JP2852431B2 - レトロウイルスのプロテアーゼ、逆転写酵素及びエンドヌクレアーゼ、並びにこれ等の酵素の製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明の要旨及び産業上利用の分野 本発明は、レトロウイルスの遺伝子がコードするプロ
テアーゼ、逆転写酵素、及びエンドヌクレアーゼ（別
名：インテグラーゼ）の各酵素とこれ等の製法に関する
ものである。更に詳しくは、レトロウイルスの上記３種
類の酵素遺伝子群から、プロテアーゼ遺伝子が必須とし
て選択される少なくとも１種の遺伝子、即ち、下記の４
通りの組合わせ：プロテアーゼ遺伝子；プロテアーゼと
逆転写酵素の両遺伝子；プロテアーゼとエンドヌクレア
ーゼの両遺伝子；プロテアーゼ、逆転写酵素及びエンド
ヌクレアーゼの３遺伝子；を夫々、組換え遺伝子技術を
用いて発現させると共に、その発現産物中のプロテアー
ゼにより該発現酸物それ自身をプロセッシングさせ、上
記各酵素を夫々、個別かつ単独の状態で成熟タンパク質
ないしは活性タンパク質として産生させる方法及びこれ
より得られる各酵素に関するものである。また、遺伝子
工学やレトロウイルス研究用材料、レトロウイルス感染
症に係る薬物療法剤開発の材料、診断用抗原、診断用抗
体の作製及びワクチン用の抗原等として有用なプロテア
ーゼ、逆転写酵素及びエンドヌクレアーゼの各酵素を提
供するものである。

従来技術とその問題点 ［レトロウイルスの定義］：レトロウイルスはウイルス
分類学上、レトロウイルス科に属するウイルスの総称で
あり、その共通な主な特徴は、エンベロープ、単鎖RNA
ゲノム、及び逆転写酵素を有することである。このウイ
ルスは、直径80−100nmの球形で、その粒子内部に分子
量約３×10⁶の線状の（＋）鎖RNAゲノム２分子または３
分子を有する。また、レトロウイルス科は更に、次の三
つの亜科、オンコウイルス亜科、レンチウイルス亜科、
スプーマウイルス亜科に分類されている（R.E.F.Matthe
ws編「Cla−ssification and Nomenclature of Viruses
−Fourth Report of the International Commit−tee o
n Taxonomy of Viruses」、124−128ページ、S.Karger
AG］スイス［1982年発行）。オンコウイルス亜科に属す
るウイルスは、RNA腫瘍ウイルスとも呼ばれ、例えば、
ヒトＴ細胞白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネズ
ミ肉腫ウイルス、モロニーマウス白血球ウイルス、ウシ
白血病ウイルス、ブタ白血病ウイルス、トリ白血病ウイ
ルス、トリ肉腫ウイルス、トリ骨髄芽球症ウイルス、ラ
ウス関連ウイルス等が公知である。また、レンチウイル
ス亜科に属するウイルスは、スローウイルス感染症を生
じるウイルスとして知られており、例えば、エイズ病原
体であるヒト免疫不全ウイルス１及び２型（以下夫々
「HIV−１」及び「HIV−２」と略称する）、サル免疫不
全ウイルス、ヒツジ脳炎を生じるビスナウイルス、ヒツ
ジ肺繊維症を起こすマエディウイルス、ヤギ関節炎脳炎
ウイルス、ウマ伝染性貧血ウイルス、ウシリンパ節病変
ウイルス等が公知である（“Cur−rent Topics in ADI
S"、第１巻,95−117ページ、John Wiley ＆Sons 1987年
発行;Advances in Virus Resear−ch,第34巻,189−215
ページ、1988年）。スプーマウイルス亜科に属するウイ
ルスは、ウォーミイウイルスとも呼ばれ、ヒト、サル、
ウシ、ネコ等の哺乳類へ感染し、これ等の宿主から夫
々、分離されたフォーミイウイルス、シンシアチルウイ
ルス等が公知である。尚、本願発明に係るレトロウイル
スは、上記レトロウイルス科に属する既知及び未知の全
てのウイルスを意味するものである。

［レトロウイルス遺伝子に関する基礎研究の現状］：レ
トロウイルスは、ヒト及び各種動物の悪性又は致命的感
染症及び人畜共通伝染病の観点から重大なウイルスであ
るだけでなく、腫瘍の解明や遺伝子工学等の研究用材料
としても有用なウイルスである。従って、該ウイルスに
関し既に、種々の膨大な報告が為されているので、ここ
では便宜的に、代表的なレトロウイルスに関する現状を
以下に説明する：衆知の通り、レトロウイルスは1980年
以前には発癌機構の解明の材料として、また難病を引起
こす奇妙なスローウイルス感染症の究明の観点から注目
され研究されていた。そして、1981年米国でエイズが発
見されて以来、その治療と予防を世界レベルで確立する
ための研究材料又は実験モデルとして、各種レトロウイ
ルス間の比較研究が免学、免疫学、ウイルス学、分子生
物学等を駆使して集中的に進められ、現在既に、該ウイ
ルスに関する有用な報告が多数集積されている（Advanc
es in Virus Research,同前;Annual Review of Immunol
ogy,第６巻,139−159,1988年;Microbial Pathogenesis,
第５巻,149−157,1988年）。これ等のうち、レンチウイ
ルスに属するHIV−１の遺伝子に関連の概要について以
下に述べる（“HIV and Other Highly Pa−thogenic Vi
ruses"33−41ページ、Academic Press,Inc.1988年発
行；“The Control of H−uman Retrovirus Gene Expre
ssion",79−89ページ,Cold Spring Harbor Laboratory
1988年発行；細胞工学，第７巻（Suppl.1）,S5−S15ペ
ージ,1988年）：ウイルスゲノムは逆転写酵素及びウイ
ルス粒子内部（コア）の構造タンパク質と複合体を形成
し、プライマーtRNAと共にウイルス粒子に内在する；ウ
イルスゲノムは、約９種類の遺伝子で構成されており、
基本的には、ウイルス増殖に必須のウイルス粒子成分を
コードする３つの主要な遺伝子、即ち、コアの構造タン
パク質の前記物質をコードするgag（group−specific a
ntigens）遺伝子、３種類の酵素の全躯体をコードするp
ol（polymerase）遺伝子、及びエンベロープの糖タンパ
ク質の前駆体をコードするenv（envelope）遺伝子から
なる；斯かる遺伝子は、５′末端から順に、gag、pol、
env、３′末端へと配列している；詳しくは、gag・pol
・vif…envの順に隣接または重複して配列しており、該
pol遺伝子の５′末端領域の一部は、コドン解読枠（rea
ding frame）を異にした状態でgag遺伝子３′末端領域
の約240塩基と重複し、この重複部で翻訳時にフレーム
シフト（frame shift）が起こり終止コドンを読み換え
て翻訳が進むと考えられている；斯かる重複部を含む全
長約3kbのpol遺伝子全領域の発現により上述の酵素前躯
体が、例えば、NH₂−プロテアーゼ逆転写酵素−インテ
グラーゼ−COOHの様に表記可能な融合タンパク質の状態
で産生された後、斯かる融合タンパク質は、該ウイルス
由来の既存のプロテアーゼ又は融合蛋白質自身が有する
プロテアーゼ活性の作用を受けて開裂し、いわゆる、プ
ロセッシングの結果、個々の成熟タンパク質（活性タン
パク質）、即ち、プロテアーゼ、逆転写酵素（p66とp5
1）及びインテグラーゼ（p32）の各酵素になると考えら
れている。

また、上述の３種類の酵素はいずれも、ウイルスの増
殖と成熟過程又はプロウイルス形成過程に於いて重要な
役割を夫々分担し、これ等の各機能について、下記が確
認又は推定されている：プロテアーゼは、翻訳後のプロ
セッシング、及びウイルス粒子のコア形成ないしは成形
過程に関与すると共に、プロテアーゼ作用はそれ自身が
由来するウイルスに対し特異性が高い；逆転写酵素は、
ウイルス増殖の基本段階であるウイルスゲノムRNAからD
NAへの逆転写過程を触媒するRNA依存性DNAポリメラーゼ
として機能すると共に、これ以外にも、DNAと相補的に
結合したRNAだけを特異的に分解するリボヌクレアーゼ
Ｈ活性、及び２本鎖DNAを生成するDNA依存性DNAポリメ
ラーゼ活性を有することが知られている。；インテグラ
ーゼは、DAN鎖に作用するエンドヌクレアーゼであり、
ウイルスゲノムRNAから上述の逆転写過程を経て生成さ
れた環状ウイルス二本鎖DNAの宿主染色体DNAへの組込み
部位の認識と切断を触媒し、プロウイルスになる過程に
関与すると考えられている。

［レトロウイルス遺伝子の応用研究の現状と課題］：レ
トロウイルス遺伝子の応用研究に関しては、主にエイズ
の診断剤やワクチンの開発を目的したenv遺伝子の発現
が、精力的に進められている（“Vaccine",558−567ペ
ージ,W.B.Saunders Company 1988年発行；サイエンス、
第18巻［第12号］、110−119ページ、1988年）。また、
レトロウイルスのgagとpol各遺伝子の利用分野の開発研
究に関しては、例えば、治療薬として特異性の高い抗レ
トロウイルス剤の開発やレトロウイルスの基礎研究に、
斯かる遺伝子産物のプロテアーゼが試薬として悠揚とい
う提言（細胞工学、第７巻（suppl.1）、S67−S77ペー
ジ、1988年）；オンコウイルスに属するブタ白血病ウイ
ルスが感染のブタ脾臓から樹立した細胞株による逆転写
酵素の生産法（特開昭59−118081）；オンコウイルスに
属するトリ肉腫ウイルスの逆転写酵素遺伝子を挿入連係
した発現ベクターを大腸菌に移入し、得られた形質転換
体を用いる逆転写酵素の生産法（米国特許第4,663,290
号）；オンコウイルスに属するモロニーマウス白血病ウ
イルスのpol遺伝子から逆転写酵素遺伝子領域のDNA断片
を調製の後、該DNA断片を挿入連係して発現ベクターを
構築し、次いで、これを大腸菌に移入して作出された形
質転換体の培養物から採取精製される逆転写酵素の製法
（OW86/06741）等が公知である。更にまた、逆転写酵素
の有無を指標とする非Ａ非Ｂ型肝炎診断用のモノクロー
ナル抗体の作製に抗原として用いる逆転写酵素はトリ肉
腫ウイルスに由来ものであり（特開昭61−104799）；衆
知の通り、相補DNAの合成用等として現在市販されてい
る逆転写酵素は主にトリ骨髄芽球症ウイルスに由来し、
その他モロニーマウス白血病ウイルスやラウス関連ウイ
ルス（RAV−２）から精製されたものである等、主にオ
ンコウイルス粒子そのものから採取精製されている。以
上から明らかな通り、従来技術は、HIVのenv遺伝子の発
現、及びオンコウイルスの構成成分、癌化作用、逆転写
酵素遺伝子等の利用に関するもが主流を占めている。そ
して現実問題として、例えば、遺伝子工学で常用されて
いる逆転写酵素は各種制限酵素に比べ希少かつ高価であ
るため、これ等の従来技術には、製造工程下でのバイオ
ハザード対策、生産コスト、生産収率、酵素活性と基質
特異性、純度、均質性、安定性等に関する難点があるも
のと思惟される。従って、低廉な高品質製品の安全な量
産体制の確立が期待される。更に、現時点では、レトロ
ウイルスの各種酵素の有用性や産業上利用に関し、重要
であるにも拘らず、あまり着目かつ指向されていない傾
向にある。それゆえ、斯かる現状下では、レトロウイル
スの酵素遺伝子産物、即ち、該ウイルスに特異的なプロ
テアーゼ、逆転写酵素及びインテグラーゼの量産による
低廉な提供が、この感染症のウイルス学的基礎研究、薬
物療法剤、診断剤及び予防剤等の開発に長足の進歩を促
すことは必常であり、その達成には貴重かつ重大な意義
があると思惟される。

問題を解決するための手段 本発明者等は、前述の従来技術の課題を克服するた
め、鋭意研究を重ねた結果、レトロウイルスの酵素遺伝
子産物、即ち、プロテアーゼ、逆転写酵素及びインテク
ラーゼの各酵素を、バイオハザードの観点から完全で、
しかも安定した高い生産収率により低コストで量産する
方法を達成した。斯かる達成は、遺伝子組換え技術を駆
使し、レトロウイルスのプロテアーゼ遺伝子を必須とし
て含むよう調製した該ウイルスの酵素遺伝子cDNA断片を
誘導可能な多量発現遺伝子と翻訳枠を一致させて連結
し、斯かる酵素遺伝子産物の発現を高め、かつ、発現さ
れたプロテアーゼによる遺伝子産物それ自身のプロセッ
シングに成功したことによる。また、本発明者等は、上
記遺伝子cDNAを挿入連係し構築した発現ベクターを移入
して形質転換体を作出すると共に、該形質転換体の培養
に後述の２段階培養法を適用することにより、その培養
物中に、該cDNAがコードする前述の各酵素が、融合タン
パク質としてではなく、特異的活性を有する個々の成熟
タンパク質として夫々、極めて大量かつ安定に生産され
ることをも見出した。更に、斯かるプロセッシングが、
上記遺伝子の発現産物である融合タンパク質の一部を占
めるプロテアーゼの特異的な活性作用によることを見出
した。即ち、プロセッシングが、レトロウイルスのプロ
テアーゼに特有の現象であることを見出した。更に、上
記各酵素は、多量生産とその精製法の改良により、純度
及び均質性が優れて高く、特に、レンチウイルスに固有
の基質特異性の極めて高い酵素活性を併せて有すること
を見出した。本発明は、これ等の知見に基づき完成され
たものである。

本発明によれば、レトロウイルスのプロテアーゼ、逆
転写酵素、及びインテグラーゼ各酵素の製法；ウイルス
構成成分の分解や開裂、相補DNAの合成、環状DNAの宿主
細胞への組込みによるプロウイルスの作製や宿主の形質
転換等に有用な遺伝子工学用材料としての上記各酵素；
タンパク質の機能と構造の解析に有用な蛋白工学用材料
としての上記各酵素；ウイルスの増殖機序解明、レトロ
ウイルスに特異的に作用する抗ウイルス剤の開発等に有
用な基礎と臨床のウイルス学用材料としての上記各酵
素；レトロウイルス感染症の診断用抗原、診断用抗体や
治療用免疫グロブリンを作製するための抗原、レトロウ
イルスの二次感染を予防するためのワクチン用抗原等と
して有用な上記各酵素；更に、上記以外にも、プロテア
ーゼ、逆転写酵素、及びインテグラーゼ各酵素の公知及
び将来解明される機能と特徴を利用する材料として上記
各酵素；等が提供される。

本発明の構成は、次の通りである： （Ｉ）レトロウイルスの酵素遺伝子の選択とそのDNA断
片の調製：レトロウイルスの酵素遺伝子に関しては、前
述の「定義」に基づくレトロウイルスが有するプロテア
ーゼ、逆転写酵素、インテグラーゼの各遺伝子が使用で
きる。尚、これ等の遺伝子は、「本発明の要旨」に記載
の通り、プロテアーゼ遺伝子の採用を必須とする４通り
の組合わせにより使用する。また、組換えDNA技術によ
る遺伝子発現では、レトロウイルスゲノムがRNAである
ため、上記各遺伝子は、これと相補的なcDNAに変換して
使用する。斯かるcDNAは、宿主染色体に組込まれている
プロウイルスゲノムや非組込み型の環状DNAをクローン
化することにより調製することができる。また、ウイル
ス粒子から抽出したゲノムRAMを鋳型として使用し、逆
転写酵素を用いる公知の常法により作製したcDNAライブ
ラリーから選別し調製することも可能である。しかしな
がら、上述の調製では危険度の高いレトロウイルスを直
接取扱うため、生物災害防止の観点から、必ずしも容易
ではない。従って、該ウイルスによる生物災害を回避す
ると共に、上記調製工程の省力化を図るには、公知かつ
既製のレトロウイルスゲノムcDNAクローンの使用が推奨
される。即ち、前述に引用の総説中に見られる通り、現
在既に、種々のレトロウイルスゲノムのクローニング、
制限酵素地図の作成、塩基配列の決定等が世界各地の研
究者により報告されているので、これ等の成果の活用が
安全かつ簡便であり、望ましい。例えば、既製のトリ肉
腫ウイルスゲノムクローンであるプラスミドpSRA2（Jou
rnal of Virology,第36巻,50−61ページ、1980年）、HI
V−１プロウイルスゲノムクローンであるプラスミドPNL
3−１、pNL3−２及びpNL4−３（Journal of Virology,
第59巻,284−291ページ、1986年）、HIV−１のpol遺伝
子クローンであるＥ．coli UT481/pNLH402（微工研菌寄
第10436号）のプラスミドpNLH402等が入手可能であり、
使用できる。cDNA断片の調製は、公知の常法、例えば、
上述のクローンから必要領域のDNAを制限酵素で切出し
た後、フェノール抽出、クロロホルム処理、エタノール
沈澱等により精製し行うことができる。尚、DNA断片の
切出しに使用する制限酵素は、各クローンの制限酵素地
図を参考にして適宜選択できる。例えば、上記pNLH402
のpol遺伝子全領域のDNA断片の切出しを所望の場合、制
限酵素Hin d III（Journal of Viro−logy,第59巻、284
−291ページ、1986年）を用いることができる。

（II）発現ベクターの構築、及び該ベクターを移入した
形質転換体の作出：上述に従って調製したレトロウイル
スゲノムcDNA断片を、公知の常法、例えば、T4DNAリガ
ーゼを用いて発現用ベクターに挿入連係することによ
り、発現ベクターを構築する。発現用ベクターとして
は、公知又は市販のもの、例えば、腸内細菌科のプラス
ミドベクターpSN508系列（米国特許第4,703,005号）、
酵母のプラスミドベクターpJM105（特開昭62−286930）
とpBH103系列（特開昭63−22098）、弱毒水痘ウイルス
・ベクター（特開昭53−14202）、弱毒マレック病ウイ
ルス・ベクター（日本獣医学会誌、第27巻、20−24ペー
ジ、1984年；及びGan Monograph onCanfer Research、
第10巻、1971年）、大腸菌のプラスミドベクターpUR290
系列（EMBO Jo−urnal、第２巻、1791−1794、1983年）
とpSN5182（Journal of Bacteriology、第157巻、909−
917ページ、1984年）等が使用できる。発現ベクターの
構築に於いて重要なことは、上述の酵素遺伝子を発現量
の多い遺伝子と連係することである。例えば、上述のpU
R290を用いる場合には、lacZ遺伝子の下流に、また、pS
N5182ではpstS遺伝子の下流に夫々、該遺伝子を挿入連
係することが好ましい。また、斯かる該遺伝子の挿入連
係に際し、注意すべきっ点は、翻訳が円滑に進行するよ
う遺伝子相互のコドン解読枠を一致させることにある。
例えば、HIV−１、HIV−２、サル免疫不全ウイルス、モ
ロニーマウス白血病気ウイルス等のcDNA断片を挿入連係
する場合、斯かるウイルスのプロテアーゼはpol遺伝子
領域にコードされているので、このpol遺伝子の解読枠
が多量発現遺伝子のそれと一致するよう連係する。ま
た、トリ肉腫ウイルスのプロテアーゼはpol遺伝子領域
とは解読枠が異なるgag遺伝子領域にコードされてお
り、ヒトＴ細胞白血病ウイルスやウシ白血病ウイルス等
のプロテアーゼ遺伝子はgag遺伝子ともpol遺伝子とも解
読枠が異なる。この様な場合には、多量発現遺伝子、プ
ロテアーゼ遺伝子及びpol遺伝子間相互の解読枠を一致
させる工夫を要する。斯かる工夫により、各種酵素遺伝
子の発現量は保証される。尚、上記解読枠の一致は、制
限酵素、ヌクレアーゼBal31、マングビーン（mung bea
n）ヌクレアーゼ等の酵素を用いる公知の常法により達
成できる。また、構築した発現ベクターを移入し形質転
換体を得る目的で用いる最適な受容細胞は、その発現ベ
クターの複製と発現とを許容する感受性宿主細胞から選
択し、同時に、斯かる宿主細胞のうち、構築した発現ベ
クターの移入が容易かつ確実に検出できる細胞を厳選し
て使用する。例えば、発現用ベクターとして上述のpSN
系列を用いる場合には受容菌として、該ベクターの移入
によりアルカリ性ホスファターゼ非産生菌から産生菌へ
と見かけ上の形質転換する大腸菌C75株（微工研菌寄第1
0191号）の使用が好ましく、また、pUR290系列を用いる
場合には、アンピシリン耐性をマーカーとして、このベ
クターが移入された形質転換体を選別できる大腸菌UT48
1（Journal of Bacteriology、第163巻、376−284ペー
ジ、1985年）が使用できる。斯かる受容細胞への発現ベ
クターの移入は、公知の常法、例えば、塩化カルシウム
法（Journal of Mole−cular Biology、第53巻、154−1
62ページ、1970年）により行うことができる。また、上
記酵素遺伝子発現ベクターが移入された形質転換は、上
記マーカーが陽性のコロニーから選別する。次に、選別
されて形質転換体コロニーから該発現ベクターDNAを抽
出の後、制限酵素で切断し、これをアガロースゲル電気
泳動にかけ、挿入連係された酵素遺伝子DNA断片のサイ
ズを測定すると共に、該遺伝子DNA断片の存在が確認さ
れたコロニーを、レトロウイルス酵素遺伝子発現の形質
転換体クローンとして採用する。例えば、前述の発現用
ベクターpUR290にpNLH402に由来のpol遺伝子全領域が挿
入連係された場合には、約4kbのEcoR I断片が検出され
る。

（III）形質転換体クローンによるレトロウイルス酵素
遺伝子発現の確認、及び該形質転換体の培養による各種
酵素の大量生産：形質転換体クローンによる酵素遺伝子
発現の確認は、例えば、ウェスタンブロット法を用い
て、該クローン培養物の粗抽出液を分析して行うことが
できる。粗抽出液は、例えば、形質転換体を公知の培地
中で培養の後、低速遠心により集菌し、これをドデシル
硫酸ナトリウムと２−メルカプトエタノールで処理し、
次いで、高速遠心にかけ、その上清を採取することによ
り調製できる。また、ウェスタンブロット法は、多種多
様に市販されている各種材料を用い、常法に従って、次
の順序で行うことができる：上記粗抽出液をポリアクリ
ルアミドケル電気泳動にかける；分離したタンパク質を
トランスブロットセルを用いてニトロセルロース膜上に
転移させる；該膜をゼラチン液に浸しブロッキングす
る。そして以下、例えば、斯かる膜上の被検体がHIVのp
ol遺伝子産物の場合には、HIVキャリアー血清と一次反
応させる；これを洗浄の後、更に、ペルオキシダーゼ標
識抗ヒトIgG抗体と二次反応させる；これを洗浄の後、
過酸化水素液と発色剤で発色させ、HIVキャリアー血清
と特異的に反応するバンドを検出することにより、上記
クローンでのpol遺伝子の発現を確認する。尚、上記被
検体がHIV以外の他のレトロウイルスに由来の酸素遺伝
子産物の場合には、HIVキャリアー血清を使用せず、一
次反応には該当するレトロウイルス抗血清を、二次反応
には該抗血清が由来のヒト又は動物のIgGに対する抗体
を夫々、使用する。

酵素遺伝子の発現が確認された形質転換体の培養によ
るプロテアーゼ、逆転写酵素、及びインテグラーゼ各酵
素の大量生産は、次の通り行う：該形質転換体の本培養
用シードを調製するため、例えば、形質転換体が大腸菌
の場合、LB培地中で、菌体濃度が10⁹〜10¹⁰細胞/mlに達
するまで、30〜40℃で12〜35時間培養する；次に、予め
調製した培養用培地1000lに対し、斯かるシート１〜10l
を接触混合の後、前培養と後培養からなる２段階培養を
行う。前培養は、シード細胞の増殖並びに発現ベクター
の増幅を目的として行うものであり、10〜40℃で１〜24
時間、好ましくは、15〜37℃で２〜12時間行い、例え
ば、大腸菌の場合には、培養下の菌体濃度、即ち、培養
液濁度OD600nm＝0.4〜0.7を目安として前培養を終了す
る。次いで、斯かる前培養の完了に伴い、該培養系を後
培養へ移行させる。後培養は、発現ベクターに連係の酸
素遺伝子の転写と翻訳、及び翻訳後の該遺伝子産物が改
編され、活性を有する個々の単独な成熟タンパク質とな
るプロセッシングを確保すると同時に、翻訳後の酵素遺
伝子産物が宿主細胞に由来のタンパク分解酸素により無
秩序に分解され失活することを避けるため、細心の注意
と創意の下で設定されるべきである。尚、後培養は、前
培養に比べ相対的に低温の方が望ましく、10〜35℃で１
〜40時間、好ましくは、15〜28℃で３〜35時間行なう。
また、使用する発現ベクターの性質を考慮し、例えば、
後培養開始時に、培地中のリン酸の飢餓化、培地中への
インデューサーの添加混合等を行うことにより、発現の
促進や誘導を図ることができる。また、上述の２段階培
養を行うことにより、レトロウイルスのプロテアーゼ、
逆転写酵素、及びインテグラーゼ各酵素が、融合タンパ
ク質の状態ではなく、個々に独立した活性タンパク質、
即ち、個別かつ単独の成熟タンパク質として、通常、培
地1l当り１〜20mgの高収量で生産される。

（IV）発現ベクターにより量産されたプロテアーゼ、逆
転写酵素、及びインテグラーゼ各酵素の精製：この工程
は、公知の常法を組合わせて用いることにより達成でき
る。例えば、沈澱剤、遠心、濾過等による形質転換体培
養物の採取；超音波処理、加圧減圧処理、ホモジナイザ
ー等により形質転換体細胞の破壊ないし破砕による粗抽
出液の調製；珪酸や活性炭による吸脱着処理、塩析、有
機溶媒による沈澱等による精製；超遠心法、カラムクロ
マトグラフィー、電気泳動法等を用いる分画による高度
精製；また、珪酸及び活性炭に吸脱着の後、密度勾配遠
心にて分画する遺伝子産物の精製法（特開昭63−297）
等により、上記各酵素の精製が可能である。

本発明の製法により提供されるプロテアーゼ、逆転写
酵素及びインテグラーゼ各酵素は、液状、乾燥粉末、又
は濾紙や膜等に吸着の状態で、アンプル、バイアル瓶等
の小型容器内に密封し、提供できる。液状の場合はその
まま必要量使用し、乾燥の場合は、蒸溜水で溶解し乾燥
前の体積まで戻した後、必要量使用する。濾紙や膜等に
吸着の場合には、使用書に指定の溶液で湿潤させた後、
使用する。

以下、本発明の具体例につき実施例を挙げて説明す
る。但し、本発明は、以下の実施例にのみ限定されるも
のではない。

実験例１ 逆転写酵素活性の測定：反応液の組成が50mMのトリス
・HCl（pH8.3）,50mMの塩化カリウム,10mMの塩化マグネ
シウム,3mMのジチオスライトール,0.1W/V％のノニデッ
トＰ−40（シェル石油社［米国］製）20μg/mlの（rA）
_ｎ・（dT）_12-18（ファルマシア社［スウェーデン］
製）,0.5mMのTTP（チミジントリフォスフェイト）,1μC
iの［³H］・TTPで検体５μｌを含めて50μｌとして、37
℃にて10分間インキュベートした。反応液を直ちに水冷
し、濾紙DE81（ワットマン社［英国］製）にて濾過し、
フィルターを５％リン酸ソーダ液にてよく洗浄し、更に
水洗後エタノールで洗い、乾燥して、液体シンチレーシ
ョンカウンターにてcpmを測定した。

実施例１ レンチウイルスのpol遺伝子を挿入連係した発現ベク
ターの構築:HIVプロウイルスゲノムDNAを保有するプラ
スミドpNL4−３（Journal of Virology,59（２）:284−
291,1986）のDNAを５μg,5μｌのHind III,20μｌの５
×RM（50mMトリス・HCl,pH7.5,35mM MgCl₂,300mM NaC
l）を加え、蒸留水で全量を100μｌとして、37℃にて１
時間，インキュベート後、TE（10mMトリス・HCl,pH7.5,
1mM EDTA）で飽和したフェノールにて抽出し、水層をク
ロロホルム処理して、エタノール沈澱した。沈澱を10μ
ｌのTEに溶解した内の１μｌと、Hind IIIで開裂し、ア
ルカリ性ホスファターゼ処理したプラスミド,pHSG398 D
NA0.1μｇ（１μｌ），更に、２μｌの10×ライゲーシ
ョン緩衝液（660mMトリス・HCl,pH7.6,66mM MgCl₂,100m
M DTT,1mM ATP）を加えたものに、１μｌのT4DNAリガー
ゼを添加し、全量を蒸留水で20μｌとした後、15℃にて
12時間、インキュベートした。次いで、この反応液によ
り大腸菌JM103株を塩化カルシウム法（Journal of Mole
cular Birology,53:154,1970）により形質転換し、クロ
ラムフェニコール20μg/ml含有のLB平板培地（1W/V％ B
acto−trypton,0.5W/V％ Bacto−yeast extract,1W/V％
NaClおよび1.5W/V％寒天）にて、クロラムフェニコー
ル耐性コロニーを選択した。クロラムフェニコール耐性
クローンにより常法によりプラスミドDNAを抽出し、プ
ラスミドpNL4−3DNA由来の約4.0kbの断片を含むクロー
ンをHind III切断により識別し、クローンpNLH402を得
た。

５μｌのプラスミドpNLH402 DNA（５μｇ）に５μｌ
のHind IIIと10μｌの５×RMを加え、全量を蒸留水で50
μｌとし、37℃で１時間インキュベートし、フェノール
抽出、クロロホルム処理後、エタノール沈澱した。この
沈澱に10μｌの５×RMと５μｌのBgl IIを加え、全量を
蒸留水で50μｌとしてよく溶解し、37℃で再び１時間イ
ンキュベートし、フェノール抽出、クロロホルム処理
後、エタノール沈澱させたDNAは10μｌのTEに溶解し
た。

一方、発現用ベクターpUR290（The EMBO Journal,2
（２）:1791−1794,1983）の５μｇに５μｌのHind II
I,10μｌの５×RMを加え、蒸留水にて50μｌにしたもの
を37℃で１時間インキュベートし、フェノール抽出、ク
ロロホルム処理後、エタノール沈澱を行い、これに５×
RM（NaClの濃度は500mM）を10μｌとBamH Iを５μｌ、
更に蒸留水を35μｌ加え、完全に沈澱を溶解し、37℃で
再び１時間インキュベートし、フェノール抽出、クロロ
ホルム処理後、エタノール沈澱させたDNAを10μｌのTE
に溶解した。

次に、上記のHind IIIとBamH Iで切断したpUR290（１
μｌ）と、Hind IIIとBgl IIで切断したpNLH402（１μ
ｌ）を混合し、10×ライゲーション緩衝液２μｌおよび
１μｌのT4DNAリガーゼを加え、全量を蒸留水にて20μ
ｌとし、15℃にて12時間インキュベートした。この反応
液にて大腸菌UT481株（Journal of Biology,163:376−3
84,1985）を前述の塩化カルシウム法にて形質転換し、
アンピシリン20μg/ml含有のLB平板培地にてアンピシリ
ン耐性コロニーを選別し、更に、pNL4−３由来の3.8kb
の断片を含むクローンをEcoR I切断にて挿入断片のサイ
ズを測定することにより選別し、クローンUT481/pPG280
を得た。即ち、このクローンはプラスミドpUR290上のla
cZ遺伝子の３′末端部に3.8kbなHIV pol遺伝子領域が連
結されており、lacZとpolの遺伝子産物は融合蛋白（約2
30kd）として発現し、その後プロセスされて各種酵素が
産生されると推定される。

実施例２ 形質転換体の培養によるレンチウイルスのプロテアー
ゼ、逆転写酵素、およびインテグラーゼ各酵素の生産：
形質転換体クローンUT481/pPG280をアンピシリン20μg/
ml含有のLB培地（Bacto−tryptone 1W/V％,Bacto−yeas
t extract 0.5W/V％およびNaCl 1W/V％）で、37℃にて1
8時間培養後、1/100容量を新鮮LB培地（アンピシリン20
μg/ml含有）に加え、25℃にて前培養した。培地の濁度
OD₆₀₀nmが0.5に到達した時、IPTG（Isopropylthiogalac
toside,シグマ社［米国］製）を1mM加え、更に25℃にて
18時間培養を続けた。遠心操作（5000rpm,5分）で菌体
を厚め、1/25容量の40mMトリス・HCl,pH8.0（0.1mM EDT
A,5mM MgCl₂,0.1W/V％ TritonX−100および10mMの２−
メルカプトエタノールを含む）に浮遊し、超音波処理
（30秒間処理を５回,19.5KHz,300W）後、遠心動作（19,
000rpm,60分）により、上清を分離した。この粗抽出液
中のHIV pol遺伝子産物を検討するため、粗抽出液の逆
転写酵素活性を測定した結果を第１図に示す。期待され
る量有意な逆転写酵素活性が認められた。また、ウエス
タンブロット法による分析も行った。即ち、集めた菌体
に4W/V％のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）と10V/V％の
２−メルカプトエタノールを加え、５分間煮沸処理し、
遠心操作（10,000rpm,5分間）した上清を、0.1W/V％SDS
−10W/V％ポリアクリルアミドのゲルを用いて電気泳動
し、トランスブロットセル（バイオラッド社［米国］
製）を用いてニトロセルロース膜（Ｓ＆Ｓ［西独］製）
にブロット後、常法通り3W/V％のゲラチン液に浸しブロ
ッキングした。次いで、フィルターをHIVキャリアー血
清と一次反応し、洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗
ヒトIgG血清（バイオラッド社［米国］製）と二次反応
した。最後にフィルターを洗浄後、50mlのTBS（20mMト
リス・HCl,pH7.4,500mM NaCl）に0.4mlのDAB（3,3′−d
iaminobenzidine tetrahydrochloride）と30W/V％の過
酸化水素液15μｌを加えた発色液に浸し、15分間室温に
て発色させ、フィルターを蒸留水で洗浄し、反応を停止
した。第２図に結果を示した。HIV pol遺伝子を保有し
ないベクターpUR290による形質転換菌UT481/pUR290の粗
抽出液では、HIVキャリアー血清と反応する特異なバン
ドは見られないが、UT481/pPG280の粗抽出液中には、HI
Vのpol遺伝子産物である分子量66kdと51kdの逆転写酵
素,32kdのインテグラーゼおよび12kdのプロテアーゼの
バンドを認めることが出来た。逆転写酵素が、β−ガラ
クトシダーゼより切断されていることは、第３図の陰イ
オン交換体MonoQ（ファマシア社［スウェーデン］製）
カラムクロマトグラフィーの結果からも容易に分かる。
即ち、逆転写酵素活性はβ−ガラクトシダーゼ活性と完
全に分離した画分に認められた。よって、HIV pol遺伝
子産物はβ−ガラクトシダーゼとの融合蛋白として産生
されるが、pol遺伝子産物のプロテアーゼにより、プロ
テアーゼ、逆転写酵素およびインテグラーゼの領域が特
異的に切断され、菌体中に蓄積されるものと推察され
る。

実施例３ レンチウイルスのプロテアーゼを多量に産生するベク
ターの構築：実施例１で得たpol遺伝子発現プラスミドp
PG280のDNA5μｇに、５μｌのHind III,20μｌの５×RM
を加え全量を蒸留水で100μｌとし,37℃で１時間インキ
ュベートし、フェノール抽出，クロロホルム処理後、エ
タノール沈澱した。この沈澱に５μｌのBal Iと10μｌ
の５×RM（−NaCl）を加え、全量を蒸留水で50μｌとし
てよく溶解し、37℃で再び１時間インキュベートし、フ
ェノール抽出，クロロホルム処理後，エタノール沈澱し
た。この沈澱に５μｌの10×ポリメラーゼ緩衝液（670m
M Tris・HCl,pH8.8,67mM MgCl₂,166mM（NH₄）₂SO₄,100m
M 2−メルカプトエタノール,67mM EDTA）と５μｌの10
×NTP溶液（各3.3mM dATP,dGTP,dTTPおよびdCTP）と１
μｌのT4DNAポリメラーゼを加え、全量を蒸留水で50μ
ｌとしてよく溶解し、37℃で15分インキュベートし、フ
ェノール抽出，クロロホルム処理後，エタノール沈澱し
た。この沈澱を10μｌのTEに溶解した内の１μｌに２μ
ｌの10×ライゲーション緩衝液を加えたものに、１μｌ
のT4DNAリガーゼを添加し、全量を蒸留水で20μｌとし
た後、15℃で12時間インキュベートした。この反応液に
て大腸菌UT481株を前述の塩化カルシウム法にて形質転
換し、アンピシリン20μg/ml含有のLB平板培地にてアン
ピシリン耐性コロニーを選別し、更に、pNL4−３由来の
0.55kbの断片を含むクローンをEcoR I切断にて挿入断片
のサイズを測定することにより選別し、クローンUT481/
pLB550−３を得た。

実施例４ 形質転換体によるレンチウイルスのプロテアーゼの多
量生産：形質転換体クローンUT481/pLB550−３をLB培地
（アンピシリン20μg/ml含有）で37℃にて18時間培養
後、1/100容量を新鮮LB培地（アンピシリン20μg/ml含
有）に加え、37℃にて前培養した。培地の濁度OD₆₀₀nm
が0.5に達したとき、IPTG（Isopropyl β−Ｄ−Thiogal
actoside,シグマ社［米国］製）を1mM加え、更に35℃に
て６時間培養を続けた。遠心操作（5000rpm,5分）で菌
体を集め、4W/V％のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）と1
0V/V％の２−メルカプタエタノールを加え、５分間煮沸
処理し、遠心操作（10,000rpm,5分間）した上清を0.1W/
V％SDS−15W/V％ポリアクリルアミドのゲルを用いて電
気泳動し、以下、実験例２に記述したとおり、ウエスタ
ン・ブロット法で解析した。UT481/pUR290の粗抽出液で
はHIVキャリアー血清と反応する特異なバンドは見られ
ないが、UT481/pLB550−３の粗抽出液では12kdのプロテ
アーゼのバンドを認めることが出来た。尚、pLB550−３
によるプロテアーゼの産生量はpPG280の数倍であった。
このクローンはプラスミドpUR290のlacZ遺伝子の３′末
端部に0.55kbのHIV pol遺伝子が連結されており、lacZ
−pol遺伝子産物は分子量約140kdの融合タンパクとして
産生され、その後、プロセスされて分子量約12kdのプロ
テアーゼが産生されると推定される。

実施例５ オンコウイルスのプロテアーゼ遺伝子およびpol遺伝
子を挿入連係した発現ベクターの構築：トリ肉腫ウイル
スDNAクローンpSRA2（Journal of virology、第36巻、5
0−61ページ、1980年）のDNA5μｇに５μｌのBamH Iと2
0μｌの５×RMを加え、蒸留水で全量を100μｌとして37
℃にて１時間インキュベートした。この反応液を1W/V％
低融点アガロースゲルで電気泳動の後、1.8kbのDNA断片
を含むゲルを切り出し、フェノール抽出，クロロホルム
処理後，エタノール沈澱した。このDNAの沈澱を10μｌ
のTEに溶解した内の１μｌに、BamH Iで開裂してアルカ
リ性ホスファターゼ処理したプラスミドpUR291DNA1μｌ
（0.1μｇ），更に、２μｌの10×ライゲーション緩衝
液,1μｌのT4DNAリガーゼを添加し、蒸留水で全量を20
μｌとした後、15℃にて12時間インキュベートした。次
いで、この反応液により大腸菌UT481株を塩化カルシウ
ム法により形質転換し、アンピシリン20μg/ml含有のLB
平板培地にてアンピシリン耐性コロニーを選択した。ア
ンピシリン耐性クローンより常法によりプラスミドDNA
を抽出し、プラスミドpSRA2由来の1.8kb断片を含み、か
つ、lacZ−gag融合タンパクを産生するクローンを選択
し、pSR281を得た。

プラスミドpSRA2のDNA5μｇに５μｌのPst Iと20μｌ
の５×RM（750mM NaCl）を加え、蒸留水で全量を100μ
ｌとして37℃で１時間インキュベートした。この反応液
を1W/V％低融点アガロースゲル電気泳動の後、3.1kbのD
NA断片を含むゲルを切り出し、フェノール抽出，クロロ
ホルム処理の後エタノール沈澱し、10μｌのTEに溶解し
た。同様に、M13mP18の二重鎖ファージDNAをPst Iで開
裂してアルカリ性フォスファターゼ処理した。このDNA1
μｌ（0.1μｇ）に上記3.1kbDNA断片１μl,2μｌの10×
ライゲーション緩衝液,1μｌのT4DNAリガーゼを添加
し、蒸留水で全量を20μｌとした後、15℃で12時間イン
キュベートした。次いで、この反応液を用いて、塩化カ
ルシウム法により大腸菌TG1株にファージDNAをトランス
フェクションして、Ｘ−gal（５−bromo−４−chloro−
３−indolyl−β−Ｄ−galactopyranoside,シグマ社
［米国］製）40μg/ml含有の2YT平板培地（1.6W/V％ Ba
cto−trypton,1W/V％ Bacto−yeast extract,0.5W/V％
NaClおよび1.5W/V％ Bacto−agar）にてプラークを形成
させた。次に、TG1株を2YT液体培地（1.6W/V％ Bacto−
trypton,1W/V％ Bacto−yeast extract,0.5W/V％ NaC
l）で濁度OD₆₀₀nm＝0.3まで増殖させ、生じたプラーク
のうち無色のもの数クローンを接種し、更に数時間培養
を続けた後、常法により単鎖DNAおよび二重鎖DNAをそれ
ぞれ調製した。得られた二重鎖DNAをPstＩおよびBamH I
で切断することにより、pSRA2由来の3.1kb断片を含むク
ローンM13sr31を選別した。pSRA2由来の3.1kb断片に
は、gag（プロテアーゼ）遺伝子の３′末端，その終止
コドンTAGおよびpol遺伝子がコードされており、終止コ
ドンの前に１塩基を挿入すれば、翻訳枠が一致したgag
−pol融合遺伝子となる。

著者等は、アマシャム社のin vitroの突然変異誘発
キットを用いてM13sr31上の該TAG終止コドンの前に１塩
基挿入し、ＡTAGに改変したクローンM13sr32を得た。

M13sr32の二重鎖DNA5μｇに５μｌのPst Iと20μｌの
５×RMを加え、蒸留水で全量を100μｌとして37℃でい
時間インキュベートした。この反応液を1W/V％低融点ア
ガロースゲル電気泳動の後、3.1kbのDNA断片を含むゲル
を切り出し、フェノール抽出，クロロホルム処理の後、
エタノール沈澱した。このDNAの沈澱を10μｌのTEに溶
解した内の１μｌにPst Iで切断してアルカリ性ホスフ
ァターゼ処理したプラスミドpSR281 DNA1μｌ（0.1μ
ｇ），更に２μｌの10×ライゲーション緩衝液,1μｌの
T4DNAリガーゼを添加し、蒸留水で全量を20μｌとした
後、15℃で12時間インキュベートした。次いで、この反
応液により大腸菌UT481株を塩化カルシウム法により形
質転換し、アンピシリン20μg/ml含有のLB平板培地にて
アンピシリン耐性コロニーを選択した。アンピシリン耐
性クローンにより常法によりプラスミドDNAを抽出し、P
st IおよびBamH Iで切断することにより、M13sr32由来
の3.1kb断片の存在とその方向を確認し、プロテアーゼ
およびpol遺伝子産物の発現が予期されるクローンUT481
/pSR271を得た。尚、pSR281に含まれるpSRA2由来の1.8k
b領域のうちM13sr32由来の3.1kb断片と重複する1.3kb
は、pSR281をPst Iで切断する際に切り出される。

実施例６ 形質転換体の培養によるオンコウイルスのプロテアー
ゼ、逆転写酵素、およびインテグラーゼ各酸素の生産：
形質転換体クローンUT481/pSR271をLB培地（アンピシリ
ン20μg/ml含有）で、37℃にて18時間培養後、1/100容
量を新鮮LB培地（アンピシリン20μg/ml含有）に加え、
25℃に前培養した。培地の濁度OD₆₀₀nmが0.5に到達した
とき、IPTGを1mM加え、更に25℃にて18時間培養を続け
た。遠心操作（5000rpm,5分）で菌体を集め、1/25容量
の40mMトリス・HCl,pH8.0（0.1mM EDTA,5mM MgCl₂,0.1W
/V％ TritonX−100および10mMの２−メルカプトエタノ
ールを含む）に浮遊し、超音波処理（30秒間処理を５
回,19.5KHz,300W）後、遠心操作（19,000rpm,60分）に
より、上清を分離した。この粗抽出液中のRSV遺伝子産
物を検討するため、粗抽出液の逆転写酵素活性を測定し
たところ期待される有意な逆転写酵素活性を認めた。ま
た、ウェスタンブロット法による分析も行った。即ち、
集めた菌体に4W/V％のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）
と10V/V％の２−メルカプトエタノールを加え、５分間
煮沸処理し、遠心操作（10,000rpm,5分間）した上清
を、0.1W/V％SDS−15W/V％ポリアクリルアミドのゲルを
用いて電気泳動し、トランスブロットセル（バイオラッ
ド社［米国］製）を用いてニトロセルロース膜（Ｓ＆Ｓ
社［西独］製）にブロット後、常法通り3W/V％のゲラチ
ン液に浸しブロッキングした。次いで、フィルターを抗
RSVウサギ血清と一次反応し、洗浄後、ペルオキシダー
ゼ標識ヤギ抗ウサギIgG血清（バイオラッド社［米国］
製）と二次反応した。最後にフィルターを洗浄後、50ml
のTBS（20mMトリス・HCl,pH7.4,500mM NaCl）に0.4mlの
DAB（3,3′−diaminobenzidine tetrahydrochloride）
と30W/V％の過酸化水素液15μｌを加えた発色液に浸
し、15分間室温にて発色させ、フィルターを蒸留水で洗
浄し、反応を停止した。RSV遺伝子を保有しないベクタ
ーpUR290による形質転換菌UT481/pUR290の粗抽出液で
は、抗RSVウサギ血清と反応する特異なバンドは見られ
ないが、UT481/pSR271の粗抽出液中には、RSVの逆転写
酵素（p92,p65）のバンドを認めることが出来た。RSVの
プロテアーゼおよびpol遺伝子産物はβ−ガラクトシダ
ーゼとの融合蛋白として産生されるが、gag遺伝子産物
のプロテアーゼにより、プロテアーゼ，逆転写酵素およ
びインテグラーゼの領域が特異的に切断され、菌体中に
蓄積されるものと推察される。また、クローンUT481/pS
R271は、プラスミドpUR281上のlacZ遺伝子の３′末端部
に3.6kbのラウス肉腫ウイルスのgagおよびpol遺伝子領
域が連結されており、lacZ，gagおよびpol遺伝子産物は
融合蛋白（約230kd）として発現し、その後、プロセス
されてプロテアーゼ（p15），逆転写酵素（p92,p65），
インテグラーゼ（p32）が産生されると推定される。

実施例７ 逆転写酵素の抽出：実施例２に記載したごとく、形質
転換大腸菌クローンUT481/pPG280を9lのLB培地（アンピ
シリン20μg/ml含有）にて25℃で培養し、菌の濁度OD
₆₀₀nmが0.5に到達したとき、IPTGを1ml加え、更に、24
時間培養を続け、集菌後、120mlの40mMトリス・HCl,pH
8.0（0.1mM EDTA,5mM MgCl₂,0.1W/V TritonX−100およ
び10Mm 2−メルカプトエタノールを含有する）緩衝液に
浮遊し、超音波処理により菌体を破砕し、遠心操作（1
9,000rpm,60分間）し、上清を粗抽出液として分離し
た。

実施例８ 逆転写酵素の粗精製：粗抽出液にポリミンＰ（BRL社
［米国］製）を0.1W/V％加え、４℃にて30分撹拌し、遠
心操作（16,000rpm,20分間）して得た上清に硫酸アンモ
ニウム液を加え、40％飽和として生じた沈澱を遠心操作
（16,000rpm,20分間）により除去し、上清137mlを得
た。再び、硫酸アンモニウム液を加えて、80％飽和と
し、生じた沈澱を上記の50mlの40mMトリス・HCl緩衝液
に溶解し、同様の50mM NaClを含む緩衝液で透析を行っ
た。

実施例９ 逆転写酵素の精製：次に、DEAEバイオゲルＡ（バイオ
ラッド社［米国］製）とアフィゲルヘパリンカラムクロ
マト（バイオラッド社製）にて精製を行った。40mMトリ
ス・HCl,pH8.0（0.1mM EDTA,5mM MgCl₂,0.1W/V％ Trito
nX−100,10mM 2−メルカプトエタノールおよび50mM NaC
lを含有する）緩衝液で平衡化した容量30mlのDEAEバイ
オゲルＡカラムを上記の透析済み試料を通過させたもの
を上記の緩衝液で平衡化した容量30mlのアフィゲルヘパ
リンカラムに通し、塩化ナトリウム勾配50mM〜400mMの
溶出液150mlにて溶出した。結果を第４図に示す。逆転
写酵素活性を含む画分29〜38をプールした。プールして
得た逆転写酵素液は20mMリン酸ソーダ緩衝液,pH 6.8
（0.1mM EDTA,5mM MgCl₂,0.1W/V％ TritonX−100および
10mM 2−メルカプトエタノールを含有する）に透析し、
ハイドロオキシアパタイトカラム（KBカラム，株式会社
高研［日本］製）を用い、高速液体クロマトにより、更
に精製を行った。即ち、上記の透析済み試料をカラムに
吸着後、20〜400mMのリン酸ソーダーの連続濃度勾配に
て溶出を行い、逆転写酵素活性を含む画分をプールし、
精製逆転写酵素を得た。本精製酵素の純度は、SDS−PAG
Eにより95W/W％以上であることが確認され、また、その
収率は粗抽出液に対し、31W/W％であった。

発明の作用と効果 （１）本発明の製法では、極めて危険度の高いレトロウ
イルスそのものを使用しないため、製造工程下でのバイ
オハザード対策の観点から、優れて安全であり、かつ、
製造作業も容易である。

（２）培養液1l中の各酵素産生量は、タンパク量で１〜
10mgであり、生産収率が極めて高い。

（３）本発明によれば、レトロウイルスのプロテアー
ゼ、逆転写酵素及びインテグラーゼが多量発現遺伝子産
物との融合タンパクとして発現されるにも拘らず、融合
タンパクの状態ではなく、夫々プロセッシングされた単
独の成熟タンパク質として産生させることが可能である
ため、単独の酵素遺伝子の発現に比べ、能率的かつ合理
的であり、更に、上記（１）及び（２）をも併せて考慮
に入れ、生産コストが低く、経済的である。

（４）レトロウイルスに固有の基質に対し極めて特異性
の高い酵素、及び該ウイルス抗原としての酵素が廉価か
つ大量に提供できるため、遺伝子工学だけではなく、レ
トロウイルス感染症、例えば、エイズ、成人Ｔ細胞白血
病、ニワトリの肉腫や白血病、ネコ白血病等の基礎研
究、高度の選択毒性を有する特異的な治療剤や予防剤の
開発、診断等に長足の進歩をもたらすと共に、人類の保
健衛生並びに畜産の振興に対する福音となる。

（５）本発明に係る製法は、レトロウイルスの各種酵素
遺伝子だけではなく、該ウイルスが有する他の多様な種
々の遺伝子並びにレトロトランスホゾンが有する各種遺
伝子の多量発現と爾後のプロセッシングを可能にするた
め、これ等遺伝子産物の合理的かつ能率的量産の開発に
応用できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、HIVのpol遺伝子をもつプラスミドpPG280で形
質転換された大腸菌と、HIVのpol遺伝子をもたないベク
ターpUR290で形質転換された大腸菌の粗抽出液の逆転写
酵素活性を示す。第２図は、HIVのpol遺伝子をもつプラ
スミドpPG280と、HIVのpol遺伝子をもたないベクターpU
R290で各々形質転換された大腸菌の粗抽出液のHIVキャ
リアー血清を用いたウエスタンブロット法による分析結
果を示す。 第３図は、陰イオン交換カラムクロマトによる大腸菌粗
抽出液の逆転写酵素の溶出パターンを示す。第４図は、
アフィゲルヘパリンクロマトグラフィーによる逆転写酵
素の分離を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 国際公開87／7296（ＷＯ，Ａ１) Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏ ｇｙ，Ｖｏｌ．36（1980）ｐ．50−61 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏ ｇｙ，Ｖｏｌ．54（1985）ｐ．703−710 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 15/48 - 15/49 C12N 9/50 C12N 9/12 C12N 9/22 C12N 15/52 - 15/61 C12N 15/67 - 15/86 ＢＩＯＳＹＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】次の（ａ）〜（ｃ）各工程を順に行うこと
   を特徴とするレトロウイルス酵素の製造方法： （ａ）レトロウイルスのプロテアーゼ，逆転写酵素及び
   エンドヌクレアーゼの各酵素をコードする遺伝子群か
   ら，プロテアーゼ遺伝子が必須として選ばれる少なくと
   も１種の上記遺伝子を含む次のレトロウイルス遺伝子cD
   NA断片（５′末端から３′末端方向に左から右に記
   載）， プロテアーゼ遺伝子； プロテアーゼ遺伝子−逆転写酵素遺伝子； 逆転写酵素遺伝子−プロテアーゼ遺伝子； プロテアーゼ遺伝子−エンドヌクレアーゼ遺伝子； プロテアーゼ遺伝子−逆転写酵素遺伝子−エンドヌクレ
   アーゼ遺伝子； 又は 逆転写酵素遺伝子−プロテアーゼ遺伝子−エンドヌクレ
   アーゼ遺伝子； を多量発現ベクターの制限酵素サイトに解読枠を一致さ
   せて挿入連係することにより発現ベクターを構築する工
   程； （ｂ）構築した発現ベクターを受容細胞に移入すること
   により形質転換体を作出する工程；及び （ｃ）作出した形質転換体を,10〜40℃で１〜24時間，
   前培養した後,10〜35℃で１〜40時間，後培養すること
   により前記遺伝子を発現させると共に，その発現物をプ
   ロセッシングさせて酵素を生成させる工程．
2. 【請求項２】請求項１に記載の工程（ａ）〜（ｃ）にお
   いて，（ａ）大腸菌UT481/pNLH401（微工研条寄第2417
   号）又は大腸菌JM109/pSRA2（微工研条寄第3921号）か
   らレトロウイルス遺伝子cDNA断片を調製の後，そのcDNA
   断片をプラスミドpUR290系列ベクターの遺伝子lacZ下流
   の制限酵素サイトに解読枠を一致させて連係挿入するこ
   とにより発現ベクターを構築し， （ｂ）構築したベクターを大腸菌UT481株（FERM BP−46
   22）に移入することにより形質転換体を作出し，（ｃ）
   作出した形質転換体をシードとして前培養と後培養から
   なる２段階培養を行う請求項１記載のレトロウイルス酵
   素の製造方法．
3. 【請求項３】次の（ａ）〜（ｃ）各工程を順に行うこと
   を特徴とするレトロウイルス逆転写酵素の製造方法； （ａ）レトロウイルスのプロテアーゼ，逆転写酵素及び
   エンドヌクレアーゼの各酵素をコードする遺伝子群か
   ら，プロテアーゼと逆転写酵素の両遺伝子が必須として
   選ばれる少なくとも２種の上記遺伝子を含む次のレトロ
   ウイルス遺伝子cDNA断片（５′末端から３′末端方向に
   左から右に記載）， プロテアーゼ遺伝子−逆転写酵素遺伝子； 逆転写酵素遺伝子−プロテアーゼ遺伝子； プロテアーゼ遺伝子−逆転写酵素遺伝子−エンドヌクレ
   アーゼ遺伝子； 又は 逆転写酵素遺伝子−プロテアーゼ遺伝子−エンドヌクレ
   アーゼ遺伝子； を多量発現ベクターの制限酵素サイトに解読枠を一致さ
   せて挿入連係することにより発現ベクターを構築する工
   程； （ｂ）構築した発現ベクターを受容細胞に移入すること
   により形質転換体を作出する工程；及び （ｃ）作出した形質転換体を,10〜40℃で１〜24時間，
   前培養した後,10〜35℃で１〜40時間，後培養すること
   により前記遺伝子を発現させると共に，その発現物をプ
   ロセッシングさせて逆転写酵素を生成させる工程．
4. 【請求項４】次の（ａ）〜（ｃ）各工程を順に行うこと
   を特徴とするレトロウイルスエンドヌクレアーゼの製造
   方法： （ａ）レトロウイルスのプロテアーゼ，逆転写酵素及び
   エンドヌクレアーゼの各酵素をコードする遺伝子群か
   ら，プロテアーゼとエンドヌクレアーゼの両遺伝子が必
   須として選ばれる少なくとも２種の上記遺伝子を含む次
   のレトロウイルス遺伝子cDNA断片（５′末端から３′末
   端方向に左から右に記載）， プロテアーゼ遺伝子−エンドヌクレアーゼ遺伝子； プロテアーゼ遺伝子−逆転写酵素遺伝子−エンドヌクレ
   アーゼ遺伝子； 又は 逆転写酵素遺伝子−プロテアーゼ遺伝子−エンドヌクレ
   アーゼ遺伝子； を多量発現ベクターの制限酵素サイトに解読枠を一致さ
   せて挿入連係することにより発現ベクターを構築する工
   程； （ｂ）構築した発現ベクターを受容細胞に移入すること
   により形質転換体を作出する工程；及び （ｃ）作出した形質転換体を,10〜40℃で１〜24時間，
   前培養した後,10〜35℃で１〜40時間，後培養すること
   により前記遺伝子を発現させると共に，その発現物をプ
   ロセッシングさせてエンドヌクレアーゼを生成させる工
   程．