JP2693145B2 - 乳頭腫ウイルス型特異的抗体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【発明の属する技術分野】本発明は、乳頭腫ウイルス
（Ｐapillomavirus(ＰＶ)、パピローマウイルス）のポ
リヌクレオチド配列中に、ＰＶの型および種の区別なら
びに識別に有用なヌクレオチド配列のセグメントが存在
するという発見に関するものである。ゲノム中のこの領
域(可変領域)は特定のＰＶ型に特異的であって、与えら
れた特定のＰＶに特異的なＤＮＡプローブ、抗体(標識
化および非標識化)、ポリペプチドセグメント、標識化
ポリペプチドセグメント、およびワクチンの製造の基礎
を形成する。 【０００２】本発明の別の局面によれば、さらに全ての
ＰＶのポリヌクレオチド配列は、全ＰＶに特有であり且
つＰＶ属特異的、即ち任意のＰＶを認識および区別し、
非ＰＶウイルスおよびウイルス生産物を識別するポリペ
プチドセグメント(標識化および非標識化)および抗体
(標識化および非標識化)の製造の基礎を形成する高度保
存化領域を含んでいることが発見された。この後者のＤ
ＮＡ配列は、「属特異的」と呼ばれる。 【０００３】[背景技術]人の癌の誘起に関係するウイル
スの探査は挫折の多いものであった。数多くのウイルス
が、ヒトの癌ウイルスとしての可能性があるものとして
新たな興味をひいてきた。こうしたウイルスの１つがヒ
ト乳頭腫ウイルス(ＨＰＶ)である。ＨＰＶは電子顕微鏡
によって見ることができた最初のウイルスの１つである
が、このウイルスの生物学についての情報は、最近まで
殆んど得られなかった。初期の研究は、ＨＰＶが悪性腫
瘍と結び付いているという直接の示唆を提供することが
できなかった(これらの研究は、ローソーン等によりバ
クテリオロジカル・レビュー(Ｂacteriol．Ｒev.)３１
巻１１０〜１３１頁(１９６７)に論評されている)。し
かしながら、早くも１９３０年代に、ワタオウサギの乳
頭腫ウイルス(ＣＲＰＶ)がその宿主の種に対し発癌性で
あるということが実験的証拠によって示されていた[ル
ース等、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メデ
ィスン(Ｊ．Ｅxp．Ｍed)６５巻５２３〜５４８頁(１９
３５)]。さらに、他の動物の乳頭腫ウイルスが実験動物
に腫瘍を発生させ、幾つかのものは培養細胞に形態学上
の形質転換を起こすことができるということがわかった
[オルソン等、アーカイブス・オブ・エンバイアランメ
ンタル・ヘルス(Ａrch．Ｅnviron．Ｈealth)１９巻８２
７〜８３７頁(１９６９)]。しかし、実験動物へのＨＰ
Ｖの実験的移入も、また、ウイルス複製または生物学的
活性の発現を許容する組織培養系のいずれもが成功しな
かった。したがって、ＨＰＶの研究は大部分が乳頭腫か
ら得られるウイルス粒子(ビリオン)の物理的および化学
的性格決定に限定されてきた。 【０００４】培養物中でＨＰＶウイルスの複製を許容す
る系を確立することの不可能性は、詳細な分子解析を可
能にするウイルスＤＮＡ配列の分子クローニングにより
ある程度克服できた。さらに、解剖学的な部位嗜好性を
有する、最小限の関連性を有する数多くのウイルス型が
発見され、また、悪性の可能性がある病変中にＨＰＶ抗
原およびＤＮＡが見出された。以前には、これらの病変
の原因は、他の伝染性物体または何か他の未知の病因に
帰せられていた。これらの発展により、ＨＰＶの研究が
ウイルス発癌の立場から魅力あるものとなった。乳頭腫
ウイルス属の成員は、小さく(直径５０〜５５nm)、二十
面の対称性を有するエンベロープの無いウイルスである
ことが知られている。このゲノムは、約８０００塩基対
(８kb)を含む円形の二本鎖ＤＮＡ分子より成る。ビリオ
ンは、ウイルス陽性の乳頭腫から、電子顕微鏡により、
また、表皮を機械的に破壊し、次いで一連の分別遠心分
離工程および塩化セシウム中でのバンド化を行なうこと
によって容易に単離できる。殆んどの試料において２本
のバンドが現われ、この一方は１.３３g／ml、他方は
１.２９g／mlに現われる。前者はＤＮＡの入った「全体
の」ビリオンを表わし、後者は「空の」ウイルス殻から成
っていると信じられている。このＤＮＡは、ビリオンを
イオン性界面活性剤で破壊し、有機抽出により蛋白質を
除くことによって単離できる。得られたＤＮＡ試料は通
常、２つの形のＤＮＡ、即ち高次コイル分画(ＦoＩ)お
よびニツク円形(nicked−circular)型(ＦoII)を含んで
いる。 【０００５】牛に感染する５種の相異なるウイルス、即
ち、乳頭腫ウイルス(ＢＰＶ)が同定されている。これら
のウイルスは、ＤＮＡ配列の相同性、抗原としての関連
性、組織特異性(皮膚または粘膜表面)の程度が異なり、
違った型の病変(線維乳頭腫または乳頭腫)を誘発する。
ヒト乳頭腫ウイルスは、さらに大きな多様性を示す。現
在１８の異なるＨＰＶ型が文献に記載されており、さら
に別の型が発見されるであろうことが予測されている。
ウイルスの新規な型として分類するためには、標準的な
ハイブリダイゼーション条件下において既分類ウイルス
と５０％以上のＤＮＡ配列の相同性があってはならな
い。与えられたウイルス型に対し５０％より大きな配列
相同性をもってハイブリダイズするＤＮＡは、サブタイ
プとみなされる[コーギン等、キャンサー・リサーチ(Ｃ
ancer Ｒes.)３９巻５４５〜５４６頁(１９７９)]。標
準的ハイブリダイゼーションは、ＤＮＡの融解温度より
２５℃低い温度(Ｔm−２５℃)で実施し、この温度では
約１７％の塩基が誤対合をおこす[レアー等、ネーチャ
ー(Ｎature)２２４巻１４９〜１５４頁(１９６９)]。現
在ＨＰＶは、配列相同性と感染部位の点で、以下の表Ｉ
に示すように分類できるようである。 【０００６】 【表１】 【０００７】皮膚表面に感染するウイルスは、粘膜表面
に感染するものよりも、他の皮膚感染性ＨＰＶに対しあ
る程度相同性が高いようである。さらに、ある特定のウ
イルス型は専らその病変部位と結び付くが、時には他の
病変部位に見出され得る。ジェンセン等の報告 [ラボラ
トリー・インベスティゲーション(Ｌab．Ｉnvest.)４７
巻４９１〜４９７頁(１９８２)]によると、ＨＰＶ−１
は足底疣贅の約８５％に存在するが、ＨＰＶ−２もまた
低率の足底疣贅に検出されており、逆の事も言える。特
に興味深いのはヒト乳頭腫ウイルスの３、５、８〜１
０、１２〜１５および１７型の群である。これらのウイ
ルスは、全身性化した粃糠疹様病変を特徴とする稀な退
行性病変である疣状表皮異形成(ＥＶ)または扁平疣贅を
もつヒトに付随して見出される[ジャブロンスカ等、キ
ャンサー・リサーチ(Ｃancer Ｒes.)３２巻５８３〜５
８９頁(１９７２)]。３および１０型を除き、この群の
ＨＰＶは健康人の疣贅からは検出されておらず、免疫抑
制された腎の同種移植片受容者の病変からに限り確認さ
れている[ルツナー等、ジャーナル・オブ・インベステ
ィゲイティブ・ダーマトロジー(Ｊ．Ｉnvest．Ｄermato
l.)７５巻３５３〜３５６頁(１９８０)]。さらに、ＨＰ
Ｖ−５およびＨＰＶ−８を含む病変は、日光に暴露され
る領域に存在する場合、しばしば悪性のものに変化する
ことが報告されている。原発生および転移性の癌のハイ
ブリダイゼーション分析により、これらの腫瘍の中にＨ
ＰＶ−５およびＨＰＶ−８のＤＮＡ配列が存在すること
がわかった[オース等、セルプロリファレーション(Ｃel
l Ｐrolif.)７巻２５９〜２８２頁(１９８０)]; オス
トロー等、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンシズ(Ｐroc．Ｎatl．Ａc
ad．Ｓci.)７９巻１６３４〜１６３８頁(１９８２)およ
びプフィスター等、レビューズ・オブ・フィジオロジー
・バイオケミストリー・アンド・ファーマコロジー(Ｒe
v．Ｐhysiol．Ｂiochem．Ｐharmacol.)９９巻１１１〜
１８１頁(１９８３)]。 【０００８】厳密でないハイブリダイゼーション条件を
用いた最近の研究によれば、ＨＰＶと他の動物の乳頭腫
ウイルスの間でそうであるように、各ＨＰＶゲノムのゲ
ノム間で同一のＤＮＡ配列が維持されていることが実証
された [ハイルマン、Ｃ.Ａ.、シ゛ャーナル・オフ゛・ウイロロシ゛ー(Ｊ.
Ｖirol.)３２巻１９９〜２０７頁(１９７９)]。したが
って、現在では、ＰＶ特異的ＤＮＡプローブを用いてＰ
Ｖ誘発性と思われる病変から取り出したＤＮＡを調べ、
非厳密ハイブリダイゼーション条件を使用することによ
り関連する配列を探すことが可能である。この試みは、
未知の型のＨＰＶのＨＰＶＤＮＡ配列ならびに肛門性器
疣贅から調製されたＤＮＡ[クルツィツェク、Ｒ.Ａ.
等、ジャーナル・オブ・ウイロロジー(Ｊ.Ｖirol.)３６
巻２３６〜２４４頁(１９８０)]および若年性喉頭乳頭
腫からのＤＮＡ[ランカスター、Ｗ.Ｄ.、インターウイ
ロロジー(Ｉntervirology)１５巻２０４〜２１２頁(１
９８１)]について成功することが立証された。 【０００９】ＰＶゲノムの分析のための適当な組織培養
系が無いにもかかわらず、分子クローニング技術により
生産された大量のＤＮＡの配列解析の結果、このウイル
スゲノムの考え得る機能についてのかなりの洞察が進め
られた。牛乳頭腫１型(ＢＰＶ−１)[チェン等、ネーチ
ャー(Ｎature)２９９巻５２９〜５３４頁(１９８２)]、
ＨＰＶ−１a[ダノス等、エンボ・ジャーナル(Ｅmbo.
Ｊ.)１巻２３１〜２３６頁(１９８２)]およびＨＰＶ−
６b[シュバルツ等、エンボ・ジャーナル(Ｅmbo.Ｊ.)２
巻２３４１〜２３４８頁(１９８３)]のヌクレオチド配
列が現在知られている。同様に既知なのは、ＨＰＶ−１
１、ＨＰＶ−１６、および鹿の乳頭腫(ＤＰＶ)のＤＮＡ
配列である。 【００１０】乳頭腫ウイルスは抗原性の点で同族である
ということも立証されている。特異的ＨＰＶの無傷なウ
イルス粒子に対して生成された抗血清は型特異的であ
り、他の型のＨＰＶに感染した組織中では反応しない
が、熱および界面活性剤で破壊したＰＶビリオンに対し
て生成された抗血清は、全てのＨＰＶおよび他の動物種
のＰＶのキャプシド抗原と交差反応する[ジェンセン、
Ａ.Ｂ.等、ジャーナル・ザ・ナショナル・キャンサー・
インスティテュート(ＪＮＣＩ)６４巻、４９５〜５００
頁(１９８０)]。この知見により、乳頭腫ウイルスの主
要キャプシド蛋白質中には、この属特異的抗原交差反応
性の原因となる共通のアミノ酸配列があり、この共通の
アミノ酸配列はビリオン粒子表面に露出していないとい
う考察が導かれた[ホーレイ、Ｐ.Ｍ.、アーカイブズ・
オブ・パソロジー・アンド・ラボラトリー・メディスン
(Ａrch．Ｐathol．Ｌab．Ｍed．)１０６巻４２９〜４３
２頁(１８８２)]。 【００１１】したがって、通常のＰＶ抗原に対して生成
された抗血清の使用は、既知または未知の任意のＨＰＶ
に増殖的感染した細胞の同定に有用である。この交差反
応性抗血清により、病理学者および臨床研究者は、若年
性喉頭乳頭腫[コスタ、Ｊ．等、アメリカン・ジャーナ
ル・オブ・クリニカル・パソロジー(Ａm．Ｊ．Ｃlin．
Ｐathol.)７５巻１９４〜１９７頁(１９８１)； および
ラック、Ｅ．等、インターウイロロジー(Ｉntervirolog
y)１４巻１４８〜１５６頁(１９８１)]および頚部扁平
疣贅[カーマン、Ｒ.Ｊ.等、アメリカン・ジャーナル・
オブ・オブステトリクス・アンド・ギネコロジー(Ａm．
Ｊ．Ｏbstet．Ｇynecol．)１４０巻９３１〜９３５頁
(１９８１); およびモリン、Ｃ．等、ジャーナル・オブ
・ザ・ナショナル・キャンサー・インスティテュート
(ＪＮＣＩ)６６巻８３１〜８３５頁(１９８１)]の病変
物質としてＨＰＶを同定することができた。しかしなが
ら、この抗血清は、特異的ＨＰＶの同定には有用でな
く、または適当でない。さらに、この抗血清は初期段階
の感染または蛋白質の発現が起こっていない感染を拾い
上げるには役立たないため、ウイルス感染が蛋白質の発
現が起こっている時点まで進行していることが必須であ
る。 【００１２】今日までＨＰＶゲノムの機能的局面につい
ては殆んど知られていない。動物の乳頭腫ウイルス系に
関しては、より多くの情報が得られている。ゲノムの体
制は乳頭腫ウイルス間で高度に共通しているため、動物
とヒトの乳頭腫ウイルスの間にゲノム構造および機能に
関して同様な関係を想定するのは理にかなっている。動
物の乳頭腫ウイルスの幾つかは高い発癌性があるため、
この機能の全てまたは一部の幾つかのＨＰＶの性質でも
あり得るということが考えられる。尋常性疣贅、足底疣
贅、および扁平疣贅といった多くのＨＰＶ誘発性病変は
全く良性であり、臨床上癌腫への進行に結び付くことは
ない。しかしながら、幾つのＨＰＶは、時に扁平上皮癌
への二次的展開を伴い、ＨＰＶ−５は、疣状表皮異形成
の患者において皮膚癌と結び付く。若年性喉頭乳頭腫は
乳頭腫ウイルスＨＰＶ−１１によって惹起される。照射
をせずに喉頭の湿潤性側頭鱗癌に自然移行した稀な症例
が、ランケル、Ｄ．等によりアメリカン・ジャーナル・
オブ・サージカル・パソロジー(Ａm．Ｊ．Ｓurg．Ｐath
ol.)４巻２９３〜２９６頁(１９８０)に記載されてい
る。照射療法の後には、より頻繁に若年性喉頭乳頭腫症
の経過が扁平上皮癌に進行する。肛門性器疣贅（condol
oma acuminata）は数多くの異なったＨＰＶによって引
き起こされる。文献には、この病変の若干例が局所性湿
潤性扁平上皮癌に進行したとの報告がある[ツア・ハウ
ゼン、Ｈ．、カレント・トピックス・イン・ミクロバイ
オロジー・アンド・イミュノロジー(Ｃurr．Ｔop．Ｍic
robiol．Ｉmmunol.)７８巻１〜３０頁(１９７７)]。さ
らに、ＨＰＶ特異性抗原が、異形成と解釈される頚部病
変の５０％に検出された。頚部異形成と同部位における
癌腫および湿潤性頚部癌腫との明白な疫学上の結び付き
は、少なくともこの進行におけるＨＰＶの役割を強く示
唆するものである。 【００１３】数多くのＰＶが存在し、或るＰＶ誘発性病
変に１以上のＰＶが存在するということ、乳頭腫と様々
な癌腫との厳密な結び付き、そして、ウイルス誘発性乳
頭腫から導かれる癌に関連しない医学上の問題から、高
度の確実性をもって、乳頭腫の特異的病因を同定する方
法論に対する、進行中の且つ絶えず増大する必要性が生
じた。したがって、存在が知られている多数のＰＶ型の
識別手段、ならびに尚未知のＰＶ型をさらに同定する手
段の必要性が存在し続けている。 【００１４】同時に、全ＰＶに共通する高度共通性ヌク
レオチド配列およびこの高度共通性ヌクレオチド配列が
コードしている「共通抗原」の決定は大きな価値があり、
かつその必要性が存在し続けている。この配列の決定
は、全ＰＶと交差反応性の抗体の生産において大きな価
値があるであろう。 【００１５】表皮細胞の増殖的乳頭腫ウイルス感染は、
有棘層の細胞の過形成(棘細胞症)につながることが現在
知られている。細胞は大きさを増し、橋小体と張原綿維
の数を増す。他の表皮細胞は、張原綿維の消失、橋小体
の剥離、核のしわ、細胞質の空胞化を伴う変性的変化を
示す。表皮の上層においては、これらの変化がより著名
である。顆粒層の細胞は、核の変性、辺縁趨向、および
クロマチンの凝縮を示す。ビリオンは電子顕微鏡による
とケラチン層の変性細胞の核中およびしばしば結晶間列
に現われる。 【００１６】乳頭腫ウイルス感染に対する宿主免疫反応
は良くわかっていないが、感染は通例若年者に起こり、
その後疣贅の持続が様々な期間に及ぶ。緩解後、宿主は
同ウイルスによる再感染に対し免疫が残る。人間の場
合、ＨＰＶ感染に対する抗体反応は、緩解の開始に先立
つＩgＭの出現を特徴とする。緩解直後にＩgＭ及びＩg
Ｇ抗体が出現し、緩解のずっと後にＩgＧのみが検出で
きる[フォン・クルー、Ｇ.Ｊ.、ダーマトロジー(Ｄerma
tol.)１８巻１９５〜２０４頁(１９７９)]。ＩgＭから
ＩgＧへのこの転換は、実験的にＢＰＶな感染させた牛
において同様に観察された[リー、Ｋ.Ｐ．等、キャンサ
ー・リサーチ(Ｃancer Ｒes.)２９巻１３９３〜１３９
７(１９６９)]。 【００１７】乳頭腫の拒絶は細胞性免疫と密接に結び付
いていると思われる。実験的に乳頭腫ウイルスに感染さ
せた牛においては、緩解に先立って単核白血球、主にリ
ンパ球の浸潤がおこる。これは通例血管周辺領域に起こ
るが、乳頭腫全体の瀰漫性散乱としても起こる[リー、
Ｋ.Ｐ.等、ジャーナル・オブ・インベスティゲイティブ
・ダーマトロジー(Ｊ.Ｉnvest.Ｄermatol.)５２巻〜４
５４〜４６４頁(１９６９)]。 【００１８】人間の場合、緩解しつつある扁平疣贅は、
上部真皮における単核白血球の血管周辺への浸潤、そし
て乳頭腫に限局された表皮への侵入を伴う。類似の組織
学的外観を呈す[タガミ、Ｈ．等、ジャーナル・オブ・
ダーマトロジー(Ｊ．Ｄermatol.)９０巻１４７〜１５４
頁(１９７４)]。離れた部位におけるこの複数の疣贅の
同時緩解は、細胞性免疫が乳頭腫の拒絶に主たる役割を
演じていることを示唆している。しかしながら、扁平疣
贅の緩解は同一人物の足底または手掌疣贅に影響せず、
これは緩解がＨＰＶの型特異的であることを示すもので
ある[バーマン、Ａ.等、ブリティッシュ・ジャーナル・
オブ・ダーマトロジー(Ｂr.Ｊ.Ｄermatol.)９９巻１７
９〜１８２頁(１９７８)]。複数の型のＢＰＶに感染さ
せた牛においても同様の別々な疣贅緩解が観察された
[バートルド、Ｓ.Ｗ.等、ジャーナル・オブ・ジ・アメ
リカン・ベタリナリー・メディカル・アソシエーション
(Ｊ.Ａm.Ｖet.Ｍed.Ａssoc.)１６５巻２７６〜２８０頁
(１９７４)]。 【００１９】[発明の開示]特異的ＰＶを同定するアッセ
イを開発するため、特異的ＰＶに対する抗血清を作り、
ここから競合的かつ／または免疫測定的アッセイを開発
するのが望ましい。足底疣贅には大量のウイルス物質が
存在し、またストリンジェントな条件下ではＨＰＶ−Ｉ
ＤＮＡと交差ハイブリダイズするＨＰＶＤＮＡが同定さ
れていないため、ＨＰＶ−１のような或る乳頭腫ウイル
スについて型特異的抗原または抗体を調製することがで
きる。しかしながら、粘膜表皮に感染するウイルスにつ
いては、免疫原物質として使用する充分量のウイルス粒
子を得ることが極めて困難である。キャプシド蛋白質上
に存在(恐らく内部に)するとわかっている共通の抗原決
定基の故に、ポリクローナル抗体が他のＰＶとの交差反
応性を最も産み出し易いと思われる。 【００２０】存在が知られている種々のＰＶを区別する
アッセイに対する必要性が募るにあたり、本発明者等は
初めに、キャプシド蛋白質中の型特異的抗原決定領域
が、各ＰＶの主要キャプシド蛋白質をコードしているＤ
ＮＡ配列をコンピューター解析することから推定し得る
と考えた。分子クローニング技術により、配列決定を行
なうに充分量のＤＮＡが得られた。 【００２１】この概念が、本発明、即ち与えられた型の
主要なＰＶキャプシド蛋白質(Ｌ１)をコードしている開
放読み取り枠（open reading frame，オープンリーディ
ングフレーム）のＤＮＡ配列が、実際には他のいかなる
ＰＶ型の対応セグメントとも実質上同一性を示さない少
なくとも１個のＤＮＡセグメントを含んでいるという発
見、そして、この非同一ＤＮＡ配列がＰＶ型特異的ＤＮ
Ａプローブ、型特異的免疫原的および／または免疫学的
特性を与えるオリゴペプチド、標識化オリゴペプチド、
標識化抗体、実質上純粋な抗体、診断方法、アッセイキ
ット、およびワクチンの製造に利用できるという発見に
導いた。 【００２２】同様の解析により、本発明の他の局面、即
ち主要キャプシド蛋白質Ｌ１をコードしている配列内に
おける共通ＰＶ抗原をコードする高度に共通したＤＮＡ
配列の発見が導かれた。この抗原(ポリペプチド)は、任
意の且つ全てのＰＶと交差反応性の抗体の生成を導き出
す。この高度に共通したヌクレオチド配列の発見は、Ｐ
Ｖ属特異的抗体、属特異的免疫原的および免疫学的特性
を与えるオリゴペプチド、属特異的標識化抗体、診断方
法、アッセイキット等の製造を可能にする。 【００２３】[発明を実施する最良の方法]本発明は任意
のＰＶに適用できる。当分野において常套であり周知の
配列決定技術、即ちマクサムおよびギルバート(１９７
７)の方法(引用としてここに記載する)を用いて、主要
キャプシド蛋白質のＬ１読み取り枠のヌクレオチド配列
を得るだけでよい。最初のＡＴＧコドンが最初のアミノ
酸であると考えられる。既に知られているＰＶ配列、特
に下記に指摘する型特異的配列との比較、または例えば
コンピューター処理による比較を利用した共通の相同領
域を比べることにより、ヌクレオチド配列内の可変領
域、即ちＰＶ型特異性を付与することのできる領域の決
定が容易にできる。 【００２４】このようにＤＮＡ配列中にＰＶ型特異的可
変領域が位置するのであるから、次には、(１)型特異的
プローブとしてこのＤＮＡ配列自体を標識化した形で利
用し、(２)ＰＶ型特異的競合アッセイにおいて、ＤＮＡ
配列から誘導できるペプチド配列を、標識化した形で利
用し、(３)ＤＮＡ配列から誘導できるペプチド配列か
ら、ＰＶ型特異的な実質上純粋な抗体を製造し、(４)免
疫測定アッセイ用に、標識化したＰＶ型特異的抗体を製
造し、(５)ＰＶ型特異的免疫原性を付与するためのアミ
ノ酸配列を製造し、そして、(６)ＰＶ型特異的アミノ酸
フラグメントからＰＶ型特異的ワクチンを製造すること
ができる。一言で言えば、本明細書に別個に記載された
型特異的可変領域のヌクレオチド配列に対して述べられ
た任意の且つ全ての用途は、本発明、即ち全てのＰＶに
振替可能な技術および概念の結果として、今や当分野に
おける通常の知識を有する者にとって利用可能である。 【００２５】例えば、図１〜３に示されるのは、ハッシ
ュのマトリックスアルゴリズムを用いたコンピューター
解析による３つの関連の無いウイルス、ＢＰＶ−１、Ｈ
ＰＶ−１aおよびＨＰＶ−６bのＬ１ヌクレオチド配列の
比較である。図１〜３は、かなりの程度の配列の相同性
を有する領域があることを示している。対角線はＬ１読
み取り枠内の相同領域を表わす。対角線に沿った各デー
タの点についての相同性の程度を、各々の図の下の棒グ
ラフに示す。図１はＢＰＶ−１(Ｘ軸)対ＨＰＶ−１aの
比較であり、図２はＢＰＶ−１(Ｘ軸)およびＨＰＶ−６
bの比較であり、図３はＨＰＶ−６b(Ｘ軸)とＨＰＶ−１
aとの比較である。 【００２６】ＢＰＶ−１とＤＰＶについてのＬ１読み取
り枠のアミノ酸配列を比較すると、遺伝暗号の過剰のた
めに、Ｌ１ポリヌクレオチド配列について示されるより
高度の一致が現われている(図４)。Ｌ１開放読み取り枠
のヌクレオチド配列の翻訳によって、アミノ酸配列が決
定された。このアミノ酸は１文字暗号で表現し(レーニ
ンジャー、Ａ.Ｌ.、バイオケミストリー(Ｂiochemistr
y)第２版７２頁(１９７５)を見よ)、ポリペプチド配列
に最初のメチオニン残基から番号を付ける。ＢＰＶ−１
配列は全て大文字であり、ＤＰＶ配列上に食い違いが生
じた場合、そのアミノ酸は小文字である。配列のずれ
は、整列の目的のために採用した。一致箇所は２つの対
応残基間の縦線として印を付けた。 【００２７】図５においては、約１０％のＤＮＡ配列相
同性を有し(液相ハイブリダイゼーション)、抗原性のう
えで交差反応性(ごく弱く働く)である２種のウイルス、
ＢＰＶ−１およびＤＰＶを比較している。５個の領域を
除きアミノ酸の一致は極めて高い。ＤＰＶアミノ酸配列
との実質的な一致を示さない、長さにして６個のアミノ
酸より長いＢＰＶ−１アミノ酸配列上の領域(Ｌ１読み
取り枠の最初のメチオニン残基から教える)は、２７〜
３１位、４６〜５７位、２６０〜２８１位、３４２〜３
４８位および４６５〜４８４位であり、これは型特異性
を司っている可能性のある領域を表わす。ＢＰＶ−１ア
ミノ酸配列を部分的ＢＰＶ−２アミノ酸配列と比較した
場合、３４２〜３４８位および４６４〜４９５位のアミ
ノ酸によってつながった領域に殆んど完全な一致があ
り、これら２つの密接に関連するウイルス間に示される
アミノ酸の一致からの実質的な逸脱を示す２６２〜２８
３位の領域がある。図５において、アミノ酸配列はＬ１
開放読み取り枠のヌクレオチド配列の翻訳によって決定
した。アミノ酸は１文字暗号で表現し、ポリペプチド配
列には最初のメチオニン残基から番号を付けてある。Ｂ
ＰＶ−１配列は全て大文字とし、ＢＰＶ−２またはＤＰ
Ｖ配列上に食い違いが起こった時、そのアミノ酸を小文
字としてある。配列のずれは整列の目的のために採用し
た。“ "は、未知のＢＰＶ−２Ｌ１ヌクレオチド配列
の領域を示す。一致箇所は２つの対応残基間の縦線とし
て印を付けてある。 【００２８】図６〜７は、ＢＰＶ−１、ＤＰＶ、ＨＰＶ
−１a、ＨＰＶ−６b、ＣＲＰＶおよびＢＰＶ−２の一部
についてのＬ１読み取り枠のアミノ酸配列を示す。それ
ぞれのＬ１の開放読み取り枠のヌクレオチド配列の翻訳
によってアミノ酸配列を決定した。アミノ酸は１文字暗
号で表現してあり、各配列に最初のメチオニン残基から
番号を付けてある。２またはそれ以上が一致する場合ア
ミノ酸を大文字とし、小文字のアミノ酸は不一致を示し
ている。配列のずれは整列の目的のために導入した。
“ "は、未知のＢＰＶ−２ヌクレオチド配列の領域を
示す。「−」は、少なくとも２個のアミノ酸が同一である
ことを、そして「＊」は、全てのアミノ酸が同一であるこ
とを示す。 【００２９】ＢＰＶ−１Ｌ１読み取り枠の２６２〜２８
３位(両端を含む)のアミノ酸によりつながっている領域
が型特異的免疫原を示すという概念を確認するため、２
７４〜２８３位間のアミノ酸に見出されるデカペプチド
を合成し、これに対する抗体を生成した。ＢＰＶ−１Ｌ
１配列から導き出されるデカペプチドは、以下の配列
(Ｎ末端より): lys−asn−asn−lys−gly−asp−ala−thr−leu−ｌｙ
ｓ を有する。この配列は１文字暗号を用いると、 ＫＮＮＫＧＤＡＴＬＫ となる。 【００３０】合成ポリぺプチドに対して抗体を生成させ
る方法の完全な詳細ならびにその結果は、下記の実施例
１に報告する。ウサギ由来の無傷のＢＰＶ−１に対する
超免疫血清はＢＰＶ−１と交差反応することがわかっ
た。さらに約１０倍の低希釈でＢＰＶ−２と反応するこ
ともわかった。デカペプチドに対し生成された抗体は
１：２の希釈でさえＢＰＶ−２線維乳頭腫と反応しなか
ったが、一方これは１：５０の希釈でＢＰＶ−１の線維
乳頭腫と反応した。この結果は、デカペプチドに対する
抗体はＢＰＶ−１型特異的である事を強く指示し、そし
てより重要なことに、この型特異的抗体は、乳頭腫ウイ
ルスの型とサブタイプ間の分類（即ちＤＮＡ配列の一致
が５０％より多いか少ないか)を規定するために用いら
れる２種のウイルス(ＢＰＶ−１およびＢＰＶ−２)を識
別することができる。ＢＰＶ−１ウイルスおよびＢＰＶ
−２ウイルスは５０％のＤＮＡ配列相同性を有する。 【００３１】本発明の１つの局面は、それ自身型特異的
であって、やはり型特異的である比較的小さなアミノ酸
配列をコードしている、Ｌ１読み取り枠中の或るヌクレ
オチド配列の発見に向けられている。この隔離された配
列は、独自の用途、即ち標識化した形でのＤＮＡハイブ
リダイゼーション分析のための用途を有する。「隔離さ
れた配列(isolated sequence)」という語は、フラグメン
トとして天然に存在せず、自然の状態で見出し得ないＤ
ＮＡフラグメントを包含することを意味している。この
配列は、典型的には長さにして５〜７５のヌクレオチ
ド、好ましくは最低１８ヌクレオチドの長さである。 【００３２】図８は、ＢＰＶ−１ゲノムおよびＢＰＶ−
２ゲノムの６０４０〜６７５４間のヌクレオチドのＤＮ
Ａ配列の相同性の比較を示している。棒グラフはウイル
スゲノム間の相同性の程度を表わしており、６４４０位
からすぐ上流の領域は最低度の配列相同性を示してい
る。上方のヌクレオチド配列は、この領域内の相同性の
程度を示す。同一のヌクレオチドに「＊」印を付けてあ
る。この配列相同性の低い領域は、アミノ酸の相違があ
るＬ１開放読み取り枠の領域を表わす。棒線はＢＰＶ−
１型特異的抗体を生成するために合成し使用したポリペ
プチドをコードしている領域を示す。 【００３３】Ｌ１開放読み取り枠中、最も興味深い領域
は、最初のメチオニン残基から教えられた場合、ＢＰＶ
−１についてはアミノ酸位置２６２〜２８３(２２のア
ミノ酸、６６のヌクレオチド)、ＤＰＶについてはアミ
ノ酸位置２６３〜２８３(２１のアミノ酸、６３のヌク
レオチド)、ＨＰＶ−１aについてはアミノ酸位置２７１
〜２９４(２４のアミノ酸、７２のヌクレオチド)、ワタ
オウサギ乳頭腫ウイルス(ＣＲＰＶ)についてはアミノ酸
位置２６６〜２９(２５のアミノ酸、７５のヌクレオチ
ド)、ＨＰＶ−６bについてはアミノ酸位置２６３〜２８
３(２１のアミノ酸、６３のヌクレオチド)、そしてＢＰ
Ｖ−２についてはアミノ酸位置２６２〜２８３(２２の
アミノ酸、６６のヌクレオチド)である。各ウイルスに
ついてのこの領域のヌクレオチド配列を以下に示す： 【００３４】 【表２】【００３５】この、型特異性を与えるＤＮＡ領域は、型
特異的アミノ酸配列、即ち主要なキャプシド蛋白質を形
成しているアミノ酸配列内の比較的小さなアミノ酸配列
であるポリペプチドをコードしている。本発明に対し、
「比較的小さな型特異的アミノ酸配列」および「比較的小
さなフラグメント」という語は、そのペプチドに免疫原
的および／または免疫学的特異性を与えるアミノ酸配列
を包含する。それ自身としては、このペプチドは最低６
個のアミノ酸を含み、その両側に位置する大体３個まで
の天然に存在するアミノ酸を含み得る。ただし、この天
然に存在する非特異的な側面のアミノ酸は、ペプチドを
特異性の(異なった型の)ＰＶに対し交差反応性とする程
の数で存在してはならない。このアミノ酸配列に関する
上限として１５〜２５のアミノ酸残基が本発明に包含さ
れる。しかしながらさらに、本発明の範囲内にあるため
には、このポリペプチドが免疫特異性でなければならな
い。 【００３６】「型特異的ポリペプチド」および「特定のＰ
Ｖに対し特異的なアミノ酸配列を有するポリペプチド」
という語は、Ｌ１キャプシド蛋白質に対応し型特異性
(上記定義による「型特異的」および「型特異性」)を付与す
るポリペプチドを包含することを意味している。本発明
のポリペプチドは、好ましくはＢＰＶ−１のＬ１キャプ
シド蛋白質の残基２５１〜２９１、最も好ましくは残基
２６２および２８３によって結合したアミノ酸配列に対
応する。この語は、天然に存在するポリペプチド、天然
に存在するポリペプチドとホモローガスな合成ポリペプ
チドおよびその誘導体の両者を包含する。「その誘導体」
とは、天然の配列とは異なるがなお型特異性を付与する
ポリペプチドを意味する。 【００３７】さらにこの発明は、型特異性を付与する領
域内からの型特異的な免疫原的および／または免疫学的
特性を与えるに充分な残基を含み、さらに天然配列の一
部ではない他の残基をも含むよう合成された合成ペプチ
ドをも包含する。本発明に係る比較的小さな型特異的ア
ミノ酸セグメントは、下記の実施例１に記載の技術を利
用して、例えば型特異的ＰＶ抗血清を製造するのに利用
することができる。しかしながら本発明は抗血清および
抗体が製造される方式によって決して制限されず、この
発明は、単離された抗原からの抗体の産生を含む既知の
またはなお決定されるべき技術を包含するものである。 【００３８】上のように、天然に存在するペプチドセグ
メントは、可変領域内に、型特異性を付与するに充分な
量のアミノ酸を含み、ただし可変領域の各側に３個まで
の側面に位置するアミノ酸を含むことができる。当業者
には理解できるように、配列を適正に並べるために、時
としてアミノ酸配列中に空白を挿入することが必要であ
る。 【００３９】アミノ酸配列を調整するとき、各配列にお
いて対応する残基の位置と正確な相同関係を示す個々の
配列内の特異的領域が用いられる。数字で参照するため
に塩基配列としてＢＰＶ−１(図６〜７)アミノ酸配列を
用い、再び図６〜７に着目すると、正確な配列相同関係
を示す６つの乳頭腫ウイルス全部についてアミノ酸配列
内に５つの領域が存在することが容易に認められる。こ
れらの領域は、両端も含めて、残基１０５および１１０
間(６−アミノ酸配列、ＲＧＱＰＬＧ、以後領域Ａとす
る)、残基１９３および１９６間(４−アミノ酸配列、Ｄ
ＧＤＭ、以後領域Ｂとする)、残基２００および２０３
間(４−アミノ酸配列、、ＧＦＧＡ、以後領域Ｃとす
る)、残基２２７および２３０間(４−アミノ酸配列、Ｙ
ＰＤＹ、以後領域Ｄとする)および残基２９２および２
９５間(４−アミノ酸配列、ＰＳＧＳ、以後領域Ｅとす
る)である。 【００４０】図６〜７からわかるように、そこに示され
たＰＶの各々の主たるキャプシド蛋白質についてのアミ
ノ酸配列を調整すると(各々のポリヌクレオチドを配列
させることにより測定)、特に配列の相同性が全く無い
一領域が存在するが、それはＢＰＶ−１残基２５１〜２
９１、好ましくは２６２〜２８３に対応する残基間の領
域である。領域Ｄのテトラペプチドおよび領域Ｅのテト
ラペプチドにおける一致並びに可能な場合領域Ｄおよび
Ｅにより結合されたアミノ酸残基における一致に特に注
意することにより、図６〜７に示されたスペーシングを
測定した(およびすることができる)。この方法で、どの
ＰＶの場合でも型特異的配列を容易に決定することがで
きる。 【００４１】ＢＰＶ−１について上記で示されたよう
に、両端を含めた位置２５１〜２９１、好ましくは２６
２〜２８３に対応するＰＶのアミノ酸配列は、ＰＶのＬ
１キャプシド蛋白質内の型特異性領域を定める。同様
に、Ｌ１キャプシド蛋白質をコードするポリヌクレオチ
ド配列内の対応する領域は型特異的なＤＮＡ領域を定め
る。 【００４２】前述し、また示唆したように、どのような
ＰＶについても型特異性ＤＮＡ配列(およびアミノ酸配
列)を容易に測定することができる。必要なことはた
だ、主たるキャプシド蛋白質をコードする遺伝子のＤＮ
Ａを配列し、そこから蛋白質のアミノ酸配列を推測し、
ＢＰＶ−１のような既知の配列を用いて配列を調整し
(特に「標識配列」、領域Ａ−Ｅを利用する)、そしてＢＰ
Ｖ−１アミノ酸配列のアミノ酸残基２５０〜２９１、好
ましくは２６２〜２８３に対応するＤＮＡセグメント
(または対応するアミノ酸セグメント)を選択することで
ある。 【００４３】この発明の意図として、「型特異的乳頭腫
ウイルスＤＮＡ」または「既知の乳頭腫ウイルス型につい
て特異的なポリヌクレオチド配列」の語は、ＢＰＶ−１
アミノ酸配列または同様に型特異性を示す場合にはその
アミノ酸配列の誘導体の残基２５１〜２９１、好ましく
は２６２〜２８３に対応する主キャプシド蛋白質の型特
異的部分をコードするポリヌクレオチドを包含するもの
とする。当技術分野に精通していれば理解できることで
あるが、前記の語は、天然配列、天然配列に由来する合
成配列、遺伝コードの結果としての同義配列（degenera
te sequence）および「ゆらぎ(wobble)」による第３番目
の塩基における可変性による変形体である配列[ワトソ
ン等、「リコビナントＤＮＡ：ア・ショート・コース」
(Ｒecombinant ＤＮＡ:Ａ Ｓhort Ｃourse)、３８頁(１
９８３年)(フリーマン・アンド・カンパニー、ニューヨ
ーク)参照、以後「ゆらぎ誘導体」とする]を包含するもの
とする。 【００４４】さら前記の語は、型特異性を与えるのに充
分なヌクレオチドを目的とするポリヌクレオチド配列内
に含むＤＮＡ配列、すなわちどちらかの端部で重複する
ことによりＰＶゲノムの「型特異性フラグメント」を表わ
す配列を包含する。「型特異的な」または「型特異性」を示
すこの発明のポリヌクレオチドには、常套のハイブリダ
イゼーション技術を用いてＰＶ型(ただしＰＶは５０％
未満のＤＮＡ配列相同性を有する)を識別する能力を示
すポリヌクレオチドが含まれる。 【００４５】この発明の範囲内の特異的ポリヌクレオチ
ドには、ＢＰＶ−１配列上の位置２５１〜２９１、好ま
しくは２６２〜２８３に対応するポリペプチドをコード
する前記ポリヌクレオチド、遺伝コードの結果としての
同義配列および「ゆらぎ」による変形体が含まれる。 【００４６】この発明の別の具体例ではまた、乳頭腫ウ
イルスの主キャプシド蛋白質をコードするＤＮＡの特異
的ポリヌクレオチドセグメントは乳頭腫ウイルスにおけ
る「共通抗原」であるポリペプチドをコードすることが見
出された。 【００４７】「型特異的」ポリヌクレオチドおよびポリペ
プチドについて前述したものと同じ方法論を用いると、
ＢＰＶ−１が番号付けを目的として塩基アミノ酸配列を
示す場合、標識領域Ａとして前記で決められた残基１０
５および１１２間のヘキサペプチドに対応する全ＰＶの
アミノ酸配列が相同性であることが決定された。コード
されたこの６−アミノ酸配列は「共通抗原」を表わす、す
なわち種特異的な抗体を産生する。これらの種特異的抗
体は全ＰＶと交差反応性を示し、様々なイムノアッセイ
において有用なものである。標識されたペプチド配列お
よびその誘導体もまたイムノアッセイにおいて有用であ
る。要するに、型特異的ポリペプチドに対して予想され
た有用性はまた種特異的ポリペプチドにも当てはまるの
である(すなわち、標識抗体、アッセイキット等)。同様
に、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅまたは他の「共通」領域から選ばれた
相同性領域を含むヘキサペプチドもまたこの発明の範囲
内に含まれる。 【００４８】図６〜７からわかるように、この発明の態
様の一具体例は、ヘキサペプチド Ａrg−Ｇly−Ｇln−Ｐro−Ｌeu−Ｇly を含むものである。当技術分野に精通しておれば容易に
わかるように、それをコードする種特異的ポリヌクレオ
チドもまた含まれる。「誘導体」の語は、配列の種特異性
は不変であるが、対応する天然ポリペプチドとは異なる
アミノ酸配列を意味する。 【００４９】〔イムノアッセイ〕一具体例において、主
キャプシド蛋白質の型特異的および種特異的アミノ酸配
列に対してあげられた抗体は当業界においてよく知られ
た常用の標識技術を用いて検出可能に標識され得る。す
なわち、抗体は、例えば³Ｈ、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉおよび³⁵Ｓ
のような放射性同位元素を用いて放射能標識され得る。
同様に、ペプチド配列自体も例えば放射性同位元素によ
り検出可能標識され得る。 【００５０】型特異的もしくは種特異的抗体または種も
しくは型特異的なペプチド配列抗原もまた蛍光標識、酵
素標識、遊離基標識またはバクテリオファージ標識を用
い、当業界で周知の技術(チャード、前出)により標識さ
れ得る。一般的な蛍光標識には、フルオレセインイソチ
オシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコ
シアニン、アロフィコシアニンおよびテキサスレッドが
ある。 【００５１】特異的酵素は共有結合により他の分子に結
合され得るため、トレーサー物質の製造における標識と
して用いられ得るという可能性も存在する。適当な酵素
には、アルカリホスファターゼ、ベーターガラクトシダ
ーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナー
ゼ、マレエートデヒドロゲナーゼおよびペルオキシダー
ゼがある。２種の主な酵素イムノアッセイは、エンザイ
ムリンクトイムノソルベントアツセイ(ＥＬＩＳＡ)およ
びエンザイムマルチプライドイムノアッセイ(ＥＭＩ
Ｔ、シバ・コーポレイーション)としても知られている
ホモジニャスエンザイムイムノアッセイである。ＥＬＩ
ＳＡシステムの場合、例えば固相に結合した抗体を用い
ることにより分離が行なわれ得る。ＥＭＩＴシステムは
トレーサー抗体複合体における酵素の不活性化によるも
のである。すなわち分離段階を必要とせずに活性を測定
することができる。 【００５２】さらに、化学ルミネッセンス化合物も標識
として用いられ得る。一般的な化学ルミネッセンス化合
物には、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジ
ニウムエステル類、イミダゾール類、アクリジニウム塩
類およびオキシレートエステル類がある。同様に、生物
発光化合物も標識に用いられ得、ルシフェリン、ルシフ
ェラーゼおよびエクオリンが挙げられる。 【００５３】一度標識されると、抗原ポリペプチドまた
はこれに対する抗体は、当業界でよく知られた技術を用
いて免疫カウンターパート(抗体または抗原ポリペプチ
ド)を同定および定量化するのに用いられ得る。 ラジ
オイムノアッセイ(ＲＩＡ)に関する詳しい記載は、ワー
ク等による「ラボラトリー・テクニクス・イン・バイオ
ケミストリー・アンド・モレキュラー・バイオロジー」
(Ｌaboratory Ｔechniques in Ｂiochemistry and Ｍol
ecular Ｂiology)中、特にチャードによる「アン・イン
トロダクション・トウ・ラジオイミューン・アッセイ・
アンド・リレイテッド・テクニクス」と題する章に見い
出され(ノース・ホーランド・パブリッシング・カンパ
ニー、ニューヨーク、ニューヨーク、１９７８年)る
が、これを引用して説明とする。 【００５４】様々な型の一般的免疫測量アッセイに関す
る詳しい記載は、次の米国特許、４３７６１１０(デビ
ッド等)または４０９８８７６(ピアシオ)に見ることが
できる。特に興味深いアッセイは、ＰＶを含有する疑の
ある試験液の小試料をＰＶ型特異的抗原と反応性のある
精製抗体で被覆された不溶性ディスクとインキュベート
することを含む。ＰＶ型特異的抗原(アミノ酸配列)が液
中に存在する場合、免疫化学結合が抗原および固定化抗
体間に生じる。可溶性物質をすべて洗浄除去後、不溶性
ディスクを今度は酵素または放射能標識されたコンジュ
ゲート試薬と２回目のインキュベーションに付す。試料
中に抗原が存在する場合、第２免疫化学結合がディスク
上の固定化抗原および標識抗体間に生成する。再び非結
合物質をすべて洗浄除去後、ディスクを測定、例えば基
質と３回目のインキュベーションに付し、固定化酵素の
触媒影響下で化学反応させることにより検出可能な最終
生成物を製造する。この最終生成物は抗原が試料中に存
在する場合のみ溶液中に存在し得るものであり、抗原が
存在しないと固定化された標識が存在しないため最終生
成物は製造され得ない。 【００５５】さらに、この発明のアッセイに用いられる
物質は理想的にはキットの製造に適したものである。こ
のようなキットは、バイアル、試験管等のような１個ま
たはそれ以上の容器手段を閉鎖制限状態で受け入れるよ
うに区画された担体手段を有し得るものであり、前記容
器手段の各々は、方法で使用される分離要素の１つを含
む。 【００５６】例えば、前記容器手段の１つは、凍結乾燥
形態または溶液に可溶性の検出可能標識抗体を含有し得
る。別の容器の場合不溶性抗体を含有し得る。また担体
手段もさらに複数の容器を含み得、各容器は相異なる予
め測定された既知量の抗原を含む。次にこれら後者の容
器を用いて未知量の抗原を含む試料から得られた結果を
間にはさむことのできる標準曲線をつくることができ
る。 【００５７】〔ＤＮＡハイブリダイゼーションアッセ
イ〕ウイルスゲノムは、独特で複雑さが限られているた
め、様々なハイブリダイゼーションアプローチに特によ
く用いられる。これらの技術は、プローブとして用いら
れる核酸の放射能標識、固定化核酸を用いたＤＮＡ−Ｄ
ＮＡおよびＲＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション、サ
イトハイブリダイゼーション並びに溶液におけるＤＮＡ
−ＤＮＡおよびＲＡＮ−ＤＮＡハイブリダイゼーション
の反応速度分析方法をともなう。プローブとして用いら
れた核酸の純度および比放射能は非常に重要であり、一
般に高い比放射能を有する核酸を用いる。 【００５８】プローブとして用いられる核酸の純度は特
異的ハイブリダイゼーションにおける非常に重要な要素
である。感染細胞ではなく細胞外流体から得られたウイ
ルスを用いるのが好ましく、特に相補ＲＡＮ(cＲＡＮ)
または相補ＤＮＡ(cＤＮＡ)が用いられる。細胞から得
られたウイルスは、汚染された細胞ＤＮＡをともなう
が、これはデオキシリボヌクレアーゼ処理により必ずし
も除去されない。すなわち、第１段階は、デオキシリボ
ヌクレアーゼ処理が封入されたゲノムの分断をひき起こ
さないようにウイルス粒子の完全さを保つ当業界で周知
の方法により高度に精製されたウイルスを製造すること
である。抽出されたウイルスＤＮＡをこの時点で厳密に
精製するべきであり、精製後に現われるゲノムは大して
分断されていないため、大きさおよび密度またはスーパ
ーコイル状態のような物理特性に基づいて細胞核酸から
分離され得る。この後、高度精製エンドヌクレアーゼで
処理して同フラグメントとし、次に型特異的または種特
異的ウイルス蛋白質をコードする所望のヌクレオチド配
列を含むフラグメントを単離および回収する。別法とし
て、特異的ポリヌクレオチドプローブを独立して合成す
ることができる。最後に、プローブを検出可能標識する
が、最も用いられる標識は³Ｈ、³²Ｐ、¹²⁵Ｉ、酵素、ビ
オチン／アビジン等である。核酸ハイブリダイゼーショ
ン技術のさらに完全な説明は、ファング等、第６巻、４
５７〜４９７頁(１９７７年)で見ることができるが、こ
れを引用して説明とする。 【００５９】ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチ
ドプローブは原子または無機基で標識され得るが最もよ
く用いられるのは放射性核種であり、また、重金属も用
い得る。場合により、一本鎖ＤＮＡに交雑(ハイブリダ
イズ)されたプローブに特異結合する抗体を用いること
も可能である。オリゴヌクレオチドプローブ技術は、ス
ゾスタック等、「メソッズ・イン・エンザイモロジー」
(Ｍeth. Ｅnzymol.)６８巻４１９ー４２８(１９７９
年）に記載されているが、これを引用して説明とする。 【００６０】最も、一般的には、放射性標識が用いら
れ、適当な放射性標識には³²Ｐ、³Ｈ、¹⁴Ｃ等がある。
充分なシグナルを発し、充分な半減期を有するものなら
いずれの放射性標識でも用いられ得る。他の標識には、
配位子、蛍光剤、化学ルミネッセンサー、酵素、抗体等
がある。 【００６１】６種の単独ＰＶ型、ＢＰＶ−１、ＤＰＶ、
ＨＰＶ−１a、ＨＰＶ−６b、ＣＲＰＶおよびＢＰＶ−２
のヌクレオチド配列のコンピュータ分析により、完全に
非相同性であり、抗原型特異的蛋白質をコードするヌク
レオチド配列を確認した。配列は次の通りである。 【００６２】 【表３】ＢＰＶ−１ ＴＣＧＧＡＧＡＡＡＣＡＡＧＣＣＣＣＴＡＣＣＡＣＡＧＡＴＴＴ ＴＴＡＴＴＴＡＡＡＧＡＡＴＡＡＴＡＡＡＧＧＧＧＡＴＧＣＣＡ ＣＣＣＴＴＡＡＡ ＤＰＶ ＡＣＴＧＡＣＡＡＡＧＡＡＣＴＣＣＣＡＣＣＣＧＡＧＧＣＣＴＡ ＴＴＡＴＣＴＧＡＡＧＣＣＡＣＣＧＧＧＧＧＡＧＡＴＧＧＡＡＣ ＴＣＡＡＡ ＨＰＶ−１a ＴＣＧＴＴＧＧＧＴＧＡＴＡＧＧＧＡＧＧＣＡＧＴＣＣＣＡＣＡ ＡＡＧＣＴＴＧＴＡＴＴＴＡＡＣＡＧＣＡＧＡＴＧＣＴＧＡＡＣ ＣＡＡＧＡＡＣＡＡＣＴＴＴＡ ＣＲＰＶ ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＧＡＡＡＡＴＧＴＧＡＡＧＡＧＣＡＧＧＧＣ ＣＴＡＣＡＴＡＡＡＡＣＧＣＡＣＡＣＡＧＡＴＧＣＡＧＧＧＡＧ ＡＧＧＣＡＡＡＴＧＣＣＡＡＣＡＴＴ ＨＰＶ−６b ＧＡＧＧＴＧＧＧＧＧＡＡＣＣＴＧＴＧＣＣＴＧＡＴＡＣＡＣＴ ＴＡＴＡＡＴＴＡＡＧＧＧＴＡＧＴＧＧＡＡＡＴＣＧＣＡＣＧＴ ＣＴＧＴＡ ＢＰＶ−２ ＴＣＴＧＡＡＡＡＡＧＡＡＧＣＡＣＣＣＡＧＴＡＡＡＧＡＣＴＴ ＣＴＡＣＣＴＣＡＡＡＡＡＴＧＧＴＡＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＡ ＣＴＣＴＡＡＡＡ 【００６３】標識ＤＮＡプローブ製造の公知技術を用い
ると、ハイブリダイゼーションを目的とする型特異的Ｄ
ＮＡプローブを構築することができる。すなわち、この
発明の一態様は、ＰＶ型特異的ＤＮＡ配列であり、これ
は配列分析の結果として確認することができる。 【００６４】この発明の意図するところでは、「型特異
的ＤＮＡ配列」の語は、免疫学上特異的な主キャプシド
構造蛋白質をコードするＰＶゲノムにおける高度可変領
域を包含するものとする。従って、所望のヌクレオチド
配列は側面に位置する天然ヌクレオチドも含むが、ただ
し、これらの側面に位置するヌクレオチドはＤＮＡ配列
のハイブリダイゼーション特異性を変えるような数では
存在し得ないものとする。一般に、ＤＮＡ配列は少なく
とも１８個のヌクレオチドを含む。さらに、最低限１８
個のヌクレオチドからなり、また免疫学上特異的な構造
蛋白質をコードするヌクレオチドであればいかなるもの
もすべてこの発明の範囲内に含まれるものとする。 【００６５】ペプチド配列自体の生成に有用であること
に加えて、ＰＶの型特異的ＤＮＡ配列はまた、当業界で
よく知られた技術を用いてＤＮＡプローブを製造する場
合にも有用である。一般的なＤＮＡプローブ製造技術
は、マンアチスによる「モレキュラー・クローニング」
(Ｍolecular Ｃloning)(コールド・スプリング・ハーバ
ー・ラボラトリー、１９８２年)に記載されている。記
載された一技術の場合、エシエリヒア・コリ(Ｅ.coli)
ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて、二本鎖ＤＮＡ分子の一
方の鎖に切り込みを入れたときに生じる３′−ヒドロキ
シ末端にヌクレオチド残基をつけ加えることができる。
さらに、酵素は、その５′〜３′外核小体活性により、
ニックの５′側からヌクレオチドを除去し得る。５′側
からヌクレオチドを除去後、３′側へヌクレオチドをつ
け加えるとＤＮＡに沿ってニックが形成(ニック翻訳)さ
れる[ケリー等、「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー(Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.)２４５巻、３９(１９７
０年)]。先在するヌクレオチドを高放射性ヌクレオチド
と置き換えることにより、１０⁸cpm／μgを超える量の
特異活性を有する標識ＤＮＡを製造することができる
[リグビー等、「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイ
オロジー」(Ｊ.Ｍol.Ｂiol.)１１３巻２３７頁(１９７７
年)]。 【００６６】分子ハイブリダイゼーションの幾つかの技
術が組織におけるウイルスＤＮＡ配列の検出に用いられ
る。各々が何らかの利点および不都合さを有する。大量
の組織が利用できる場合、ハイブリダイゼーション反応
速度論分析により、存在するウイルスＤＮＡの量を正確
に定量し、またプローブと緊密な関連性はあるが同一で
はない配列を識別し、パーセント相同性を測定する機会
が得られる。反応は、プローブの再会合速度が最適とな
るハイブリダイゼーション条件(Ｔm−２５℃)下で行な
われる[ウエトマー等、「ジャーナル・オブ・モレキュラ
ー・バイオロジー」(Ｊ.Ｍol.Ｂiol.)３１巻、３４９〜
３７０頁(１９６８年)]。組織の配列がプローブの配列
と同一であるとき、反応速度は２次的である。しかしな
がら、プローブ配列が組織の配列と部分的相同性を有す
る場合、反応は複雑な反応速度を示す[シャープ等、「ジ
ャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジ−」(Ｊ.Ｍo
l.Ｂiol.)８６巻、７０９〜７２６頁(１９７４年)]。 【００６７】一般的に、ＤＮＡは、冷凍器上で切断し、
ＳＤＳ(ドデシル硫酸ナトリウム)のようなデタージエン
トおよびＥＤＴＡのようなキレート剤を用いて薄片を溶
解させ、所望により一液プロテイナーゼＫ(５０μg／m
l)で消化することにより組織が単離され得る。蛋白質は
フェノールおよびクロロホルム抽出により除去され、核
酸はエタノールにより沈殿する。ＲＮＡは、加熱処理さ
れたリボヌクレアーゼ(ＲＮase)Ａで処理することによ
り除去され、ＤＮＡはフェノールおよびクロロホルムに
より再抽出される。反応速度研究のために、ＤＮＡ溶液
を音波処理により一律の一本鎖片サイズ(約５００ヌク
レオチド)に切る。³Ｈ−チミジントリホスフェートまた
はアルファ³²Ｐ−デオキシヌクレオチドホスフェートを
用いてニック翻訳によりプローブＤＮＡを標識して高比
活性とする(リグビー等、前出)。細胞ＤＮＡに対するプ
ローブの濃度を所望の感度で測定する。１細胞当たり１
乳頭腫ウイルスゲノムを検出するためには細胞ＤＮＡ１
μg当たり１.３pgのプローブが必要である(ゲルブ等、
「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー」(Ｊ.
Ｍol.Ｂiol.)、５７巻、１２９〜１４５頁(１９７１
年)]。ＤＮＡを混合し、変性させ、適当な塩濃度および
温度にし、様々な時間放置してハイブリダイズさせる。
水酸化リン灰石クロマトグラフィー[ブライテン等、「サ
イエンス」(Ｓcience)、１６１巻、５２９〜５４０頁(１
９６８年)]またはＳ１ヌクレアーゼ消化[サトン、「ビオ
キミカ・エ・ビオフィシカ・アクタ」(Ｂiochim.Ｂiophy
s.Ａcta)、２４０巻、５２２〜５３１頁(１９７１年)]
によりハイブリダイズされたプローブの量を定量するこ
とにより再会合速度を測定することができる。 【００６８】ハイブリダイゼーションのさらに簡単な方
法は、サザーンブロッティング技術である[サザーン、
「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー」(Ｊ.
Ｍol.Ｂiol.)、９３巻５０３〜６１７頁(１９７５
年)]。この技術は、ハイブリダイゼーション反応のスト
リンジェンシーにおける可変性および分析下の試料にお
けるウイルス配列状態の決定をもたらす。細胞ＤＮＡ
(５〜２０μg)は、制限エンドヌクレアーゼにより消化
されるかまたは未消化のままでアガロースゲル電気泳動
に付され得る。ＤＮＡをその場でアルカリにより変性さ
せ、中和し、ニトロセルロース膜に移す。未消化または
ＦoＩ配列を含むゲルにおけるＤＮＡの移動を容易にす
るために、変性前に希ＨＣlでゲルを処理することによ
りＤＮＡを除プリン化する[ワール等、「プロシーディン
グズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンシーズ」(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.)７６巻、３６８
３〜３６８７頁(１９７９年)]。洗浄後、膜を８０℃で
２時間真空下で焼き、６０℃で４時間５０μg／mlの音
波処理および変性したサーモン精液ＤＮＡを含む４×Ｓ
ＳＣ(ＳＳＣ＝０.１５モルＮaＣl、０.０５モルクエン
酸ナトリウム)中１０×デンハルツ(Ｄenhardts)溶液(フ
イコル、うし血清アルブミン、ポリビニルピロリドン各
々０.２％)においてプレハイブリダイズする。ストリン
ジエントハイブリダイゼーション(Ｔm−２５℃)は、３
７℃で１６〜２４時間１−５×１０⁶カウント／分³²Ｐ
標識ニック翻訳ＤＮＡ(１−２×１０⁸カウント／m／μg
(ＤＮＡ)の比活性)、１モルＮaＣl、１×デンハルツ、
０.１５モルＴＥＳ[トリス(ヒドロキシメチル)メチル−
２−アミノエタンスルホン酸]、pＨ７.５、５０μg／ml
の音波処理および変性したサーモン精液ＤＮＡおよび５
０％ホルムアミドを含む溶液中で行なわれる。０.１×
ＳＳＣにおいて５２℃で膜を広範に洗浄し、風乾し、Ｘ
線フイルムにあてる、非ストリンジエントハイブリダイ
ゼーション(Ｔm−４３℃)の場合、全細胞ＤＮＡはＨＰ
Ｖ配列の検出を妨げる基底値ハイブリダイゼーションを
もたらす。これらの反応の場合、前述と同様、ただし除
蛋白質前に組織薄片を溶解させることにより、上清フラ
クションを単離し、粘稠溶液を１モルＮaＣlに導入し、
一夜４℃に保つことにより高分子量配列が沈殿する。高
および低分子量フラクションを低温で２０分間１２００
０×gの遠心分離により分離する。上清を除蛋白質し、
沈殿したＤＮＡをサザーン分析に用いる。反応は前記と
同様に行なわれるが、ただしサーモン精液ＤＮＡの代わ
りにヒトリンパ球ＤＮＡを用い、ハイブリダイゼーショ
ンは３０％ホルムアミドを含む。膜を５２℃で４×ＳＳ
Ｃ中広範に洗浄し、風乾し、Ｘ線フイルムにさらす。乳
頭腫ウイルスは非ストリンジエントハイブリダイゼーシ
ョン条件下で検出され得るＤＮＡ配列を維持しているた
め、非ストリンジエントハイブリダイゼーションは型特
異的ＰＶではないＰＶを同定するのに有用である。 【００６９】乳頭腫ウイルスのハイブリダイゼーション
分析にともなう主たる問題は、研究試料に存在する配列
とプローブの関連度である。このことはサザーンブ・ロ
ッティング技術の場合に重要である。その理由は、試料
におけるプローブおよび配列が異なるウイルス型を示し
ている場合でもハイブリダイゼーションのストリンジエ
ント条件下で配列相同性の程度が適度であれば強いシグ
ナルを得ることができるからである。ＨＰＶ−６および
ＨＰＶ−１１のストリンジエント条件下における配列相
同性のシエアは約２５％であり[ギスマン等、「ジャーナ
ル・オブ・バイロロジー(Ｊ.Ｖirol．)、４４巻、３９
３〜４００頁(１９８２年)]、また制限酵素分析が行な
われなければ、シグナルがＨＰＶ−６またはＨＰＶ−１
１配列によるものであるかどうかを決定するのは困難で
ある。これらの２種のウイルスタイプおよびそれらのサ
ブタイプを区別するためにはＰstＩ消化が有用であると
判明した[ギスマン等、「プロシーディングズ・オブ・ザ
・ナショナル・アカデミー、オブ・サイエンシーズ」(Ｐ
roc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.)８０巻、５６０〜５６３頁（１
９８３年）］。このクロスハイブリダイゼーションの例
を後記実施例２および図８に示す。 【００７０】前述のように、標識プローブは、型特異的
ＰＶ検出の一般的分析方法を提供する。この方法は、適
当な速さであり、簡単なプロトコルでよく、市販キット
として標準化され、提供され得る試薬を用いるものであ
り、大量の試料を速くスクリーニングできるものであ
る。処理を行なう一方法の場合、ゲノムを含む臨床単離
物を処理することにより一本鎖ゲノム核酸を得、次いで
一本鎖ポリヌクレオチドを支持体に固定する。付着した
核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡを、型特異的キャプシド蛋白
質をコードする遺伝子のコード(解読)鎖に相補的な塩基
配列を有する標準ポリヌクレオチドと接触させる。 【００７１】主たる試薬はＲＮＡまたはＤＮＡであり得
る標識プローブである。一般に、プローブは少なくとも
約２５個の塩基を、さらに通常は少なくとも約３０個の
塩基を有し、それ以上の場合もあり得る。この点に関す
る制限は、プローブがコードされる蛋白質に関するＰＶ
型特異性を維持するのに要求される最低数より多いヌク
レオチドを含まないということである。 【００７２】概して、プローブは、メッセンジャーＲＮ
Ａから、逆転写酵素によるメッセンジャーＲＮＡの逆転
写またはゲノムの開裂により得られたcＤＮＡから、好
都合にはエンドヌクレアーゼ消化を行ない、次いで公知
技術にしたがって遺伝子もしくは遺伝子フラグメントの
クローニングにより得ることができる。例えばコーンバ
ーグ、「ＤＮＡレプリケーション」(ＤＮＡ Ｒeplicatio
n)、ダブリュー・エッチ・フリーマン・アンド・カンパ
ニー・サンフランシスコ、１９８０年、６７０〜６７９
頁参照。別法として、遺伝子は、メリフィールドによる
「ジャーナル・オブ・Ｍ・ケミカル・ソサエティー」(Ｊ.
Ｍ.Ｃhem.Ｓoc.)８５巻２１４９頁(１９６２年)に記載
された技術にしたがい合成され得る。ＤＮＡフラグメン
トの単離後、フラグメントをプローブ製造に用いること
ができる。 【００７３】特定のハイブリダイゼーション技術はこの
発明において本質的なものではなく、当業界で一般に用
いられている技術はすべてこの発明の範囲内に含まれ
る。代表的なプローブ技術は、米国特許４３５８５３５
(ファルコウ等)に記載されているが、これを引用して説
明とする。 【００７４】前記イムノアッセイの場合のように、この
発明のハイブリダイゼーションアッセイは、キット形態
の体裁で商品化するのに特によく適しており、前記キッ
トは１個またはそれ以上の容器手段(バイアル、試験管
等)を閉鎖制限状態で受け入れるように区画された担体
手段を含み、また、前記容器手段の各々はハイブリダイ
ゼーションアッセイで使用される分離要素の１つを有す
るものである。例えば、１個のバイアルが可溶性で検出
可能標識された型特異的または種特異的ＤＮＡ配列(標
識プローブ)を含み、１個またはそれ以上の異なるバイ
アルが相異なる予め測定された量のＰＶ抗原を含み得
る。後者の容器は、未知の試料から得られたデータを間
に入れるための標準曲線をつくるのに用いられ得る。 【００７５】〔ワクチン類〕この発明の一態様は、ＰＶ
型特異的ワクチンの開発を含む。ウイルスに対するワク
チンの様々な製造方法がある。ワクチンおよびワクチン
の製造方法に関する基本的な好ましい必要条件は、(１)
生成したワクチンが宿主において抗体形成を誘発するの
に必要な抗原決定因子を含むこと、(２)ワクチンが高い
免疫原能を有すること、(３)生成したワクチンが受容側
または受容側の接触に関して臨床感染の危険を一切とも
なわずに投与されるほど充分安全なものであり、したが
って(危険性が)完全には除去されない場合予防接種にと
もなう危険性を最少減にすること、(４)生成したワクチ
ンが有毒な副作用、例えば死んだ細胞または抽出された
細胞に存在するエンドトキシンによる発熱を一切もたら
さないこと、(５)生成したワクチンが有効な径路による
投与、例えば経口、鼻腔内、局所または非経口投与に適
していること、(６)生成したワクチンが自然感染状況に
よく似ていること、(７)生成したワクチンが長期貯蔵条
件下で安定しており、しかも前記長期貯蔵が室温でなさ
れていること、並びに(８)生成したワクチンが常用の不
活性ワクチン担体と融和性であることである。それらの
条件はこの発明のワクチンにより達成され得る。 【００７６】この発明の一具体例において、Ｌ１リーデ
ィングフレームの免疫原的型特異的アミノ酸配列から製
造されたワクチンは、ワクチンの抗原成分を含む。抗原
を免疫原担体すなわちうし血清アルブミンまたはキーホ
ールリンペットヘモシアニンと共有結合させるのが必要
であるかまたは好ましい。この発明のワクチンは乳頭腫
ウイルスに感染されやすい哺乳動物すべてに投与され得
る。ヒトおよびヒト以外の哺乳動物に宿主として利益が
もたらされ得る。 【００７７】自然の感染径路により異なり、非経口投与
され得るが、好ましくは経口または鼻腔内投与される。
投与量は、年齢、健康状態、体重、同時処置をしている
とすればその種類および乳頭腫ウイルスの性質により変
化し得る。ワクチンは、経口投与の場合カプセル、液
剤、けん濁液またはエリキシルのような投与形態で用い
られ、非経口または鼻腔内投与の場合液剤またはけん濁
液のような滅菌液体製剤で用いられ得る。好ましくは食
塩水または燐酸緩衝食塩水のような不活性の免疫原的に
許容される担体が用いられる。 【００７８】この発明の方法は、Ｌ１キャプシド蛋白質
の免疫原的活性ヘプチドをコードする核酸配列の特異的
部分が既知のＰＶに対するワクチンの製造を可能にする
ものである。さらに、同概念によりＰＶのＤＮＡ内にお
ける任意の免疫原型特異的核酸配列からのワクチン製造
も可能となる。総括的に発明の記載を行ない、次に実例
として下記実施例を挙げるが、特記しない限りこれらに
限定するわけではない。 【００７９】実施例１ ＢＰＶ−１ Ｌ１配列の２７４〜２８３部分由来のデカ
ペプチド、lys−asn−asn−lys−gly−asp−ala−thr−
leu−lys(Ｎ末端から)を合成した。クロマトグラフィー
分析はデカペプチドの純度を９８％を越えるものとして
示した。このデカペプチドをポリ−ＤＬ−アラニン−ポ
リ−Ｌ−リジンに連結し、このコンジュゲートをアジュ
バントペプチドＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニン−
Ｄ−イソグルタミンに連結した。コンジュゲートをフロ
インド完全アジュバント中においてホモジネートした。
ウサギにコンジュゲートデカペプチドを筋肉内接種、す
なわち２週間隔でこの製剤を３回注射し、次いで非コン
ジュゲートデカペプチドを２週間隔でさらに３回注射し
た。３度目のコンジュゲート注射の2週間後、非常に弱い
抗体応答がＢＰＶ-1線維乳頭腫のアセトン固定凍結部分
の免疫蛍光により検出された。３度目のコンジュゲート
ペプチド注射後、抗体応答が１：５０希釈率で免疫蛍光
により検出され得た。これとは対照的に、インタクト(i
ntact)なＢＰＶ−１に対してあげられた高度免疫ウサギ
血清は、免疫蛍光により約１０倍高い滴定濃度アッセイ
を有する。このような高度免疫血清はＢＰＶ−１と反応
したが、これはまた約１：１２５の希釈率で線維乳頭腫
を含むＢＰＶ−２とも反応した。しかしながら、デカペ
プチドに対してあげられた抗体は、１：２の希釈率でＢ
ＰＶ−２線維乳頭腫と反応しなかった。これらの結果
は、デカペプチドに対する抗体がＢＰＶ−１型特異的で
あることを示す。図９は、デカペプチドに対する抗血清
によるＢＰＶ−１形質転換活性の中和反応速度を示す。
デカペプチド(Ｏ)に対する抗血清、デタージエント崩壊
ＢＰＶ−１( )に対する抗血清または正常なウサギ血
清(Ｏ)の存在下にＢＰＶ−１をインキュベートした。Ｃ
１２７マウス細胞の単層を血清処理ウイルスで感染さ
せ、３週間後にフォーカス形成を調べた。デタージエン
ト崩壊ＢＰＶ−１に対する抗血清のウイルス形質転換活
性の５０％中和は約１：１００００であり、正常なウサ
ギ血清はＢＰＶ−１形質転換活性を抑制しなかった。 【００８０】発明について詳しく記載したが、当技術分
野にある程度精通しておれば請求の範囲である種の変化
および修正がなされ得ることは明白であろう。

【図面の簡単な説明】 【図１】図１は、ＢＰＶ−１、ＨＰＶ−１aおよびＨＰ
Ｖ−６bのＬ１開放読み取り枠のＤＮＡ配列相同性の比
較を示すためのものであり、具体的にはＢＰＶ−１（Ｘ
軸）対ＨＰＶ−１aの比較を示す。 【図２】図２は、ＢＰＶ−１、ＨＰＶ−１aおよびＨＰ
Ｖ−６bのＬ１開放読み取り枠のＤＮＡ配列相同性の比
較を示すためのものであり、具体的にはＢＰＶ−１（Ｘ
軸）対ＨＰＶ−６bの比較を示す。 【図３】図３は、ＢＰＶ−１、ＨＰＶ−１aおよびＨＰ
Ｖ−６bのＬ１開放読み取り枠のＤＮＡ配列相同性の比
較を示すためのものであり、具体的にはＨＰＶ−６b
（Ｘ軸）対ＨＰＶ−１aの比較を示す。 【図４】図４は、ＢＰＶ−１およびＤＰＶについてのＬ
１読み取り枠のアミノ酸配列を示す。 【図５】図５は、ＢＰＶ−１、ＤＰＶおよびＢＰＶ−２
の一部についてのＬ１読み取り枠のアミノ酸配列を示
す。 【図６】図６は、ＢＰＶ−１、ＤＰＶ、ＨＰＶ−１a、
ＨＰＶ−６b、ＣＲＰＶおよびＢＰＶ−２の一部につい
てのＬ１読み取り枠のアミノ酸配列を並べたものを示
す。相同マーク領域Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ、ならびに
好ましい、そしてより好ましい型特異的(ＴＳ)領域を示
してある。 【図７】図７は、ＢＰＶ−１、ＤＰＶ、ＨＰＶ−１a、
ＨＰＶ−６b、ＣＲＰＶおよびＢＰＶ−２の一部につい
てのＬ１読み取り枠のアミノ酸配列を並べたものを示
す。相同マーク領域Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ、ならびに
好ましい、そしてより好ましい型特異的(ＴＳ)領域を示
してある。 【図８】図８は、ＢＰＶ−１ゲノムとＢＰＶ−２ゲノム
の６０４０および６７５４ヌクレオチド間のＤＮＡ配列
の相同性の比較である。 【図９】図９は、型特異的デカペプチドに対する抗血清
によるＢＰＶ−１の形質転換活性が中和される動力学を
示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｅ Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ

Claims (1)

1. (57)【特許請求の範囲】 １．乳頭腫ウイルスの型間を区別するに有用である、Ｂ
   ＰＶ−１Ｌ１アミノ酸２５１−２９１の少なくとも一部
   に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して
   生起した、抗体。 ２．ポリペプチドが６〜１４個のアミノ酸を含むもので
   ある、請求項１に記載の抗体。 ３．ポリペプチドがその各端の側面に位置する天然配列
   として３個以下の天然アミノ酸を含むものである、請求
   項２に記載の抗体。 ４．ポリペプチドがアミノ酸配列ＫＮＮＫＧＤＡＴＬＫ
   を含むものである、請求項２に記載の抗体。 ５．標識形態をしたものである、請求項１〜４のいずれ
   かに記載の抗体。 ６．抗体が放射能標識、酵素標識、蛍光標識、化学ルミ
   ネッセンス標識、抗体標識または遊離基標識された、請
   求項５に記載の抗体。 ７．型特異的乳頭腫ウイルスを含有する試料を標識され
   たポリペプチドおよび当該ポリペプチドに対する抗体と
   接触させ、当該抗体と当該ポリペプチド間の結合程度を
   測定することを特徴とする、型特異的乳頭腫ウイルスの
   同定方法（ただし、当該ポリペプチドは、乳頭腫ウイル
   スの型間を区別するに有用である、ＢＰＶ−１Ｌ１アミ
   ノ酸２５１−２９１の少なくとも一部に対応するアミノ
   酸配列を有するものである。）。 ８．型特異的乳頭腫ウイルスを含有する試料をポリペプ
   チドに対する標識された抗体と接触させ、当該抗体と当
   該ウイルス間の結合程度を測定することを特徴とする、
   型特異的乳頭腫ウイルスの同定方法（ただし、当該ポリ
   ペプチドは、乳頭腫ウイルスの型間を区別するに有用で
   ある、ＢＰＶ−１Ｌ１アミノ酸２５１−２９１の少なく
   とも一部に対応するアミノ酸配列を有するものであ
   る。）。 ９．うさぎを特許請求の範囲第１〜４項のいずれかに記
   載のポリペプチドで高度免疫化することを特徴とする、
   抗体の製造方法。 １０．ＢＰＶ−１Ｌ１アミノ酸１０５−１１０、１９３
   −１９６、２００−２０３、２２７−２３０または２９
   ２−２９５に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチ
   ドに対して生起した、抗体。 １１．標識形態をした特許請求の範囲第１０項記載の抗
   体。 １２．抗体が放射能標識、酵素標識、蛍光標識、化学ル
   ミネッセンス標識、抗体標識または遊離基標識された、
   特許請求の範囲第１１項記載の抗体。