| IT (1) | IT1096742B (fi) |
| LU (1) | LU79812A1 (fi) |
| NL (1) | NL7806471A (fi) |
| NO (1) | NO782081L (fi) |
| PL (1) | PL207652A1 (fi) |
| SE (1) | SE7806729L (fi) |
| ZA (1) | ZA783261B (fi) |
Families Citing this family (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0008092B1 (de) | 1978-08-10 | 1982-07-28 | Schering Aktiengesellschaft | Verfahren zur Gewinnung von Immunglobulin-E-Antikörpern der Maus, die hierfür verwendbaren Hybridzellinien und deren Herstellung; Verwendung der so erhaltenen Immunglobulin-E-Antikörper |
| CA1142466A (en) * | 1979-01-09 | 1983-03-08 | Cesar Milstein | Cell lines |
| US4271145A (en) * | 1979-10-22 | 1981-06-02 | The Massachusetts General Hospital | Process for producing antibodies to hepatitis virus and cell lines therefor |
| EP0038642B1 (en) * | 1980-04-09 | 1989-02-08 | National Research Development Corporation | A monoclonal antibody against hepatitis b and its production, a hybridoma producing the monoclonal antibody and compositions containing it, the propagation of the hybridoma and the monoclonal antibody for use as an antiviral agent against hepatitus b and in isolating hepatitus b surface antigen from a sample |
| US5204095A (en) * | 1980-04-09 | 1993-04-20 | National Research Development Corporation | Monoclonal antibodies against hepatitis B virus |
| NL185309C (nl) * | 1980-07-28 | 1990-03-01 | Akzo Nv | Methode voor het bepalen van antigenen met behulp van twee of meer monoklonale antilichamen alsmede immuunreagens. |
| JPS5825439B2 (ja) * | 1980-12-30 | 1983-05-27 | 株式会社林原生物化学研究所 | ヒト副甲状腺ホルモンの製造方法 |
| US4608337A (en) * | 1980-11-07 | 1986-08-26 | The Wistar Institute | Human hybridomas and the production of human monoclonal antibodies by human hybridomas |
| JPS609795B2 (ja) * | 1980-12-11 | 1985-03-13 | 株式会社林原生物化学研究所 | ヒト上皮細胞成長因子の製造方法 |
| WO1982003089A1 (en) * | 1981-03-06 | 1982-09-16 | Lennox Edwin Samuel | Monoclonal antibody |
| CA1262238C (en) * | 1982-09-30 | 1989-10-10 | HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST BACTERIAL TOXINS | |
| JPH03271235A (ja) * | 1983-04-08 | 1991-12-03 | Kureha Chem Ind Co Ltd | 抗カンジダ菌抗体分泌ハイブリドーマ |
| JPS60104020A (ja) * | 1983-10-14 | 1985-06-08 | メルク エンド カムパニー インコーポレーテツド | Ａ型肝炎‐タンパク質サブユニツト抗原 |
| US4707442A (en) * | 1983-10-24 | 1987-11-17 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Hybrid cell line producing monoclonal antibody cytolytic to Trichomonas vaginalis |
| US4731237A (en) * | 1983-11-07 | 1988-03-15 | The Wistar Institute | Immune response to virus induced by anti-idiotype antibodies |
| US5053224A (en) * | 1983-11-07 | 1991-10-01 | Hilary Koprowski | Induction of antibody response to solid tumors with anti-idiotype antibodies |
| NL8401221A (nl) * | 1984-04-16 | 1985-11-18 | Innovi Nv | Analytische toepassing van fagocyt-cellijnen. |
| JPS6140800A (ja) * | 1984-07-27 | 1986-02-27 | バイオテクノロジー アンド エクスペリメンタル リサーチ インコーポレーテツド | 電気細胞融合法を用いたモノクローナル抗体の製造方法 |
| EP0198086B1 (en) * | 1984-09-28 | 1991-01-16 | Teijin Limited | Mouse human hybridoma producing antivirus human antibody, process for its preparation, and antivirus human monoclonal antibody |
| JPS6181782A (ja) * | 1984-09-28 | 1986-04-25 | Teijin Ltd | 抗ウイルス・ヒト抗体を産生するマウス−ヒトハイブリド−マ及びその製造法並びにその使用方法 |
| JPS6226300A (ja) * | 1984-10-10 | 1987-02-04 | セントコ−・インコ−ポレ−テツド | Ｈｔｌｖ−３ｄｎａのクロ−ニングおよび発現 |
| GB8501473D0 (en) * | 1985-01-21 | 1985-02-20 | Pasteur Institut | Cloned dna sequences |
| JPS61104796A (ja) * | 1984-10-26 | 1986-05-23 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | モノクロ−ナル抗体の製造方法 |
| JP2518607B2 (ja) * | 1985-08-29 | 1996-07-24 | 雪印乳業株式会社 | インフルエンザａ型ウイルスｈａ抗原に対するモノクロ―ナル抗体およびその作成方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3423505A (en) * | 1964-10-31 | 1969-01-21 | Univ Toronto | Rabies vaccine and process for preparation thereof |
| US3585266A (en) * | 1969-02-24 | 1971-06-15 | Dow Chemical Co | Live rabies virus vaccine and method for the production thereof |
-
1978
- 1978-06-07 FI FI781818A patent/FI64952C/fi not_active IP Right Cessation
- 1978-06-07 ZA ZA00783261A patent/ZA783261B/xx unknown
- 1978-06-09 SE SE7806729A patent/SE7806729L/xx unknown
- 1978-06-12 FR FR7817545A patent/FR2394607A1/fr active Granted
- 1978-06-13 JP JP53071398A patent/JPS592276B2/ja not_active Expired
- 1978-06-13 GB GB7826758A patent/GB2000186A/en not_active Withdrawn
- 1978-06-13 ES ES470729A patent/ES470729A1/es not_active Expired
- 1978-06-14 BE BE188549A patent/BE868099A/xx not_active IP Right Cessation
- 1978-06-14 DE DE19782826075 patent/DE2826075A1/de active Granted
- 1978-06-14 IL IL54908A patent/IL54908A/xx unknown
- 1978-06-14 IT IT7824577A patent/IT1096742B/it active
- 1978-06-14 AU AU37088/78A patent/AU525724B2/en not_active Expired
- 1978-06-14 DK DK267378A patent/DK267378A/da not_active Application Discontinuation
- 1978-06-14 LU LU79812A patent/LU79812A1/de unknown
- 1978-06-14 NO NO782081A patent/NO782081L/no unknown
- 1978-06-14 CA CA305,453A patent/CA1103157A/en not_active Expired
- 1978-06-14 CH CH649278A patent/CH640735A5/de not_active IP Right Cessation
- 1978-06-15 NL NL7806471A patent/NL7806471A/xx not_active Application Discontinuation
- 1978-06-15 PL PL20765278A patent/PL207652A1/xx unknown
-
1982
- 1982-11-12 JP JP57198816A patent/JPS58101688A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IT1096742B (it) | 1985-08-26 |
| JPS58101688A (ja) | 1983-06-16 |
| JPS592276B2 (ja) | 1984-01-18 |
| NO782081L (no) | 1978-12-15 |
| FR2394607A1 (fr) | 1979-01-12 |
| IL54908A0 (en) | 1978-08-31 |
| IL54908A (en) | 1982-01-31 |
| DE2826075A1 (de) | 1979-02-15 |
| CA1103157A (en) | 1981-06-16 |
| AU525724B2 (en) | 1982-11-25 |
| SE7806729L (sv) | 1978-12-16 |
| NL7806471A (nl) | 1978-12-19 |
| DE2826075C2 (fi) | 1987-08-06 |
| LU79812A1 (de) | 1978-12-07 |
| PL207652A1 (pl) | 1979-06-04 |
| GB2000186A (en) | 1979-01-04 |
| DK267378A (da) | 1978-12-16 |
| FI781818A (fi) | 1978-12-16 |
| ZA783261B (en) | 1979-06-27 |
| FR2394607B1 (fi) | 1983-12-30 |
| JPS5417185A (en) | 1979-02-08 |
| FI64952B (fi) | 1983-10-31 |
| BE868099A (fr) | 1978-10-02 |
| ES470729A1 (es) | 1979-01-16 |
| IT7824577A0 (it) | 1978-06-14 |
| AU3708878A (en) | 1979-12-20 |
| CH640735A5 (de) | 1984-01-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI64952C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av genetiskt stabila cellinjer | |
| US4196265A (en) | Method of producing antibodies | |
| Walsh et al. | Monoclonal antibodies to respiratory syncytial virus proteins: identification of the fusion protein | |
| Koprowski et al. | Production of antibodies against influenza virus by somatic cell hybrids between mouse myeloma and primed spleen cells. | |
| US4790987A (en) | Viral glycoprotein subunit vaccine | |
| FI87734B (fi) | Immunologisk motverkan foer tumoerer och virus | |
| Bruns et al. | Lymphocytic choriomeningitis virus. VI. Isolation of a glycoprotein mediating neutralization | |
| Mathews et al. | Role of complement and the Fc portion of immunoglobulin G in immunity to Venezuelan equine encephalomyelitis virus infection with glycoprotein-specific monoclonal antibodies | |
| EP0038642B1 (en) | A monoclonal antibody against hepatitis b and its production, a hybridoma producing the monoclonal antibody and compositions containing it, the propagation of the hybridoma and the monoclonal antibody for use as an antiviral agent against hepatitus b and in isolating hepatitus b surface antigen from a sample | |
| CA2167835A1 (en) | Monoclonal iga antibody against respiratory syncytial virus | |
| Tamura et al. | Subtype cross-reactive, infection-enhancing antibody responses to influenza A viruses | |
| CN111153988A (zh) | 广谱抗肠道病毒d68型的中和性单克隆抗体 | |
| DE69738312T2 (de) | Hepatitis b monoklonale antikörper | |
| PL172853B1 (pl) | Niezjadliwa szczepionka przeciw wsciekliznieoraz sposób wytwarzania niezjadliwej szczepionki przeciw wsciekliznie PL | |
| Smorodinsky et al. | Towards an idiotype vaccine against mammary tumors. Induction of an immune response to breast cancer‐associated antigens by anti‐idiotypic antibodies | |
| Stavrou et al. | Monoclonal antibodies reactive with glioma cell lines derived from experimental brain tumors | |
| FI111518B (fi) | Menetelmä monoklonaalisten vasta-aineiden ja vasta-ainetta sisältävän farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseksi | |
| Prabhakar et al. | Monoclonal antibody techniques applied to viruses | |
| Nagata et al. | Identification of epitopes associated with different biological activities on the glycoprotein of vesicular stomatitis virus by use of monoclonal antibodies | |
| EP0370090B1 (en) | Immunogens and biologically active peptides derived from shared sequences from antigens and anti-idiotypic antibodies or antibodies specific for cellular receptors of the antigens | |
| CN107446049B (zh) | 一种靶向人肝癌干细胞的单克隆抗体及其应用 | |
| Desgranges et al. | High affinity human monoclonal antibodies directed against hepatitis B surface antigen | |
| US10092635B2 (en) | Tumor vaccines and methods of use thereof | |
| CN114773461B (zh) | 乙型脑炎病毒抗体1d11及其应用 | |
| Vincent et al. | Immunological relationships between rabies virus and rabies-related viruses studied with monoclonal antibodies to Mokola virus |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM | Patent lapsed |
Owner name: THE WISTAR INSTITUTE |