JP2518607B2 - インフルエンザａ型ウイルスｈａ抗原に対するモノクロ―ナル抗体およびその作成方法 - Google Patents
インフルエンザａ型ウイルスｈａ抗原に対するモノクロ―ナル抗体およびその作成方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、インフルエンザＡ型ウイルスの感染による
発症の診断、予防ならびに治療に利用される抗インフル
エンザウイルス抗体としてのモノクローナル抗体および
その作成方法に関する。
発症の診断、予防ならびに治療に利用される抗インフル
エンザウイルス抗体としてのモノクローナル抗体および
その作成方法に関する。
従来の技術的背景 インフルエンザウイルスは、オルソミクソウイルスに
属するエンベロープウイルスであつて、Ａ型、Ｂ型およ
びＣ型が知られているが、そのうちで最も広域での流行
を起すのはＡ型ウイルスである。
属するエンベロープウイルスであつて、Ａ型、Ｂ型およ
びＣ型が知られているが、そのうちで最も広域での流行
を起すのはＡ型ウイルスである。
また、ウイルス抗原としては、血球凝集素（HA）とノ
イラミニダーゼ（NA）の糖タンパクスパイクが知られて
おり、Ａ型ウイルスは周期的にHAとNAのタイプを変えて
大規模な流行を引き起こす特性を有する。
イラミニダーゼ（NA）の糖タンパクスパイクが知られて
おり、Ａ型ウイルスは周期的にHAとNAのタイプを変えて
大規模な流行を引き起こす特性を有する。
したがつて、インフルエンザの流行期である冬期前に
ワクチン接種を受けても、別の型のウイルスによるイン
フルエンザが流行するため、ワクチンの効果が期待でき
ないことが多い。
ワクチン接種を受けても、別の型のウイルスによるイン
フルエンザが流行するため、ワクチンの効果が期待でき
ないことが多い。
上述した事情から、特定のウイルスに対する抗体を与
えることがインフルエンザの治療上最も望ましいと言え
る。
えることがインフルエンザの治療上最も望ましいと言え
る。
近年、単クローン性抗体の作成技術の確立に伴ない、
種々のウイルスに対する抗体が作成されている。しかし
ながら、これらの抗体のほとんどは、マウス由来のもの
であつて、それを臨床に応用する場合、マウス免疫グロ
ブリンがヒトにとつて異種タンパクである故に免疫反応
が起ることが予想されるため、ヒト型単クローン性抗体
が不可欠である。
種々のウイルスに対する抗体が作成されている。しかし
ながら、これらの抗体のほとんどは、マウス由来のもの
であつて、それを臨床に応用する場合、マウス免疫グロ
ブリンがヒトにとつて異種タンパクである故に免疫反応
が起ることが予想されるため、ヒト型単クローン性抗体
が不可欠である。
従来、ヒト単クローン性抗体を得る方法としては、ヒ
トリンパ球とヒト骨髄腫細胞あるいは他の動物の骨髄腫
細胞とを細胞融合させる方法と、ヘルペスウイルスの一
種であるエプスタイン・バールウイルス（以下、EBVと
略記する）でヒトリンパ球を形質転換させる方法とがあ
る。
トリンパ球とヒト骨髄腫細胞あるいは他の動物の骨髄腫
細胞とを細胞融合させる方法と、ヘルペスウイルスの一
種であるエプスタイン・バールウイルス（以下、EBVと
略記する）でヒトリンパ球を形質転換させる方法とがあ
る。
而して、上記細胞融合による方法では、得られる抗体
は親株の性質に大きく依存するものであるが、現在まで
のところ、汎用性の高い、融合効率の良好な親株は見出
されていない。これに対し、上記EBVによる形質転換方
法では、高い確立で形質転換株を得ることができるもの
の、その抗体産生能が不安定であるため、長期間におけ
る抗体の安定な産生を維持することは困難であるとされ
ている。しかし、最近、上記方法で得られた形質転換株
についてクローニングを繰返し行なうことにより、安定
な抗体産生クローンを得ることが可能となり、また、正
常リンパ球から得られるクローンの数も細胞融合法より
もはるかに多いので、EBVによる形質転換法は単クロー
ン性抗体の作成上有利な方法であると言える。因に、近
年では形質転換細胞と骨髄腫細胞とを融合させて安定な
抗体産生株を得る方法も開発されている。
は親株の性質に大きく依存するものであるが、現在まで
のところ、汎用性の高い、融合効率の良好な親株は見出
されていない。これに対し、上記EBVによる形質転換方
法では、高い確立で形質転換株を得ることができるもの
の、その抗体産生能が不安定であるため、長期間におけ
る抗体の安定な産生を維持することは困難であるとされ
ている。しかし、最近、上記方法で得られた形質転換株
についてクローニングを繰返し行なうことにより、安定
な抗体産生クローンを得ることが可能となり、また、正
常リンパ球から得られるクローンの数も細胞融合法より
もはるかに多いので、EBVによる形質転換法は単クロー
ン性抗体の作成上有利な方法であると言える。因に、近
年では形質転換細胞と骨髄腫細胞とを融合させて安定な
抗体産生株を得る方法も開発されている。
発明が解決しようとする問題点 本発明者等は、上述した状況に鑑み、インフルエンザ
Ａ型ウイルスHA抗原に対する安定な単クローン性抗体の
取得について検討した結果、ヒトリンパ球として末梢血
由来のヒトリンパ球を用い、該ヒトリンパ球をEBVで形
質転換して得られる形質転換株であるヒトリンパ芽球様
細胞が上記抗体を安定に産生し得ること、及び上記形質
転換株が産生する単クローン性抗体（モノクローナル抗
体）が上記Ａ型ウイルスHA抗原に対して特異的に反応性
を示すことの知見を得て、本発明をなすに至つた。
Ａ型ウイルスHA抗原に対する安定な単クローン性抗体の
取得について検討した結果、ヒトリンパ球として末梢血
由来のヒトリンパ球を用い、該ヒトリンパ球をEBVで形
質転換して得られる形質転換株であるヒトリンパ芽球様
細胞が上記抗体を安定に産生し得ること、及び上記形質
転換株が産生する単クローン性抗体（モノクローナル抗
体）が上記Ａ型ウイルスHA抗原に対して特異的に反応性
を示すことの知見を得て、本発明をなすに至つた。
すなわち、本発明は、インフルエンザＡ型ウイルスHA
抗原に対して特異的に反応性を示すヒトモノクローナル
抗体およびその作成方法を提供することを目的とする。
抗原に対して特異的に反応性を示すヒトモノクローナル
抗体およびその作成方法を提供することを目的とする。
以下本発明を詳しく説明する。
発明の構成 本発明の特徴は、 ヒトリンパ球をEBVで形質転換させたヒトＢリンパ
芽球様細胞より産生され、インフルエンザＡ型ウイルス
HA抗原に対し特異性を有し、ヒトIgGクラスに属するモ
ノクローナル抗体及び ヒトリンパ球に、EBV株の培養液の上清を加えて感
染させたEBV感染リンパ球を培養して形質転換させてヒ
トＢリンパ芽球様細胞を得、この細胞から、インフルエ
ンザＡ型ウイルスHA抗原を吸着させた固相を用い、酵素
結合免疫吸着体法による活性測定を行なって、インフル
エンザＡ型ウイルスHA抗原に対して特異的に反応性を示
す細胞株を分取し、この細胞株をクローニングすること
を特徴とするインフルエンザＡ型ウイルスのHA抗原に特
異性を有し、ヒトIgGクラスに属するモノクローナル抗
体の作成方法。
芽球様細胞より産生され、インフルエンザＡ型ウイルス
HA抗原に対し特異性を有し、ヒトIgGクラスに属するモ
ノクローナル抗体及び ヒトリンパ球に、EBV株の培養液の上清を加えて感
染させたEBV感染リンパ球を培養して形質転換させてヒ
トＢリンパ芽球様細胞を得、この細胞から、インフルエ
ンザＡ型ウイルスHA抗原を吸着させた固相を用い、酵素
結合免疫吸着体法による活性測定を行なって、インフル
エンザＡ型ウイルスHA抗原に対して特異的に反応性を示
す細胞株を分取し、この細胞株をクローニングすること
を特徴とするインフルエンザＡ型ウイルスのHA抗原に特
異性を有し、ヒトIgGクラスに属するモノクローナル抗
体の作成方法。
にある。
問題点を解決するための手段 本発明におけるEBVで形質転換したヒトリンパ芽球様
細胞により産出される、インフルエンザＡ型ウイルスHA
抗原に対するモノクローナル抗体は下記特性を有する。
細胞により産出される、インフルエンザＡ型ウイルスHA
抗原に対するモノクローナル抗体は下記特性を有する。
ｉ）インフルエンザＡ型HA抗原に対する反応性： HA抗原の種類 反応性 インフルエンザＡ石川 ＋ インフルエンザＡ熊本 ＋ インフルエンザＡ新潟 ＋ インフルエンザＢシンガポール − 本発明に係るモノクローナル抗体は下記手順により作
成し得る。
成し得る。
モノクローナル抗体の作成： 本発明で用いるヒトリンパ球は末梢血由来のもののほ
かに、リンパ節、脾臓、扁桃ならびにサイ帯血由来のも
のも用いられるが、末梢血由来のものを用いるのが操作
上最も簡便である。
かに、リンパ節、脾臓、扁桃ならびにサイ帯血由来のも
のも用いられるが、末梢血由来のものを用いるのが操作
上最も簡便である。
ヒトリンパ球を形質転換するのに用いるEBVは、常法
に従つてB95−８細胞由来のものを用い、B95−８細胞を
RPMI 1640培地に10％の牛胎児血清（FCS）を加えて培養
し、この培養液を400×Ｇで10分間遠心させて得られる
上清を使用する。
に従つてB95−８細胞由来のものを用い、B95−８細胞を
RPMI 1640培地に10％の牛胎児血清（FCS）を加えて培養
し、この培養液を400×Ｇで10分間遠心させて得られる
上清を使用する。
ヒトリンパ球の形質転換は、ヒトリンパ球に上記上清
のEBVを加えて混合してEBVを感染させ、このEBV感染リ
ンパ球を、３〜４日毎に培地を交換しながら、２〜６週
間培養することにより行なう。
のEBVを加えて混合してEBVを感染させ、このEBV感染リ
ンパ球を、３〜４日毎に培地を交換しながら、２〜６週
間培養することにより行なう。
上述のようにしてヒトリンパ球を形質転換することに
より、目的とするインフルエンザＡ型ウイルスHA抗原に
対して特異的なモノクローナル抗体の産生能を有するヒ
トＢリンパ芽球様細胞が得られ、培養上清中に上記抗イ
ンフルエンザ抗体が分泌される。
より、目的とするインフルエンザＡ型ウイルスHA抗原に
対して特異的なモノクローナル抗体の産生能を有するヒ
トＢリンパ芽球様細胞が得られ、培養上清中に上記抗イ
ンフルエンザ抗体が分泌される。
次いで、この抗インフルエンザ抗体の活性を、インフ
ルエンザＡ型ウイルス吸着させた固相（マイクロタイタ
ープレート）を用いる酵素結合免疫吸着体測定法（ELIS
A）により測定し、活性を示す抗体細胞は直ちにクロー
ニングを行なう。このクローニングには軟寒天培養によ
る方法、限界稀釈による方法、単一細胞分離による方法
等があるが、フイーダ細胞を使わない平底マイクロタイ
タープレートを用いる方法が操作上簡便である。
ルエンザＡ型ウイルス吸着させた固相（マイクロタイタ
ープレート）を用いる酵素結合免疫吸着体測定法（ELIS
A）により測定し、活性を示す抗体細胞は直ちにクロー
ニングを行なう。このクローニングには軟寒天培養によ
る方法、限界稀釈による方法、単一細胞分離による方法
等があるが、フイーダ細胞を使わない平底マイクロタイ
タープレートを用いる方法が操作上簡便である。
クローニングした細胞は、その抗体産生能を確認した
後、大量に培養して培養上清を集めることにより抗イン
フルエンザＡ型ウイルスHA抗原抗体を取得することがで
きる。
後、大量に培養して培養上清を集めることにより抗イン
フルエンザＡ型ウイルスHA抗原抗体を取得することがで
きる。
本発明により、叙上のようにして得られたモノクロー
ナル抗体は、インフルエンザＡ型ウイルスHA抗原に対し
て特異的に反応性を示すので、上記Ａ型ウイルスの感染
による発症の診断は勿論のこと、その治療ならびに予防
に利用し得るものである。
ナル抗体は、インフルエンザＡ型ウイルスHA抗原に対し
て特異的に反応性を示すので、上記Ａ型ウイルスの感染
による発症の診断は勿論のこと、その治療ならびに予防
に利用し得るものである。
以下に実施例を示して、本発明に係るモノクローナル
抗体の作成方法を具体的に説明する。
抗体の作成方法を具体的に説明する。
実施例 ヒトリンパ球の採取： 健康成人の末梢血をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で
稀釈し、この稀釈液をフイコール・パツク（フアルマシ
ア社）上に重層して400×Ｇで30分間遠心を行ない、生
成した中間層のリンパ球を採取し、PBSで洗浄した。
稀釈し、この稀釈液をフイコール・パツク（フアルマシ
ア社）上に重層して400×Ｇで30分間遠心を行ない、生
成した中間層のリンパ球を採取し、PBSで洗浄した。
EBVの調製： マーモセツト細胞B95−８を、RPMI 1640培地（ギブコ
社）に牛胎児血清（FCS）を10％になるように加えた培
地中で培養し、得られた培養液を400×Ｇで10分間遠心
を行ない、得られた上清をEBVとして用いた。
社）に牛胎児血清（FCS）を10％になるように加えた培
地中で培養し、得られた培養液を400×Ｇで10分間遠心
を行ない、得られた上清をEBVとして用いた。
形質転換： 上記採取したリンパ球５×106あたり、上記EBV1mlを
加えて混合し、37℃に２時間放置してリンパ球にEBVを
感染させた。次いで、EBV感染リンパ球を５×105づつ24
ウエルプレート（コーニング社）に播種し、３〜４日毎
に培地交換を行ないながら、培養を行なつた。培養は、
10％FCSを含むRPMI 1640培地中で、37℃の温度、５％炭
酸ガス雰囲気下で行なつた。３週間の培養後、上記ウエ
ルの全てに形質転換したＢリンパ芽球様細胞（BLCL）が
確認された。
加えて混合し、37℃に２時間放置してリンパ球にEBVを
感染させた。次いで、EBV感染リンパ球を５×105づつ24
ウエルプレート（コーニング社）に播種し、３〜４日毎
に培地交換を行ないながら、培養を行なつた。培養は、
10％FCSを含むRPMI 1640培地中で、37℃の温度、５％炭
酸ガス雰囲気下で行なつた。３週間の培養後、上記ウエ
ルの全てに形質転換したＢリンパ芽球様細胞（BLCL）が
確認された。
酵素結合免疫吸着体測定法（ELISA）による抗ウイルス
抗体の検出： インフルエンザＡ型ウイルスHA抗原（デンカ生研）を
0.05M重炭酸ナトリウム水溶液で稀釈し、96穴マイクロ
タイターELISAプレート（住友化学社）に50μづつ分
注し、４℃で一夜抗原被覆したものを固相として用い
た。
抗体の検出： インフルエンザＡ型ウイルスHA抗原（デンカ生研）を
0.05M重炭酸ナトリウム水溶液で稀釈し、96穴マイクロ
タイターELISAプレート（住友化学社）に50μづつ分
注し、４℃で一夜抗原被覆したものを固相として用い
た。
次いで、１％ウシ血清アルブミンでウエルを被覆した
後、これに50μのBLCLの培養上清を加え、結合した抗
インフルエンザウイルス抗体を、西洋ワサビパーオキシ
ダーゼ結合抗ヒトIgと反応させ、上記固相に結合した酵
素活性を測定した。
後、これに50μのBLCLの培養上清を加え、結合した抗
インフルエンザウイルス抗体を、西洋ワサビパーオキシ
ダーゼ結合抗ヒトIgと反応させ、上記固相に結合した酵
素活性を測定した。
上記測定により多数のBLCLの中からインフルエンザＡ
型HA抗原に反応する22・２・５細胞を得た。
型HA抗原に反応する22・２・５細胞を得た。
この22・２・５細胞の培養上清中の抗ウイルス抗体の
上記Ａ型HA抗原に対する反応性は表１に示すとおりであ
る。
上記Ａ型HA抗原に対する反応性は表１に示すとおりであ
る。
22・２・５細胞のクローニング： 上述のようにして得られた22・２・５細胞を、丸底の
96穴マイクロタイタープレートに5/ウエルになるように
播種し、上述したELISAにより培養上清中の抗インフル
エンザ抗体を検出したところ、30/191の陽性ウエルが認
められた。この陽性ウエルにおける単一のクラスの免疫
グロブリンを分泌しているものを調べた結果、すべてIg
Gであつた。
96穴マイクロタイタープレートに5/ウエルになるように
播種し、上述したELISAにより培養上清中の抗インフル
エンザ抗体を検出したところ、30/191の陽性ウエルが認
められた。この陽性ウエルにおける単一のクラスの免疫
グロブリンを分泌しているものを調べた結果、すべてIg
Gであつた。
そのうちのIgG産生能の高いクローン22・２・5,3株
は、６ケ月以上にわたつて１μg/mlの抗インフルエンザ
Ａ型ウイルス抗体を分泌したことが確認された。この培
養上清を集め、常法に従ってインフルエンザＡ型ウイル
スHA抗原に特異的なモノクローナル抗体を得た。
は、６ケ月以上にわたつて１μg/mlの抗インフルエンザ
Ａ型ウイルス抗体を分泌したことが確認された。この培
養上清を集め、常法に従ってインフルエンザＡ型ウイル
スHA抗原に特異的なモノクローナル抗体を得た。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/577 (Ｃ１２Ｐ 21/08 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (56)参考文献 特開 昭58−101688（ＪＰ，Ａ) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，80〔３〕（1983）Ｐ．840 −844 Ｎａｔｕｒｅ．269（1977）Ｐ．419− 422 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，81〔６〕（1984）Ｐ．1809 −1812
Claims (2)
- 【請求項１】ヒトリンパ球をエプスタイン・バールウイ
ルスで形質転換させたヒトＢリンパ芽球様細胞より産生
され、インフルエンザＡ型ウイルスHA抗原に対し特異性
を有し、ヒトIgGクラスに属するモノクローナル抗体。 - 【請求項２】ヒトリンパ球に、エプスタイン・バールウ
イルス株の培養液の上清を加えて感染させたエプスタイ
ン・バールウイルス感染リンパ球を培養して形質転換さ
せてヒトＢリンパ芽球様細胞を得、この細胞から、イン
フルエンザＡ型ウイルスHA抗原を吸着させた固相を用
い、酵素結合免疫吸着体法による活性測定を行なって、
インフルエンザＡ型ウイルスHA抗原に対して特異的に反
応性を示す細胞株を分取し、その細胞株をクローニング
することを特徴とするインフルエンザＡ型ウイルスHA抗
原に特異性を有し、ヒトIgGクラスに属するモノクロー
ナル抗体の作成方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60190086A JP2518607B2 (ja) | 1985-08-29 | 1985-08-29 | インフルエンザａ型ウイルスｈａ抗原に対するモノクロ―ナル抗体およびその作成方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60190086A JP2518607B2 (ja) | 1985-08-29 | 1985-08-29 | インフルエンザａ型ウイルスｈａ抗原に対するモノクロ―ナル抗体およびその作成方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6251700A JPS6251700A (ja) | 1987-03-06 |
| JP2518607B2 true JP2518607B2 (ja) | 1996-07-24 |
Family
ID=16252131
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60190086A Expired - Lifetime JP2518607B2 (ja) | 1985-08-29 | 1985-08-29 | インフルエンザａ型ウイルスｈａ抗原に対するモノクロ―ナル抗体およびその作成方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2518607B2 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2817869B1 (fr) * | 2000-12-07 | 2005-01-14 | Technopharm | Anticorps monoclonal humain dirige contre le virus influenza ou un fragment de celui-ci |
| JPWO2005007698A1 (ja) * | 2003-07-23 | 2008-01-17 | 富士レビオ株式会社 | 抗インフルエンザｂ型ウイルスモノクローナル抗体及び該抗体を用いる免疫測定器具 |
| US9969794B2 (en) | 2012-05-10 | 2018-05-15 | Visterra, Inc. | HA binding agents |
| WO2017083627A1 (en) | 2015-11-13 | 2017-05-18 | Visterra, Inc. | Compositions and methods for treating and preventing influenza |
| AU2020248404A1 (en) | 2019-03-25 | 2021-09-30 | Visterra, Inc. | Compositions and methods for treating and preventing influenza |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ZA783261B (en) * | 1977-06-15 | 1979-06-27 | Wistar Inst | Method of producing antibodies |
-
1985
- 1985-08-29 JP JP60190086A patent/JP2518607B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Ｎａｔｕｒｅ．２６９（１９７７）Ｐ．４１９−４２２ |
| Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０〔３〕（１９８３）Ｐ．８４０−８４４ |
| Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１〔６〕（１９８４）Ｐ．１８０９−１８１２ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6251700A (ja) | 1987-03-06 |
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