JP2000189164A - ＨＩＶのＮｅｆ遺伝子を多量発現するプラスミドとその作製方法 - Google Patents

ＨＩＶのＮｅｆ遺伝子を多量発現するプラスミドとその作製方法

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敦 斉藤
Hideo Shinagawa
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Tokuo Nakada
篤男 中田
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 ＨＩＶのＮｅｆ蛋白の低コストによる安全な
量産体制を確立する。 【解決手段】 ＨＩＶのＮｅｆ遺伝子ｃＤＮＡを、大腸
菌ＵＴ４８１／ｐＵＲ２９０系列で間接発現、又は大腸
菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴ７−７で直接発現させる。
発現プラスミドとその作製方法、並びに精製Ｎｅｆ蛋白
が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】この発明は、ヒト免疫不全ウ
イルスのＮｅｆ遺伝子を多量発現するプラスミドとその
作製方法、及びその発現産物であるＮｅｆ蛋白をも併せ
て提供し、遺伝子工学による医薬品や診断剤等の製造分
野、また、研究用試薬として分子生物学、ウイルス学、
医学、薬学、獣医学、免疫学等の分野で利用できる。
【０００２】
【従来の技術】１９８１年に米国でエイズが発見されて
以来、その治療と予防を世界規模で確立するため、分離
されたエイズウイルス（ＨＩＶ）株間の比較研究が疫
学、免疫学、ウイルス学、分子生物学等を駆使して集中
的に進められ、現在既に該ウイルスに関する有用な報告
が多数集積されている（Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ
ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第６巻、１３９−１５
９，１９８８年；Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐａｔｈｏｇｅ
ｎｅｓｉｓ，第５巻、１４９−１５７，１９８８年；
“Ｖｉｒｏｌｏｇｙ”，Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ等編、第
２巻、１４３７−１５８９ページ、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅ
ｓｓ［米国］１９９０年発行）。尚、この発明でいうＨ
ＩＶは、ヒト免疫不全ウイルス、いわゆるエイズの病原
体であるエイズウイルスを意味し、１型（ＨＩＶ−１）
と２型（ＨＩＶ−２）に大別される。ＨＩＶの主な特徴
は、エンベロープ、単鎖ＲＮＡ型ゲノム、及び逆転写酵
素を有することである。このウイルスは直径８０−１０
０ｎｍの球形で、そのゲノムは分子量約３×１０６の線
状の（＋）鎖ＲＮＡ２分子からなり、これ等の２分子は
インバーティッドダイマー（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｄｉｍ
ｅｒ）を形成している。ＨＩＶゲノムは逆転写酵素及び
ウイルス粒子内部（コア）の構造蛋白質と複合体を形成
し、プライマーｔＲＮＡと共にウイルス粒子に内在す
る。ウイルスゲノムは、約１０種類の遺伝子で構成され
ており、基本的には、ウイルス増殖に必須のウイルス粒
子成分をコードする３つの主要な遺伝子、即ち、ウイル
ス・コアの３種類の構造蛋白質の前駆物質をコードする
Ｇａｇ（ｇｒｏｕｐ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅ
ｎｓ）遺伝子、３種類の酵素の前駆体をコードするＰｏ
ｌ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）遺伝子、及びエンベロープ
の２種類の糖蛋白質の前駆物質をコードするＥｎｖ（ｅ
ｎｖｅｌｏｐｅ）遺伝子からなる。これ等の遺伝子は、
５′末端から順に ｇａｇ、 ｐｏｌ、 ｅｎｖ、
３′末端へと配列し、更に詳しくは、 ｇａｇ・ ｐｏ
ｌ・ ｓｏｒ… ｅｎｖ・ｎｅｆ の順に隣接配列して
おり、この発明に係るＮｅｆ遺伝子は、全長が約０．４
ｋｂ、分子量が約２７ｋｄであり、負の調節因子（ｎｅ
ｇａｔｉｖｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ）
をコードしており、該調節因子は、ＨＩＶゲノムの発現
に抑制的に作用してＨＩＶの増殖を止め、潜伏感染に関
与していると考えられている（“Ｖｉｒｏｌｏｇｙ”，
Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ等編、第２巻、１５３４−１５３
５ページ、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ ［米国］１９９０
年発行）。ＨＩＶ抗原の量産に関し、主なものは、Ｅｎ
ｖ遺伝子がコードする前駆体糖タンパクｇｐ１６０とそ
のプロセッシング産物であるｇｐ１２０及びｇｐ４１等
であり（「エイズ対策最前線」、小松敏昭編著、下巻、
４７７−４９５ページ、シーエムシー１９８９年発
行）。例えば、ｇｐ１６０の生産では、バキュロウイル
スベクターと昆虫細胞（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅ
ｎｃｅｓ［ＵＳＡ］，ｖｏｌ．８４，ｐｐ．６９２４−
６９２８，１９８７）、組換えワクチニアウイルスとＢ
ＳＣ−４０又はＨｅＬａ細胞（Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．
３２０，ｐｐ．５３７−５４０，１９８６；同前、ｖｏ
ｌ．３３０，ｐｐ．２５９−２６２，１９８７）、アデ
ノウイルスベクターとＡ５４９細胞（“Ｖａｃｃｉｎｅ
８９”，ｐｐ．２０７−２１７，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ １９８９
年発行）等の使用が報告されている。また、ｇｐ１２０
遺伝子領域を挿入連係したプラスミドとＣＨＯ株化細胞
による該領域の発現（Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２３
３，ｐｐ．２０９−２１２，１９８６）、大腸菌による
ｇｐ１２０の生産（Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２３４，
ｐｐ．１３９２−１３９５，１９８６）等も報告されて
いる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】ＨＩＶ抗原の量産で
は、前述の通り、その主力がＥｎｖ蛋白に注がれてお
り、Ｎｅｆ蛋白は、その機能と抗原性の観点から、エイ
ズの発症機序の解明や診断、治療等の分野において有用
かつ重要であるにも拘らず、量産の確立は未だ知られて
いない
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、前述の課
題を解決するため、鋭意研究を重ねた結果、遺伝子組換
え技術を駆使することにより、Ｎｅｆ蛋白の量産と精製
に成功した。この発明によれば、Ｎｅｆ蛋白の多量発現
または量産が可能なプラスミドとその作製方法並びにそ
の発現産物であるＮｅｆ蛋白が精製されたかたちで提供
される。かかるＮｅｆ蛋白は、レトロウイルス感染症の
予防や治療の研究の材料として、例えば、遺伝子工学、
蛋白工学、分子生物学、レトロウイルス感染症に対する
薬物療法剤や抗ウイルス剤の開発等の分野での試薬とし
て、また、ワクチン、診断剤、抗体作製等の抗原として
極めて有用である。
【０００５】
【発明の実施の形態】（Ｉ）ＨＩＶのＮｅｆ遺伝子ｃＤ
ＮＡ断片の調製：組換えＤＮＡ技術による遺伝子発現で
は、ＨＩＶゲノムがＲＮＡであるため、上記各遺伝子
は、これと相補的なｃＤＮＡ断片に変換して使用する。
斯かるｃＤＮＡ断片は、宿主染色体に組込まれているプ
ロウイルスゲノムやクローン化された非組込み型の環状
ＤＮＡから調製することができる。また、ウイルス粒子
から抽出したゲノムＲＮＡを鋳型として使用し、逆転写
酵素を用いる公知の常法により作製したｃＤＮＡライブ
ラリーから選別し調製することも可能である。しかしな
がら、上述の調製では危険度の高いＨＩＶを直接取扱う
ため、生物災害防止の観点から、必ずしも容易ではな
い。従って、該ウイルスによる生物災害を回避すると共
に、上記調製工程の省力化を図るには、公知かつ既製の
ＨＩＶゲノムｃＤＮＡクローンの使用が推奨される。即
ち、前述の通り、現在既に、ＨＩＶゲノムのクローニン
グ、制限酵素地図の作成、塩基配列の決定等が世界各地
の研究者により報告されているので、これ等の成果の活
用が安全かつ簡便であり、望ましい。例えば、ＨＩＶ−
１プロウイルスゲノムクローンであるプラスミドｐＮＬ
３−１、ｐＮＬ３−２及びｐＮＬ４−３（Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第５９巻、２８４−２９
１ページ、１９８６年）、ＨＩＶ−１のＮｅｆ遺伝子ク
ローンであるＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９／ｐＮＬＨ１５２
（微工研条寄第３１７９号）が保有のプラスミドｐＮＬ
Ｈ１５２等が入手可能であり使用できる。ｃＤＮＡ断片
の調製は、公知の常法、例えば、上述のクローンからＮ
ｅｆ遺伝子領域のＤＮＡを制限酵素で切出した後、フェ
ノール抽出、クロロフォルム処理、エタノール沈澱等に
より精製し行うことができる。尚、ＤＮＡ断片の切出し
に使用する制限酵素は、各クローンの制限酵素地図を参
考にして適宜選択できる。例えば、上記ｐＮＬＨ１５２
のＮｅｆ遺伝子領域の切出しには、Ｈｉｎｄ ＩＩＩと
ＸｈｏＩの両制限酵素を用いることができる。
【０００６】（ＩＩ）Ｎｅｆ遺伝子発現プラスミドの構
築、及び該プラスミドを移入した形質転換体の作製：上
述に従って調製したＨＩＶゲノムｃＤＮＡ断片を、公知
の常法、例えば、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて多量発現
遺伝子内又は遺伝子直接発現ベクター内に挿入連係する
ことにより、Ｎｅｆ遺伝子発現プラスミドを構築する。
尚、かかる発現プラスミドの構築には、公知又は市販の
発現用のベクター、例えば、腸内細菌科のプラスミドベ
クターｐＳＮ５０８系列（米国特許第４，７０３，００
５号）、酵母のプラスミドベクターｐＪＭ１０５（特開
昭６２−２８６９３０）とｐＢＨ１０３系列（特開昭６
３−２２０９８）、弱毒水痘ウイルス・ベクター（特開
昭５３−４１２０２）、弱毒マレック病ウイルス・ベク
ター（欧州公開特許第３３４５３０号）、大腸菌のプラ
スミドベクターｐＵＲ２９０系列（ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒ
ｎａｌ、第２巻、１７９１−１７９４、１９８３年）、
ｐＳＮ５１８２（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌｏｇｙ、第１５７巻、９０９−９１７ページ、１
９８４年）及びｐＴ７−７（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ
ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏ
ｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ［ＵＳＡ］、第８２巻、１０７４
−１０７８ページ、１９８５年）等が使用できる。かか
る構築において重要なことは、Ｎｅｆ遺伝子を発現量の
多い遺伝子と連係することである。例えば、上述のｐＵ
Ｒ２９０を用いる場合には ｌａｃＺ遺伝子の下流に、
ｐＳＮ５１８２では ｐｓｔＳ遺伝子の下流に、また、
ｐＴ７−７ではＴ７プロモータ支配下のｐＴ７−７由来
のオリゴペプチド遺伝子の下流にそれぞれ、Ｎｅｆ遺伝
子を挿入連係することが好ましい。また、遺伝子の挿入
連係に際し、注意すべき点は、翻訳が円滑に進行するよ
う遺伝子相互のコドン解読枠（フレーム）を一致させる
ことにある。即ち、Ｎｅｆ遺伝子フレームが多量発現遺
伝子のそれと一致するよう連係する。かかる工夫によ
り、Ｎｅｆ遺伝子の発現量は保証される。尚、上記フレ
ームの一致は、制限酵素、ヌクレアーゼＢａｌ３１、マ
ングビーン（ｍｕｎｇ ｂｅａｎ）ヌクレアーゼ等の酵
素を用いる公知の常法により達成できる。また、構築し
た発現ベクターを移入し形質転換体を得る目的で用いる
最適な受容細胞は、その発現ベクターの複製と発現とを
許容する感受性宿主細胞から選択し、同時に、かかる宿
主細胞のうち、構築した発現ベクターの移入が容易かつ
確実に検出できる細胞を厳選して使用する。例えば、発
現用ベクターとして上述のｐＳＮ系列を用いる場合には
受容菌として、該ベクター移入による形質転換体を薬剤
耐性をマーカーとして選別できる大腸菌Ｃ７５株微工研
菌寄第１０１９１号）の使用が好ましく、また、ｐＵＲ
２９０系列及びｐＴ７−７を用いる場合には、これ等の
ベクターが移入された形質転換体をアンピシリン耐性を
マーカーとして選別できる大腸菌ＵＴ４８１株（Ｊｏｕ
ｒｎａｌｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、第１６３
巻、３７６−２８４ページ、１９８５年）及び大腸菌Ｂ
Ｌ２１（ＤＥ３）株（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１８９巻、第１号、１
１３−１３０ページ、１９８６年）等の使用が望まし
い。かかる受容細胞への発現ベクターの移入は、公知の
常法、例えば、塩化カルシウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏ
ｆ ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、第５３巻、１
５４−１６２ページ、１９７０年）により行うことがで
きる。また、上述Ｎｅｆ遺伝子発現プラスミドが移入さ
れた形質転換体は、上記マーカーが陽性のコロニーから
選別する。次に、選別された形質転換体コロニーから該
発現ベクターＤＮＡを抽出の後、制限酵素で切断し、こ
れをアガロースゲル電気泳動にかけ、挿入連係されたＤ
ＮＡ断片のサイズを測定することにより、該遺伝子ＤＮ
Ａ断片の存在が確認されたコロニーを、Ｎｅｆ遺伝子発
現の形質転換体クローンとして採用する。
【０００７】（ＩＩＩ）形質転換体クローンによるＮｅ
ｆ遺伝子発現の確認、及び該形質転換体の培養による各
種蛋白の大量生産：形質転換体クローンによる遺伝子発
現の確認は、例えば、ウェスタンブロット法を用いて、
該クローン培養物の粗抽出液を分析して行うことができ
る。粗抽出液は、例えば、形質転換体を公知の培地中で
培養の後、低速遠心により集菌し、これをドデシル硫酸
ナトリウムと２−メルカプトエタノールで処理し、次い
で、高速遠心にかけ、その上清を採取することにより調
製できる。また、ウェスタンブロット法は、多種多様に
市販されている各種材料を用い、常法に従って、次の順
序で行うことができる：上記粗抽出液をポリアクリルア
ミドケル電気泳動にかける；分離した蛋白質をトランス
ブロットセルを用いてニトロセルロース膜上に転移させ
る；該膜をゼラチン液に浸しブロッキングする。次に、
かかる膜上の被検体，即ち、ＨＩＶのＮｅｆ蛋白を、例
えば、ＨＩＶキャリアー血清と一次反応させる；これを
洗浄の後、更に、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトｌｇＧ抗
体と二次反応させる；これを洗浄の後、過酸化水素液と
発色剤で発色させ、ＨＩＶキャリアー血清と特異的に反
応するバンドを検出することにより、上記クローンでの
Ｎｅｆ遺伝子の発現を確認する。Ｎｅｆ遺伝子の発現が
確認された形質転換体の培養によるＮｅｆ蛋白の大量生
産は次の通り行う：該形質転換体の本培養用シードを調
製するため、例えば、形質転換体が大腸菌の場合、ＬＢ
培地中で、菌体濃度が２×１０９〜８×１０９細胞／ｍ
ｌに達するまで、３０〜４０℃で１２〜３５時間培養す
る；次に、予め調製した培養用培地１０００ｌに対し、
かかるシード１〜１０ｌを接種混合の後、前培養と後培
養からなる２段階培養を行う。前培養は、シード細胞の
増殖並びに発現ベクターの増幅を目的として行うもので
あり、１０〜４０℃で１〜２４時間、好ましくは、１５
〜３７℃で２〜１２時間行い、例えば、大腸菌の場合に
は、培養下の菌体濃度、即ち、培養液濁度ＯＤ６００ｎ
ｍ＝０．１〜２．０を目安として前培養を終了する。次
いで、かかる前培養の完了に伴い、該培養系を後培養へ
移行させる。後培養は、発現ベクターに連係のＮｅｆ遺
伝子が転写及び翻訳され、活性を有するＮｅｆ蛋白の生
成を確保すると同時に、翻訳後の遺伝子産物が宿主細胞
に由来のタンパク分解酵素により無秩序に分解され失活
するのを避けるため、細心の注意と創意の下で設定され
るべきである。尚、後培養は、前培養に比べ相対的に低
温の方が望ましく、１０〜４０℃で１〜４０時間、好ま
しくは、１５〜３７℃で３〜３５時間行なう。また、使
用する発現ベクターの性質を考慮し、例えば、後培養開
始時に、培地中のリン酸の飢餓化、培地中へのインデュ
ーサーの添加混合等を行うことにより、発現の促進や誘
導を図ることができる。この発明によれば、上述の２段
階培養の実施により、Ｎｅｆ蛋白が、培養全菌体蛋白の
１０％（Ｗ／Ｗ）以上、又は培地１ｌ当り約１〜３０ｍ
ｇの高収量で生産される。
【０００８】（ＩＶ）発現ベクターにより量産されたＮ
ｅｆ蛋白の精製：この工程は、公知の常法を組合わせて
用いることにより達成できる。例えば、沈澱剤、遠心、
濾過等による形質転換体培養物の採取；超音波処理、加
圧減圧処理、ホモジナイザー等により形質転換体細胞の
破壊ないしは破砕による粗抽出液の調製；珪酸や活性炭
による吸脱着処理、塩析、有機溶媒による沈澱等による
精製；超遠心法、カラムクロマトグラフィー、電気泳動
法等を用いる分画による高度精製；また、珪酸及び活性
炭に吸脱着の後、密度勾配遠心にて分画する遺伝子産物
の精製法（特開昭６３−２９７）等の常法により、上記
各蛋白ないしは各酵素の精製が可能である。本発明の作
成法により得られる発現ベクターはアンプル、バイアル
瓶等の小型容器内で密封された状態、又は宿主に移入し
た状態で提供される。また、本発明に係る発現ベクター
により量産される各コア蛋白、プロテアーゼ、逆転写酵
素及びインテグラーゼ各酵素は、液状、乾燥粉末、又は
濾紙や膜等に吸着の状態で、アンプル、バイアル瓶等の
小型容器内に密封し、提供できる。液状の場合はそのま
ま必要量使用し、乾燥の場合は、蒸溜水で溶解し乾燥前
の体積まで戻した後、必要量使用する。濾紙や膜等に吸
着の場合には、使用書に指定の溶液で湿潤させた後、使
用する。以下、本発明の具体例につき実施例を挙げて説
明する。但し、本発明は、以下の実施例にのみ限定され
るものではない。
【０００９】
【実施例】実施例１ ＨＩＶ−１のＮｅｆ遺伝子を挿入・連結した発現プラス
ミドの構築：ＨＩＶ−１プロウイルスＤＮＡクローンｐ
ＮＬ４−３をＨｉｎｄ ＩＩＩで切断し、生じた約１．
５ｋｂのＤＮＡ断片をクローニングベクターｐＨＳＧ３
９８のＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入し、ｐＮＬＨ１５２を
作製した。ｐＮＬＨ１５２をＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏ
Ｉで切断し、この時生じた約０．７２ｋｂのＸｈｏ
Ｉ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をＳａｌ Ｉ及びＨｉｎｄＩＩ
Ｉで開裂した発現ベクターｐＵＲ２９２（Ｔｈｅ ＥＭ
ＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，２（２）：１７９１−１７９
４，１９８３）に挿入・連結し、ｐＮＦ１０２を作製し
た。ｐＮＦ１０２をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切
断し、生じた約０．７２ｋｂのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩ
ＩＩ断片をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで開裂した発
現ベクターｐＴ７−７に挿入・連結してｐＴＦ１０３を
作製した。ｐＴＦ１０３をＢａｍＨＩで開裂し、Ｔ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼで処理した後、自己連結させてｐＴＮ
１０４を作製した。ｐＮＦ１０２はβ−ガラクトシダー
ゼと、Ｎｅｆ蛋白のアミノ酸３５番目から２０６番目
（Ｃ末端）までの領域とからなるキメラ蛋白を多量に発
現する。ｐＴＮ１０４はＮｅｆ蛋白のアミノ酸３５番目
から２０６番目までの領域のＮ末端にｐＴ７−７のマル
チクローニング部位由来の１１アミノ酸から成るペプチ
ドが付加されたキメラ蛋白を多量に発現する。これらキ
メラ蛋白は、ウェスタンブロッティングでＨＩＶ−１感
染者血清と特異的に反応した。発現の宿主として、ｐＮ
Ｆ１０２ではＪＭ１０３株及びＵＴ４８１株を、ｐＴＦ
１０４ではＢＬ２１（ＤＥ３）株を用いた。
【００１０】実施例２ ＨＩＶ−１のＮｅｆ蛋白を多量に発現するベクターの構
築：ｐＮＬＨ１５２をＨｉｎｄＩＩＩ及びＨｉｎｃＩＩ
で切断し、生じた約０．９６ｋｂのＨｉｎｃＩＩ−Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ断片を、ＨｉｎｃＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで
開裂したＭ１３ｍｐ１９に挿入・連結し、Ｎｅｆ１９・
（Ｈｃ−Ｈ）を作製した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａ
ｇｅｎｅｓｉｓによりＮｅｆ１９・（Ｈｃ−Ｈ）上のＮ
ｅｆ遺伝子の翻訳開始コドン（ＡＴＧ）直前の塩基配列
ＡＡＧをＣＡＴに改変し、新たにＮｄｅ Ｉ部位を挿入
したＮｅｆ１９・（Ｎｄｅ）を作製した。Ｎｅｆ１９・
（Ｎｄｅ）をＮｄｅ Ｉ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断し、
生じた約０．８２ｋｂのＮｄｅ Ｉ−ＨｉｎｄＩＩＩ断
片を、Ｎｄｅ Ｉ及びＨｉｎｄＩＩＩで開裂した発現ベ
クターｐＴ７−７に挿入・連結し、ｐＴ７−Ｎｅｆを作
製の後、ｐＴ７−ＮｅｆをＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入
し形質転換体クローンＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴ７−Ｎ
ｅｆを得た（微工研条寄第４６２１号）。この形質転換
体の培養によるＮｅｆ蛋白の発現・蓄積の量は、全菌体
蛋白の１０％以上であった。
【００１１】実施例３ Ｎｅｆ蛋白の抽出と精製：実施例２で得たＢＬ２１（Ｄ
Ｅ３）／ｐＴ７−Ｎｅｆをアンピシリン２０μｇ／ｍｌ
含有のＬＢ培地［Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎ１％（Ｗ
／Ｖ），Ｂａｃｔ−ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ０．
５％（Ｗ／Ｖ），およびＮａＣｌ １％（Ｗ／Ｖ）］で
３７℃にて１８時間培養した。新鮮ＬＢ培地（２０μｇ
／ｍｌアンピシリン含有）に前述の培養液を１／１００
容量相当を加え、３７℃にて培養した。培地の濁度ＯＤ
６００ｎｍが１．０に達した時、ＩＰＴＧ［ｉｓｏｐｒ
ｏｐｙｌ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ，シグマ社
（米国）製］を１ｍＭとなるよう加え、更に、３７℃に
て５時間培養した。遠心操作（５，０００ｒｐｍ，１０
分）により菌体を集め、培養液の１／５０容量の２０ｍ
Ｍリン酸ナトリウムｐＨ７．０に浮遊し、超音波処理
（３０秒処理を６回，１９．５ｋＨｚ，３００Ｗ）後、
遠心操作（１９，０００ｒｐｍ，６０分）により得られ
た上清を粗抽出液として分離した。 Ｎｅｆ蛋白の粗精製：粗抽出液に３５％飽和となるよう
硫酸アンモニウムを加え、攪拌後、遠心操作（１６，０
００ｒｐｍ，２０分）を行った。得られた沈澱を２０ｍ
Ｍリン酸ナトリウムｐＨ７．０に溶解し、同液で透析を
行った。 Ｎｅｆ蛋白の精製：透析後の試料を２０ｍＭリン酸ナト
リウムｐＨ７．０で平衡化したＳ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
（ファルマシア社［スウェーデン］製）に通した。０及
至１Ｍの塩化ナトリウム勾配により溶出し、Ｎｅｆ蛋白
を含む画分をプールし、２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ
７．０で透析した。これを、ハイドロキシアパタイトカ
ラム（ＫＢカラム，（株）高研製）に通し、２０及至７
００ｍＭのリン酸ナトリウム勾配にて溶出を行った。Ｎ
ｅｆ蛋白を含む画分をプールし、２０ｍＭ トリス・Ｈ
Ｃｌ ｐＨ８．３， ５ｍＭ ２−メルカプトエタノー
ルで透析を行った。この試料をＭｏｎｏ０カラムに通
し、０及至１Ｍの塩化ナトリウム勾配により溶出を行っ
た。Ｎｅｆ蛋白を含む画分をプールし、精製Ｎｅｆ蛋白
とした。１ｌの形質転換体培養液から約７ｍｇの精製Ｎ
ｅｆ蛋白を得ることができた。大腸菌で多量産生し、精
製したＮｅｆ蛋白は、Ｎ末端のメチオニン残基が除去さ
れていたが、ミリストイル化は受けておらず、Ｎ末端ア
ミノ酸配列はＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ
−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−
Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｖａｌ−…で、塩基配列から
予測されるアミノ酸配列と一致した。
【００１２】実施例４ 精製Ｎｅｆ蛋白を用いるＨＩＶ−１の診断：実施例３で
得た精製Ｎｅｆ蛋白を、０．１％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ−１
０％（Ｗ／Ｖ）ポリアクリルアミド上で電気泳動し、次
いで、ニトロセルロース膜［Ｓ＆Ｓ社（西独）製］上に
ブロットした後、ブロッキングのため、該膜を３％（Ｗ
／Ｗ）ゼラチン溶液に浸漬した。ＨＩＶ−１Ｎｅｆ蛋白
に対する抗体の存在は、ウェスタンブロット法によりヒ
トＨＩＶ−１キャリアー（７例）の血清を用いて検査し
た。健康な成人（９例）の血清についても同様に検査し
た。その結果を表１に示す。ＨＩＶ−１キャリアー血清
７例のうち６例が、Ｎｅｆ蛋白と反応し陽性（＋）であ
り，残りの１例が陰性（−）であった。この結果は、本
発明により得られる精製Ｎｅｆ蛋白がＨＩＶ感染の特異
的な検出及び診断に有効であることを示している。
【００１３】
【表１】
【００１４】
【発明の効果】（１）本発明は、ＨＩＶのＮｅｆ蛋白の
量産を可能にすると共に、その製造工程下で極めて危険
度の高いＨＩＶそのものを使用しないため、バイオハザ
ード対策の観点から、優れて安全であり、また、製造作
業も容易である。 （２）培養液１ｌ中のＮｅｆ蛋白の量は、全菌体蛋白の
１０％以上、精製蛋白として約７ｍｇであり、生産量及
び生産収率が極めて高い。 （３）ＨＩＶに特異性の高い高純度のＮｅｆ抗原が廉価
かつ大量に提供されるため、エイズの基礎研究、高度の
選択毒性を有する特異的な治療剤や予防剤の開発、診断
等に長足の進歩をもたらすと共に、人類の保健衛生への
福音となる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 中田 篤男 大阪府豊中市東豊中町６丁目24番１−201 号

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】大腸菌ＵＴ４８１においてＨＩＶ遺伝子を
    発現するプラスミドであって、プラスミドｐＵＲ２９０
    シリーズのｌａｃＺ遺伝子内にフレームを一致させてＨ
    ＩＶのＮｅｆ遺伝子ｃＤＮＡの全長又はその断片を挿入
    連係することを特徴とするプラスミドの作製方法。
  2. 【請求項２】請求項１に記載の作製方法により得られる
    プラスミド。
  3. 【請求項３】大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）においてＨＩＶ
    遺伝子を発現するプラスミドであって、プラスミドｐＴ
    ７−７のプロモーター下流に近接してＨＩＶのＮｅｆ遺
    伝子ｃＤＮＡの全長又はその断片を挿入連係することを
    特徴とするプラスミドの作製方法。
  4. 【請求項４】請求項３に記載の作製方法により得られる
    プラスミド。
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