JP2691184B2 - 感染性ウイルス粒子を生産することなく、エイズウイルス抗原を製造する細胞系 - Google Patents
感染性ウイルス粒子を生産することなく、エイズウイルス抗原を製造する細胞系Info
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Description
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、後天性免疫不全症候群（AIDS）の原因とな
るウイルスに関する。さらに詳細には、本発明は、エイ
ズ感染性のウイルス粒子を付随的に生産することなく、
安全に、大量のエイズウイルスタンパク質を生産するこ
とのできる細胞系に関する。 従来技術の供述 AIDSは、致命的なヒトの疾患であり、Ｔリンパ球ヒト
レトロウイルスにより引き起こされるというのが有力な
説である。〔バレ−シノウシ等（Barre−Sinoussi,et a
l.），サイエンス（Science）220:868,1983;ポポビック
等（Popovic,et al.），サイエンス224:497,1984;レヴ
ィー等（Levy,et al.），サイエンス225:840,1984〕。
ウイルスは、感染した個体の体液、例えば血清または血
液が、非感染のヒトに移ったときに広がるということが
信じられている。AIDSの症例の多数が、汚染された血液
の輸血により生じていることが報告されているため、ポ
テンシャル キャリアー（potential carriers）を検出
するために、供与者の血清を免疫学的に試験することが
行われている。現在のところ、二つのタイプのスクリー
ニング試験、即ち酵素結合イムノアドソルベントアッセ
イ（ELISA）及びイムノブロッティング（Immunoblottin
g）法が使用されている。両方の例において、純粋なウ
イルス粒子または感染した細胞リセート（lysates）か
ら単離されたタンパク質が、AIDSウイルスに対する血清
抗体を検出するために抗原として使用される。これらの
ウイルス抗原の製造には、大量（約50リットル／週）の
感染性ウイルス及び組織培養体の処理が含まれる。現在
では、これらの試薬を製造する作業者は、感染した材料
に持続して曝されることを避けられず、AIDSにかかると
いう潜在的な危険に陥っている。 発明の要約 従って、本発明の目的は、感染性ウイルス粒子を付随
的に生産することなく、エイズウイルス抗原を効率よく
製造することができる細胞系を提供することにある。 本発明の他の目的は、本発明の細胞系により製造され
たAIDSウイルス抗原を含む容器と、特定の抗原−抗体反
応の免疫学的試験のための試薬または手段とからなる、
ヒトの体液または組織の検体中のAIDS抗体を検出するた
めのキットを提供することにある。 本発明の他の目的及び利点は、本発明の方法の詳細な
説明により明らかになるであろう。 図面の簡単な説明 これらの及び他の目的、特徴、並びに本発明の多くの
付随的な利点は、下記の詳細な説明を添付された図面と
関連づけて考えながら読むと、より良く理解されるであ
ろう。 第１図は、AIDS RV RNAを合成するヒト系リンパ球系
のin situハイブリダィゼーションを示す。（Ａ）は、I
UdRで処理した後の、（Ｂ）はIUdRで処理する前の8E5細
胞の顕微鏡写真であり、（Ｃ）はAIDS RVで感染した３
日後のA3.01細胞の顕微鏡写真であり、（Ｄ）は未感染
のA3.01細胞の顕微鏡写真であり、（Ｅ）はIUdrと培養
する前の、（Ｆ）はIUdrと培養した後の、IUdrで誘導さ
れた細胞の顕微鏡写真を示す。倍率は400倍である。 第２図は、8E5細胞のAIDS RV DNA,RNA及びタンパク質
の特性を示す。（Ａ）8E5 DNA 5.0μｇをEcoR Iで消化
し、サザーンブロットハイブリダィゼーションにより、
pBenn6プローブを用いて分析する。（Ｂ）ポリアデニル
化RNAをウイルス感染させたA3.01（レーン１）または8E
5（レーン２）細胞から製造し、ウイルスLTRプローブを
用いたノーザン分析にかける。（Ｃ）感染したA3.01
（レーン１）または8E5（レーン２）細胞リセートのイ
ムノブロット；数は、キロダルトン（kd）で示した標準
マーカーの分子量を表し、矢印は記載された条件下で電
気泳動にかけたときのマーカーの位置を示す；そして、 第３図は、8E5（Ａ）またはウイルス感染したAE.01
（Ｂ）細胞から合成されたAIDS RV粒子の電子顕微鏡写
真を示す。倍率は、50,000倍である。 発明の詳細な説明 本発明の上記及び他の目的及び利点は、アメリカ合衆
国,20852,マラーランド（Maryland），ロックヴィル（R
ockville），パークローン ドライブ（Parklawn Driv
e）,12301のアメリカン タイプ カルチャー コレク
ション（American Type Culture collection）に、ATCC
No.CRL8993の受託番号で、1986年１月22日に寄託され
たものの特質を有する、8E5と命名されたユニークなヒ
トＴリンパ球細胞系により達成される。本発明による特
許の発行により、この寄託は30年間生存状態で維持し続
けられ、当然ながら法律に適合して、制限なく公共の利
用に供される。 従って、本発明は、感染性のウイルス粒子を生産する
ことなくAIDSウイルス抗原を製造することができる能力
を有することを特徴とし、そしてATCC−CRL 8993の特性
を有することを特徴とする細胞系に関し、並びにメルカ
プトエタノールの存在下で、３％−27％のポリアクリル
アミドゲル電気泳動におけるイムノブロット分析により
調べられた分子量が、160,120,90,55,46,43,41,24及び1
7キロダルトンであるが、64及び34ではない抗原性のウ
イルスタンパク質から作られ、特に、該抗原性ウイルス
タンパク質の少なくとも一種が特異的にAIDSウイルスの
抗体と結合することができる非感染性エイズウイルスに
関する。本発明はさらに、検体と上記抗原性ウイルスの
蛋白質とを反応させ、抗原−抗体反応を免疫学的に検出
することを特徴とする検体中のAIDSウイルス抗体の検出
方法、並びに上記抗原性ウイルスタンパク質を含有する
容器と、抗原−抗体反応の発現の免疫学的測定のための
試薬または手段とからなる、上記方法を実施するための
キットに関する。 本発明の実施または試験には、ここに記載したものと
似ているかまたは同じであるいずれの方法及び材料も使
用しうるが、好ましい方法及び材料を下記に示す。下記
に挙げた全ての出版物は、参考文献として、本明細書中
に挿入される。別に定めない限り、ここで使用した全て
の技術または科学的用語は、本発明の属する技術分野の
通常の技術者により一般的に理解されるのと同じ意味を
有する。 ユニークなヒトレトロウイルス（RV）は、後天性免疫
不全症候群（AIDS）の患者から必ず単離されており、AI
DSの病原体であると信じられている。ヒトＴリンパ球ま
たはＴリンパ球系にAIDS RVを感染させることにより、
急速な細胞の死から、機能的に不活性なプロウイルスDN
Aの組み込みに至るまで、様々な結果が生じる。典型的
なAIDS RV感染は、多核細胞の出現、逆転写（RT）活性
の突発、及び５ないし20日にわたる著しい細胞変性を特
徴とする。近年の報告には、AIDS RVのヒトリンパ球に
対する非細胞毒性効果が記載されている。この報告によ
ると、フィトヘマグルチニンにより刺激されたヘルパー
インデューサーヒトＴリンパ球のインターロイキン−２
依存性の培養液は、急性のウイルス感染の特徴的な細胞
毒性効果を示したが、それにもかかわらず、充分な数の
細胞が生き残って、それらが培地に維持されていた４箇
月の間感染性ウイルスを生産し続けた。〔ホキシー等
（Hoxie et al.），サイエンス（Science）229:1400（1
985）〕。 本明細書に記載されたように、Leu−3+T細胞から誘導
された、AIDS RVに感染しても生き残ったLeu−3-非ウイ
ルス生産性細胞は、p64及びp35以外の主なウイルスタン
パク質の全てを本質的に生産するが、感染性ウイルスは
生産しないことが発見された。この発見の詳細を下記に
示す。 細胞クローンが、AIDS RVプロウイルスのシングルコ
ピーを含むサバイバー細胞の大量培養液から単離され
た。組み込まれた該プロウイルスのDNAは、本質的には
発現するが、検出可能な逆転写酵素の合成を行うことが
できない欠陥ウイルス粒子を生産する。細胞クローンの
製造及び幾つかの試験等の実施に使用された方法及び材
料を下記に示す。 材料及び方法 ウイルス感染、IUdR誘導、及び細胞クローニング： Folks et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,82:4539（19
85）に記載されているCEM T細胞系（A3.01）の変種で始
めて、約２×106個のA3.01細胞を、AIDS RV株のLAV菌株
の１×10-3の希釈液で、フォークス（Folks）等,supra
の方法に従って感染させた。続いて、37℃１時間の吸着
を行った後、細胞を洗浄し、10％のウシ胎児血清を補っ
たRPMI−1640培地中に維持（１×106細胞/ml）した。感
染しても生き残ったLeu−3-培養液のRT活性が検出不可
能になったら（RTのピーク後、７ないし10日）、当該技
術分野で良く知られていた標準技術に従って、細胞（１
×106細胞/ml）をIUdR（100μg/ml）に24時間暴露し、
その後Leu−3+A3.01細胞で共培養を行った。ウイルスの
誘導は共培養した細胞中のRT活性の第２の波により示さ
れる。RTがもはや検出されなくなったとき、サバイバー
細胞をIUdR誘導／共培養の第２のサイクルに課した。RT
陰性の、これらの処理を経て生き残ったLeu−3-細胞
は、標準的な限界希釈技術により、96ウェル微小滴定プ
レート中でクローン化された。111個のシングル細胞ク
ローンが得られ、10のグループにプールされ、総計１×
106個の細胞に広がり、IUdRに24時間暴露され、Leu−3+
A3.01細胞と共培養した。その後、AIDS RVの発現を、シ
ンシチア（syncytia）の形成をモニターすることにより
毎日試験した。これにより、シングルクローン（8E5）
が得られた。 核酸ハイプリダィゼーション:AIDS RVに感染した細胞
または8E5細胞からDNA及びRNAを製造し、クローン化LTR
（末端繰り返し配列）を使用して、サザーンまたはノー
ザンブロットハイブリダィゼーションにより、ウイルス
関連配列の存在または代表的なgag−pol−envプローブ
の存在を、Folks et al .,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,8
2:4539（1985）;Rabson et al.,Science,230:949（198
5）;Benn et al.,Science,230:949（1985）に記載され
たように分析した。in situハイブリダィゼーションの
ためには、培養された細胞をポリリジンでコーティング
されたスライドガラス上に沈降させ、過ヨウ素酸−リジ
ン−パラホルムアルデヒド−グルタールアルデヒド（PL
PG）中で固定し、そしてHCl及びプロティナーゼＫで前
処理し、そして、標識されたプロープを、Gendelman et
al.,J.Immun.Meth.,65:137（1983）;Gendelman et a
l.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:7086に従って、細胞に
入れる。細胞を10mMのトリスpH7.4,2×標準クエン酸塩
（SSC）（１×SSCは0.15MのNaCl,0.015Mのクエン酸ナト
リウム、pH7.4）、50％ポルムアミド、１×デンハルツ
（Denhardt's）溶液C0.02％ポリビニルピロリドン,0.02
％フィコール、0.02％ウシ血清アルブミン）及び200μg
/ml酵母tRNA中で、45℃の温度で２時間プレハイブリダ
ィゼーションし、反応混合物10μ中のデキストランス
ルフェート10％、５μＭジチオトリエトール及び反応混
合物10ml中、106カウント／分の35S−標識AIDS RV RNA
中でハイブリダィゼーションした。サブゲノムウイルス
DNA断片が、pBl（Benn et al,supra）,pBenn6（Folks e
t al.,supra）,pBll（Benn et al,supra）及び組み換え
プラスミド（pRG−Ｂ）中に存在し、それらは、プロウ
イルスDNA上の8.25と9.6kbとの間の1.25kbのHind III断
片マッピングを含み、これらは、SP6/T7ベクター（Prom
ega Biotec,Madison,WI）、及び35S−UTP（Amersham Co
rp.,Arington Hgts.,IL）により転写された、プールさ
れたDNAにザブクローン化された。標識RNAは、それらの
細胞への侵入を促進するハイブリダィゼーションよりも
前に40μＭのNaHCO3、60MのNa2CO3、pH10.2で培養し
た。 in situハイブリダィゼーションは、45℃で８時間実
施される。その後、検体は、22℃の２×SSCで10分間×
２チェンジ;2×SSC,0.1％トリトン（TRITON）Ｘ−100 6
0℃で30分間;RNaseA（40μg/ml）及びRNaseT1（10U/m
l）を伴った２×SSCで30分間；そして、２×SSC 60℃で
10分間、に洗い入れられた。RNaseを含むものを除く全
ての溶液は、５μＭのDDT及び１μＭのEDTAを含有させ
た。当該技術分野でよく知られた標準方法に従って、オ
ートラジオグラフィーを１〜２日間行った。 in situハイブリダィゼーションの特性を調整するた
めに、センスオリエンテーション（ウイルスmRNAと同じ
極性）で合成したプローブをデュープリケート細胞製剤
でインキュベートした。さらに、未感染の細胞をアンチ
センスプローブ（例えばウイルスmRNAに相補的なもの）
とハイブリダイゼーションさせた。感染した細胞製剤も
また、プローブの添加の前にRNaseで処理される。 イムノブロッティング:AIDS RVに感染したA3.01または8
E5（１×108）細胞から製造した全ての細胞リセート
を、２％のSDS及び２−メルカプトエタノール中で煮沸
し、３〜27％の勾配ポリアクリルアミドゲルを通して、
約100ボルトで、約18時間、Laemmli,Nature227:680（19
70）の方法により、電気泳動（Integration Separation
Sciences）にかけ、その後、ニトロセルロースメンブ
ラン（Towbin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76:4350
（1979））に移した。その後、その場で、10μＭのNaCl
（TN）中、フィルターを５％のノンファットドライミル
クで30分間処理し、さら0.3％のトゥイーン（Tween）−
20,0.5％のNP40（TN−TN）及び１％のBSAを含有するTN
緩衝液中ですすいだ。３％のBSAを含有するTN−TN中で
希釈された、プールされたAIDS患者の血清（1:1000）
を、ニトロセルロースフィルターとともに、室温で一晩
培養した。その後、メンブランをTN−TN緩衝液中で３回
洗浄し、125I−プロティンＡ（200,000dpm/ml）で２時
間培養し、風乾し、その後、当該技術分野でよく知られ
た技術に従って、Ｘ線フィルムに暴露した。 電子顕微鏡:AIDSレトロウイルスを感染させたA3.01細
胞、または8E5細胞を、標準ビームカプセル中で、650Xg
の遠心分離にかけた。その後、ペレットを、血清を含ま
ないRPMI1650媒体中で穏やかに洗浄し、その後、その場
で0.1Mのナトリウム カコジレート緩衝液,pH7.2の存在
下で、2.5％のグルタールアルデヒド中で、１〜２時間
固定した。４％のショ糖を含有する0.1Mのナトリウム
カコジレート緩衝液中、５分間で３回の洗浄に続いて、
ペレットを１％の四酸化オスミウムで１〜２時間処理し
た。その後、これらを0.1Mのナトリウム カコジレート
緩衝液中で３回洗浄し、そして30ないし100％のエタノ
ール中で脱水し、続いてプロピレンオキサイドを用い
て、最終的な脱水を行った。その後、検体をエポン−ア
ラルダイト（epon−Araldite）LX−112（Ladd Research
Industries,Burlington,VT,USA）中に埋封し、薄い切
片を製造した。続いて、酢酸鉛及びウラニルアセテート
で染色した後、JOEL 100B電子顕微鏡で、約80KVで調べ
た。 ここに記載された方法により、シンシチアを製造し、
IUdRに暴露した後、共培養したLeu−3+A3.01細胞で製造
したシングルクローン（8E5）を単離した。8E5細胞を膨
張させ、さらに詳細に特徴づけた時、予期されなかった
結果が得られた。IUdRで繰り返し処理したにもかかわら
ず、30日より長く維持された8E5及びLeu−3+A3.01細胞
の共培養液中にはRT活性は検出されなかった。これは、
8E5細胞のIUdR処理に続く24時間に現れるシンシチアが
容易に示されるということからみて驚くべきことであ
る。 8E5細胞中ウイルスRNA、DNA及びタンパク質の検出 誘導された8E5細胞内において、どのAIDSRV遺伝子生
成物が、もしあるとすれば、発現されているかというこ
とは不明確であるため、IUdR効果をモニターするために
は、in situハイブリダィゼーションが使用される。第
１図のＡに示すように、IUdRで処理された8E5細胞の実
質的に全てが、ウイルスRNAを合成した。興味深いの
は、IUdRの不在下で成長した8E5細胞もまた、高レベル
のAIDS RV RNAを発現するという事実である（第１図の
Ｂ）。第１図に示したin situハイブリダィゼーション
の結果もまた、クローン化した8E5細胞が、ウイルスに
感染した細胞（第１図のＣ）中に存在するものに比べ
て、かなりの量のウイルスのmRNAを含有することを示し
ている。さらに完全に8E5クローン中のRNAの存在を評価
するために、ポリアデニル化されたRNAを単離し、LTRプ
ローブを用いて、上記のように、ノーザンブロットハイ
ブリダィゼーションにより評価した。第２図のＢは、活
発にウイルスを生産するA3.01細胞と同様に、誘導され
ていない8E5細胞も、かなりの量の9.1（ゲノム性／gag
−pol）,5.0,4.3（env），及び1.8−2.0kbのウイルスRN
Aを含有することを示している。このノーザン分析は、8
E5細胞において、5.5kb種のウイルスRNAの発現が減少す
るかもしれないことを示しており、S1ヌクレアーゼ保護
実験（データは示していない）は、5.5kbのウイルスRNA
のための推定されているスプライス受容体でプロセッシ
ングされたRNAが、容易に同定されたことを示してい
る。 8E5細胞中のプロウイルスDNAのコピーの数及び状態
は、EcoR Iで消化されたサザーンブロットハイブリダィ
ゼーションにより分析される。親のLAVプロウイルスは
1.1kbのウイルスDNA配列を定める二つの内部EcoR I制限
部位を含有するので、三つの反応性開裂生成物（第２図
のＡ）のみ存在することは、8E5系のクローン性（clona
lity）及びウイルスDNAのシングル組み換えコピーの存
在とは矛盾しない。 これらの結果は、明らかに8E5細胞中のLAVプロウイル
スの一つのコピーが本質的にウイルスRNAとして発現さ
れるが、IUdR処理に続くRT活性の失活の説明にはならな
いことを示す。これらの異常を確認するための第１の段
階として、8E5細胞中のウイルスタンパク質の存在を、
プールされたAIDS血清を用いたイムノブロティングによ
り分析した。ウイルス生産性A3.01細胞（第２図のＣ）
中の免疫反応性ポリペプチドと並行して比較することに
より、8E5細胞中のメジャーのウイルスがエンコード化
したグリコプロテインである。gp120、及びポリペプチ
ドp55、p41及びp25（他は見られない）の存在及び明瞭
な64kd及び比較的不明瞭な34kd（キロダルトン）ウイル
スポリペプチドの不存在が証明される。 8E5細胞が電子顕微鏡により試験されると、教えられ
ないほどのレトロウイルス様の構造がそれらの表面から
ブッディングしているのが見える（第３図）。これらの
粒子は、AIDS RVの特徴である縮合された棹型ヌクレオ
イドを欠いているため、A3.01細胞で生産される感染性
ビリオンとは容易に区別される。 未処理またはIUdRで処理された8E5細胞からの組織培
養液も、感染性ウイルス粒子の存在について試験され
る。１×108個の8E5の細胞から濃縮された上清液は、放
出されたウイルス粒子のいずれをも拡大することを目的
として、Folks et al,supraに記載されたように、２×1
06個のLeu−3+A3.01の細胞と共に培養される。繰り返し
実験することにより、感染性ブロゲニービリオンの合成
は、RTによりモニターされてわかるように、一定して陰
性である。それにもかかわらず、濃縮された8E5組織培
地の上清液に暴露されたA3.01の細胞は、最小のシンシ
チアの形成を示す。しかしながら、下記の8E5のA3.01R
からの上清液の連続（及びブラインド）継代に続いて、
シンシチアの発達を論証するとはできない。 IUdRにより誘導される細胞のin situハイブリダィゼー
ション クローン化された8E5サバイバー細胞の特性は、欠陥
のあるウイルス粒子の合成に関連するプロウイルスDNA
のシングルコピーの存在を示すので、いかに、いつこの
細胞が発生したかを決定する努力がなされている。従っ
て、in situハイブリダィゼーションが、LAVによる初期
感染後に生き残った、IUdRにより誘導された細胞を評価
するために使用された。第１図のＥに示すように、本質
的にAIDS RV mRNAを発現する細胞は、IUdRにより誘導さ
れた細胞の大量培養中で確認されることができた。これ
らの細胞は、8E5クローンの単離の前に少なくとも二つ
のIUdR/共培養サイクルで1/1000以上の頻度で存在し
た。IUdRの存在下で、サバイバー細胞中でのウイルスRN
Aの合成のレベルは、確認できるほどには変化しなかっ
た（第１図のＦ）。Folks et al,Science,231:600−602
（1986），（参考文献として、本明細書に挿入される）
には、AIDS RVの感染後に生き残ったウイルスを含まな
いLeu−3-リンパ球をIUdR処理することにより、RT分析
によりモニターされるように、感染性ウイルスを誘導す
ることが報告されている。IUdRにより誘導されたプロゲ
ニービリオンは、Folks et al,により記載されているよ
うに、Leu−3+リンパ球の向性によって、並びにヒトＴ
細胞及びそれらの感染の動力学において複製の間に起こ
るそれらの細胞毒性効果によっては、それらの親のLAV
とは区別不可能である。分析の前に、「野性型」プロウ
イルスを含むIUdR誘導性サバイバー細胞を8E5細胞中で
クローン化することが一般に予測されるが、分析によ
り、8E5細胞がAIDSウイルスDNAの欠陥コピーを実際に含
んでいることが明らかにされたことは実に驚くべきこと
であった。 AIDS RVプロウイルスDNAの存在及びp64及びp34を除く
全てのメジャーなウイルスタンパク質の合成が、細胞の
生存性には何の効果も有しないことも、記載しておくべ
きである。従って、ウイルスの複製の複雑な過程よりむ
しろ、ウイルスのエンコードされたタンパク質が、ウイ
ルスのCPE及び細胞死に関連するならば、そのようなタ
ンパク質は、当然ながら8E5細胞中では合成されず、そ
のようなタンパク質の特性は死に至るAIDSウイルスの感
染に関連する要因についての重要な手がかりを提供する
であろう。 本発明の有用な適用のいくつかの例を以下に記載す
る。 1.8E5細胞がRPMI−1640および10％ウシ胎児血清中
で、約１〜５×106細胞/mlに維持される。上清液および
全体の細胞の両方が、タンパク質配列決定のような生化
学的分析のためのウイルス性の粒子／タンパク質の抽出
／精製のために使用される。これは大規模な精製（10
を越える培養材料）により行われる。 2.抗体検出（血液スクリーニング）のためのELISA及び
イムノブロッティングキットに使用するために、8E5ウ
イルス粒子を含有する上清材料が集められ、そして精製
される。 3.8E5細胞からの細胞材料が集められ、イムノブロッテ
ィングキットにおける抗体の検出（血液スクリーニン
グ）のためのウイルス抗原として使用される。 4.8E5細胞が集められ、そして免疫蛍光診断キットまた
はフローサイトメトリック分析アッセイにおける抗体検
出のためのウイルス抗原源として使用される。 5.モノクローナル抗体が、HTLV−III/LAV抗原に対して
反応する8E5ウイルス抗原に対して製造される。8E5ウイ
ルス抗原は、マウスまたはラットに接種され、これらの
動物からのリンパ様細胞は腫瘍細胞と融合され、下記の
標準技術でハイブリドーマを産生する安定なモノクロナ
ール抗体を形成する。 6.ウイルスタンパク質を構成要素として生産するための
異なる哺乳類の種のリンパ様細胞と非リンパ様細胞との
形質転換に使用するために、8E5プロウイルスDNAが単離
され、そして分子的にクローン化される。 7.精製された8E5細胞または粒子がヒト以外の霊長類、
他の動物、及びヒトの接種のために、ワクチン開発のた
めに使用される。 8.8E5細胞が細胞媒介及び補体媒介細胞毒性アッセイ系
における標的細胞として使用される。 9.8E5粒子が、細胞媒介細胞毒性アッセイにおける使用
の目的で、HLA適合標的細胞を生物学的に変性するため
に使用される。 10.8E5細胞が、核酸のその場でのハイブリダイゼーショ
ンおよび免疫蛍光抗体アッセイのためのクローン化HTLV
−III/LAV抗原源の安全な標準として使用される。 ここに記載された例及び実施態様は、説明の目的のた
めだけのものであり、様々な軽い修飾または変化が、当
該技術分野の技術者に提案され、これも、本出願の精神
及び範囲、並びに添付されたクレームの範囲に含まれる
べきである。
るウイルスに関する。さらに詳細には、本発明は、エイ
ズ感染性のウイルス粒子を付随的に生産することなく、
安全に、大量のエイズウイルスタンパク質を生産するこ
とのできる細胞系に関する。 従来技術の供述 AIDSは、致命的なヒトの疾患であり、Ｔリンパ球ヒト
レトロウイルスにより引き起こされるというのが有力な
説である。〔バレ−シノウシ等（Barre−Sinoussi,et a
l.），サイエンス（Science）220:868,1983;ポポビック
等（Popovic,et al.），サイエンス224:497,1984;レヴ
ィー等（Levy,et al.），サイエンス225:840,1984〕。
ウイルスは、感染した個体の体液、例えば血清または血
液が、非感染のヒトに移ったときに広がるということが
信じられている。AIDSの症例の多数が、汚染された血液
の輸血により生じていることが報告されているため、ポ
テンシャル キャリアー（potential carriers）を検出
するために、供与者の血清を免疫学的に試験することが
行われている。現在のところ、二つのタイプのスクリー
ニング試験、即ち酵素結合イムノアドソルベントアッセ
イ（ELISA）及びイムノブロッティング（Immunoblottin
g）法が使用されている。両方の例において、純粋なウ
イルス粒子または感染した細胞リセート（lysates）か
ら単離されたタンパク質が、AIDSウイルスに対する血清
抗体を検出するために抗原として使用される。これらの
ウイルス抗原の製造には、大量（約50リットル／週）の
感染性ウイルス及び組織培養体の処理が含まれる。現在
では、これらの試薬を製造する作業者は、感染した材料
に持続して曝されることを避けられず、AIDSにかかると
いう潜在的な危険に陥っている。 発明の要約 従って、本発明の目的は、感染性ウイルス粒子を付随
的に生産することなく、エイズウイルス抗原を効率よく
製造することができる細胞系を提供することにある。 本発明の他の目的は、本発明の細胞系により製造され
たAIDSウイルス抗原を含む容器と、特定の抗原−抗体反
応の免疫学的試験のための試薬または手段とからなる、
ヒトの体液または組織の検体中のAIDS抗体を検出するた
めのキットを提供することにある。 本発明の他の目的及び利点は、本発明の方法の詳細な
説明により明らかになるであろう。 図面の簡単な説明 これらの及び他の目的、特徴、並びに本発明の多くの
付随的な利点は、下記の詳細な説明を添付された図面と
関連づけて考えながら読むと、より良く理解されるであ
ろう。 第１図は、AIDS RV RNAを合成するヒト系リンパ球系
のin situハイブリダィゼーションを示す。（Ａ）は、I
UdRで処理した後の、（Ｂ）はIUdRで処理する前の8E5細
胞の顕微鏡写真であり、（Ｃ）はAIDS RVで感染した３
日後のA3.01細胞の顕微鏡写真であり、（Ｄ）は未感染
のA3.01細胞の顕微鏡写真であり、（Ｅ）はIUdrと培養
する前の、（Ｆ）はIUdrと培養した後の、IUdrで誘導さ
れた細胞の顕微鏡写真を示す。倍率は400倍である。 第２図は、8E5細胞のAIDS RV DNA,RNA及びタンパク質
の特性を示す。（Ａ）8E5 DNA 5.0μｇをEcoR Iで消化
し、サザーンブロットハイブリダィゼーションにより、
pBenn6プローブを用いて分析する。（Ｂ）ポリアデニル
化RNAをウイルス感染させたA3.01（レーン１）または8E
5（レーン２）細胞から製造し、ウイルスLTRプローブを
用いたノーザン分析にかける。（Ｃ）感染したA3.01
（レーン１）または8E5（レーン２）細胞リセートのイ
ムノブロット；数は、キロダルトン（kd）で示した標準
マーカーの分子量を表し、矢印は記載された条件下で電
気泳動にかけたときのマーカーの位置を示す；そして、 第３図は、8E5（Ａ）またはウイルス感染したAE.01
（Ｂ）細胞から合成されたAIDS RV粒子の電子顕微鏡写
真を示す。倍率は、50,000倍である。 発明の詳細な説明 本発明の上記及び他の目的及び利点は、アメリカ合衆
国,20852,マラーランド（Maryland），ロックヴィル（R
ockville），パークローン ドライブ（Parklawn Driv
e）,12301のアメリカン タイプ カルチャー コレク
ション（American Type Culture collection）に、ATCC
No.CRL8993の受託番号で、1986年１月22日に寄託され
たものの特質を有する、8E5と命名されたユニークなヒ
トＴリンパ球細胞系により達成される。本発明による特
許の発行により、この寄託は30年間生存状態で維持し続
けられ、当然ながら法律に適合して、制限なく公共の利
用に供される。 従って、本発明は、感染性のウイルス粒子を生産する
ことなくAIDSウイルス抗原を製造することができる能力
を有することを特徴とし、そしてATCC−CRL 8993の特性
を有することを特徴とする細胞系に関し、並びにメルカ
プトエタノールの存在下で、３％−27％のポリアクリル
アミドゲル電気泳動におけるイムノブロット分析により
調べられた分子量が、160,120,90,55,46,43,41,24及び1
7キロダルトンであるが、64及び34ではない抗原性のウ
イルスタンパク質から作られ、特に、該抗原性ウイルス
タンパク質の少なくとも一種が特異的にAIDSウイルスの
抗体と結合することができる非感染性エイズウイルスに
関する。本発明はさらに、検体と上記抗原性ウイルスの
蛋白質とを反応させ、抗原−抗体反応を免疫学的に検出
することを特徴とする検体中のAIDSウイルス抗体の検出
方法、並びに上記抗原性ウイルスタンパク質を含有する
容器と、抗原−抗体反応の発現の免疫学的測定のための
試薬または手段とからなる、上記方法を実施するための
キットに関する。 本発明の実施または試験には、ここに記載したものと
似ているかまたは同じであるいずれの方法及び材料も使
用しうるが、好ましい方法及び材料を下記に示す。下記
に挙げた全ての出版物は、参考文献として、本明細書中
に挿入される。別に定めない限り、ここで使用した全て
の技術または科学的用語は、本発明の属する技術分野の
通常の技術者により一般的に理解されるのと同じ意味を
有する。 ユニークなヒトレトロウイルス（RV）は、後天性免疫
不全症候群（AIDS）の患者から必ず単離されており、AI
DSの病原体であると信じられている。ヒトＴリンパ球ま
たはＴリンパ球系にAIDS RVを感染させることにより、
急速な細胞の死から、機能的に不活性なプロウイルスDN
Aの組み込みに至るまで、様々な結果が生じる。典型的
なAIDS RV感染は、多核細胞の出現、逆転写（RT）活性
の突発、及び５ないし20日にわたる著しい細胞変性を特
徴とする。近年の報告には、AIDS RVのヒトリンパ球に
対する非細胞毒性効果が記載されている。この報告によ
ると、フィトヘマグルチニンにより刺激されたヘルパー
インデューサーヒトＴリンパ球のインターロイキン−２
依存性の培養液は、急性のウイルス感染の特徴的な細胞
毒性効果を示したが、それにもかかわらず、充分な数の
細胞が生き残って、それらが培地に維持されていた４箇
月の間感染性ウイルスを生産し続けた。〔ホキシー等
（Hoxie et al.），サイエンス（Science）229:1400（1
985）〕。 本明細書に記載されたように、Leu−3+T細胞から誘導
された、AIDS RVに感染しても生き残ったLeu−3-非ウイ
ルス生産性細胞は、p64及びp35以外の主なウイルスタン
パク質の全てを本質的に生産するが、感染性ウイルスは
生産しないことが発見された。この発見の詳細を下記に
示す。 細胞クローンが、AIDS RVプロウイルスのシングルコ
ピーを含むサバイバー細胞の大量培養液から単離され
た。組み込まれた該プロウイルスのDNAは、本質的には
発現するが、検出可能な逆転写酵素の合成を行うことが
できない欠陥ウイルス粒子を生産する。細胞クローンの
製造及び幾つかの試験等の実施に使用された方法及び材
料を下記に示す。 材料及び方法 ウイルス感染、IUdR誘導、及び細胞クローニング： Folks et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,82:4539（19
85）に記載されているCEM T細胞系（A3.01）の変種で始
めて、約２×106個のA3.01細胞を、AIDS RV株のLAV菌株
の１×10-3の希釈液で、フォークス（Folks）等,supra
の方法に従って感染させた。続いて、37℃１時間の吸着
を行った後、細胞を洗浄し、10％のウシ胎児血清を補っ
たRPMI−1640培地中に維持（１×106細胞/ml）した。感
染しても生き残ったLeu−3-培養液のRT活性が検出不可
能になったら（RTのピーク後、７ないし10日）、当該技
術分野で良く知られていた標準技術に従って、細胞（１
×106細胞/ml）をIUdR（100μg/ml）に24時間暴露し、
その後Leu−3+A3.01細胞で共培養を行った。ウイルスの
誘導は共培養した細胞中のRT活性の第２の波により示さ
れる。RTがもはや検出されなくなったとき、サバイバー
細胞をIUdR誘導／共培養の第２のサイクルに課した。RT
陰性の、これらの処理を経て生き残ったLeu−3-細胞
は、標準的な限界希釈技術により、96ウェル微小滴定プ
レート中でクローン化された。111個のシングル細胞ク
ローンが得られ、10のグループにプールされ、総計１×
106個の細胞に広がり、IUdRに24時間暴露され、Leu−3+
A3.01細胞と共培養した。その後、AIDS RVの発現を、シ
ンシチア（syncytia）の形成をモニターすることにより
毎日試験した。これにより、シングルクローン（8E5）
が得られた。 核酸ハイプリダィゼーション:AIDS RVに感染した細胞
または8E5細胞からDNA及びRNAを製造し、クローン化LTR
（末端繰り返し配列）を使用して、サザーンまたはノー
ザンブロットハイブリダィゼーションにより、ウイルス
関連配列の存在または代表的なgag−pol−envプローブ
の存在を、Folks et al .,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,8
2:4539（1985）;Rabson et al.,Science,230:949（198
5）;Benn et al.,Science,230:949（1985）に記載され
たように分析した。in situハイブリダィゼーションの
ためには、培養された細胞をポリリジンでコーティング
されたスライドガラス上に沈降させ、過ヨウ素酸−リジ
ン−パラホルムアルデヒド−グルタールアルデヒド（PL
PG）中で固定し、そしてHCl及びプロティナーゼＫで前
処理し、そして、標識されたプロープを、Gendelman et
al.,J.Immun.Meth.,65:137（1983）;Gendelman et a
l.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:7086に従って、細胞に
入れる。細胞を10mMのトリスpH7.4,2×標準クエン酸塩
（SSC）（１×SSCは0.15MのNaCl,0.015Mのクエン酸ナト
リウム、pH7.4）、50％ポルムアミド、１×デンハルツ
（Denhardt's）溶液C0.02％ポリビニルピロリドン,0.02
％フィコール、0.02％ウシ血清アルブミン）及び200μg
/ml酵母tRNA中で、45℃の温度で２時間プレハイブリダ
ィゼーションし、反応混合物10μ中のデキストランス
ルフェート10％、５μＭジチオトリエトール及び反応混
合物10ml中、106カウント／分の35S−標識AIDS RV RNA
中でハイブリダィゼーションした。サブゲノムウイルス
DNA断片が、pBl（Benn et al,supra）,pBenn6（Folks e
t al.,supra）,pBll（Benn et al,supra）及び組み換え
プラスミド（pRG−Ｂ）中に存在し、それらは、プロウ
イルスDNA上の8.25と9.6kbとの間の1.25kbのHind III断
片マッピングを含み、これらは、SP6/T7ベクター（Prom
ega Biotec,Madison,WI）、及び35S−UTP（Amersham Co
rp.,Arington Hgts.,IL）により転写された、プールさ
れたDNAにザブクローン化された。標識RNAは、それらの
細胞への侵入を促進するハイブリダィゼーションよりも
前に40μＭのNaHCO3、60MのNa2CO3、pH10.2で培養し
た。 in situハイブリダィゼーションは、45℃で８時間実
施される。その後、検体は、22℃の２×SSCで10分間×
２チェンジ;2×SSC,0.1％トリトン（TRITON）Ｘ−100 6
0℃で30分間;RNaseA（40μg/ml）及びRNaseT1（10U/m
l）を伴った２×SSCで30分間；そして、２×SSC 60℃で
10分間、に洗い入れられた。RNaseを含むものを除く全
ての溶液は、５μＭのDDT及び１μＭのEDTAを含有させ
た。当該技術分野でよく知られた標準方法に従って、オ
ートラジオグラフィーを１〜２日間行った。 in situハイブリダィゼーションの特性を調整するた
めに、センスオリエンテーション（ウイルスmRNAと同じ
極性）で合成したプローブをデュープリケート細胞製剤
でインキュベートした。さらに、未感染の細胞をアンチ
センスプローブ（例えばウイルスmRNAに相補的なもの）
とハイブリダイゼーションさせた。感染した細胞製剤も
また、プローブの添加の前にRNaseで処理される。 イムノブロッティング:AIDS RVに感染したA3.01または8
E5（１×108）細胞から製造した全ての細胞リセート
を、２％のSDS及び２−メルカプトエタノール中で煮沸
し、３〜27％の勾配ポリアクリルアミドゲルを通して、
約100ボルトで、約18時間、Laemmli,Nature227:680（19
70）の方法により、電気泳動（Integration Separation
Sciences）にかけ、その後、ニトロセルロースメンブ
ラン（Towbin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76:4350
（1979））に移した。その後、その場で、10μＭのNaCl
（TN）中、フィルターを５％のノンファットドライミル
クで30分間処理し、さら0.3％のトゥイーン（Tween）−
20,0.5％のNP40（TN−TN）及び１％のBSAを含有するTN
緩衝液中ですすいだ。３％のBSAを含有するTN−TN中で
希釈された、プールされたAIDS患者の血清（1:1000）
を、ニトロセルロースフィルターとともに、室温で一晩
培養した。その後、メンブランをTN−TN緩衝液中で３回
洗浄し、125I−プロティンＡ（200,000dpm/ml）で２時
間培養し、風乾し、その後、当該技術分野でよく知られ
た技術に従って、Ｘ線フィルムに暴露した。 電子顕微鏡:AIDSレトロウイルスを感染させたA3.01細
胞、または8E5細胞を、標準ビームカプセル中で、650Xg
の遠心分離にかけた。その後、ペレットを、血清を含ま
ないRPMI1650媒体中で穏やかに洗浄し、その後、その場
で0.1Mのナトリウム カコジレート緩衝液,pH7.2の存在
下で、2.5％のグルタールアルデヒド中で、１〜２時間
固定した。４％のショ糖を含有する0.1Mのナトリウム
カコジレート緩衝液中、５分間で３回の洗浄に続いて、
ペレットを１％の四酸化オスミウムで１〜２時間処理し
た。その後、これらを0.1Mのナトリウム カコジレート
緩衝液中で３回洗浄し、そして30ないし100％のエタノ
ール中で脱水し、続いてプロピレンオキサイドを用い
て、最終的な脱水を行った。その後、検体をエポン−ア
ラルダイト（epon−Araldite）LX−112（Ladd Research
Industries,Burlington,VT,USA）中に埋封し、薄い切
片を製造した。続いて、酢酸鉛及びウラニルアセテート
で染色した後、JOEL 100B電子顕微鏡で、約80KVで調べ
た。 ここに記載された方法により、シンシチアを製造し、
IUdRに暴露した後、共培養したLeu−3+A3.01細胞で製造
したシングルクローン（8E5）を単離した。8E5細胞を膨
張させ、さらに詳細に特徴づけた時、予期されなかった
結果が得られた。IUdRで繰り返し処理したにもかかわら
ず、30日より長く維持された8E5及びLeu−3+A3.01細胞
の共培養液中にはRT活性は検出されなかった。これは、
8E5細胞のIUdR処理に続く24時間に現れるシンシチアが
容易に示されるということからみて驚くべきことであ
る。 8E5細胞中ウイルスRNA、DNA及びタンパク質の検出 誘導された8E5細胞内において、どのAIDSRV遺伝子生
成物が、もしあるとすれば、発現されているかというこ
とは不明確であるため、IUdR効果をモニターするために
は、in situハイブリダィゼーションが使用される。第
１図のＡに示すように、IUdRで処理された8E5細胞の実
質的に全てが、ウイルスRNAを合成した。興味深いの
は、IUdRの不在下で成長した8E5細胞もまた、高レベル
のAIDS RV RNAを発現するという事実である（第１図の
Ｂ）。第１図に示したin situハイブリダィゼーション
の結果もまた、クローン化した8E5細胞が、ウイルスに
感染した細胞（第１図のＣ）中に存在するものに比べ
て、かなりの量のウイルスのmRNAを含有することを示し
ている。さらに完全に8E5クローン中のRNAの存在を評価
するために、ポリアデニル化されたRNAを単離し、LTRプ
ローブを用いて、上記のように、ノーザンブロットハイ
ブリダィゼーションにより評価した。第２図のＢは、活
発にウイルスを生産するA3.01細胞と同様に、誘導され
ていない8E5細胞も、かなりの量の9.1（ゲノム性／gag
−pol）,5.0,4.3（env），及び1.8−2.0kbのウイルスRN
Aを含有することを示している。このノーザン分析は、8
E5細胞において、5.5kb種のウイルスRNAの発現が減少す
るかもしれないことを示しており、S1ヌクレアーゼ保護
実験（データは示していない）は、5.5kbのウイルスRNA
のための推定されているスプライス受容体でプロセッシ
ングされたRNAが、容易に同定されたことを示してい
る。 8E5細胞中のプロウイルスDNAのコピーの数及び状態
は、EcoR Iで消化されたサザーンブロットハイブリダィ
ゼーションにより分析される。親のLAVプロウイルスは
1.1kbのウイルスDNA配列を定める二つの内部EcoR I制限
部位を含有するので、三つの反応性開裂生成物（第２図
のＡ）のみ存在することは、8E5系のクローン性（clona
lity）及びウイルスDNAのシングル組み換えコピーの存
在とは矛盾しない。 これらの結果は、明らかに8E5細胞中のLAVプロウイル
スの一つのコピーが本質的にウイルスRNAとして発現さ
れるが、IUdR処理に続くRT活性の失活の説明にはならな
いことを示す。これらの異常を確認するための第１の段
階として、8E5細胞中のウイルスタンパク質の存在を、
プールされたAIDS血清を用いたイムノブロティングによ
り分析した。ウイルス生産性A3.01細胞（第２図のＣ）
中の免疫反応性ポリペプチドと並行して比較することに
より、8E5細胞中のメジャーのウイルスがエンコード化
したグリコプロテインである。gp120、及びポリペプチ
ドp55、p41及びp25（他は見られない）の存在及び明瞭
な64kd及び比較的不明瞭な34kd（キロダルトン）ウイル
スポリペプチドの不存在が証明される。 8E5細胞が電子顕微鏡により試験されると、教えられ
ないほどのレトロウイルス様の構造がそれらの表面から
ブッディングしているのが見える（第３図）。これらの
粒子は、AIDS RVの特徴である縮合された棹型ヌクレオ
イドを欠いているため、A3.01細胞で生産される感染性
ビリオンとは容易に区別される。 未処理またはIUdRで処理された8E5細胞からの組織培
養液も、感染性ウイルス粒子の存在について試験され
る。１×108個の8E5の細胞から濃縮された上清液は、放
出されたウイルス粒子のいずれをも拡大することを目的
として、Folks et al,supraに記載されたように、２×1
06個のLeu−3+A3.01の細胞と共に培養される。繰り返し
実験することにより、感染性ブロゲニービリオンの合成
は、RTによりモニターされてわかるように、一定して陰
性である。それにもかかわらず、濃縮された8E5組織培
地の上清液に暴露されたA3.01の細胞は、最小のシンシ
チアの形成を示す。しかしながら、下記の8E5のA3.01R
からの上清液の連続（及びブラインド）継代に続いて、
シンシチアの発達を論証するとはできない。 IUdRにより誘導される細胞のin situハイブリダィゼー
ション クローン化された8E5サバイバー細胞の特性は、欠陥
のあるウイルス粒子の合成に関連するプロウイルスDNA
のシングルコピーの存在を示すので、いかに、いつこの
細胞が発生したかを決定する努力がなされている。従っ
て、in situハイブリダィゼーションが、LAVによる初期
感染後に生き残った、IUdRにより誘導された細胞を評価
するために使用された。第１図のＥに示すように、本質
的にAIDS RV mRNAを発現する細胞は、IUdRにより誘導さ
れた細胞の大量培養中で確認されることができた。これ
らの細胞は、8E5クローンの単離の前に少なくとも二つ
のIUdR/共培養サイクルで1/1000以上の頻度で存在し
た。IUdRの存在下で、サバイバー細胞中でのウイルスRN
Aの合成のレベルは、確認できるほどには変化しなかっ
た（第１図のＦ）。Folks et al,Science,231:600−602
（1986），（参考文献として、本明細書に挿入される）
には、AIDS RVの感染後に生き残ったウイルスを含まな
いLeu−3-リンパ球をIUdR処理することにより、RT分析
によりモニターされるように、感染性ウイルスを誘導す
ることが報告されている。IUdRにより誘導されたプロゲ
ニービリオンは、Folks et al,により記載されているよ
うに、Leu−3+リンパ球の向性によって、並びにヒトＴ
細胞及びそれらの感染の動力学において複製の間に起こ
るそれらの細胞毒性効果によっては、それらの親のLAV
とは区別不可能である。分析の前に、「野性型」プロウ
イルスを含むIUdR誘導性サバイバー細胞を8E5細胞中で
クローン化することが一般に予測されるが、分析によ
り、8E5細胞がAIDSウイルスDNAの欠陥コピーを実際に含
んでいることが明らかにされたことは実に驚くべきこと
であった。 AIDS RVプロウイルスDNAの存在及びp64及びp34を除く
全てのメジャーなウイルスタンパク質の合成が、細胞の
生存性には何の効果も有しないことも、記載しておくべ
きである。従って、ウイルスの複製の複雑な過程よりむ
しろ、ウイルスのエンコードされたタンパク質が、ウイ
ルスのCPE及び細胞死に関連するならば、そのようなタ
ンパク質は、当然ながら8E5細胞中では合成されず、そ
のようなタンパク質の特性は死に至るAIDSウイルスの感
染に関連する要因についての重要な手がかりを提供する
であろう。 本発明の有用な適用のいくつかの例を以下に記載す
る。 1.8E5細胞がRPMI−1640および10％ウシ胎児血清中
で、約１〜５×106細胞/mlに維持される。上清液および
全体の細胞の両方が、タンパク質配列決定のような生化
学的分析のためのウイルス性の粒子／タンパク質の抽出
／精製のために使用される。これは大規模な精製（10
を越える培養材料）により行われる。 2.抗体検出（血液スクリーニング）のためのELISA及び
イムノブロッティングキットに使用するために、8E5ウ
イルス粒子を含有する上清材料が集められ、そして精製
される。 3.8E5細胞からの細胞材料が集められ、イムノブロッテ
ィングキットにおける抗体の検出（血液スクリーニン
グ）のためのウイルス抗原として使用される。 4.8E5細胞が集められ、そして免疫蛍光診断キットまた
はフローサイトメトリック分析アッセイにおける抗体検
出のためのウイルス抗原源として使用される。 5.モノクローナル抗体が、HTLV−III/LAV抗原に対して
反応する8E5ウイルス抗原に対して製造される。8E5ウイ
ルス抗原は、マウスまたはラットに接種され、これらの
動物からのリンパ様細胞は腫瘍細胞と融合され、下記の
標準技術でハイブリドーマを産生する安定なモノクロナ
ール抗体を形成する。 6.ウイルスタンパク質を構成要素として生産するための
異なる哺乳類の種のリンパ様細胞と非リンパ様細胞との
形質転換に使用するために、8E5プロウイルスDNAが単離
され、そして分子的にクローン化される。 7.精製された8E5細胞または粒子がヒト以外の霊長類、
他の動物、及びヒトの接種のために、ワクチン開発のた
めに使用される。 8.8E5細胞が細胞媒介及び補体媒介細胞毒性アッセイ系
における標的細胞として使用される。 9.8E5粒子が、細胞媒介細胞毒性アッセイにおける使用
の目的で、HLA適合標的細胞を生物学的に変性するため
に使用される。 10.8E5細胞が、核酸のその場でのハイブリダイゼーショ
ンおよび免疫蛍光抗体アッセイのためのクローン化HTLV
−III/LAV抗原源の安全な標準として使用される。 ここに記載された例及び実施態様は、説明の目的のた
めだけのものであり、様々な軽い修飾または変化が、当
該技術分野の技術者に提案され、これも、本出願の精神
及び範囲、並びに添付されたクレームの範囲に含まれる
べきである。
フロントページの続き
(72)発明者 マーチン，マルコルム アラン
アメリカ合衆国，マリーランド 20817,
ベセスダ，クレーンテラス 6408
(72)発明者 パウエル，ダグラス マクミラン
アメリカ合衆国，マリーランド 20901,
シルバー スプリング イースト ハミ
ルトン アヴェニュー ６
(56)参考文献 特開 昭57−39784（ＪＰ，Ａ)
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1985）Ｐ．９−16
Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．227（Ｆｅ
ｂ．1985）Ｐ．484−492
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．感染性のAIDSウイルス粒子を産生することなく、分
子量が３〜27％のポリアクリルアミドゲル電気泳動中、
メルカプトエタノールの存在下でイムノ−ブロット分析
により測定して、160、120、90、55、46、43、41、24お
よび17kdの抗原性ウイルスタンパク質は存在し、64kdお
よび34kdの抗原性ウイルスタンパク質は存在しないAIDS
ウイルス抗原を含有する非感染性AIDSウイルス粒子を産
生するヒトＴリンパ球細胞系。 ２．ヒトＴリンパ球細胞系8E5（ATCC CRL 8993）である
請求項１記載のヒトＴリンパ球細胞系。 ３．ヒトＴリンパ球細胞系8E5（ATCC CRL 8993）が産生
することができる、分子量が３〜27％のポリアクリルア
ミドゲル電気泳動中、メルカプトエタノールの存在下で
イムノ−ブロット分析により測定して、160、120、90、
55、46、43、41、24および17kdの抗原性ウイルスタンパ
ク質は存在し、64kdおよび34kdの抗原性ウイルスタンパ
ク質は存在しないAIDSウイルス抗原を含有する非感染性
AIDSウイルス粒子。 ４．ヒトＴリンパ球細胞系8E5（ATCC CRL 8993）が産生
することができる非感染性AIDSウイルス粒子が含有す
る、分子量が３〜27％のポリアクリルアミドゲル電気泳
動中、メルカプトエタノールの存在下でイムノ−ブロッ
ト分析により測定して、160、120、90、55、46、43、4
1、24および17kdの抗原性ウイルスタンパク質は存在
し、64kdおよび34kdの抗原性ウイルスタンパク質は存在
しないAIDSウイルス抗原。 ５．検体中のAIDS抗体の存在を検出するためのキットを
製造するために、ヒトＴリンパ球細胞系8E5（ATCC CRL
8993）が産生することができる非感染性AIDSウイルス粒
子が含有する、分子量が３〜27％のポリアクリルアミド
ゲル電気泳動中、メルカプトエタノールの存在下でイム
ノ−ブロット分析により測定して、160、120、90、55、
46、43、41、24および17kdの抗原性ウイルスタンパク質
は存在し、64kdおよび34kdの抗原性ウイルスタンパク質
は存在しないAIDSウイルス抗原を使用する方法であっ
て、該方法は、 ａ）前記ヒトＴリンパ球細胞系8E5（ATCC CRL 8993）の
培養物を維持し、 ｂ）非感染性のAIDSウイルス粒子が含有する前記AIDSウ
イルス抗原を製造し、 ｃ）前記培養物中の前記ウイルス抗原を精製し、そして ｄ）非感染性であり、かつ、AIDSウイルス抗体と特異的
に結合し得るAIDSウイルス抗原と、抗原−抗体反応の発
現の免疫学的測定のための試薬または手段とからなるキ
ット中に前記抗原を収納することからなる前記AIDSウイ
ルス抗原を使用する方法。
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