JPH01193299A - 組替ｈｔｌｖ−３蛋白質及びその用途 - Google Patents

組替ｈｔｌｖ−３蛋白質及びその用途

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JPH01193299A
JPH01193299A JP63111348A JP11134888A JPH01193299A JP H01193299 A JPH01193299 A JP H01193299A JP 63111348 A JP63111348 A JP 63111348A JP 11134888 A JP11134888 A JP 11134888A JP H01193299 A JPH01193299 A JP H01193299A
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htlv
iii
immunoadsorbent
amino acid
acid sequence
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スコット　ディー．パトニー
Debra Lynn
デブラ　リン
Kashayar Javaherian
カシャヤ　ジャワヘリアン
William T Mueller
ウィリアム　ティー．ミューラー
John Farley
ジョン　ファーレイ
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は組換ＨＴＬＶ−ｍ蛋白質とその用途に間する。
［従来の技術］ ヒトＴ細胞白血病ウィルス（ＨＴＬＶ−ｍ　）、リンパ
節障害間蓮ウィルス（ＬＡＶ）、又はＡＩＤＳ関連レト
ロウィルス（ＡＲＶ）は、後天性免疫不全症（ＡＩＤＳ
）の原因として確認された［ボボビック・エム（Ｐｏｐ
ｏｖｉｃ。
阿、〉、サルンガドハラン・エム・ジー（Ｓａｒｎｇａ
ｄｈａ−ｒａｎ、　Ｍ、Ｇ、）、リード・イー（Ｒｅａ
ｄ、　Ｅ、）、及びガロ・アール・シー（Ｇａｌｌｏ、
　Ｒ，Ｃ，）［１９８４年］　５ｃｉｅｎｃｅ２２４巻
４９７−５００頁］、コノウィルスパ、ｏＫ丁４＋リン
パ球サブセットに対して向性を示す［クラララマン・デ
イ−（に１ａｔｚｎ＋ａｎ、　Ｄ、）、バレ＝シノッシ
・エフ（Ｂａｒｒｅ−５ｉｎｏｕｓｓｉ、　Ｆ、）、ヌ
ゲイレ争エム・ティー（Ｎｕｇｅｙｒｅ、　Ｍ、Ｔ、）
、ドウジｘ　’ｙト・シー（Ｄａｕｇｕｅｔ。
Ｃ，）、ヴイルマー・イー（Ｖｉｌｅｅｒ、　Ｅ、）、
グリセリ・シー（Ｇｒｉｓｃｅｌｌｉ、　Ｃ，）、ブル
ン＝ヴエジネ壷エフ（Ｂｒｕｎ−Ｖｅｚｉｎｅｔ、　Ｆ
、）、ルジュウ・シー（Ｒｏｕｚｉｏｕｘ。
Ｃ，）、グルツクマン・ジェイ・シー（ＧＩｕｃｋ＋ｓ
ａｎ、　Ｊ。
Ｃ，）、’＜　エルマン・ジエイ・シー（ｃｈｅｒｍａ
ｎｎ、　Ｊ、Ｃ，）及びモンタニエール・エル（Ｍｏｎ
ｔａｇｎｉｅｒ、Ｌ、）（１９８４年）　５ｃｉｅｎｃ
ｅ　２２５巻５９−６３頁］。はとんどのエイズ患者と
エイズ関連複合症候群（ＡＲＣ）患者、及び同ウィルス
に感染した無症状の人々［サルンガドハラン・エム・ジ
ー、ボボビック・エム、ブラッチ・エル（Ｂｒｕｃｈ、
　Ｌ、）、シャブバッチ・ジエイ（Ｓｃｈ−ｕｐｂａｃ
ｈ、　Ｊ）及びガロ・アール・シー（Ｇａｌｌｏ、　Ｒ
，Ｃ，）（１９８４年）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２４巻５０
６−５０８頁］の血清中のＨＴＬｖ−■タンパクに対す
る抗原は、これらの抗原に対する抗体を検出するための
免疫学を基盤とする試験の開発を可能にした。これらの
試験は、ウィルスに感染した人々の血液試料を調べるこ
とによって、輸血によるＨＴＬＶ−ｍの伝播を抑えるた
めに使用される。現在市販されている診断試験は、抗原
として不活性化ウィルスのタンパクを使用する。
診断への新しい手がかりとなるほか、朝換えＤＮＡは細
菌とウィルス双方に対するワクチンの開発にとって大き
な有望性をもっている［ウィルソン・ティー（Ｗｉｌｓ
ｏｎ、　Ｔ、）［１９８４年１　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏ３ｙ２巻２９−３９頁］０組換えワクチンを発現さ
せるのに最も広く使用される生物は、大腸菌（Ｅ、　ｃ
ｏｌｉ）、Ｓ。
セレビシェ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及び培養哺
乳類細胞であった。例えば９、手足０病［クライト・デ
イ−・ジー（Ｋｌｅｉｄ、　Ｄ、Ｇ、）、ヤンスラ・デ
４−（Ｙａｎｓｕｒａｔ［１，）、スモール・ビー（Ｓ
ｍａｌｌ、　Ｂ、）、ダウベンコφデイ−（Ｄｏｗｂｅ
ｎｋｏ、　Ｄ、）、ムーア・ディー−エム（Ｍｏｏｒｅ
、Ｄ、Ｍ、）、ブラプマン・エム争ジエイ（Ｂｒｕｂ−
ｍａｎ、　Ｍ、、１．）、マツカーチャー・ビーφデ４
−（Ｍｃ−にｅｒｃｈｅｒ＋　Ｐ、口、）、モーガン中
デイ−・オー（Ｍｏｒ−ｇａｎ　、口、０．）、ロバー
トソン・ビー・エッチ（Ｒｏｂｅｒｔ−ｓｏｎ、　Ｂ、
Ｈ，）、及びパックラッチ・エッチ・エル（Ｂｃｈｒａ
ｃｈ、Ｈ，Ｌ、）（１９８１年）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２１
４巻１１２５−１１２９頁）］及びマラリア［ヤング・
ジエイ・エフ（Ｙｏｕｎｇ。
Ｊ、Ｆ、）、ホックメイヤー・ダブリユウ・ティー（）
ｆｏｅｌｎ＋ｅｙｅｒ、讐、Ｔ、）、グロス・エム（Ｇ
ｒＯ８Ｓ＋　Ｍ、）、リプレイエバロウ・ダブリユウ（
Ｒｉｐｌｅｙ　Ｂａ１ｌｏｕ、讐、）、ワーフ・アール
・エイ（す１ｒｔｚ、　Ｒ，Ａ、）、トロスパー・ジエ
イ・エッチ（Ｔｒｏｓｐｅｒ、　Ｊ、Ｈ，）、ボードイ
ン・アール・エル（Ｂｅａｕｄｏｉｎ、　Ｒ，Ｌ、）、
ホリンゾールφエム・アール（Ｈｏｌｌｉｎｄａｌｅ、
　Ｍ、Ｒ，）、ミラー拳エル番エム（Ｍｉｌｌｅｒ、　
Ｌ、Ｍ、）、デイツプス・シーφ゛エル（Ｄｉｇｇｓ、
　Ｃ，Ｌ、）、及びローゼンバーグ・エム（Ｒｏｓａｎ
ｂｅｒｇ、　Ｍ、）（１９８５年）　５ｃｉｅｎｃｅ　
２２８巻９５８−９６２頁）に対するサブユニットワク
チンは、大腸菌で合成された。ｆｌｌ！の例は、酵母で
つくられるＢ型肝炎表面抗原［マカリーア・ダブリユウ
・ジエイ（ＭｃＡｌｅｅｒ、Ｗ、、１．）、バイナク・
イー・ビー（Ｂｕｙｎａｋ、　Ｅ。
Ｂ、）、メイゲッター・アールφゼット（Ｍａｉｇｅｔ
ｔｅｒ、Ｒ。
Ｚ、）、ワンブラー・デイ−・イー（ＬＪａｓ＋ｐｌｅ
ｒ、口、Ｅ、）、ミラー・ダブリュウφジエイ（旧１ｌ
ｅｒ、　Ｗ、Ｊ、）及びヒルマン拳エム・アール（Ｈｉ
ｌｌｅｍａｎ、　Ｍ、Ｒ，）（１９８４年）　Ｎａｔｕ
ｒｅ　３０７巻＋７８−１８０頁］、及び哺乳類細胞で
つくられるヘルペスワクチン［バーマン・ビー・ダブリ
ユウ（Ｂｅｒｗａｎ、　Ｐ、ν、）、グレゴリ−・ティ
ー（Ｇｒｅｇｏｒｙ＊　Ｔ、）、チェース・デイ−（ｃ
ｈａｓｅ、　Ｄ、）及びラスキー・エル・エイ（Ｌａｓ
ｋｙ、　Ｌ、Ａ、）（１９８４年）Ｓｃｌｅｎｃｅ　２
２７巻１４９０−１４９２頁］である。
［発明が解決すべき課題］ 現時点で、エイズワクチンを開発する差迫った必要性が
ある。そのようなワクチンは存在することが知られてい
ない。
［課題をＭ決する手段］ 本発明は新規な絹換えＨＴＬＶ−ＩＩＩタンパクとその
使用に間する。更に詳しくは、本発明はエイズの診断、
予防又は治療に使用できる新規な紹換えＨＴＬＶ−ｍエ
ンベロープタンパクに間する。これらの新規なタンパク
は標準手順を使用して細菌プラスミドにコードされ、適
当なホスト、例えば大ＩＩ菌を形質転換するのにこれを
使用できる。
発現ベクタープラスミドｐＲＥＶ２．２をプラスミドρ
８ＧＩから構築した。このプラスミドの構築を示す流れ
図を図面の第１図に示す。
プラスミドｐｏｌｏは本質的にＫｐｎ　１位置からｌｌ
ｔｇｌＩＩまでのＨＴＬＶ−ＤＩ　ｅｎｖ遺伝子をコー
ドしたＤＮＡ約１２７５塩基対を含有している。適当な
細菌ホスト、例えば大腸菌内のこのプラスミドは、Ｒ１
０で指定される９５　ｋＤの新規な組換えＨＴＬＶ−Ｉ
ＩＩ融合タンパクをつくるのに使用できる。融合タンパ
クＲ１０のアミノ酸配列を第８表に示す、このタンパク
をコードしたＤＮＡ配列を第８Ａ表に示す。タンパクＲ
１０の旧Ｖ部分のアミノ酸配列を第１２表に示す、タン
パクＲ１０のＩＩＩＶ部分をコードしたＤＮＡ配列を第
１２Ａ表に示す。
プラスミドｐＰＢＩは、本質的にＰｖｕ　ｎ位置からＢ
ｇｌ■位置までの１１　Ｔ　Ｌ　Ｖ・ｌ１ｌｅｎｖ遺伝
子をコードしたＤＮＡ約５４０塩基対を含む。適当なホ
スト、例えば大腸菌内のこのプラスミドを用いて、ＰＢ
ｌと指定される２６ｋＯの新規な紐換えＨＴＬＶ−Ｉ１
１融合タンパクをつくることができる。融合タンパクＦ
ＢＩのアミノ酸配列を第９表に示す。このタンパクをコ
ードしたＤＮＡ配列を第９Ａ表に示す、タンパクＰＢＩ
のＨＩＶ部分のアミノ酸配列を第１３表に示す。タンパ
クＰＢＩのＨＩＶ部分をコードしたＤＮＡ配列を第１３
Ａ表に示す。
プラスミドｐ５９０は本質的にＰｖｕ　ｎ位置から）ｆ
ｉｎｄ■位置までのＨＴＬＶ−ｍ　ｅｎｖ遺伝子をコー
ドしたＤＮＡ約１０５５塩基対を含んでいる。適当なホ
スト、例えば大腸菌内のこのプラスミドを用いて、５９
０と指定される８６　ｋＤの新規な絹換えＨＴＬＶ−Ｉ
ＩＩタンパクをつくることができる。融合タンパク５９
０のアミノ酸配列を第１Ｏ表に示す。このタンパクをコ
ードしたＤＮＡ配列を第１０Ａ表に示す、タンパク５９
０の１Ｖ部分のアミノ酸配列を第１４表に示す。タンパ
ク５９０のＨＩＶ部分をコードしたＤＮＡ配列を第１４
Ａ表に示す。
プラスミドｐＫＨＩは、本質的ににｐｎ１位置からＨｉ
ｎｄｍ位置までのＨＴＬＶ−ｍｅｎｖ遺伝子をコードし
た［ｌＮＡ約１８３０塩基対を含んでいる。適当なホス
ト、例えば大腸菌内のこのプラスミドを用いて、に旧と
指定される７０　ｋＤの新規な紐換えＨＴＬＶＩＩＩタ
ンパクをつくることができる。融合タンパクＫＨＩのア
ミノ酸配列を第１１表に示す、このタンパクをコードし
たＤＮＡ配列を第１１Ａに示す、タンパクに旧のＨＩＶ
部分のアミノ酸配列を第１５表に示す。タンパクに■１
の■１ｖ部分をコードしたＤＮＡ配列を第１５Ａ表に示
す。
大腸菌ホストＭＳ３７１内のプラスミドρＢＣＩは、合
衆国イリノイ州ビオリア、合衆国ｌＩＩ務省北部地域研
究所（ＮＲＲＬ）に寄託される。プラスミドはこの寄託
所の永久保存施設内にある。大腸菌ＭＳ３７１（ρＢＧ
＋）。
ＮＲＲＬ　Ｂ−１５９０４，は１９８４年１１月り日に
寄託された。大腸菌ＭＳ３７１．　ＮＲＲＬ　Ｂ−１５
１２９は現在、一般に゛入手できる。大腸菌５Ｇ２０２
５１．　ＮＲＲＬ　Ｂ−１５９１８，は１９８４年１２
月１２日に寄託された。ＮＲＲＬ　Ｂ−１５９０４とＮ
ＲＲＬ　Ｂ−１５９１８は、これらを明らかにした特許
の授与によって一般に人手できよう、　ＮＲＲＬに寄託
されたその他の培養基と寄託期日と番号は以下のとおり
である。
培養基　　　　受託番号　　　寄託明日大腸菌ＪＭＩ０
３　　　ＮＲＲＬ　Ｂ−１８０９１１９８６年７月３０
日（ρＲＥＶ２．２＞ 上の寄託物は、少なくとも３０年間ＮＲＲＬ受託施設に
保存され、これらを明らかにした特許の授与によって一
般に人手できよう、寄託物はまた、本出順の対応特許又
は子孫特許が出願される諸国の外国特許法の要求に応じ
て入手できる。しかし、寄託物が人手できるからといっ
て、政府措置によって授与される特許権を侵害してまで
本発明を実施する実施権を構成するものではないことを
了解すべきである。
本発明の新規なＨＴＬＶ−ＩＩＩタンパクは、サツカロ
ミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からの誘発可能なガラクトース・
プロモータを含有するプラスミドを使用して、この微生
物中で発現させることができる［ブロー・チ・グレイ・
アール（ＢｒＱａＣ１１＋　Ｊ、Ｒ−）、シー・ワイ（
Ｌｉ、　Ｙ、）、ウー壷エル・シー（νｕ、　Ｌ、Ｃ，
）、及びジャヤラム・エム（Ｊａｙａｒａｍ、Ｍ、）ｒ
遺伝子発現の実験操作Ｊ（１９８３年）８３頁、エム・
イノウニ編、アカデミツク・プレス社］。
これらのプラスミドはＹＥｐ５１及びＶＥρ５２［ブロ
ーチ・グレイ・アールら（１９８３年）］と呼ばれ、大
腸菌の複製開始点、β−ラクタマーゼ遺伝子、酵母Ｌａ
１２遺伝子、２μ１１複製開始点、及び２μ厘円形ＲＥ
Ｐ３位置を含んでいる０組換え遺伝子の発現は酵母ＧＡ
Ｌ１０遺伝子プロモータによって駆動される。
酵母プロモータは、ガラクトース及びアルコールデヒド
ロゲナーゼ［ベネッツエン・グレイ・エル（８ｅｎｎｅ
ｔｚｅｎ、　Ｊ、Ｌ、）、及びハル・ビー・デイ−（）
ｆａｌｌ、　Ｂ、Ｄ、）（１９８２年）Ｊ、　Ｂｉｏｌ
、　Ｃｈｅｎ＋、　２５７巻３６１８頁；アメシー・ジ
ー（Ａｍｍｅｒｅｒ、　Ｇ、）ｒ酵素学の方法」（Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）（１９８３
年）１０１巻＋９２頁］、ホスホグリセレート・キナー
ゼ［プリンク・アール（Ｄｅｒｙｎｃｋ、　Ｒ，）、ヒ
ッツェマン・アール・エイ（旧ｔｚｅｓａｎ＋　Ｒ，Ａ
、）、グレイ・ビーΦダブリユウ（Ｇｒａｙ、　Ｐ、ν
、）、ゲーデル・デイ−・ヴ４−　（Ｇｏｅ＋１−ｄｅ
ｌ、　Ｄ、Ｖ、）、「遺伝子発現の実験操作Ｊ（１９８
３年）２４７頁、エム・イノウニ編、アカデミツク・プ
レス社］、トリオース・フォスフェートφイソメラーゼ
［アルバー・ティー（Ａｌｂｅｒ、　Ｔ、）、及びカワ
サキφジー（１９８２年）Ｊ、Ｍｏ１ｅｃ、　ａｎｄ　
Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｇｅｎｅｔ、１巻４！９頁］、又はエ
ノラーゼ［イネス・エム・エイ（ｌｎｎｅｓ、Ｍ、Ａ、
）ら（１９８５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２６巻２１頁コ
などを使用できる。
本明細書で明らかにされた遺伝子は、シミアン細胞内で
発現できる。これらのタンパクをコードした遺伝子が、
オカヤマ及びバーブ［０ｋａｙａｓａ、　Ｈ。
ａｎｄ　Ｂｅｒｇ、　Ｐ、（１９８３年）Ｍｏｌｅｃ、
　ａｎｄ　Ｃｅ１１．　Ｒｉｏｔ、　３巻２８０頁】と
その参考文献に記述されたプラスミドの一つか、又はこ
れらのプラスミドで形質転換されたＣＯ５！１　＠にク
ローン化されると、ＨＴＬＶ−ｍタンパクの合成を免疫
的に検出できる。
その他の哺乳類細胞遺伝子の発現ｌタンパク生産系を使
用できる。他のこのような系の例にはワクシニアウィル
ス発現系［モス拳ビー（Ｍｏｓｓ、　Ｂ、）（１９８５
年）Ｉｗａ＋ｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ　６巻２４３
頁；チャクラパルティ・ニス（ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ
、　Ｓ、）、プレッチリング・ケイ（Ｂｒｅｃｈｌ　ｆ
ｎｇ＋に、）、及びモス争ビー（１９８５年）Ｍｏｌｅ
ｃ、　ａｎｄ　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　５巻３４０３
頁］及びねずみレトロウィルスから誘導されるベクター
類［マリガン中アール・シー（Ｍｕｌｌｉｎｇａｎ、　
Ｒ，Ｃ，）ｒ遺伝子発現の実験操作Ｊ（１９８３年）１
５５頁、エム会イノウニ編、アカデミツクブレス社］が
ある。
本発明のＨＴＬＶ−Ｉ１１タンパクはＢＯＣやＦＭＯＣ
［メリフィールド中アール・ビー（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌ
ｄ、　Ｒ，Ｂ、）（１９６３年）Ｊ、　Ａｍｅｒ、　Ｃ
ｈｅｗ、　Ｓｏｃ、　８５巻２１４９頁；チャン拳シー
（ｃｈａｎｇ、　Ｃ，）及びマイエンホーファーφジエ
イ（Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ、　Ｊ、）（１９７８年）Ｉ
ＩＩｔ、　　Ｊ、　ＰｅｐｔｉｄｅＰｒｏｔｅｉｎ　Ｒ
ｅｓ、　Ｉ＋巻２４６頁］のような固体相ペプチド合成
手法によって化学的に合成できる。
この技術で周知のように、タンパクのアミノ酸配列は、
ＤＮＡのヌクレオチド配列によって決定される。遺伝暗
号の重剰性のため、すなわちタンパクをつくるのに使用
されるアミノ酸のほとんどに対して一つ以上の暗号化ヌ
クレオチドトリブレット（コドン）を使用できるため、
一つの特定アミノ酸に対して異なるヌクレオチド配列が
コードできる。このため、遺伝暗号を次のように描くこ
とができる。
フェニルアラニン（Ｐｈｅ）　　　ＴＴにロイシン（Ｌ
ｅｕ）　　　　　　　　ＸＴＹイソロイシン（Ｉｌｅ）
　　　　　４７Ｍメチオニン（Ｎｅｔ）’　　　　　　
ＡＴＧバリン（Ｖａｌ）　　　　　　　　ＧＴＬセリン
（Ｓｅｒ）　　　　　　　　　ＱＲＳプロリン（Ｐｒｏ
）　　　　　　　　ＣＣＬスレオニン（Ｔｈｒ）　　　
　　　ＡＣＬアラニン（Ａｌａ）　　　　　　　ａｃｔ
。
チロシン（Ｔｙｒ）　　　　　　　ＴＡにヒスチジン（
Ｈｉｓ）　　　　　　ＣＡにグルタミン（Ｇｌｎ）　　
　　　　ＣＡＪアスパラギン（Ａｓｎ）　　　　　ＡＡ
にリジン（Ｌｙｓ）　　　　　　　　　ＡＡＪアスパラ
ギン酸（Ａｓｐ）　　　　ＧＡＫグルタミン酸（＋；　
ｌ　ｕ　）　　　　　ｌ−、Ａ　Ｊシスティン（ｃｙｓ
）　　　　　　ＴＧにトリプトファン（Ｔｒｐ）　　　
　ＴＧＧアルギニンＣＡｒｇ＞　　　　　　ＷＧＺグリ
シン（Ｇｌｙ）　　　　　　　　ＧＧＬ終結信号　　　
　　　　　　ＴＡＪ 終結信号　　　　　　　　　ＴＧＡ 解読法：各三文字のデオキシヌクレオチドの三つ組は、
左側に５゛末端、右側に３′末端をもつ伝令ＲＮＡのト
リヌクレオチドに対応する０本明細書に記載のＤＮＡは
すべて、ウラシルにはチミンを置き換えた、ｌｌＲＮＡ
の配列に対応する配列のＤＮＡ鎖のものである０文字は
デオキシヌクレオチド配列を形成するプリン又はピリミ
ジン塩基を示す。
Ａ：アデニン Ｇ＝ニブアニ ン＝シトシン Ｔ：チミン ＹがＡまたはＧの場合は、ｘ：Ｔ又はＣ６ＹがＣまたは
Ｔの場合は、Ｘ＝Ｃ。
ＸがＣの場合は、Ｖ＝Ａ、　Ｇ、　Ｃ又ハＴ。
×がＴの場合は、Ｙ＝Ａ又はＧ。
ＺがＡ又はＧの場合は、Ｖ＝Ｃ又はＡ。
２がＣ又はＴの場合は、ν＝Ｃ０ νがＣの場合は、Ｚ＝Ａ、　Ｇ、　Ｃ又はＴ。
ＶがＡの場合は、Ｚ＝Ａ又はＧ。
Ｊ＝Ａ又は６ に：Ｔ又はＣ Ｌ＝Ａ、　Ｔ、　Ｃ又はＧ。
？Ｉ＝Ａ、　　Ｃ又はＴ。
上記は、本発明のＨＴＬＶ−ｍタンパクの新規なアミノ
酸配列が、本明細書で明らかにされたもの以外のヌクレ
オチド配列によって調製できることを示す。これらのＨ
ＴＬＶ−ＩＩＩタンパク、又はＨＴＬＶ−ｒ［Ｉの抗原
活性又は免疫原活性又は治療活性をもつその断片、の新
規なアミノ酸配列をコードした機能的に同等なヌクレオ
チド配列を、既知合成手順によってつくることができる
。従って、本発明はこのような機能的に同等なヌクレオ
チド配列を包含する。
このように、本発明の範囲は本明細書に記述された特定
的なヌクレオチド配列のみならず、実質的に同じＨＴＬ
Ｖ−ｍ抗原活性又は免疫原活性又は治療活性をもつ分子
をコートしたすべての同等なヌクレオチド配列をも包含
している。
更に、本発明の範囲は明らかにされた特定的なアミノ酸
配列を含むだけでなく、特異的なＨＴＬＶ−■抗体類の
形成を誘発し、及び／又はこれらに結びつく相当な能力
をもつタンパク又はタンパク断片をコードした類似の配
列をも含める意図がある。
「同等」という用語は、通常の特許用語としての用法の
とおりであって、本質的に同じ種類のホスト中で、実質
的に同じＨＴＬＶ−ｍ抗原活性又は免疫原活性又は治療
活性をもった分子をつくることが本明細書で確認されて
いるヌクレオチド配列として実質的に役目を果たすよう
なヌクレオチド配列を指すのに用いられている。この定
義の範囲には、ＨＴＬＶ−０１の抗原活性又は免疫原活
性又は治療活性をもった二次断片も含まれる。
上で明らかにされたように、微生物的な方法によってＨ
ＴＬＶ−ｍタンパクをつくるために、本発明のＨＴＬＶ
−ＩＩＩの抗原活性又は免疫原活性又は治療活性をコー
ドしたヌクレオチド配列を使用することは、遺伝子工学
の当業者に周知である０発現ベクターへ配列を融合し、
真核生物（酵母又は嘩乳類纏１１ａ）か原核生物（線菌
細胞）のホストへの形質転換ないしトランスフェクショ
ンを行なわせるのは、他の周知のタンパク類、例えばイ
ンスリン、インターフェロン、ヒト成長ホルモン、ＩＬ
−１，ＩＬ・２等をつくるのに使用される標準手順であ
る０本発明に従って、微生物手段又は組織培養技術によ
ってＨＴＬＶ−ｍタンパクをつくるために、同様な手順
又はその明白な変法を使用できる。
本明細書で明らかにされたヌクレオチド配列は、この技
術て周知の手順により、′遺伝子機械”によってつくる
ことができる。これは、ヌクレオチド配列の開示のゆえ
に可能である。
開示された制限酵素は、ベテスダ研究所（メリーラント
州ゲイサーズバーグ）又はニューイングランド・バイオ
ラボ（マサチューセッツ州ビバリー）から購入できる。
酵素類は、供給者側から提供された指示に従って使用さ
れる。
プラスミドの調製とホスト生物の形質転換に使用される
種々の方法は、この技術において周知である。これらの
手順はすべて、マニアティス・ティー　（Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ、Ｔ、）、フ菖ノ・ソチ命イー・エフ（Ｆｒｉ−ｔ
ｓｃｈ、　Ｅ、Ｆ、）及びサムプル’７り争ジェイ（Ｓ
ａｓｂｒｏｏｋ。
Ｊ、）（１９８２年）１分子クローニング」（実験マニ
ュアル）コールドスプリングハーバ−研究所にューヨー
ク）に記述されている。このように、ＤＮＡを微生物細
胞から抽出し、制限酵素による消化を行ない、ＤＮＡ断
片を電気泳動にかけ、プラスミドをテーリングとアニー
リングにかけ、口ＨＡを挿入し、ＤＮＡを再結合させ、
細胞、例えば大腸菌細胞を形質転換し、プラスミドＤＮ
Ａを調製し、タンパクを電気泳動にかけ、ＤＮＡの配列
決定をするのは、当業者の技術範囲内にある。
本発明のＨＴＬＶ−ＩＩＩタンパクを使用する免疫化学
的検定は、種々の形態を取りうる。好ましいタイプは固
体相免疫検定である。このタイプの検定では、ＨＴＬＶ
−ｍタンパクは固体相に固定されて、抗原−免疫晴着剤
を形成する。免疫晴着剤は、試験しようとする試料と一
緒に培養される。適当な培養期間後、免疫晴着剤を試料
から分離し、標識つき抗（ヒ）　ＩｇＧ）抗体を使用し
て、免疫晴着剤に結合されたヒトの抗ＨＴＬＶ−ｍ抗体
を検出する。免疫晴着剤と結びついた標識の量を陽性・
陰性の対照群と比較すると、抗ＨＴＬＶ−ｍ抗体が存在
するか存在しないかについて評価ができる。
免疫晴着剤は、精１！　ＨＴＬＶ−１７Ｉタンパクを固
体相に吸着又は結合させることによってつくられる。
固体相は、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、デ
キストラン、又は池の材料のビーズなど、種々のものを
使用できる。他の適した固体相は、これらの材料からつ
くられるか、これらで被覆された管又はプレートを包含
する。
ＨＴＬＶ−ＩＩＩタンパクは、アミドやエステル結合経
由の共有結合のような技術や吸着によって、共有又は非
共有的に固体相へ結合できる。ＨのＨＴＬＶ−ＩＩＩタ
ンパクが固体相へ固定された後、固体相を動物タンパク
、例えば３ｚ魚ゼラチンで後被覆できる。これは免疫唆
着剤表面へのタンパクの非特異的吸着を減少させるよう
な封鎖タンパクを提供している。
次に免疫晴着剤を、抗ＨＴＬＶ−ｍ抗体について試験し
ようとする試料と一緒に培養する。血液検査では血漿又
は血清を使用する。血漿又は血清を正常な動物の血漿又
は血清で希釈する。希釈血漿又は血清は、抗（ヒ）　Ｉ
ｇＧ）抗体源である同じ動物種に由来している。好まし
い抗（ヒトＩｇＧ）抗体はヤギの抗（ヒ）ＩｇＧ）抗体
である。このように、好ましい態様では、希釈剤はヤギ
の血清又は血漿である。
培養条件、例えばｐＨと温度、また培養開閉は決定的な
ものではない。これらのパラメータは定常的な実験によ
って最適化できる。概して、培養はｐＨ７−８の緩衝液
中で約４５℃、１−２時間行なわれる。
培糞後、免疫晴着剤と試料を分離する０分離は、沈降又
は遠心分離のような慣用の分離技術によって実施できる
０次に干渉物質を排除するために、免疫晴着剤を洗って
試料を含まないようにすることができる。
免疫晴着剤に結合されたヒト抗体を検出するには、免疫
晴着剤を標識つき抗（ヒ）　ＩｇＧ）抗体（トレーサー
）と−緒に培養する。一般に、抗くヒ）ＩｇＧ）抗体源
として働く動物種の少ｊｌ（約Ｉりの血清又は血漿を含
有する標識つき抗（ヒ）ＩｇＧ）抗体溶液と一緒に免疫
晴着剤を培養する。抗（ヒ）　ＩｇＧ）抗体は任意の動
物源から得られる。しかし、ヤギの抗（ヒ）　ＩｇＧ）
抗体が好ましい。抗（ヒトＩｇＧ）抗体は、ヒトＩｇＧ
のＦｃ断片に対する抗体、例えばヤギの抗（ヒトＩｇＧ
）Ｆｃ抗体でありうる。
抗（ヒ）　ＩｇＧ）抗体又は抗（ヒ）　ＩｇＧ）Ｆｃを
、放射性材料、例えばヨウ素１２５で；蛍光材料のよう
な光学的標識で；又はワサビダイコンペルオキシダーゼ
のような酵素で標識をつけることができる。抗ヒト抗体
をバイオタイニレート化し、標識つきアビジンを用いて
免疫晴着剤へのその結合を検出することもてきる。
標識つき抗体と共に培養後、免疫晴着剤を溶液から分離
し、免疫晴着剤と結びついた標識を評価する。標識の選
択にもよるが、評価は種々の方法で行なうことができる
。標識が放射性ガンマ放出体である場合はガンマカウン
ターで、蛍光材料の場合は蛍光計で標識を検出できる。
酵素の場合には、標識検出は酵素用基質を使用して、比
色法で行なうことができる。
抗ＨＴＬＶ−ＩＩＩ抗体の存在を決定するためには、免
疫晴着剤に結びついた標識量を陽性及び陰性対照群と比
較する。対照群は、一般に試験試料と同時に処理される
。陽性対照は抗ＨＴＬＶ−ｍ抗体を含有する血清である
。陰性対照は、抗ＨＴＬＶ−ｍ抗体を含有しない健康な
人々からの血清である。
便宜上及び標準化のため、免疫検定実施用の試薬を検定
キットにまとめることができる。血液検査キットは、例
えば以下を包含する。
（ａ）免疫晴着剤、例えばＨＴＬＶ−ｍタンパクで被覆
されたポリスチレンビーズ； （ｂ）血清又は血漿試料用の希釈剤、例えば正　常なヤ
ギ血清又は血漿； （ｃ）抗（ヒ）　ＩｇＧ）抗体、例えば約ＩＸのヤギ血
清又は血漿を含有する緩衝水溶液中のヤギ抗（ヒトＩｇ
Ｇ）抗体； （ｄ）陽性対照、例えば新規なＨＴＬＶ−ＩＩＩタンパ
クの少なくとも一つに対する抗体を含有する血清；及び （ｅ）陰性対照、例えば新規なＨＴＬＶ−ＩＩＩタンパ
クの少なくとも一つに対する抗体を含有しない健康な人
からの保存血清。
標識が酵素の場合は、キットの追加分は酵素用基質であ
りうる。
もう一つのタイプの抗ＨＴＬＶ−Ｉ１７抗体検定は抗原
サンドイッチ検定である。この検定では、抗（ヒ）Ｉｇ
Ｇ）抗体の代わりに標識つきＨＴＬＶ−ＩＩＩタンパク
を使用して、免疫晴着剤に結合された抗ＨＴＬＶ−ＩＩ
Ｉ抗体を検出する。この検定は、原則として抗体分子の
二価性に基づいている。抗体の一つの結合位置が、固体
相に固定された抗原と結びつく、第二位置は標識つき抗
原を結合させるのに利用できる。
検定手順は免疫検定で述べたものと本質的に同じである
が、但し試料と一緒に培養後、免疫晴着剤を標識つきＨ
ＴＬＶ−ｍタンパク溶液と一緒に培養する。このタイプ
の検定のため、ＨＴＬＶ−ｍタンパクを放射性同位元素
、酵素等で標識をつけろことができる。
第三の形式では、抗原−抗体の相互作用に干渉せずに１
８６分子のＦｃ切片に結合する細菌タンパクのプロティ
ンＡを標識つきトレーサーとして使用して、免疫晴着剤
に吸着された抗ＨＴＬＶ−ｍ抗体を検出できる。プロテ
ィンＡに、放射性同位元素、酵素又は他の検出可能な種
で容易に標識をつけることができる。
ＨＴＬＶ−ｍタンパクを使用する免疫化学的検定は、丸
ごとのく又は破砕した）ウィルスを使用するものより幾
つかの利点をもっている。　ＨＴＬＶ−ｍタンパクに基
づく検定は、増殖する多量の感染性ウィルスや細胞培養
とウィルス生産に関連する固有の多様性に対する懸念を
軽減しよう。更に、検定は病院や診療所、血液銀行で試
験を行なう技能者がもつエイズら患の現実的ないしは感
覚的な恐れを緩和する助けになるであろう。
本明細書に明らかにされたＨＴＬＶ−ＩＩＩタンパクの
一つ以上、及び抗原性をもつその変異型を含めてなるワ
クチンは、この技術で周知の手順によってつくることが
できる。例えば、このようなワクチンを注射液、例えば
：α体溶液や懸濁液として調製できる。注射に先立って
液体中の溶液又は懸濁液とするための固体型もｙＩｉ％
１できる。任意に製剤を乳化することもできる。活性抗
原成分を、活性成分と相溶性のある薬学的に受は入れら
れる助剤と混合できる。適当な賦形剤の例は水、食塩水
、デキストロース、グリセロール、エタノール等、及び
それらの組合わせである。更に所望により、ワクチンは
少量の湿潤剤や乳化剤、ｐＨ緩衝剤のような補助的物質
やワクチンの有効性を強化する助剤を含有できる。ワク
チンを注射て、例えば皮下又は筋肉内に非経口投与する
のが好都合である。他の投与方式に適した追加の処方剤
は、座薬、またある場合には経口処方剤である。座薬用
の伝統的な結合剤と担体は、例えばポリアルキレングリ
コール又はトリグリセリド類を包含する。座薬は、約０
．５ｚないし約ｌＯχ、好ましくは約ｌχないし約２ｘ
の範囲の活性成分を含有する混合物から形成できる。経
口処方剤は、例えば製薬等級のマニトール、乳糖、澱粉
、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、
セルロース、炭酸マグネシウム等のような通常使用され
る助剤を包含できる。これらの組成物は溶液、懸１１液
、錠剤、丸薬、カプセル剤、持続放出処方剤、又は散剤
の形を取り、約１０工ないし約９５χ、好ましくは約２
５％ないし約７０χの活性成分を含有できる。
タンパクを中性型又は塩型としてワクチンに処方できる
。薬学的に受は入れられる塩類は、（ペプチドの遊離ア
ミノ基で形成される）酸付加塩類と、例えば塩酸や燐酸
のような無機酸、又は酢酸、修酸、酒石酸、マンデル酸
等のような有機酸によって形成されるものを包含する。
遊離カルボキシル基で生成する塩類は、例えば水酸化ナ
トリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は
第二鉄のような無機塩基から、及びイソプロピルアミン
、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒ
スチジン、プロ力イン等のような有機塩基からも誘導で
きる。
ワクチンは適量処方剤と両立できる形で、また治療上有
効で免疫原性であるような量で投与される。投与量は処
置を受ける被験者、抗体を合成する被験者の免疫系の能
力、及び望んでいる保護程度に左右される。投与される
活性成分の正確な必要量は実施者の判断に依存しており
、各個人に特有である。しかし、適した適量範囲は、−
人当たり活性成分数百マイクログラムのオーダである。
最初の投与に適した投薬量と追加投与量は可変であるが
、典型的には最初の投与に続いて１週間ないし２週間の
間隔で二度目以降の注射その他の投与を行なう。
ＨＴＬＶ−ｍは特にエンベロープ遺伝子内において、ア
ミノ酸配列の変動を受けることが知られている［スダー
シッチ・ビー命アール（Ｓｔａｒｃｉｃｌｌ、　Ｂ、Ｒ
，）（＋９８（３年）Ｃｅｌｌ　４５巻６３７−６４８
頁：バーン・ビー・エッチ（Ｈａｈｎ、　Ｂ、Ｈ，）（
１９８６年）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３２巻１５４８−１５
５３頁１ｅ　１００以上の変異型が分子クローン化及び
制限酵素認識分析によって分析され、またこれらの幾つ
かはヌクレオチド配列決定によって分析された。これら
の幾つかはＲＦ［ボボビック・エム（ＰＯ−ｐｏｖｉｃ
、Ｍ、）ら、（１９８４年）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２４巻
４９７−５００頁］、ＷＭＪ−１［バーン・ビー・エッ
チ（Ｈａｈｎ、　８．Ｈ，）ら（１９８６年）Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ　２３２巻＋５４８−１５５３頁］、ＬＡＶ　［
：ウエイン＝ホブソン・ニス（ｌＪａｉｎ−Ｈｏｂｓｏ
ｎ、Ｓ、）ら、（１９８５年）Ｃｅｌ１４０巻９−１７
頁］及びＡＲＶ−２［サンチェス：ペス力ドル・アール
（５ａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒ、　Ｒ，）ら、（
１９８５年）　５ｃｉｅｎｃｅ　２２７巻４８４−４９
２頁］として知られるＩＩ　のＨＴＬＶ−ＩＩＩ分離体
である０本発明は一つのＨＴＬＶ−Ｉ１１分離体からの
配列について記述しているが、Ｒ１０ｌＦＢＩ、５９０
及びＫＨＩのＳｌ！ＩＩ！のため本明細書に記述された
手順を使用して、任意のＨＴＬＶ−ｍ分離体の適当なエ
ンベロープ領域をつくることができる。異なるウィルス
分離体からのＨＴＬＶ−ＩＩＩタンパクを、上で明らか
にされたようにワクチン製剤に使用して、異なるＨＴＬ
Ｖ−ｍ分離体による感染を防ぐことができる。更に、一
つ以上のＨＴＬＶ−ｍ分離体からの一つの＆ｔ１１０え
抗原タンパクを用いてワクチン製剤をつくると、エイズ
に対する免疫が提供され、いっそうすぐれた予防となる
。
［実施例］ 以下は、最善のａ様を含めた本発明方法を例示する実施
例である。これらの実施例は限定的に考えられてはなら
ない、池に注意がなければ、溶媒混合物の割合はすべて
容量による。
実施例１　プラスミドｐＲＥＶ２．２の構築ρＲＥＶ２
．２プラスミド発現ベクターをプラスミドｐＢＧＩから
構築した。プラスミドｐＢＧ＋は、周知の手順、例えば
透明溶菌物／等密度勾配法等を用いて、大腸菌ホストか
ら単離できる。　ｐＢＧＩのように、ｐＲＥＶ２．２は
大１４Ｍプロモーターのうしろの挿入遺伝子を発現させ
る。ｐｅＧｔとｐＲＥＶ２．２との差は、次のとおりで
ある。２ ！、　　ｐＲＥＶ２．２はプラスミド（ｒｏｐ）タンパ
クの機能的複製を欠いている。
２、　　ｐＲＥＶ２．２はＡａｔ■位置へ挿入されたｔ
ｒｐＡ転写ターミネータ−をもっている。この配列は過
剰発現された遺伝子の転写終結を確実にする。
３、　　ｐＲＥＶ２．２は、アンピシリンとクロラムフ
ェニコールに対する耐性を提供する遺伝子をもつが、ｐ
ＢＧ　＋はアンピシリンのみの耐性を提供する。
４、　　ｐＲＥＶ２．２は幾つかの制限酵素の位置をコ
ードした配列を含んでいる。
図面の第１図に示す以下の手順を使用して、上に列挙さ
れた四つの相違の各々を生じさせた。
Ｉａ、　　プラスミドｐＢＧ１（５ｕ　ｇ）をＮｄｅ　
Ｉで制限すると、約２１６０及び３４４０塩基対の２断
片を生じた。
Ｈ＋、　　Ｎｄｅ　Ｉの不活性化後、消化混合物からの
０ＮＡＯ，Ｉａｇを、分子内再結合に好ましい条件下に
７４ＤＮＡリガーゼで処理したく標準的Ｔ４リガーゼ反
応条件を使用し、反応容量２００７１１）［ニューイン
グランド番バイオラブ、マサチューセッツ州ビバリーコ
。
３４４０塩基対の断片の分子内再結合はアンピシリン耐
性プラスミドをもたらした。再結合混合物を受容菌株の
大腸菌Ｊ旧０３にューイングランド・バイオラブから人
手）へ形質転換し、アンピシリン耐性クローンを標準手
順によって選択した。
Ｉｃ、　　ｐＢＧＩから２１６０塩基対のＮｄｅ　ｌ断
片を削除した場合の生成物プラスミド９８ＧｌΔＮは、
アンピシリン耐性クローンからプラスミドをつくり、Ｎ
ｄｅＩ及び５ａｉｌでの制限消化パターンを決定するこ
とによって選択された（生成物断片は約１７９０と１０
５０）、この削除で、プラスミドの複製を制御する「０
ρ遺伝子が不活性化される。
２ａ、　　次にｐＢＧＩΔＮ（５μｇ）をＥｃｏＲＩと
Ｂｅ１ｌで消化させ、約２４５５塩基対の大きい方の断
片を単離した。２ｂ、第１表に示す構造の二本鎖合成断
片をイタクラら［イタクラ・ケイ（Ｉｔａｋｕｒａ、に
、）、ロッジ・ジエイΦジエイ（Ｒｏｓｓｉ＋　ｊ、Ｊ
、）及びウオーレス・アール中ビー（％／ａｌｌａｃｅ
、　Ｒ，Ｂ、）（１９８４年）Ａｎｎ。
Ｒｅｖ、８ｉｏｃｈｅｍ、　５３巻３２３−３５６頁、
及びその中の参考文献］の手順によってつくった。この
断片はＢｃｌｌとＥｃｏＲＩの粘着末端をもち、幾つか
の制限酵素に対する認識配列を含んでいる。
２ｃ、　　２４５５塩基対のＥｃｏＲＩ　−ｅｅｌ　ｌ
断片０．１ｕｇと合成断片０．０１ｔｔｇをＴ４　ＤＮ
Ａリガーゼで合体させ、菌株、１旧０３のコンピテント
細胞を形質転換させた。
合成断片がｐＢＧｌΔＮのＢｃｌｌとＥｃｏＲ１位置の
間に挿入されている絹換えプラスミドを受入れた細胞は
、）１ｐａｌ及びＥｃｏＲＩでプラスミドを消化させる
ことによって選択された０診断断片の大きさは約２３５
５及び２００塩基対である。このプラスミドはｐＲＥＶ
Ｉと呼ばれる。
２ｄ、　　ｐＲＥＶｌ（５μｇ）をＡａｔＩＩで消化さ
せると、特異な開裂をする。
２ｅ、　　第２表に示す二本鎖断片を合成した。この断
片はＡａｔ■の粘着末端をもち、ｔｒｐＡ転写終結配列
を含んでいる。
２ｆ、　　Ａａｔｎで消化させたｐＲＥＶｌ（０，１ｕ
　ｇ＞は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、２０μｍの容
量中で合成断片０．０１ｕｇと再結合させた。
２訃　コンピテントにされた菌株Ｊ旧０３の細胞を形質
転換し、アンピシリン耐性クローンを選択した。
２ｈ、　　選択されたコロニーから単離されたプラスミ
ドのにｐＩＩＩとＥｃｏＲＩによる二重制限消化物を用
いて、正しい構造を含む細胞を単離した。にｐｎＩとＥ
ｃｏＲＩで生じた断片の大きさは約２４７５と８０塩基
対である。このプラスミドはｐＲＥＶ１７Ｔと呼ばれ、
ｔ「ρＡ転写ターミネーターを含んでいる。
３ａ、　　上記のとおり（標準的な方法で）調製される
ｐＲＥＶ１７Ｔ（５μｇ）をＮｄｅ　Ｉ及びＸ＋ｓｎ　
Ｉで開裂し、約８５０塩基対の断片を単離した。
３ｂ、　　クロラムフェニコール並びにアンピシリンと
テトラサイクリンに対する耐性を与える遺伝子を含有す
るプラスミドｐＢＲ３２５（ＢＲＬ、メリーランド州ゲ
イサーズバーグ）５μｇをｅｅｌ　Ｉで開裂し、末端を
クレノフボリメラーゼ及びデオキシヌクレオチドでプラ
ントにした。酵素を不活性化してから、混合物をＮｄｅ
　Ｉで処理し、約３１８５塩基対の断片を単離した。こ
の断片はクロラムフェニコール及びアンピシリン耐性の
遺伝子と＊ａの開始点を含んでいる。
３ｃ、　　ｐＲＥＶ１７ＴからのＮｄｅ　Ｉ　−Ｘｎ＋
ｎ　Ｔ断片０．１ａｇとｐＢＲ３２５からのＮｄｅ　Ｉ
　−Ｂｃｌ　Ｉ断片とを７４ＤＮＡリガーゼにより２０
μｊ中で再結合し、混合物を菌株ＪＭＩ０３のコンピテ
ント細胞の形質転換に使用した。アンピシリンとクロラ
ムフェニコール双方に耐性のあう細胞を選択した。
３ｄ、　　選択されたクローンからのプラスミドをＥｃ
ｏＲＩ及びＮｄｅ　Ｉで二重消化させ、この消化物を使
用して約２４８０．１１４５及び４１０塩基対の断片規
模を生ずるプラスミドを選択した。これはプラスミドｐ
ＲＥＶ１７Ｔ／ｃ旧と呼ばれ、アンピシリン及びクロラ
ムフェニコール双方に耐性のある遺伝子をもっている。
４ａ、　　第３表に示す二本鎖断片を合成した。この断
片はプラント末端とＳｓｔ　Ｉ粘着末端をもち、場つか
の制限酵素位置に対する認識配列を含んでいる。
４ｈ、　　ｐＲＥＶ１７Ｔ／ｃｈｉ（５１１ｇ）をＮｒ
ｕ　Ｉ　（Ｂｃｌ　１位置から約２０ヌクレオチドを開
裂する）及び５Ｓｔｌ（複数クローン化位置内で開裂す
る）によって開裂した。
大きい方の約３９９０塩基対をアガロースゲルから単離
した。
４ｃ、　　ｐＲＥＶ１７Ｔ／ｃｈｌからのＮｒｕ　Ｉ　
−５ｓｔ　Ｉ断片０．１ａｇと合成断片０．０１７１ｇ
を２０μｍの容量中で７４［ＩＮＡＮカリゼによって処
理した。
４ｄ、　　この混合物を菌株ＪＭ１０３に形質転換し、
アンピシリン耐性クローンを選択した。
４ｅ、　　プラスミドを幾つかのクローンから精製し、
旧ｕｌ又はＣ１ａ　Ｉで消化させて選定した。新しい複
数クローン化位置をもつ組換えクローンは、これらの酵
素のどちらで消化させても、いずれもプラスミドを１回
だけ開裂するため、一つの断片を与える。
４ｆ、　　複数クローン化位置の配列を検証した。
これを行なうには、プラスミドをＨｐａｌとＰｖｕ■で
制限し、１３９５塩基対の断片を単離し、これをｍｐ１
８のＳｅａ　１位置へクローン化し、標準方法を使用す
るジデオキシヌクレオチド・シーフェンシングによって
その配列を決定する。
４ｇ、　　ｐＲＥＶ２．２と呼ばれるこのプラスミドは
、図面の第２図に図示されている。
実施例２　ρＲ１０の構築とその発現 プラスミドｐＲ＋ｏは、本質的ににｐｎ１位置からＢｇ
ｌ■位置までのＨＴＬＶ−ＩＩＩ　ｅｎｖ遺伝子をコー
ドしたＤＮＡ約１２７５塩基対を含有しており、これか
らｇｐ１２０エンベロープタンパクのこの部分を含んだ
約９５　ｋＤの融合タンパクが合成される。このプラス
ミドを以下のように構築できる。
１、第４表に示す配列をもつＤＮＡを合成する。このＤ
ＮＡ断片は標準的な方法［前掲イタクラら、及びその中
の参考文献］で合成でき、ｇｐ１２０の一部をコードし
ている。これは５′にプラント末端をもち、３′末端に
ＢａｍＨＩ張り出し部分と再結合する末端をもっている
。
２、プラスミドｐ８Ｇ１５ｕｇをＢｃｌｌで制限し、ク
レノフボリメラーゼとデオキシリボヌクレオチド三燐酸
（ａＮｒＰｓ）で張り出し末端を満たし、この断片をＢ
ａａ＋ＨＩで制限し、約８．９ｋｂの大きい断片を７ガ
ロースゲルから単離する。
３、　　Ｔ４ＯＮＡリガーゼを用いて、第４表の断片０
．１ａｇを２０７ｚｌ容量中で１）ＢＩＪＩ断片０．１
μｓと再結合させ、再結合混合物をコンピテント細胞菌
株５Ｇ２０２５１　［ゴッテスマン争ニス（Ｇｏｔｔｅ
ｓ＋＋＋ａｎ、　Ｓ、）、ハルバーン中イー（Ｈａｌｐ
ｅｒｎ、Ｅ、）及びトリスラー・ビー（Ｔｒｉｓ−１ｅ
ｒ、　Ｐ、）（１９８１年）Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ１４８巻２［１７−２７３頁］
へ形質転換し、アンピシリン耐性形質転換体を選択する
。
４、精製プラスミドのＡ　ｈ　ａ　ｍ制限パターンを使
用して、合成断片をもつ絹喚えプラスミドが受入れられ
た細胞を選択するが、この合成断片は断片のプラント末
端がｐＢＧ１断片の補充されたＢｃｌｌ末端に再結合さ
れ、ＢａｍＨＩ張り出し末端とうしが−緒に再結合され
るような方向にある。適当なプラスミドをＡｈａｍで消
化させると、約５３００．３１７０．６９０．６４０．
３３０、及び２０塩基対の断片長さが得られる。
５、この組換えプラスミドを受入れた菌株を、５０μｓ
／ｍｌのアンピシリンを含有する２ｘ培地［２に酵母エ
キス、バクトドリブトン、カサミノ＃（デイフコ製、ミ
シガン州デトロイト）、０．２ｚ−塩基カリウム、０．
２ｚ二塩基カリウム、及び０．２χ二塩基ナトリウム］
中で生育させ、細胞タンパクの全量を５Ｏ５−ポリアク
リルアミドゲル１で電気泳動にかけると、約９５（ｏの
有力タンパクをクマシーブルー染色により、又はエイズ
、ＡＲＣ叉はＨＴＬＶ−ＩＩＩに感染した人から選択さ
れた血清をプローブとして使用するウェスタン・プロッ
ト分析によって視覚化できる。
実施例３　プラスミドｐＲＩｏからのＨＴ　Ｌ　Ｖ・■
エンベロープ配列を含有する絹換えタンパクの ｖ４襞 １、細胞の生育 チエマツプ発酵装置（チエマツプ社、ニューヨーク州ウ
ッドベリ）中で２ｚ培地中の細胞をｌθリットル容量で
生育させた。発酵温度３７℃、ｐＨ６，８、及び空篤を
ｔ　ｖｖ＋ｉで供給した。プラスミド選択は、５０μｇ
／ａ＋ｌアンピシリンで提供された。典型的な細胞数ｆ
Ｘ（湿潤重量）は３０　ｇ／ｌであった。
２、　！Ｉ胞溶菌 ！換えＨＴＬＶ−ＩＩＩ工ンベロープ融合タンパクを含
有する大ｉＩ菌５０ｇ（湿潤！ｌ＃！重量）を、５０樗
門トリス−ＩＩｃＩ（ｐＨ８，０）、５懺Ｎエチレンジ
アミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、５＋ａＭジチオスレイ
トール（Ｄ丁Ｔ）、１５ｍＭのβ−メ）レカブトエタノ
ール、０．５ＸＴＲＩ丁ＯＮ”　Ｘ−１００、及び５ｍ
Ｍフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）中の最
終室ｆｉ１１００ｍｌ中に懸濁させた。リゾチーム３０
０　ｍｇを加え、！Ｌ！濁液を室温で３０分培養した。
この材料は同量の０．１−０．Ｉ５７ｔｍガラスピーズ
を含有するＢＥＡＤ−ＢＥＡＴＥＲ”（バイオスペック
・プロダクツ社、オクラホマ州パードルビル）を使用し
て溶菌化された。室温で、１分間隔で６分間、溶菌を行
なった。液体をビーズから分離し、２０．０００ｘｇで
２．５時間遠心分離した。上澄み液を除去し、ペレット
を８Ｍ尿素、２０ｍＭ　）リス−ＩＣ＋（＋）１８．０
）、５ｓＭ　ＤＴｒ。
１５ｍＭβ−メルカプトエタノール、５ｍＭ　ＰＭＳＦ
及び１１ＥＤＴＡからなる！００１に溶解した。ポリト
ロン・ホモジナイザー（ベックマン社、カリフォルニア
州バークレー）を使用してベレットを溶解化し、２０゜
０００ｘ８で２時間遠心分離した。
３、ジエチルアミノエチル（０εＡＥ）クロマトグラフ
ィ ロＥＡＥ　Ｆａｓｔ　Ｆ　ｌｏｗ　５ＥＰＨＡＲＩ）Ｓ
Ｅ”　（ファーマシ７社、ニューシャーシー州ビス力タ
ウエー）を充填し、８阿尿素、２０ＩＩＩＭトリスーＨ
ＣＩ（ｐＨ８，、Ｏ）、１５ｍＭβ−メルカプトエタノ
ール、及び１ｍＭにＥＤＴＡで平衡化した５５０１カラ
ム（５ｃｍ　ｘ　２Ｂ　ｃｍ）に上澄み液を室温で装填
した。カラムを１．５１．Ｊットル平衡化緩衝ｉ＆で洗
い、タンパクを平衡緩衝液中で０・０．８Ｍ　ＮａＣｌ
の５．０リツトル線形勾配で溶離した。　ＨＴＬＶ−Ｉ
ｆｆタンパクは、０゜２Ｍ　ＮａＣｌでｉＷ離され、５
Ｏ５−ポリアクリルアミド電気泳動を使用し、約９５ｋ
Ｏの有力タンパクを追跡して検定された。
ＨＴＬＶ・■タンパクを含有するフラクションを一緒に
し、分子量１０，０００カツトオフ膜（ＹＭ−１０、ア
ミコン社）を取り付けた応力化細胞正圧濃縮器（アミコ
ン社、マサチューセッツ州ダンバース）を使用して、タ
ンパクを１０　ｗ＋ｌに濃縮した。スーパーファインセ
ファクリルＳ−３００（ファーマシ７社）を充填し、８
Ｍ尿素、２０ＩＩＭトリスーＨＣＩ（ｐＨ８，０）、＋
５ａ＋Ｍβ−メルカプトエタノール、及びＩｍＭ　ＥＤ
ＴＡで平衡化した５５０１カラム（２，５ｃ＋＋＋　ｘ
　１００　ｃｍ）に、濃縮液を装填した。カラムを室温
で平衡化＆ｌｌ液液溶離した。毎分０．５１の流量を維
持した。ＨＴＬＶ−Ｉ’ｌｌタンパクはカラム容量の約
４０１ｔ’ｉｌ離した。
実施例４　プラスミドｐＰＢＩｚ＋ｅの構築と発現プラ
スミドｐＰＢ＋は、Ｐｖｕ　１７位置からｅｇ＋ｎ位置
までのＨＴＬＶ−ｍ　ｅｎｖ遺伝子を本質的にコードし
たＤＮＡ約５４０塩基対を含有しており、ｇρ１２０エ
ンベロープタンパクのこの部分を含有する約２６　ｋＤ
の融合タンパクがこれから合成される。このプラスミド
を次のように構築できる。
１、第１５表に示す配列のＤＮＡを合成する。この口Ｈ
Ａ断片は標準方法で合成でき、ｇｐ１２０の一部をコー
ドしている。これは５′末端にプラント末端をもち、３
′末端にＢａ＋ｇＨＩ張り出し部分と再結合する末端を
もっている。
２、　プラスミドｐＲＥＶ２．２（５１１ｇ）をＥ！ｌ
：ＯＲＶとＢａｍＨＩで制限し、約４に口の大きな断片
をアガロースゲルから単離する。
３、Ｔ４０ＮＡリガーゼを用いて、第１５表の断片０．
１μｇを２０μｍの容量でρＲＥＶ２．２断片０．１μ
ｇと再結合させ、再結合混合物をコンピテント細胞菌株
５６２０２５１へ形質転換し、アンピシリン耐性形質転
換体を選択する。
４、精製プラスミドのＡｈａＩＩＩ制限パターンを使用
して、合成断片をもつ絹換えプラスミドが受入れられた
細胞を選択するが、この合成断片は断片のプラント末端
がｐＲＥＶ２．２のＥｃｏＲＶ末端に再結合され、Ｂａ
ｍＨＩ張り出し末端とうしが一緒に再結合されるような
方向にある。適当なプラスミドをＡｈａ■で消化させる
と約１２１０．１０２０．７５０．６９０．５００．３
４０及び２０塩基対の断片長さが得られる。この組換え
プラスミドを受入れた菌株を、５０μｇ／ｍｌのアンピ
シリンを含有する２ｚ培地中で生育させ、細胞タンパク
の全量を５Ｏ５−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動
にかけると、約２６ｋＯのタンパクをクマシーブルー染
色により、又はエイズ、ＡＲＣ又はＨＴＬＶ−ＩＩＩに
感染した人から選択された血清をプローブとして使用す
るウェスタン・プロット分析によって視覚化できる。
実施例５　プラスミドｐＰＢＩ　＋□８からのＨＴＬＶ
−ｍエンベロープ配列を含有する絹換えタンパ クの精製 ｌ、細胞生育 チエマツプ発酵装置中で２ｘ培地中の細胞を１０リツト
ル容量で生育させた０発酵塩度３７℃、ｐＨ６，８、及
び空気をｌ　ＶＶｌｌで供給した。プラスミド選択は、
５０μ８／１アンピシリンと２０μｇ／ｍｌクロラムフ
ェニコールで提供された。典型的な細胞収率（？ｉ潤重
重量は３０３ｚ＋であった。
２、細胞溶菌 組換えＨＴＬＶ−ＩＩＩエンベロープ融合タンパクを含
有する大腸菌５０ｇ（湿潤細胞重量）を、５０＋ｗＭ　
）リス−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）、５ａ＋Ｍエチレンジア
ミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、５ｍＭジチオスレイトー
ル（ＤＴＴ）、１５ｗＭβメルカプトエタノール、０．
５ＸＴＲ１７ＯＮ”　Ｘ−１００、及び５Ｉｌｌｌｌフ
ツ化フエニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）からなる液
の最終容量１００１中に再懸濁させた。リゾチーム３０
０　ｍｇを加え、懸濁液を室温で３０分培養した。
この材料は同量の０．１−０．１５μ剛ガラスピーズを
含有するＢＥＡＤ−ＨＥＡＴＥＲＴ″（バイオスペック
・プロダクツ社、オクラホマ州パードルスピル）を使用
して’１１Ｍ化された。室温で、１分間隔で６分間、溶
菌を行なった。液体をビーズから分離し、２０．ＯＯＯ
ｘｇて２．５時間遠心分離した。上澄み液を除去し、ペ
レットを６ｈグアニジン塩酸塩、２０５Ｍ　）リス−Ｍ
ＣＩ（ｐＨ８，０）、５ｓＭ　ＤＴＴ、　１５ｍＭβ−
メルカプトエタノール５ｓ＋Ｍ　ＰＭＳＦ及びｌ−Ｍ　
ＥＤＴＡ（１００　ｍｌ）に溶解した．ポリトロンホモ
ジナイザーを使用してペレットを溶解化し、２０．ＯＯ
Ｏｘｇで２時間遠心分離した。
上澄み液（９０　ｍｌ）を８Ｍ尿素、２０　ｍＭ燐酸カ
リウム（ｐＨ　７．０）、Ｉ　ｎ＋Ｍ　ＥＤＴＡ、及び
１５渭Ｎβ・メルカプトエタノール（４リツトル）に対
して透析した。透析は、緩衝液を３回代えて、１回ごと
に８時間以上行なった．分子量３．５　ｋｎのカットオ
フをもつスペクトラファー透析管（Ｓ／Ｐ社、イリノイ
州マグローヒル）を使用した。
３、　　ＣＭりａマドグラフィ ＣＭファスト　フロー　セファ０ース（Ｆａｓｔ　Ｆｌ
ｏｗＳＥＰＨＡＲＯＳＥゝ）（）７−マシア社）を充填
し、８Ｍ尿素、ｔｏ　ｎ＋Ｍ燐酸カリウム（ｐＨ　７．
０）、１５ｍＭβ−メルカプトエタノール、及びｌａ＋
Ｍ　ＥＤＴＡテ平衡化した５５ｏＩＩ１１カラム（５ｃ
■ｘ　２８　ｃｍ）に透析物を室温で装填した。
カラムを２リツトル平衡化緩衝液で洗い、ダンバクを０
−０．４Ｍ　ＮａＣｌの５．０リツトル線形勾配で溶離
した，　ＨＴＬＶ−ｍタンパク（２６　ｋＤ）は、Ｓ口
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で検定されると、
約０．２Ｍ　ＮａＣ１で溶離された。
実施例６　プラスミドｐ５９０の構築と発現プラスミド
ｐ５９０は、Ｐｖｕ■位置からＨｉｎｄｍｉ置までのＨ
ＴＬＶ−ＩＩＩｅｎｖ遺伝子を本質的にコードしたＤＮ
Ａ約１０５５塩基対を含有しており、ｇｐ１６０エンベ
ローブタンバクのこの部分を含有する約８６　ｋＤの融
合タンパクがこれから合成される。このプラスミドを次
のように構築できる。
１、　第６表に示す配列のＤＮＡを合成する。このＤＮ
Ａ断片は標準方法で合成でき、ｇｐｔ６ｏの一部をコー
ドしている。これは５°末端にプラント末端をもち、３
゛末端にＨｉｎｄｌｌ張り出し部分と再結合する末端を
もっている。
２、　プラスミドｐＲＥＶ２．２（５μｇ）をＥｃｏＲ
ＶとＨｉ　ｎｄ　ｍて制限し、約４　ｋＤの大きな断片
を７ガロースゲルから単離する。
３、　７４［ＩＮＡリガーゼを用いて、第６表の断片０
．１μｇヲ２０１）容量テｐＲＥＶ２．２断片０．１μ
ｇと再結合させ、再結合混合物をコンピテント細胞菌株
５Ｇ２０２５１へ形質転換し、アンピシリン耐性形質転
換体を選択する。
４、精製プラスミドのＡｈａｍ制限パターンを使用して
、合成断片をもつ絹換えプラスミドが受入れられた細胞
を選択するが、この合成断片は断片のプラント末端がｐ
ＲＥＶ２．２のＥｃｏＲＶ末端に再結合され、Ｈｉｎｄ
ｍ張り出し末端とうしが一緒に再結合されるような方向
にある。適当なプラスミドをＡｈａｍで消化させると約
１７４０、ｌ０２０．７５０．６９０．５００．３４０
及び２０塩基対の断片長さが得られる。
５、　この菌株から精製されたプラスミド５μｇをＮｄ
ｅ　Ｉ及びＳ＋ｗａ　Ｉで制限する。約１４２５塩基対
の断片をアガロースゲルから単離する。　ｇｌ）＋６０
の切片をコードしたＤＮＡに１５０５塩基対の断片を融
合する。
６、プラスミドｐ８ＧＩ０１１ｔｅａＩｌｌ　ｒで制限
し、クレノフボリメラーゼとｄＮＴＰｓで張り出し末端
を補充してから、この断片をＮｄｅ　Ｔで制限する。約
６．５に口の断片が７ガロースゲルからｍｌ離される。
７、　　Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、Ｎｄｅ　Ｉ　−
５ｅａ　Ｉの断片０．１μｓをｐＢＧ１断片０．１μｇ
と再結合させ、再結合混合物をコンピテント細胞菌株５
Ｇ２０２５＋へ形質転換し、アンピシリン耐性形質転換
体を選択する。
８、精製プラスミドのＡｈａｍ制限パターンを使用して
、合成断片をもつ組換えプラスミドが受入れられた細胞
を選択するが、この合成断片は断片の５ｌｌａ　Ｉプラ
ント末端が補充されたＢａ５ｉｎ　Ｉ末端に再結合され
、Ｎｄｅ　Ｉ張り出し末端どうしが一緒に再結合される
ような方向にある。適当なプラスミドをＡｈａｍで消化
させると、約５９００．１０２０．６９０．４３０、及
び２０塩基対の断片長さが得られる。
９、　この組換えプラスミドを受入れた菌株を、５ｅａ
ｇ／１ｍ　ｌのアンピシリンを含有する２ｘ培地中で生
育させ、細胞タンパクの全量を５Ｏ５−ポリアクリルア
ミドゲル上で電気泳動にかけると、約８６　ｋＤのタン
パクをクマシーブルー染色により、又はエイズ、ＡＲＣ
又はＨＴＬＶ−ＩＩＩに感染した人から選択された血清
をプローブとして使用するウェスタン・プロット分析に
よって視覚化できる。
実施例７　プラスミドｐ５９０からのＨＴＬＶ−ＩＩＩ
エンベロープ配列を含有する組換えタンパクの 精製 １、細胞の生育 チエマツプ発酵装置中で２ｘ培地中の細胞をｌＯリット
ル容量で生育させた。発酵温度３７℃、ｐＨ６，８、及
び空気をＩ　ｖｖ＋ｗで供給した。プラスミド選択は、
５ｅａｇ／ｌａ　Ｉアンピシリンで提供された。典型的
な細胞収率（湿潤重量）は３０　ｇ／ｌであった。
２、細胞溶菌 組換えＨＴＬＶ−ＩＩＩエンベロープ融合タンパクを含
有する大ｌｉ菌５０ｇ（湿潤細胞重量）を、５０ｍＭ　
）リス−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）、５ｓ＋Ｍ　ＥＤＴＡ、
　５ｍＭ　ＤＴＴ、　　１５ｍＭ　　β−メルカプトエ
タノール、０．５！ＴＲ１７ＯＮ”　Ｘ−１００、及び
５１ＰＭＳＦからなる液の最終容量１００■ｌ中に再懸
濁させた。リゾチーム３００　Ｂを加え、懸ｉｌＩ液を
室温で３０分培養した。
この材料は同量の０．１−０．１５ａ＋ｓガラスピーズ
を含有するＢＥＡＤ−ＨＥＡＴＥＲＴＭを使用して溶菌
化された。
室温で、１分間隔で６分間、溶菌を行なった。液体をビ
ーズから分離し、２０，０００ｘｇで２．５時間遠心分
離した。１漫み液を除去し、ペレットを６Ｍグアニジン
塩酸塩、２０■阿トリス−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）、５ａ
＋Ｍ口ＴＴ、１５ｍＭβ−メルカプトエタノール、５ｓ
Ｍ　ＰＭＳＦ及びＩＩＩＭεＤＴＡ（１００ｍｌ）に再
懸濁した。ポリトロンホモジナイザーを使用してペレッ
トを溶解化し、２０．ＯＯＯｘｇで２時間遠心分離した
。
上澄み液（９０ｍｌ）を８Ｍ尿素、２０ｍＭ）リス−Ｈ
ＣＩ（ｐ８８．０）、ｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡ、及び１５　
ｍＭβ−メルカプトエタノール（４リツトル）に対して
透析した。透析は、緩衝液を３回代えて、１回ごとに８
時閉以上行なった。
３、ジエチルアミノエチル（１）ＥＡＥ）クロマトグラ
フィ ＤＥＡＥファストフロー（Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ）セファ
ロース（５ＥＰＨＡＲＯ５Ｅゝ）（ファーマシア社）を
充填し、渕尿素、２０ＩＩＭトリスーＨＣＩ（ｐＨ８，
０）、１５ａ＋Ｍβ−メルカプトエタノール、及びｌｓ
Ｍ　ＥＤＴＡで平衡化した５５０ＩＩＩカラム（５ｃ＋
ｗ　ｘ　２８　ｃｎ＋）に透析物を室温で装填した。
カラムを１．５リットル平衡化ｍ衝液で洗い、タンパク
をＩＩ　ｉｉ　Ｋｌ中の０−０．８Ｍ　ＮａＣｌの５す
・ントル線形勾配で溶離した。　ＨＴＬＶ・■タンパク
は約０．４Ｍ　ＮａＣ１で溶離され、５Ｏ５−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動を使用し、約８６ｋＯの有力タ
ンパクを追跡して検定された。
１（ＴＬＶ−Ｉ１１タンパクを含有するフラクションを
一緒にし、分子量１０，０００のカットオフ膜（ＹＭ−
１０、アミコン社）を取り付けた応力セル正圧濃縮器（
アミコン社）を使用して、タンパクを１０１に１縮した
。
スーパーファイン５ＥＰＨＡＣＲＹＬ”　Ｓ−３００（
ファーマシア社）を充填し、８Ｍ尿素、２０１１Ｍトリ
ス−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）、１５ｍＭβ−メルカプトエ
タノール 平衡化した５００１カラム（２．５　ｃ＋ｓ　ｘ　１０
０　ｃａ＋）に、濃縮液を装填した．カラムを室温で平
衡化緩衝液で溶離した．毎分０．５１の流量を維持した
。ＨＴＬＶ−■タンパクはカラム容量の約４０χで溶離
した。
実施例８　プラスミドルＫ旧の構築と発現プラスミドρ
に旧は、本質的ににｐｎ１位置からＨｉｎｄｍ位置まで
のＨＴＬＶ−ｍｅｎｖ遺伝子をコードしたＤＮＡ約１８
３０塩基対を含有しており、ｇｐｔｅｏエンベロープタ
ンパクのこの部分を含有する約７０ｋ［ｌの融合タンパ
クがこれから合成される．このプラスミドを次のように
構築できる。
１、第７表に示す配列のＤＮＡを合成する。このＤＮＡ
断片は標準方法で合成でき、ｇｐ＋ｓｏの一部をコード
している．これは５′末端にプラント末端をもち、３′
末端にＨｉｎｄＩＩＩ張り出し部分と再結合する末端を
もっている。
２、　プラスミドｐＲＥＶ２．２（５４　ｇ）を旧ｕｌ
で制限し、末端をプラントにするためにＤＮＡをクレノ
フボリメラーゼで処理してから、ＨｉｎｄＩＩＩで処理
して、約５　ｋＤの大きな断片を７ガロースゲルから単
離する。
３、　　Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、第７表の断片０
．１／ｊｇヲ２０μｍの容量ｔ’　ｐＲＥＶ２．２断片
０．ＩＩｉｇと再結合させ、再結合混合物をコンピテン
ト細胞菌株ＣＡＧ６２９へ形質転換し、アンピシリン耐
性形質転換体を選択する。
４、精製プラスミドのＡｈａＩＩＩ制限パターンを使用
して、合成断片をもつ組換えプラスミドが受入れられた
ｍ胞を選択するが、この合成断片は断片のプラント末端
がｐＲＥＶ２．２の旧ｕｌ末端に再結合され、）Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ張り出し末端どうしが一緒に再結合されるよう
な方向にある。適当なプラスミドをＡｈａ■で消化させ
ると約１７３０、１０２０、７５０、６９０、６４０、
６００、３４０及び２０塩基対の断片長さが得られる。
この組換えプラスミドを受入れた菌株を、５０μ８７ｍ
ｌのアンピシリンを含有する２Ｉ培地中で生育させ、細
胞タンパクの全量をＳＯＳ−ポリアクリルアミドゲル上
で電気泳動にかけると、約７０　ｋｎのタンパクをクマ
シーブルー染色により、又はエイズ、ＡＲＣ又はＨＴＬ
Ｖ−　ＩＩＩに感染した人から選択された血清をブロー
７として使用するウェスタン・プロット分析によって視
覚化できろ。
実施例９　プラスミドｐに旧からのＨＴＬＶ−ｍエンベ
ロープ配列を含有する組換えタンパクの １１！製 １、細胞の生育 チヱマップ発酵装置中で２ｚ培地中の細胞を１０ｊＪッ
トル容量で生育させた．発酵温度３２℃、ｐＨ６．８、
及び空気をＩ　ｖｖｗで供給した．プラスミド選択は、
５０μＨ／ｍｌアンピシリンで提供された．典型的な細
胞収率（湿潤［１は３０　ｇ／Ｉであった。
２、細胞溶菌 ｖＡ換えＨＴＬＶ・■エンヘローブ融合タンパクを含ん
だ大腸菌５０ｇり湿潤細胞重量）を、５０ｍＭ）リス−
ＨＣＩ（ｐＨ　８．０）、５＋ｅ　ＥＤＴＡ．　５＋＋
＋Ｍジチオスレイトール（　ＤＴＴ）　、１５ｍＭβ−
メルカプトエタノール、０．５χＴＲ１７１１Ｎ”　Ｘ
−１００、及び５ｔｓＭ　Ｐ阿ＳＦからなる液のＭ終容
量１００１中に再懸濁させた。リゾチーム３００　ｒａ
ｇを加え、懸濁？αを室温で３０分培養した。
この材料は同量のＯ，ｌ−０，１５μ■ガラスピーズを
含有するＢＥＡＤ−ＨＥＡＴＥＲＴ″（バイオスペック
・プロダクツ社）を使用して溶菌化された。室温で、１
分間隔で６分間、溶菌を行なった。液体をビーズから分
離し、２０　、０００ｘｇて２．５時間遠心分雄した。
上澄み液を除去し、ペレットを８Ｍ尿素、２０ｍＭ　）
リス−■ＣＩ（ｐ）１８．０）、５ｓ＋Ｍ　ＤＴＴ、　
１５ｍＭβ−メルカプトエタノール、５ｍＭ　ＰＭＳＦ
及びＩＩＩ＋ＭεＤＴＡ（１００ａｌｌ）に溶解した。
ポリトロンホモジナイザー（ペックマン社、カリフォル
ニア州バークレー）を使用してペレットを溶解化し、２
０．０００ｘ８で２時間遠心分離した。
３、　０ＥＡＥクロマトグラフイ ＤＥＡＥ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ　５ＥＰＨＡＲＯ５εゝ
（ファーマシア社）を充填し、８Ｍ尿素、２０ｍＭ）リ
ス・ＨＣＩ（ｐＨ８，０）、１５ｍＭβ−メルカプトエ
タノール、及びｌ＊Ｍ　ＥＤＴＡで平衡化した５５０１
カラム＜５ｃｙｇ　ｘ　２８　ｃａｂ）に上澄み液を室
温で装填した。カラムを１．５リツトル平衡化緩衝液で
洗い、タンパクを緩衝液中のＯ−Ｑ、８Ｍ　ＮａＣ１の
５リツトル線形勾配で溶離した。　ＨＴＬＶ−ｍタンパ
クは約０．２Ｍ　ＮａＣｌで溶離され、５ＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動を使用し約Ｔｏ　ｋ［）のタ
ンパクを追跡して検定された。
ＨＴＬＶ−ＩＩＩタンパクを含有するフラクションを一
緒にし、分子量１０，０００のカットオフ膜（ＹＭ−１
０、アミコン社）を取り付けた応力セル正圧濃縮器（ア
ミコン社）を使用して、タンパクを１０１に濃縮した。
スーパーファイン５ＥＰ）ＩＡＣＲＹＬｌｌｌＳ−３０
０（７−ｙ　−マシア社）を充填し、８Ｍ尿素、２０ｍ
Ｍ）リス−ＨＣＩ（ｐＨ８゜０）、１５５Ｍβ−メルカ
プトエタノールで平衡化した５００１カラム（２．５ｃ
ｔａ　ｘ　１００　ｃ＋ｗ）に濃縮液を装填した．カラ
ムを室温で平衡化ｗＩ衝重液溶離した．毎分０．５　ｍ
ｌの流量を維持した。ＨＴＬＶ−ｍタンパクはカラム容
量の約４０Ｘで溶離した。
４、　　ＳＯＳ・ポリアクリルアミド電気泳動ＫＨ１を
含有するフラクションを一緒にし、分子量１０．０００
のカットオフ膜を取り付けた応力セル正圧濃縮器を使用
して、タンパクを濃縮した．タンパク２■ｇを装填ｍ重
液と混合し、エム・ダブリュウ・バンカピラー（Ｍ．ｌ
Ｊ．　Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ）、イー・ルジャン（Ｅ
．　Ｌｕｊａｎ）、エフ・オストランダー（Ｆ．Ｏｓｔ
ｒａｎｄｅｒ）、及びエル・イー・フード（Ｌ．Ｅ．　
Ｈｏｏｄ）Ｍｅｔｈｏ＋ｉ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ　９１巻２２７−２３６頁（１９８３年）に記述され
たとおりに、分離用ＳＯＳーポリアクリルアミドゲル（
４０　ｃｍ　ｘ　２０　ｃｍ　ｘ　４　ａｌｌ）に通し
て電気泳動にかけた。７０ｋ［１のＨＴＬＶ−ｍタンパ
クを０．２５ＭにＣ１で視覚化し、上記のようにゲルか
ら溶離した．タンパクをア七トンで沈殿させてＳＯＳか
ら除去できる［ダイナン◆ダブリュウ・ジエイ（Ｄｙｎ
ａｎ，Ｗ．Ｊ．）、ジエントリサック・ジエイ・ジエイ
（Ｊｅｎｄｒｉｓａｋ．Ｊ・Ｊ．）、ヘイガー・デイ−
・エイ（）ｌａｇｅｒ，　［１．Ａ．）及びバージニス
・アール拳アール（Ｂｕｒｇｅｓｓ，　Ｒ．Ｒ．）（１
９８１年）Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｗ．　２５６巻５
８６０−５８６５頁］。
実施例１０　　ＰＢＩの非融合誘導体の構築Ｎ−末端メ
チオニン以外の非ＨＴＬＶーｍアミノ酸を含有しないＰ
ＢＩタンパクの非融合誘導体は、オリゴヌクレオチド指
向の部位特異的変異誘発［イノウニ・ニス、イノウニ・
エムｒ　ＤＮＡ及びＲＮＡの合成と応用Ｊ　（Ｓｙｎｔ
ｈｅｓｉｓ　＆　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｄ
ＮＡ　＆　ＲＮＡ）、ナラング・サラン・エイ編、アカ
デミツクブレス社、１９８７年］を用いて構築された。
この手順では、ｐＰＢ　ｌのｅｎｖ遺伝子配列から上流
の非ＨＴＬＶ−ｍ９０ｈｐと下流の３９　ｂｐとが、合
成オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成によって生
ずるＤＮＡループアウトを経て削除された。
Ｎ・末端ループアウトのために合成されるオリゴヌクレ
オチドは、β−グルクロニダーゼ遺伝子の出発コドンが
ＨＴＬＶ−　ｍ　ｅｎｖ遺伝子配列の５′末端に隣接し
て置かれるように意図されている（第４図）。
オリゴヌクレオチドは、新しくつくられたこの連結点の
両側と相同の配列を含んでおり、これによって１ラスミ
ドＤＮＡへの適当なハイブリッド形成が可能となる。
ハイブリッド形成の基質である１本鎖ギャップと共にヘ
テロデュプレックスを形成するために使用される二つの
ＤＮＡ分子は、ｐＰＢＩをＳａｌ　ＩとＨｐａ　Ｉで、
又はＰｓｔ　Ｉのみで消化させてつくった．線状化した
ｐＰＢｌｌｔＰｓｔ　１で消化し、またＳａｌｌとＨｐ
ａ　１で二重に消化すると、３８００と７００ｂρの断
片を生じ、その大きい方を変異誘発用にゲル単離した。
オリゴヌクレオチドのキナーゼ処理、ハイブリッド形成
、重合、及び閉環分子をつくるための再結合は、上記の
イノウニ及びイノウニの方法に従って行なわれた。欠失
を含んだＤＮＡ分子を濃縮するために、削除される領域
内で切断を行なう旧ＵＩでＤＮＡ混合物を消化させた。
消化済みＤＮＡを使用して、コンピテント大ｆｌｉＭＪ
旧０５細胞を形質転換し、ＹＴ（リットル当たりトリプ
トン８　ｇ、酵母エキス５ｇ、及びＮａＣｌ　５　Ｋ）
Ｃ−プレート上で３７℃で一夜生育させて、プラスミド
を含有する形質転換体を単離した。
プラスミドＤＮＡを各形質転換体から単離し、旧ＬＩＩ
とＨｉｎｄｍでの同時消化によって正しい構造について
審査した。削除されなかった分子は、約３９００とｓｏ
ｏ　ｂｐの断片を生じた。欠失を含んでいる分子は旧ｕ
１位置をもたず、約４４００　ｂｐの線状分子を生じた
。欠失を含むと思われる形質転換体か、らのプラスミド
ＤＮＡを再形質転換させ、欠失及び簾欠失プラスミドの
分離と純粋なプラスミド集団の回収を確実にした。これ
らの第二の形質転換体からのＤＮＡを前の消化物でのよ
うに分析し、正しい構造をもつことを決定した。このプ
ラスミドはｐΔＰａｌと指定された。
Ｃ末端の非ｔｌＴＬＶ−ｍアミノ酸を排除するために、
ｐΔＰＨ１プラスミドを基質として使用し、オリゴヌク
レオチド指向性の部位特異的変異誘発を行なった。オリ
ゴヌクレオチド（第５図）は、ＴＧＡコドンが枠外では
ｅｎｖ遺伝子配列から下流に生じ、これがｅｎｖ遺伝子
配列の３′末端にすぐ隣接するようにＴＧＡコドンを位
置させ、また枠内では翻訳停止コドンとして作用させる
ことを意図している。
ハイブリッド形成に使用されるペテａデュプレックスを
形成する分子は、ｐΔＰＢＩをＰｓｔにのみで、又はに
ｐＩＩＩとＨｐａ　Ｉで消化させてつくった。ベクター
のほとんどを包括する大きなＫｐｎ　Ｉ　／Ｈｐａ　Ｉ
断片を、変異誘発用にゲル単離した。キナーゼ処理、ハ
イブリッド形成、重合、及び再結合は上のように実施さ
れた。欠失分子の濃縮は、削除される値域内で切断を行
なうＨｉｎｄ［での消化によって達成された。ＤＮＡを
上のように細胞の形質転換に使用した。
プラスミド［ｌＮＡを各形質転換体から単離し、Ｅｃ。
Ｒ１と）Ｉｐａ　Ｉでの同時消化によって正しい構造に
ついて審査した。欠失プラスミドは２９００と１７５０
　ｂｐの二つの制限断片をもたらす、このパターンを示
すプラスミド［）ＮＡを上のとおりに再形質転換し、こ
れらの形質転換体からのＤＮＡを同じ消化で分析した。
Ｎ−末端とＣ−末端の欠失を含有するこのプラスミドは
、ｐｄ２ＦＢＩと指定される。
プラスミドｐΔＰＢＩを受入れた菌株を、５０μ８／ｍ
ｌのアンピシリンを含有する２ｚ培地［２％酵母エキス
、バクトドリブトン、カサミノ酸（デイフコ製、ミシガ
ン州デトロイト）、０．２ｚ−塩基カリウム、０．２Ｘ
二塩基カリウム、及び０．２Ｘ二塩基ナトリウム］中で
生育させ、細胞タンパクの全量を５ＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル上で電気泳動にかけると、約２２ｋＯのタン
パクをクマシーアルー染色により、又は組喚えｅｎｖ遺
伝子タンパクで免疫化された動物から選択される血清を
プローブとして使用するウェスタン・プロット分析によ
って視覚化できる。同じ条件下に約２０　ｋＤのタンパ
クがｐｄ２ＰＢＩを含有する菌株中でつくられる。
オリゴヌクレオチド指向性の部位特異的変異誘発の手法
は、ｅｎｖ遺伝子の融合タンパクＲ１０１５９０、及び
ＫＨＩを迂回して非ＨＴＬＶ−ｍアミノ酸を排除するた
めに、同様な方法で使用できる。
上記の手順で、融合タンパクからの非ＨＴＬＶ−ＩＩＩ
配列の除去は、タンパクのＮ−末端とＣ・末端の双方で
アミノ酸を除去するものであり、連続した二段階で達成
される。
Ｎ−末端位置のメチオニンが酵素メチオニンアミノペプ
チダーゼ（ＭＡＰ）を用いて酵素的に閉袋されることは
、この技術で周知である。　ＭＡＰは大腸菌［ベン＝バ
サット・エイ（Ｂｅｎ−Ｂａｓｓａｔ、　Ａ、）−バウ
アー・ケイ（Ｂａｕｅｒ、に、〉、チャン・ニス・ワイ
（ｃｈａｎｇ。
Ｓ、Ｙ、）、ミャンボ・ケイ（Ｍｙａｍｂｏ、に、）、
ブースマン・エイ（Ｂｏｏｓｍａｎ＋Ａ、）及びチャン
・ニス（ｃｈａｎｇ、　Ｓ、）（１９８７年）　Ｊ、　
ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　　１６９巻（２号）７５
１−７５７頁］とねずみチフス菌（Ｓａｌ＋１ｏｎｅｌ
ｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）からクローン化され、
生体外活性は組換えタンパクで実証された［ミラー・シ
ー拳ジー（Ｍ目Ｉｅｒ、　Ｃ。
Ｇ、）、ストラウチ・ケイ・エル（Ｓｔｒａｕｃｈ、に
、し、）、ククシール・エイ壷エム（にｕｋｒａｌ、　
Ａ、Ｍ、）、ミラー・ジエイ・エル（旧１１ｅｒ、　Ｊ
、Ｌ、）、ウィングフィールド・ビー・ティー（Ｗｉｎ
ｇｆｉｅｌｄ、　Ｐ、Ｔ、）、マツセイ・ジー・ジェイ
（Ｍａｓｓｅｉ、　Ｇ、Ｊ、）、ワーレン・アールΦシ
ー（讐ｅｒｌｅｎ、　Ｒ，Ｃ，）、グレーバー・ビー（
Ｇｒａｂｅｒ、　Ｐ、）及びモヴ７”ｚヌ・アール（Ｍ
ｏｖｖａ　。
Ｎ、Ｒ，）（１９８７年）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　
Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８４巻２７１８−２７２
２頁］。従って、Ｎ・末端メチオニン除去は生体内で、
ＭＡＰをつくるホスト（例えば大ＩＩＩ　Ｍ　ＣＭ８９
又はＳ、セレビシェ）中でタンパクを発現させろか、又
は生体外で精製ＭＡＰを用いて（例えばミラーらの手順
で）達成できる。
ｐｄ２ＰＢ　Ｉの精製 他に特定されなければ、段階はすべて室温で実施される
。
［溶菌］−ｐｄ２ＰＢ１を含有する冷凍細胞ペーストの
Ｔｏｏ　ｎｉｌびん３本を３７℃で解凍し、ＪＳ−４，
２０−タ付きＪ−ｆｌＢ遠心分離器（ベックマン社、カ
リフォルニア州パロアルト）にかけ、４℃、４，０００
　ｒｐｍで３０分回転させる。上澄み液を捨て、細胞ペ
レット重量を測定する。！ｌ１ｌｉ！ペレット（典型的
にはｌ　ｋｇ）を８Ｍ尿素、２０ＩＩＩＭトリスーＨＣ
Ｉ（ｐＨ７，５±０．１）、ＩｍＭ　ＥＤＴＡ、　１４
．７−Ｍ２−メルカプトエタノール及び１ｍＭ　ＰＭＳ
Ｆからなる溶菌緩衝液（ｖ／ｗ）２倍量に再懸濁する。
０．５−０．７　＋ｕｗガラスピーズを含有するＴＤに
型パイロットＤＹＮＯ・旧ＬＬＲ（インバンデックス社
、ニューシャーシー州メイウッド）に、再懸濁された細
胞ペレットを毎分２００−４００　ｍｌで通す。使用に
先立って、ＤＹＮＯ−旧ＬＬ”に溶菌緩衝液１リツトル
を仕込み、溶液が周囲温度より低温で流れるように装置
を冷却する。再懸濁された細胞ペレットをＤＶＮＯ−旧
ＬＬＲに２回通し、二回目の通過後、ＤＹＮＯ−旧ＬＬ
Ｒを溶菌緩衝液１リツトルで洗う、溶菌細胞懸濁液と洗
浄液を一緒に蓄える。
［濃縮と濾過］−溶菌細胞懸濁液に洗浄液１リツトルを
加えたものを、ペリコン４　ＧＰＭ系（ミリポア社、マ
サチューセッツ州ベトフォード）中の０．４５μデユラ
ボアＣＤＵＲＡＰＯＲＥ””）ペリコンカセットを使用
して、８００１に濃縮する＊　４０　ｐｓｉ以下の人口
圧と１０ないし２０ｐｓ−の出口圧で濃縮を行なう、濃
縮後、溶菌細胞懸濁液は、透析濾過用の配管を取り付け
た同じペリコン系、カセット、及び圧力設定を使用して
、溶菌緩衝液４７）ットルと共に濾過される。
［抽出］−洗浄された溶菌細胞懸濁液は、上記のように
透析濾過用の配管を取り付けた同じペリコン系、カセッ
ト及び圧力設定を使用して、６ＭグアニジンＨＣＩ、＋
００５Ｍ　）リス−ＨＣＩ（ｐＨ７，６±０．１）、及
び１０＋ｇＭε［ｌＴＡからなる抽出緩衝液ｌＯリット
ルで抽出される。
［ｗｉ衝重液換］−ＰＴＧＣ力セツ）　二ツ（１０，０
００ＮＭνＬ）をもつベリコン４ＧＰＭ系を使用して、
前段階からの濾液を典型的には１リツトルに濃縮する。
５０ｐｓ１以下の入口圧と３０ないし４５　ｐｓｉの出
口圧で濃縮を行なう、濃縮後、上澄み液を８Ｍ尿素、２
５ｗＭ燐酸カリウム、及びｌ−Ｍ　ＥＤＴＡ（ＰＨ６，
８±０．１）からなる３、ＯＬｌｓ／ｃｍ以下の伝導率
をもつＣＭカラム緩衝液と１１衝液交換する。ｍ重液の
交換には、上記のように透析濾過用の配管を取り付けた
同じペリコン系、同じカセット及び同じ圧力設定が使用
される。
濃縮抽出液１リツトルを緩衝液交換するのに、ＣＭカラ
ム緩衝液８リットルが使われる。ｍ衝ｔα交換後、緩衝
液交換された抽出液を系から抜出し、印カラム緩衝液ｌ
リットルで系を洗う。ｗｉ衝液液交換た抽出液と洗浄液
を一緒にし、溶）αの伝導率とｐＨを測定する。溶ｉｒ
１伝導率を脱イオン化された開尿素で３．０　ａ＋ｓ／
ｃｓ＋に調整し、ｐＨを６．５−７．０の範囲内に調整
する。
［ＣＭクロマトグラフィ］−ＣＭセファロース（ＳＥＰ
ＨＡＲＯ５Ｅ”）ファストフロー（ＦＡＳＴ　　ＦＬＩ
）ＩＪ）　（）７−マシア社、ニューシャーシー州ビス
力タウエー）の５０　ｘ　５１　ｃｎ＋カラムを、４カ
ラム容量の０．５Ｍ　ＮａＯＨ１２カラム容量の脱イオ
ン水、及び２−３カラム容量のＣＭカラム緩衝液で次々
に洗浄することによって平衡化する。流出液のｐＨがＣ
Ｍカラム緩衝液の０．２単１ａ内にあり、流出液の伝導
率がＣＭカラム緩衝液の０．３１１５１ｃｍ内にある時
に、カラムは平衡状態と考えられる。
装填には、緩衝液交換された抽出液を１０ないし１５ρ
ｓｉの人口圧でカラムにポンプで送る。装填後、流出液
の２８０　ｎ＋ｇでの光学密度（ＯＤ）が０．１未満に
なるまで、ＣＭカラムをＣＭカラム緩衝液で洗う。次に
ＣＭカラム緩１ｉ１中のＯ−０，５Ｍ　ＮａＣ１の８リ
ツトル線形勾配でｐｄ２ＰＢＩを溶離し、１００　ｍｌ
フラクションを集める。フラクションを５Ｏ５−ＰＡＧ
Ｅと抗ｇｐ１６０抗体によるウェスタンで検定し、有意
のｐｄ２ＰＢ１と痕跡量の汚染物質を含有するフラクシ
ョンを一緒にする。
［有機抽出］−前段階からの一緒にしたタンパク溶液を
、かきまぜながら純粋なアセトニトリルを徐々に添加す
ることにより、アセトニトリル５５２対タンパク溶液４
５Ｘ（ｖ／ｖ）の比にもっていく、全部のアセトニトリ
ルを添加してから、ＪＡ１０ロータ（ベックマン）を使
用するＪ２−２１遠心分離器で、溶液を１０，０００　
ｒｐ園、４℃、１５分の遠心分離にかける。
遠心分離後、上澄み液を集め、ペレットを捨てる。
かきまぜながら純粋な９５ｚエタノールを徐々に添加す
ることにより、遠心分離の上澄み液を、エタノール３５
χ対上澄み液６５％（ｖ／ｖ）の比にもっていく、全部
のエタノールを添加した後、ＪＡ−１０ロータを使用す
るＪ２−２１遠心分離器で、溶液を１０．０００ｒｐｍ
、４℃で１５分の遠心分離にかける。遠心分離後、ペレ
ットを集め、上澄み液を捨てる。
ペレットを１５分空気乾燥し、８Ｍ尿素、０．３Ｍグリ
シン、５＋ｇＭ　ＥＤＴＡ、　１５ｍＭ　２−メルカプ
トエタノール、１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）（
ｐＨＬ５０±０．０１）からなるＳ−３００カラム＆ｌ
衝液に再溶解する。この段階の初めに蓄えたタンパク溶
液の１０分の１の容量に等しい容量のＳ−３００力ラム
ｍ？＃１液にペレットを溶解する。
［濃縮］−上からの、再溶解タンパク溶液の吸光度を２
８ｏｎ−で測定し、タンパクのＩ　＋Ｈ／ｍｌ溶液が２
８０　ｎ＊″ｒ！１．０の吸光度をもつことを仮定して
、大体のタンパク濃度を測定する。　ＹＭ−１０膜を備
えた２００１アミコン製のかきまぜ機付き細胞濃縮装置
を使用して、溶液を１０　＋ｗｇ／−１に濃縮する。
［Ｓ・３００クロマトグラフィ］−濃縮タンパク溶液３
Ｏ−ＴＯｍｌをセフｙクリル（ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ”）
　Ｓ−３００（ファーマシ７社）の５．０ｘ１３５　ｃ
■カラムに装填する。
８Ｍ尿素、０．３Ｍグリシン、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、　１
５ｍＭ　２−メルカプトエタノール、１ｍＭジチオスレ
イトール（ＤＴＴ）（ｐＨ８，５０±０．０１）からな
るＳ−３００カラム緩１液で予めカラムを平衡化してお
く、装填後、カラムを同じ緩衝液でまんべんなく操作す
る。２０１フラクシヨンを集め、フラクションを５ＤＳ
−ＰＡＧＥ１？ｐｄ２ＰＢ１含有量の検定を行なう。
ｐｄ２ＰＢ１を含有する適当なフラクションから同量の
７リコートを取り、とのフラクションが蓄えるのにｉｌ
ｌ　ＦｆｉＬかを決めるために使用する。アリ゛コート
を蓄え、８Ｍ尿素、２５ｍＭ燐酸ナトリウム、１ｍＭ　
ＥＤＴＡ（ｐＨ６，８±０．１）に対して一夜透析し、
透析緩衝液をブランクとして使用して、透析された貯蔵
液のｐＨを測定する。溶液のタンパク濃度は、ｐｄ２Ｐ
Ｂｌの計算吸光係数１．０（Ｂ／ａｇｌ）−’を用いて
決定される。
５ＤＳ−ＰＡＧＥは、１５１５ＤＳ７　クリルアミドゲ
ルヲ使用して、透析貯蔵物１０８ｇ上で操作される。ク
マシー染色及び脱染色後、ウォータース（マサチューセ
ッツ州ミルフォード）＄！７４０インテグレー夕に接続
されたＬＫ８（メリーランド州ゲイサーズバーグ）製の
走査式濃度計を使用して、ゲルを走査する。
ゲル上のｐｄ２ＦＢＩバンドが９７膜純度より大きい場
合は、アリコートに使用されたフラクションは、０゜０
６　ｅｕ／ｍｌ管を使用するリムラス・アメーバ様繍胞
溶菌物（Ｉｉｍｕｌｕｓ　Ａ＋ｇｅｂｏｃｙｔｅ　Ｌｙ
ｚａｔｅ）（ＬＡＬ）検定で、ｔ−２０１８希釈の菌体
内毒素について検査される。希釈フラクションでのＬＡ
Ｌ試験が陰性の場合は、フラクションを蓄え、その後の
操作に使用される。
ゲルが純度仕様に満たない場合は、異なる絹のフラクシ
ョンからの同量のアリコートを用いて、方法を繰り返す
、　１−２０倍希釈で陰性のＬＡＬ試験をもつフラクシ
ョンのみを蓄える。
ｐ４　　　　ＭｅｅＬｅｕＡｓｎＧｌｎＳｅｒリａ　Ｉ
　Ｇ　１　１Ｊ　Ｉ８ＳｅｒｌｌｅＡｒｇ工１ｅＧｌｎ
Ａｒ！。
”　　　　　　Ｇ１ｖＡｓｎＭｅｔＡｒｇＧ１ｒ＋Ａ１
ａＨト、 −１１４″ 〉 減＝；　　　　ＣｖｓＧ１ｙＧ１ｙ，Ｇ１＋」ＰｈｅＦ
’ｈｅＴ＋Ｃ　　　　　　Ｆｉ１ｅＡｓｎｓｅｒＴｈｒ
丁ｒｐ’．ｅｒＴ｝”　　　　　　　Ｉ１ｅＴｈｒＬｅ
ｕＦ’ｒｏＣｙｓＡｒｃ！Ｉ）へ ”：　　　　　　ＬｙｓＡ１ａＭｅｔＴｙｒＡｌａＦ’
ｒｏＰｔ！） へ　　　　　　丁ｈｒＧ１ｙＬｅｕｌ−ｅｕＬ＝ｕＴｈ
ｒＡｔ１ｅＡｓｎＣｙｓＴｈｒＡｒｅＩＰｒｏＡｓｒ＋
ＡｓｎＡｓｎＴｈｒ＾ｒｇＬｖｓ１％：ｉＦ’ｒｏＧ１
ｖＡｒｌＡ１ａＦ’ｈｅリａｌＴｈｒＩ１ｅＧ１ｖＬｙ
ｓｌｌｅｉｓＣ＋ｓＡｓｎＩｌｅＳｅｒＡｒｃｌＡ１ａ
Ｌｖｓ　丁ｒｐＡｓｎＡ．ｓｎＴｈ　ｒｓＬｅｕＡｒ！
Ｇ１ｕＧ１ｒ＋Ｆ’ｈｅＧ１＋ｖＡｓｎＡｓｎＬｙｓＴ
ｈｒＩ１ｅ＋ｙＧ１ｙＡｓｐＰｒｏＧ１りＩ１ｅりａｌ
ＴｈｒＨｉｓｓ：ｅｒＦ’ｈｅＡｓｎｖｒＣｖｓＡｓｎ
ＳｅｒＴｈｒＧ１ｎＬｅｕＰｈｅＡｓｒ＋！ＥｅｒＴｈ
ｒＴｒｐ１ｒＬｙｓＧｌｖｓｅｒＡｓｎＡｓｎＴｈｒＧ
ＩＩＪＧ１ｖｓｅｒＡｓｐＴｈｒＬ＝ＬｖｓＧ１ｎＩ１
ｅＩ１ｅＡｓｎＭｅｔＴｒｐＧ１ｎＧ１＋Ａ’ａｌＧ１
ｖ′ｏ１１ｃｓＳｅｒＧ１ｙＧ１ｎＩｌｅＡｒｃ！ｌＥ
ｙｓｓｅｒｓｅｒＡｓｒ＋Ｉ１ｅ１ｃ！ＡｓｐＧＩＩ：
ＩＧ１′−ＪＡｓｎＳｅｒＡｓｎ＾ｓｎＧ１ｕｓｅｒＧ
１ｕＩ１ｅＦ’ｈｅＡｒｃＩＰｒｏＧ１ｕＧ’ｌｙＧ１
ｙ＾ｓＰＭｅｔ＾ＴｖｒＬｙｓｌｖｌａｌｕ＝ｌＬｙｓ
ＩｌｅＧ１ｕＦ’ｒｏＬＡｒｆり８１リａ　Ｉ　Ｇ　１
　ｒ＋＾ＭＧ１ｕＬ＋ｓへｒ≦八Ｆ’ｈｅＬｅｕＧｌｙ
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ｊＧ１’ｎＬｅｕＬｅｕＳｅｒＧｌｖＩＡ１ａＩ１ｅＧ
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Ａｓｒ＋Ｔ：ｒ＝ＡｓＰＡｓｎＴｒＰＡｒｃ！ＳｅｒＧ
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９ｕＴｈｒｕａｌＴｒｐＧ１ｙＧｌｕＡｒｃｊＴｙｒＬ
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ｓＴｈｒＴｈｒＡｌａｕａｌＦＧ１ｕＧｌｎＩｌｅＴｒ
ｒ−ＡｓｎＡｓｒ＋ＭｅｔコＴソｒＴｈｒ ＡｌａＬｙｓＡｒｌＡｒｌリａｌＶａｌＧ１ｎＡｒ！１
Ｇ１ｕＬｖｓ＾ｒ≦ＰｈｅＬｅｕＧ１ｙＦ’ｈｅＬｅｕ
Ｇ１ｖ＾１’ａＡ１ａＧ１ｖＳｅｒＴｈｒ−ｅｕＴｈｒ
ＶａｌＧ１ｒ＋Ａ１ａＡｒｌＧ１ｎＬｅｕＬｅｕＳｅｒ
Ｇ１ｙＬｅｕＬｅｕＡｒｃｌ＾ｌａＩｌｅＧ１ｕＡｌａ
Ｇ１ｎＧ１ｎＨｉｓＬｅｕ［１ｅＬｙｓＧ１ｒ＋Ｌｅｔ
」Ｇ１ｎＡ１ａＡｒ４Ｉ１ｅＬｅｕ　＾ｌａｕａｌ３１
ｎＬｅｕＬｅｕＧ１ｓＩ１ｅＴｒＰＧｌ＋ＣｙｓＳｅｒ
Ｇ１ｖＬ＋ｇｓ０゜ｒｏＴｒｐＡｓｒ＋ＡｌａＳｅｒＴ
ｒＰＳｅｒＡｓｎＬｙｓＳｅｒＬｅｕｒｈｒＴｒｐＭｅ
ｔＧｌｕＴｒｐＡｓ’ｐＡｒｌＧ１ｕＩ１ｅＡｓｎＡｓ
ｎＡＴＧＧ’ｒＧＴＧＧＡＡＧＧＡＡＧＣＡＡＣＣＡＣ
Ｃ／’＋”　　　　　　Ｇ　Ａ　Ｔ　Ａ　Ｃ　Ａ　Ｇ　
Ａ　Ｇ　Ｇ　Ｔ　Ａ　Ｃ　Ａ　Ｔ　Ａ　Ａ　Ｔ　Ｇ　Ｔ
　Ｔ　Ｔ二） シ、　　　　　　　＾＾ＣＣ’ＣＡＣＡＡＧＡＡＧ丁Ａ
ＧＴＡＴＴＧＧ３ＡＴＧＣ ＡＴＴＡＡ ＴＡＣＣＡ こＴＣＴＴ ＴＴＴＴＴ１ へ　　　　　　　ＡＣＴＡＣＣＡＧＣＴＡ丁ＡＣＧＴＴ
ＧＡＣＡＡｊ【 ；、Ｃ　Ｃ　Ａ　Ａ　？＋　Ｇ　Ｇ　Ｔ　ｉ！１７　Ｃ
　Ｃ　Ｔ　Ｔ　Ｔ　Ｇ　Ａ　ＧＣ　Ｃ　Ａ　Ａ　’へ　
　　　　　　ＧＣＧＡＴＴＣＴＡＡＡＡＴＧ丁ＡＡＴＡ
ＡＴ＾ＩＧＴＣＡＧＣＡＣＡＧＴＡＣＡＡＴＧ’ＴＡＣ
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【図面の簡単な説明】
第１図−これは新規なタンパクをコードしたベクターを
構築するために使用されるプラスミドｐＲＥＶ２．２の
構築の流れ図である。 第２図・−これは複数のクローン化位置を示すプラスミ
ドρＲＥＶ２．２の図である。 第３図−これはＨＴＬＶ−ｍエンベロープ遺伝子とそれ
から得られる新規な組損えタンパクの作図である。 第４図・−ＰＢ１からのＮ−末端における非ＨＴＬＶ−
ｍ配列の除去を示す図。 第５図−ＰａｌからのＣ−末端における非ＨＴＬＶ−Ｉ
ＩＩ配列の除去を示す図。 出願人　レブリゲン　コーポレーション代理人　佐々井
　弥太部　（外１名） 図４ Ｐ８１のＮ−末端井目１ 八ＧＧＡＧＴＣＣＣ’ｌ”１”へＩＩＩＧＴＴΔＣＧ’
ｌ’ＣＣ’ｌ’Ｇ’ｌ’ＡＧ八八八ｃｃｃｃ八八オリゴ
ヌクレオチ 八ＧＧＡＧ’ｌ’ＣＣＣ’ｌ”１’八’ｌｌ’ＧＣ’ｌ
’Ｇ八八Ｃ（Ｊ配列の除去 ト コへへ’ｌ’ｃ’ｒＧ“１゛八 手続補正書（禎） ｌ　事件の表示　　　　　　　　　昭和６３年特許願第
ＩＩＩ３４８号３　補正をする者 事件との関係　　　　　　特許出願人 性　　所　　　アメリカ合衆国０２１３９マサチユーセ
ツツ州カンブリツジ　ビルデイングア００　ワン　ケン
ダールスクエアー（＠地なし）氏名（名称）　レブリゲ
ン　コーポレーション４代理人 住　　所　　東京都新宿区新宿２丁目　８番１号新宿セ
ブンビル３０３号６７１１Ｉ正により増加する発明の数
　　　　　増加せず７　補正の対象　　　　図面 ”’％−−

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）第１２表に示されるアミノ酸配列を有するＲ
    １０のＨＴＬＶ−III蛋白質部分、 （ｂ）第１３表に示されるアミノ酸配列を有するＰＢ１
    のＨＴＬＶ−III蛋白質部分、 （ｃ）第１４表に示されるアミノ酸配列を有する５９０
    のＨＴＬＶ−III蛋白質部分、及び （ｄ）第１５表に示されるアミノ酸配列を有するＫＨ１
    のＨＴＬＶ−III蛋白質部分、 からなる群から選ばれる蛋白質。 ２、Ｎ−末端メチオニンを有さない、特許請求の範囲第
    １項に記載の蛋白質。 ３、第１２表に示されるアミノ酸配列を有する、特許請
    求の範囲第１項に記載のＲ１０のＨＴＬＶ−III蛋白質
    部分。 ４、第１３表に示されるアミノ酸配列を有する、特許請
    求の範囲第１項に記載のＰＢ１のＨＴＬＶ−III蛋白質
    部分。 ５、第１４表に示されるアミノ酸配列を有する、特許請
    求の範囲第１項に記載の５９０のＨＴＬＶ−III蛋白質
    部分。 ６、第１５表に示されるアミノ酸配列を有する、特許請
    求の範囲第１項に記載のＫＨ１のＨＴＬＶ−III蛋白質
    部分。 ７、（ａ）第１２表に示されるアミノ酸配列を有するＲ
    １０のＨＴＬＶ−III蛋白質部分、 （ｂ）第１３表に示されるアミノ酸配列を有するＰＢ１
    のＨＴＬＶ−III蛋白質部分、 （ｃ）第１４表に示されるアミノ酸配列を有する５９０
    のＨＴＬＶ−III蛋白質部分、及び （ｄ）第１５表に示されるアミノ酸配列を有するＫＨ１
    のＨＴＬＶ−III蛋白質部分、 からなる群から選ばれる蛋白質をコード化しているＤＮ
    Ａ。 ８、第１２表に示されるアミノ酸配列を有するＲ１０の
    ＨＴＬＶ−III蛋白質部分をコード化している、特許請
    求の範囲第７項に記載のＤＮＡ。 ９、第１３表に示されるアミノ酸配列を有するＰＢ１の
    ＨＴＬＶ−III蛋白質部分をコード化している、特許請
    求の範囲第７項に記載のＤＮＡ。 １０、第１４表に示されるアミノ酸配列を有する５９０
    のＨＴＬＶ−III蛋白質部分をコード化している、特許
    請求の範囲第７項に記載のＤＮＡ。 １１、第１５表に示されるアミノ酸配列を有するＫＨ１
    のＨＴＬＶ−III蛋白質部分をコード化している、特許
    請求の範囲第７項に記載のＤＮＡ。 １２、（ａ）第１２表に示されるアミノ酸配列を有する
    Ｒ１０のＨＴＬＶ−III蛋白質部分、 （ｂ）第１３表に示されるアミノ酸配列を有するＰＢ１
    のＨＴＬＶ−III蛋白質部分、 （ｃ）第１４表に示されるアミノ酸配列を有する５９０
    のＨＴＬＶ−III蛋白質部分、及び （ｄ）第１５表に示されるアミノ酸配列を有するＫＨ１
    のＨＴＬＶ−III蛋白質部分、 からなる群から選ばれる蛋白質をコード化しているＤＮ
    Ａを含んでいる組み替えＤＮＡトランスファーベクター
    。 １３、第１２表に示されるアミノ酸配列を有するＲ１０
    のＨＴＬＶ−III蛋白質部分をコード化しているＤＮＡ
    を含んでいる、特許請求の範囲第１２項に記載の組み替
    えＤＮＡトランスファーベクター。 １４、第１３表に示されるアミノ酸配列を有するＰＢ１
    のＨＴＬＶ−III蛋白質部分をコード化しているＤＮＡ
    を含んでいる、特許請求の範囲第１２項に記載の組み替
    えＤＮＡトランスファーベクター。 １５、第１４表に示されるアミノ酸配列を有する５９０
    のＨＴＬＶ−III蛋白質部分をコード化しているＤＮＡ
    を含んでいる、特許請求の範囲第１２項に記載の組み替
    えＤＮＡトランスファーベクター。 １６、第１５表に示されるアミノ酸配列を有するＫＨ１
    のＨＴＬＶ−III蛋白質部分をコード化しているＤＮＡ
    を含んでいる、特許請求の範囲第１２項に記載の組み替
    えＤＮＡトランスファーベクター。 １７、特許請求の範囲第１２項に従うプラスミド、ｐΔ
    ＰＢ１。 １８、特許請求の範囲第１２項に従うプラスミド、ｐｄ
    ２ＰＢ１。 １９、Ｒ１０、ＰＢ１、５９０及びＫＨ１からなる群か
    ら選ばれるＨＴＬＶ−III蛋白質のＨＴＬＶ−III蛋白質
    部分を用いる、流体中のＨＴＬＶ−IIIに対する抗体検
    出または定量する為の免疫化学検定方法。 ２０、ＨＴＬＶ−III蛋白質部分が、Ｒ１０からのもの
    である特許請求の範囲第１９項に記載の免疫化学検定方
    法。 ２１、ＨＴＬＶ−III蛋白質部分が、ＰＢ１からのもの
    である特許請求の範囲第１９項に記載の免疫化学検定方
    法。 ２２、ＨＴＬＶ−III蛋白質部分が、５９０からのもの
    である特許請求の範囲第１９項に記載の免疫化学検定方
    法。 ２３、ＨＴＬＶ−III蛋白質部分が、ＫＨ１からのもの
    である特許請求の範囲第１９項に記載の免疫化学検定方
    法。 ２４、（ａ）Ｒ１０、ＰＢ１、５９０及びＫＨ１からな
    る群から選ばれるＨＴＬＶ−III蛋白質のＨＴＬＶ−II
    I蛋白質部分が取り付けられている固体相からなってい
    る免疫吸着剤を、試験しようとする生物流体の試料と共
    に試料中の抗−ＨＴＬＶ−III抗体が免疫吸着剤に結合
    することができるような条件下で培養し （ｂ）試料から免疫吸着剤を分離し、そして、（ｃ）試
    料中に抗−ＨＴＬＶ−IIIが存在することの指標として
    免疫吸着剤に抗体が結合したかどうかを決定する、 段階からなる生物流体中のＨＴＬＶ−IIIに対する抗体
    を検出する方法。 ２５、免疫吸着剤に抗体が結合したかどうかを決定する
    段階が、その免疫吸着剤を生物流体が由来する種の抗原
    に対する標識された抗体と共に、免疫吸着剤を培養する
    ことからなり、その後で培養期間の後に標識された抗体
    から免疫吸着剤を分離し、そして免疫吸着剤と結合した
    標識を検出することからなる特許請求の範囲第２４項に
    記載の方法。 ２６、抗体が免疫吸着剤に結合したかどうかを決定する
    段階が、免疫吸着剤をＲ１０、ＰＢ１、５９０及びＫＨ
    １からなる群から選ばれるＨＴＬＶ−III蛋白質の標識
    されたＨＴＬＶ−III蛋白質部分と共に培養し、免疫吸
    着剤を標識されたＨＴＬＶ−III蛋白質から分離し、そ
    して免疫吸着剤と結合した標識を検出することからなる
    特許請求の範囲第２４項に記載の方法。 ２７、抗体が免疫吸着剤に結合したかどうかを決定する
    段階が、免疫吸着剤を標識されたプロテインＡと共に培
    養し、免疫吸着剤を標識されたプロテインＡから分離し
    、そして免疫吸着剤と結合した標識を検出することから
    なる特許請求の範囲第２４項に記載の方法。 ２８、（ａ）Ｒ１０、ＰＢ１、５９０及びＫＨ１からな
    る群から選ばれるＨＴＬＶ−III蛋白質のＨＴＬＶ−II
    I蛋白質部分で被覆されたビーズからなる免疫吸着剤を
    用意し、（ｂ）試料中の抗−ＨＴＬＶ−III抗体が免疫
    吸着剤に結合できるような条件下で、免疫晴着剤を血清
    または血漿試料と共に培養し、 （ｃ）免疫吸着剤と試料を分離し、 （ｄ）抗−（人ＩｇＧ）抗体が、免疫吸着剤に結合され
    た人抗−ＨＴＬＶ−III抗体と結合することができるよ
    うな条件下で免疫吸着剤を標識された抗−（人ＩｇＧ）
    抗体と共に培養し、 （ｅ）免疫吸着剤を結合されていない抗−（人ＩｇＧ）
    抗体から分離し、そして、 （ｆ）試料中のＨＴＬＶ−IIIに対する抗体が、存在す
    る印として免疫吸着剤と結合している標識を評価するこ
    と、 からなる段階からなる人の血清または血清試料中のＨＴ
    ＬＶ−IIIに対する抗体を検出する方法。 ２９、免疫吸着剤が、動物蛋白質の後被覆物を更に含ん
    でいる特許請求の範囲第２８項に記載の方法。 ３０、標識された抗−（人ＩｇＧ）抗体が、動物の抗体
    であって血清または血漿試料が同じ種の動物の正常な血
    清で希釈される特許請求の範囲第２８項に記載の方法。 ３１、抗−（人ＩｇＧ）抗体が、ヤギの抗体であって血
    清または血漿試料が正常なヤギの血清で希釈される特許
    請求の範囲第２８項に記載の方法。 ３２、抗−（人ＩｇＧ）抗体が、ラジオアイソトープ、
    酵素または蛍光化合物で標識される特許請求の範囲第２
    ８項に記載の方法。 ３３、Ｒ１０、ＰＢ１、５９０及びＫＨ１からなる群か
    ら選ばれるＨＴＬＶ−III蛋白質のＨＴＬＶ−III蛋白質
    部分が、結合されている固体相からなるＨＴＬＶ−III
    に対する抗体の固相免疫化学検定用の免疫吸着剤。 ３４、固相がガラスまたはプラスチックビーズ、ミクロ
    滴定プレートのウェルまたは試験官である特許請求の範
    囲第３３項に記載の免疫吸着剤。 ３５、更に、動物蛋白質後被覆物を含んでいる特許請求
    の範囲第３３項に記載の免疫吸着剤。 ３６、薬理学的に受入れられる賦形薬中の、Ｒ１０、Ｐ
    Ｂ１、５９０及びＫＨ１からなる群から選ばれるＨＴＬ
    Ｖ−III蛋白質のＨＴＬＶ−III蛋白質部分の抗原性を有
    している１またはそれ以上のＨＴＬＶ−III蛋白質を含
    んでいるワクチン組成物。 ３７、上記ＨＴＬＶ−III蛋白質が、Ｒ１０のＨＴＬＶ
    −III蛋白質部分の抗原性を有している特許請求の範囲
    第３６項に記載のワクチン組成物。 ３８、上記ＨＴＬＶ−III蛋白質が、ＰＢ１のＨＴＬＶ
    −III蛋白質部分の抗原性を有している特許請求の範囲
    第３６項に記載のワクチン組成物。 ３９、上記ＨＴＬＶ−III蛋白質が、５９０のＨＴＬＶ
    −III蛋白質部分の抗原性を有している特許請求の範囲
    第３６項に記載のワクチン組成物。 ４０、上記ＨＴＬＶ−III蛋白質が、ＫＨ１のＨＴＬＶ
    −III蛋白質部分の抗原性を有している特許請求の範囲
    第３６項に記載のワクチン組成物。 ４１、（ａ）Ｒ１０、ＰＢ１、５９０及びＫＨ１からな
    る群から選ばれる、少なくとも１つのＨＴＬＶ−III蛋
    白質の少なくとも１つのＨＴＬＶ−III蛋白質部分が結
    合されている固体相と試料中の抗−ＨＴＬＶ−III抗体
    を免疫吸着剤に結合させるような条件下で、試験すべき
    生物流体の試料からなる免疫吸着剤、 （ｂ）標識されたＨＴＬＶ−III抗体、及び （ｃ）免疫吸着剤と結合した標識を検出する為の手段、 からなる生物流体中のＨＴＬＶ−IIIに対する抗体を検
    出するのに使用するキット。 ４２、抗−ＨＴＬＶ−III抗体が、検出できる標識とし
    て抗−（人ＩｇＧ）抗体で標識されている特許請求の範
    囲第４１項に記載のキット。
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