JPH07143888A - 型特異的乳頭腫ウイルスdna配列およびペプチド - Google Patents

型特異的乳頭腫ウイルスdna配列およびペプチド

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JPH07143888A
JPH07143888A JP6195324A JP19532494A JPH07143888A JP H07143888 A JPH07143888 A JP H07143888A JP 6195324 A JP6195324 A JP 6195324A JP 19532494 A JP19532494 A JP 19532494A JP H07143888 A JPH07143888 A JP H07143888A
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 乳頭腫ウイルスの分類を可能にすること。 【構成】 特定の乳頭腫ウイルスに特異的なアミノ酸配
列を有し、天然産生L1オープンリーディングフレーム
ポリペプチドの比較的小さなフラグメントまたはその誘
導体を表わすポリペプチドとその使用による検定試薬の
作成。 【効果】 乳頭腫ウイルスの型の分類と詳細な診断を可
能にした。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】
[技術分野]本発明は、乳頭腫ウイルス(Papillomaviru
s(PV)、パピローマウイルス)のポリヌクレオチド配
列中に、PVの型および種の区別ならびに識別に有用な
ヌクレオチド配列のセグメントが存在するという発見に
関するものである。ゲノム中のこの領域(可変領域)は特
定のPV型に特異的であって、与えられた特定のPVに
特異的なDNAプローブ、抗体(標識化および非標識
化)、ポリペプチドセグメント、標識化ポリペプチドセ
グメント、およびワクチンの製造の基礎を形成する。
【0002】本発明の別の局面によれば、さらに全ての
PVのポリヌクレオチド配列は、全PVに特有であり且
つPV属特異的、即ち任意のPVを認識および区別し、
非PVウイルスおよびウイルス生産物を識別するポリペ
プチドセグメント(標識化および非標識化)および抗体
(標識化および非標識化)の製造の基礎を形成する高度保
存化領域を含んでいることが発見された。この後者のD
NA配列は、「属特異的」と呼ばれる。
【0003】[背景技術]人の癌の誘起に関係するウイル
スの探査は挫折の多いものであった。数多くのウイルス
が、ヒトの癌ウイルスとしての可能性があるものとして
新たな興味をひいてきた。こうしたウイルスの1つがヒ
ト乳頭腫ウイルス(HPV)である。HPVは電子顕微鏡
によって見ることができた最初のウイルスの1つである
が、このウイルスの生物学についての情報は、最近まで
殆んど得られなかった。初期の研究は、HPVが悪性腫
瘍と結び付いているという直接の示唆を提供することが
できなかった(これらの研究は、ローソーン等によりバ
クテリオロジカル・レビュー(Bacteriol.Rev.)31
巻110〜131頁(1967)に論評されている)。し
かしながら、早くも1930年代に、ワタオウサギの乳
頭腫ウイルス(CRPV)がその宿主の種に対し発癌性で
あるということが実験的証拠によって示されていた[ル
ース等、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メデ
ィスン(J.Exp.Med)65巻523〜548頁(19
35)]。さらに、他の動物の乳頭腫ウイルスが実験動物
に腫瘍を発生させ、幾つかのものは培養細胞に形態学上
の形質転換を起こすことができるということがわかった
[オルソン等、アーカイブス・オブ・エンバイアランメ
ンタル・ヘルス(Arch.Environ.Health)19巻82
7〜837頁(1969)]。しかし、実験動物へのHP
Vの実験的移入も、また、ウイルス複製または生物学的
活性の発現を許容する組織培養系のいずれもが成功しな
かった。したがって、HPVの研究は大部分が乳頭腫か
ら得られるウイルス粒子(ビリオン)の物理的および化学
的性格決定に限定されてきた。
【0004】培養物中でHPVウイルスの複製を許容す
る系を確立することの不可能性は、詳細な分子解析を可
能にするウイルスDNA配列の分子クローニングにより
ある程度克服できた。さらに、解剖学的な部位嗜好性を
有する、最小限の関連性を有する数多くのウイルス型が
発見され、また、悪性の可能性がある病変中にHPV抗
原およびDNAが見出された。以前には、これらの病変
の原因は、他の伝染性物体または何か他の未知の病因に
帰せられていた。これらの発展により、HPVの研究が
ウイルス発癌の立場から魅力あるものとなった。乳頭腫
ウイルス属の成員は、小さく(直径50〜55nm)、二十
面の対称性を有するエンベロープの無いウイルスである
ことが知られている。このゲノムは、約8000塩基対
(8kb)を含む円形の二本鎖DNA分子より成る。ビリオ
ンは、ウイルス陽性の乳頭腫から、電子顕微鏡により、
また、表皮を機械的に破壊し、次いで一連の分別遠心分
離工程および塩化セシウム中でのバンド化を行なうこと
によって容易に単離できる。殆んどの試料において2本
のバンドが現われ、この一方は1.33g/ml、他方は
1.29g/mlに現われる。前者はDNAの入った「全体
の」ビリオンを表わし、後者は「空の」ウイルス殻から成
っていると信じられている。このDNAは、ビリオンを
イオン性界面活性剤で破壊し、有機抽出により蛋白質を
除くことによって単離できる。得られたDNA試料は通
常、2つの形のDNA、即ち高次コイル分画(FoI)お
よびニツク円形(nicked−circular)型(FoII)を含んで
いる。
【0005】牛に感染する5種の相異なるウイルス、即
ち、乳頭腫ウイルス(BPV)が同定されている。これら
のウイルスは、DNA配列の相同性、抗原としての関連
性、組織特異性(皮膚または粘膜表面)の程度が異なり、
違った型の病変(線維乳頭腫または乳頭腫)を誘発する。
ヒト乳頭腫ウイルスは、さらに大きな多様性を示す。現
在18の異なるHPV型が文献に記載されており、さら
に別の型が発見されるであろうことが予測されている。
ウイルスの新規な型として分類するためには、標準的な
ハイブリダイゼーション条件下において既分類ウイルス
と50%以上のDNA配列の相同性があってはならな
い。与えられたウイルス型に対し50%より大きな配列
相同性をもってハイブリダイズするDNAは、サブタイ
プとみなされる[コーギン等、キャンサー・リサーチ(C
ancer Res.)39巻545〜546頁(1979)]。標
準的ハイブリダイゼーションは、DNAの融解温度より
25℃低い温度(Tm−25℃)で実施し、この温度では
約17%の塩基が誤対合をおこす[レアー等、ネーチャ
ー(Nature)224巻149〜154頁(1969)]。現
在HPVは、配列相同性と感染部位の点で、以下の表I
に示すように分類できるようである。
【0006】
【表1】
【0007】皮膚表面に感染するウイルスは、粘膜表面
に感染するものよりも、他の皮膚感染性HPVに対しあ
る程度相同性が高いようである。さらに、ある特定のウ
イルス型は専らその病変部位と結び付くが、時には他の
病変部位に見出され得る。ジェンセン等の報告 [ラボラ
トリー・インベスティゲーション(Lab.Invest.)47
巻491〜497頁(1982)]によると、HPV−1
は足底疣贅の約85%に存在するが、HPV−2もまた
低率の足底疣贅に検出されており、逆の事も言える。特
に興味深いのはヒト乳頭腫ウイルスの3、5、8〜1
0、12〜15および17型の群である。これらのウイ
ルスは、全身性化した粃糠疹様病変を特徴とする稀な退
行性病変である疣状表皮異形成(EV)または扁平疣贅を
もつヒトに付随して見出される[ジャブロンスカ等、キ
ャンサー・リサーチ(Cancer Res.)32巻583〜5
89頁(1972)]。3および10型を除き、この群の
HPVは健康人の疣贅からは検出されておらず、免疫抑
制された腎の同種移植片受容者の病変からに限り確認さ
れている[ルツナー等、ジャーナル・オブ・インベステ
ィゲイティブ・ダーマトロジー(J.Invest.Dermato
l.)75巻353〜356頁(1980)]。さらに、HP
V−5およびHPV−8を含む病変は、日光に暴露され
る領域に存在する場合、しばしば悪性のものに変化する
ことが報告されている。原発生および転移性の癌のハイ
ブリダイゼーション分析により、これらの腫瘍の中にH
PV−5およびHPV−8のDNA配列が存在すること
がわかった[オース等、セルプロリファレーション(Cel
l Prolif.)7巻259〜282頁(1980)]; オス
トロー等、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンシズ(Proc.Natl.Ac
ad.Sci.)79巻1634〜1638頁(1982)およ
びプフィスター等、レビューズ・オブ・フィジオロジー
・バイオケミストリー・アンド・ファーマコロジー(Re
v.Physiol.Biochem.Pharmacol.)99巻111〜
181頁(1983)]。
【0008】厳密でないハイブリダイゼーション条件を
用いた最近の研究によれば、HPVと他の動物の乳頭腫
ウイルスの間でそうであるように、各HPVゲノムのゲ
ノム間で同一のDNA配列が維持されていることが実証
された [ハイルマン、C.A.、ジャーナル・オブ・ウイロロジー(J.Vir
ol.)32巻199〜207頁(1979)]。したがっ
て、現在では、PV特異的DNAプローブを用いてPV
誘発性と思われる病変から取り出したDNAを調べ、非
厳密ハイブリダイゼーション条件を使用することにより
関連する配列を探すことが可能である。この試みは、未
知の型のHPVのHPVDNA配列ならびに肛門性器疣
贅から調製されたDNA[クルツィツェク、R.A.等、
ジャーナル・オブ・ウイロロジー(J.Virol.)36巻2
36〜244頁(1980)]および若年性喉頭乳頭腫か
らのDNA[ランカスター、W.D.、インターウイロロ
ジー(Intervirology)15巻204〜212頁(198
1)]について成功することが立証された。
【0009】PVゲノムの分析のための適当な組織培養
系が無いにもかかわらず、分子クローニング技術により
生産された大量のDNAの配列解析の結果、このウイル
スゲノムの考え得る機能についてのかなりの洞察が進め
られた。牛乳頭腫1型(BPV−1)[チェン等、ネーチ
ャー(Nature)299巻529〜534頁(1982)]、
HPV−1a[ダノス等、エンボ・ジャーナル(Embo.
J.)1巻231〜236頁(1982)]およびHPV−
6b[シュバルツ等、エンボ・ジャーナル(Embo.J.)2
巻2341〜2348頁(1983)]のヌクレオチド配
列が現在知られている。同様に既知なのは、HPV−1
1、HPV−16、および鹿の乳頭腫(DPV)のDNA
配列である。
【0010】乳頭腫ウイルスは抗原性の点で同族である
ということも立証されている。特異的HPVの無傷なウ
イルス粒子に対して生成された抗血清は型特異的であ
り、他の型のHPVに感染した組織中では反応しない
が、熱および界面活性剤で破壊したPVビリオンに対し
て生成された抗血清は、全てのHPVおよび他の動物種
のPVのキャプシド抗原と交差反応する[ジェンセン、
A.B.等、ジャーナル・ザ・ナショナル・キャンサー・
インスティテュート(JNCI)64巻、495〜500
頁(1980)]。この知見により、乳頭腫ウイルスの主
要キャプシド蛋白質中には、この属特異的抗原交差反応
性の原因となる共通のアミノ酸配列があり、この共通の
アミノ酸配列はビリオン粒子表面に露出していないとい
う考察が導かれた[ホーレイ、P.M.、アーカイブズ・
オブ・パソロジー・アンド・ラボラトリー・メディスン
(Arch.Pathol.Lab.Med.)106巻429〜43
2頁(1882)]。
【0011】したがって、通常のPV抗原に対して生成
された抗血清の使用は、既知または未知の任意のHPV
に増殖的感染した細胞の同定に有用である。この交差反
応性抗血清により、病理学者および臨床研究者は、若年
性喉頭乳頭腫[コスタ、J.等、アメリカン・ジャーナ
ル・オブ・クリニカル・パソロジー(Am.J.Clin.
Pathol.)75巻194〜197頁(1981); および
ラック、E.等、インターウイロロジー(Intervirolog
y)14巻148〜156頁(1981)]および頚部扁平
疣贅[カーマン、R.J.等、アメリカン・ジャーナル・
オブ・オブステトリクス・アンド・ギネコロジー(Am.
J.Obstet.Gynecol.)140巻931〜935頁
(1981); およびモリン、C.等、ジャーナル・オブ
・ザ・ナショナル・キャンサー・インスティテュート
(JNCI)66巻831〜835頁(1981)]の病変
物質としてHPVを同定することができた。しかしなが
ら、この抗血清は、特異的HPVの同定には有用でな
く、または適当でない。さらに、この抗血清は初期段階
の感染または蛋白質の発現が起こっていない感染を拾い
上げるには役立たないため、ウイルス感染が蛋白質の発
現が起こっている時点まで進行していることが必須であ
る。
【0012】今日までHPVゲノムの機能的局面につい
ては殆んど知られていない。動物の乳頭腫ウイルス系に
関しては、より多くの情報が得られている。ゲノムの体
制は乳頭腫ウイルス間で高度に共通しているため、動物
とヒトの乳頭腫ウイルスの間にゲノム構造および機能に
関して同様な関係を想定するのは理にかなっている。動
物の乳頭腫ウイルスの幾つかは高い発癌性があるため、
この機能の全てまたは一部の幾つかのHPVの性質でも
あり得るということが考えられる。尋常性疣贅、足底疣
贅、および扁平疣贅といった多くのHPV誘発性病変は
全く良性であり、臨床上癌腫への進行に結び付くことは
ない。しかしながら、幾つのHPVは、時に扁平上皮癌
への二次的展開を伴い、HPV−5は、疣状表皮異形成
の患者において皮膚癌と結び付く。若年性喉頭乳頭腫は
乳頭腫ウイルスHPV−11によって惹起される。照射
をせずに喉頭の湿潤性側頭鱗癌に自然移行した稀な症例
が、ランケル、D.等によりアメリカン・ジャーナル・
オブ・サージカル・パソロジー(Am.J.Surg.Path
ol.)4巻293〜296頁(1980)に記載されてい
る。照射療法の後には、より頻繁に若年性喉頭乳頭腫症
の経過が扁平上皮癌に進行する。肛門性器疣贅(condol
oma acuminata)は数多くの異なったHPVによって引
き起こされる。文献には、この病変の若干例が局所性湿
潤性扁平上皮癌に進行したとの報告がある[ツア・ハウ
ゼン、H.、カレント・トピックス・イン・ミクロバイ
オロジー・アンド・イミュノロジー(Curr.Top.Mic
robiol.Immunol.)78巻1〜30頁(1977)]。さ
らに、HPV特異性抗原が、異形成と解釈される頚部病
変の50%に検出された。頚部異形成と同部位における
癌腫および湿潤性頚部癌腫との明白な疫学上の結び付き
は、少なくともこの進行におけるHPVの役割を強く示
唆するものである。
【0013】数多くのPVが存在し、或るPV誘発性病
変に1以上のPVが存在するということ、乳頭腫と様々
な癌腫との厳密な結び付き、そして、ウイルス誘発性乳
頭腫から導かれる癌に関連しない医学上の問題から、高
度の確実性をもって、乳頭腫の特異的病因を同定する方
法論に対する、進行中の且つ絶えず増大する必要性が生
じた。したがって、存在が知られている多数のPV型の
識別手段、ならびに尚未知のPV型をさらに同定する手
段の必要性が存在し続けている。
【0014】同時に、全PVに共通する高度共通性ヌク
レオチド配列およびこの高度共通性ヌクレオチド配列が
コードしている「共通抗原」の決定は大きな価値があり、
かつその必要性が存在し続けている。この配列の決定
は、全PVと交差反応性の抗体の生産において大きな価
値があるであろう。
【0015】表皮細胞の増殖的乳頭腫ウイルス感染は、
有棘層の細胞の過形成(棘細胞症)につながることが現在
知られている。細胞は大きさを増し、橋小体と張原綿維
の数を増す。他の表皮細胞は、張原綿維の消失、橋小体
の剥離、核のしわ、細胞質の空胞化を伴う変性的変化を
示す。表皮の上層においては、これらの変化がより著名
である。顆粒層の細胞は、核の変性、辺縁趨向、および
クロマチンの凝縮を示す。ビリオンは電子顕微鏡による
とケラチン層の変性細胞の核中およびしばしば結晶間列
に現われる。
【0016】乳頭腫ウイルス感染に対する宿主免疫反応
は良くわかっていないが、感染は通例若年者に起こり、
その後疣贅の持続が様々な期間に及ぶ。緩解後、宿主は
同ウイルスによる再感染に対し免疫が残る。人間の場
合、HPV感染に対する抗体反応は、緩解の開始に先立
つIgMの出現を特徴とする。緩解直後にIgM及びIg
G抗体が出現し、緩解のずっと後にIgGのみが検出で
きる[フォン・クルー、G.J.、ダーマトロジー(Derma
tol.)18巻195〜204頁(1979)]。IgMから
IgGへのこの転換は、実験的にBPVな感染させた牛
において同様に観察された[リー、K.P.等、キャンサ
ー・リサーチ(Cancer Res.)29巻1393〜139
7(1969)]。
【0017】乳頭腫の拒絶は細胞性免疫と密接に結び付
いていると思われる。実験的に乳頭腫ウイルスに感染さ
せた牛においては、緩解に先立って単核白血球、主にリ
ンパ球の浸潤がおこる。これは通例血管周辺領域に起こ
るが、乳頭腫全体の瀰漫性散乱としても起こる[リー、
K.P.等、ジャーナル・オブ・インベスティゲイティブ
・ダーマトロジー(J.Invest.Dermatol.)52巻〜4
54〜464頁(1969)]。
【0018】人間の場合、緩解しつつある扁平疣贅は、
上部真皮における単核白血球の血管周辺への浸潤、そし
て乳頭腫に限局された表皮への侵入を伴う。類似の組織
学的外観を呈す[タガミ、H.等、ジャーナル・オブ・
ダーマトロジー(J.Dermatol.)90巻147〜154
頁(1974)]。離れた部位におけるこの複数の疣贅の
同時緩解は、細胞性免疫が乳頭腫の拒絶に主たる役割を
演じていることを示唆している。しかしながら、扁平疣
贅の緩解は同一人物の足底または手掌疣贅に影響せず、
これは緩解がHPVの型特異的であることを示すもので
ある[バーマン、A.等、ブリティッシュ・ジャーナル・
オブ・ダーマトロジー(Br.J.Dermatol.)99巻17
9〜182頁(1978)]。複数の型のBPVに感染さ
せた牛においても同様の別々な疣贅緩解が観察された
[バートルド、S.W.等、ジャーナル・オブ・ジ・アメ
リカン・ベタリナリー・メディカル・アソシエーション
(J.Am.Vet.Med.Assoc.)165巻276〜280頁
(1974)]。
【0019】[発明の開示]特異的PVを同定するアッセ
イを開発するため、特異的PVに対する抗血清を作り、
ここから競合的かつ/または免疫測定的アッセイを開発
するのが望ましい。足底疣贅には大量のウイルス物質が
存在し、またストリンジェントな条件下ではHPV−I
DNAと交差ハイブリダイズするHPVDNAが同定さ
れていないため、HPV−1のような或る乳頭腫ウイル
スについて型特異的抗原または抗体を調製することがで
きる。しかしながら、粘膜表皮に感染するウイルスにつ
いては、免疫原物質として使用する充分量のウイルス粒
子を得ることが極めて困難である。キャプシド蛋白質上
に存在(恐らく内部に)するとわかっている共通の抗原決
定基の故に、ポリクローナル抗体が他のPVとの交差反
応性を最も産み出し易いと思われる。
【0020】存在が知られている種々のPVを区別する
アッセイに対する必要性が募るにあたり、本発明者等は
初めに、キャプシド蛋白質中の型特異的抗原決定領域
が、各PVの主要キャプシド蛋白質をコードしているD
NA配列をコンピューター解析することから推定し得る
と考えた。分子クローニング技術により、配列決定を行
なうに充分量のDNAが得られた。
【0021】この概念が、本発明、即ち与えられた型の
主要なPVキャプシド蛋白質(L1)をコードしている開
放読み取り枠(open reading frame,オープンリーディ
ングフレーム)のDNA配列が、実際には他のいかなる
PV型の対応セグメントとも実質上同一性を示さない少
なくとも1個のDNAセグメントを含んでいるという発
見、そして、この非同一DNA配列がPV型特異的DN
Aプローブ、型特異的免疫原的および/または免疫学的
特性を与えるオリゴペプチド、標識化オリゴペプチド、
標識化抗体、実質上純粋な抗体、診断方法、アッセイキ
ット、およびワクチンの製造に利用できるという発見に
導いた。
【0022】同様の解析により、本発明の他の局面、即
ち主要キャプシド蛋白質L1をコードしている配列内に
おける共通PV抗原をコードする高度に共通したDNA
配列の発見が導かれた。この抗原(ポリペプチド)は、任
意の且つ全てのPVと交差反応性の抗体の生成を導き出
す。この高度に共通したヌクレオチド配列の発見は、P
V属特異的抗体、属特異的免疫原的および免疫学的特性
を与えるオリゴペプチド、属特異的標識化抗体、診断方
法、アッセイキット等の製造を可能にする。
【0023】[発明を実施する最良の方法]本発明は任意
のPVに適用できる。当分野において常套であり周知の
配列決定技術、即ちマクサムおよびギルバート(197
7)の方法(引用としてここに記載する)を用いて、主要
キャプシド蛋白質のL1読み取り枠のヌクレオチド配列
を得るだけでよい。最初のATGコドンが最初のアミノ
酸であると考えられる。既に知られているPV配列、特
に下記に指摘する型特異的配列との比較、または例えば
コンピューター処理による比較を利用した共通の相同領
域を比べることにより、ヌクレオチド配列内の可変領
域、即ちPV型特異性を付与することのできる領域の決
定が容易にできる。
【0024】このようにDNA配列中にPV型特異的可
変領域が位置するのであるから、次には、(1)型特異的
プローブとしてこのDNA配列自体を標識化した形で利
用し、(2)PV型特異的競合アッセイにおいて、DNA
配列から誘導できるペプチド配列を、標識化した形で利
用し、(3)DNA配列から誘導できるペプチド配列か
ら、PV型特異的な実質上純粋な抗体を製造し、(4)免
疫測定アッセイ用に、標識化したPV型特異的抗体を製
造し、(5)PV型特異的免疫原性を付与するためのアミ
ノ酸配列を製造し、そして、(6)PV型特異的アミノ酸
フラグメントからPV型特異的ワクチンを製造すること
ができる。一言で言えば、本明細書に別個に記載された
型特異的可変領域のヌクレオチド配列に対して述べられ
た任意の且つ全ての用途は、本発明、即ち全てのPVに
振替可能な技術および概念の結果として、今や当分野に
おける通常の知識を有する者にとって利用可能である。
【0025】例えば、図1〜3に示されるのは、ハッシ
ュのマトリックスアルゴリズムを用いたコンピューター
解析による3つの関連の無いウイルス、BPV−1、H
PV−1aおよびHPV−6bのL1ヌクレオチド配列の
比較である。図1〜3は、かなりの程度の配列の相同性
を有する領域があることを示している。対角線はL1読
み取り枠内の相同領域を表わす。対角線に沿った各デー
タの点についての相同性の程度を、各々の図の下の棒グ
ラフに示す。図1はBPV−1(X軸)対HPV−1aの
比較であり、図2はBPV−1(X軸)およびHPV−6
bの比較であり、図3はHPV−6b(X軸)とHPV−1
aとの比較である。
【0026】BPV−1とDPVについてのL1読み取
り枠のアミノ酸配列を比較すると、遺伝暗号の過剰のた
めに、L1ポリヌクレオチド配列について示されるより
高度の一致が現われている(図4)。L1開放読み取り枠
のヌクレオチド配列の翻訳によって、アミノ酸配列が決
定された。このアミノ酸は1文字暗号で表現し(レーニ
ンジャー、A.L.、バイオケミストリー(Biochemistr
y)第2版72頁(1975)を見よ)、ポリペプチド配列
に最初のメチオニン残基から番号を付ける。BPV−1
配列は全て大文字であり、DPV配列上に食い違いが生
じた場合、そのアミノ酸は小文字である。配列のずれ
は、整列の目的のために採用した。一致箇所は2つの対
応残基間の縦線として印を付けた。
【0027】図5においては、約10%のDNA配列相
同性を有し(液相ハイブリダイゼーション)、抗原性のう
えで交差反応性(ごく弱く働く)である2種のウイルス、
BPV−1およびDPVを比較している。5個の領域を
除きアミノ酸の一致は極めて高い。DPVアミノ酸配列
との実質的な一致を示さない、長さにして6個のアミノ
酸より長いBPV−1アミノ酸配列上の領域(L1読み
取り枠の最初のメチオニン残基から教える)は、27〜
31位、46〜57位、260〜281位、342〜3
48位および465〜484位であり、これは型特異性
を司っている可能性のある領域を表わす。BPV−1ア
ミノ酸配列を部分的BPV−2アミノ酸配列と比較した
場合、342〜348位および464〜495位のアミ
ノ酸によってつながった領域に殆んど完全な一致があ
り、これら2つの密接に関連するウイルス間に示される
アミノ酸の一致からの実質的な逸脱を示す262〜28
3位の領域がある。図5において、アミノ酸配列はL1
開放読み取り枠のヌクレオチド配列の翻訳によって決定
した。アミノ酸は1文字暗号で表現し、ポリペプチド配
列には最初のメチオニン残基から番号を付けてある。B
PV−1配列は全て大文字とし、BPV−2またはDP
V配列上に食い違いが起こった時、そのアミノ酸を小文
字としてある。配列のずれは整列の目的のために採用し
た。“ "は、未知のBPV−2L1ヌクレオチド配列
の領域を示す。一致箇所は2つの対応残基間の縦線とし
て印を付けてある。
【0028】図6〜7は、BPV−1、DPV、HPV
−1a、HPV−6b、CRPVおよびBPV−2の一部
についてのL1読み取り枠のアミノ酸配列を示す。それ
ぞれのL1の開放読み取り枠のヌクレオチド配列の翻訳
によってアミノ酸配列を決定した。アミノ酸は1文字暗
号で表現してあり、各配列に最初のメチオニン残基から
番号を付けてある。2またはそれ以上が一致する場合ア
ミノ酸を大文字とし、小文字のアミノ酸は不一致を示し
ている。配列のずれは整列の目的のために導入した。
“ "は、未知のBPV−2ヌクレオチド配列の領域を
示す。「−」は、少なくとも2個のアミノ酸が同一である
ことを、そして「*」は、全てのアミノ酸が同一であるこ
とを示す。
【0029】BPV−1L1読み取り枠の262〜28
3位(両端を含む)のアミノ酸によりつながっている領域
が型特異的免疫原を示すという概念を確認するため、2
74〜283位間のアミノ酸に見出されるデカペプチド
を合成し、これに対する抗体を生成した。BPV−1L
1配列から導き出されるデカペプチドは、以下の配列 (N末端より): lys−asn−asn−lys−gly−asp−ala−thr−leu−ly
s を有する。この配列は1文字暗号を用いると、 KNNKGDATLK となる。
【0030】合成ポリぺプチドに対して抗体を生成させ
る方法の完全な詳細ならびにその結果は、下記の実施例
1に報告する。ウサギ由来の無傷のBPV−1に対する
超免疫血清はBPV−1と交差反応することがわかっ
た。さらに約10倍の低希釈でBPV−2と反応するこ
ともわかった。デカペプチドに対し生成された抗体は
1:2の希釈でさえBPV−2線維乳頭腫と反応しなか
ったが、一方これは1:50の希釈でBPV−1の線維
乳頭腫と反応した。この結果は、デカペプチドに対する
抗体はBPV−1型特異的である事を強く指示し、そし
てより重要なことに、この型特異的抗体は、乳頭腫ウイ
ルスの型とサブタイプ間の分類(即ちDNA配列の一致
が50%より多いか少ないか)を規定するために用いら
れる2種のウイルス(BPV−1およびBPV−2)を識
別することができる。BPV−1ウイルスおよびBPV
−2ウイルスは50%のDNA配列相同性を有する。
【0031】本発明の1つの局面は、それ自身型特異的
であって、やはり型特異的である比較的小さなアミノ酸
配列をコードしている、L1読み取り枠中の或るヌクレ
オチド配列の発見に向けられている。この隔離された配
列は、独自の用途、即ち標識化した形でのDNAハイブ
リダイゼーション分析のための用途を有する。「隔離さ
れた配列(isolated sequence)」という語は、フラグメン
トとして天然に存在せず、自然の状態で見出し得ないD
NAフラグメントを包含することを意味している。この
配列は、典型的には長さにして5〜75のヌクレオチ
ド、好ましくは最低18ヌクレオチドの長さである。
【0032】図8は、BPV−1ゲノムおよびBPV−
2ゲノムの6040〜6754間のヌクレオチドのDN
A配列の相同性の比較を示している。棒グラフはウイル
スゲノム間の相同性の程度を表わしており、6440位
からすぐ上流の領域は最低度の配列相同性を示してい
る。上方のヌクレオチド配列は、この領域内の相同性の
程度を示す。同一のヌクレオチドに「*」印を付けてあ
る。この配列相同性の低い領域は、アミノ酸の相違があ
るL1開放読み取り枠の領域を表わす。棒線はBPV−
1型特異的抗体を生成するために合成し使用したポリペ
プチドをコードしている領域を示す。
【0033】L1開放読み取り枠中、最も興味深い領域
は、最初のメチオニン残基から教えられた場合、BPV
−1についてはアミノ酸位置262〜283(22のア
ミノ酸、66のヌクレオチド)、DPVについてはアミ
ノ酸位置263〜283(21のアミノ酸、63のヌク
レオチド)、HPV−1aについてはアミノ酸位置271
〜294(24のアミノ酸、72のヌクレオチド)、ワタ
オウサギ乳頭腫ウイルス(CRPV)についてはアミノ酸
位置266〜29(25のアミノ酸、75のヌクレオチ
ド)、HPV−6bについてはアミノ酸位置263〜28
3(21のアミノ酸、63のヌクレオチド)、そしてBP
V−2についてはアミノ酸位置262〜283(22の
アミノ酸、66のヌクレオチド)である。各ウイルスに
ついてのこの領域のヌクレオチド配列を以下に示す:
【0034】
【表2】
【0035】この、型特異性を与えるDNA領域は、型
特異的アミノ酸配列、即ち主要なキャプシド蛋白質を形
成しているアミノ酸配列内の比較的小さなアミノ酸配列
であるポリペプチドをコードしている。本発明に対し、
「比較的小さな型特異的アミノ酸配列」および「比較的小
さなフラグメント」という語は、そのペプチドに免疫原
的および/または免疫学的特異性を与えるアミノ酸配列
を包含する。それ自身としては、このペプチドは最低6
個のアミノ酸を含み、その両側に位置する大体3個まで
の天然に存在するアミノ酸を含み得る。ただし、この天
然に存在する非特異的な側面のアミノ酸は、ペプチドを
特異性の(異なった型の)PVに対し交差反応性とする程
の数で存在してはならない。このアミノ酸配列に関する
上限として15〜25のアミノ酸残基が本発明に包含さ
れる。しかしながらさらに、本発明の範囲内にあるため
には、このポリペプチドが免疫特異性でなければならな
い。
【0036】「型特異的ポリペプチド」および「特定のP
Vに対し特異的なアミノ酸配列を有するポリペプチド」
という語は、L1キャプシド蛋白質に対応し型特異性
(上記定義による「型特異的」および「型特異性」)を付与す
るポリペプチドを包含することを意味している。本発明
のポリペプチドは、好ましくはBPV−1のL1キャプ
シド蛋白質の残基251〜291、最も好ましくは残基
262および283によって結合したアミノ酸配列に対
応する。この語は、天然に存在するポリペプチド、天然
に存在するポリペプチドとホモローガスな合成ポリペプ
チドおよびその誘導体の両者を包含する。「その誘導体」
とは、天然の配列とは異なるがなお型特異性を付与する
ポリペプチドを意味する。
【0037】さらにこの発明は、型特異性を付与する領
域内からの型特異的な免疫原的および/または免疫学的
特性を与えるに充分な残基を含み、さらに天然配列の一
部ではない他の残基をも含むよう合成された合成ペプチ
ドをも包含する。本発明に係る比較的小さな型特異的ア
ミノ酸セグメントは、下記の実施例1に記載の技術を利
用して、例えば型特異的PV抗血清を製造するのに利用
することができる。しかしながら本発明は抗血清および
抗体が製造される方式によって決して制限されず、この
発明は、単離された抗原からの抗体の産生を含む既知の
またはなお決定されるべき技術を包含するものである。
【0038】上のように、天然に存在するペプチドセグ
メントは、可変領域内に、型特異性を付与するに充分な
量のアミノ酸を含み、ただし可変領域の各側に3個まで
の側面に位置するアミノ酸を含むことができる。当業者
には理解できるように、配列を適正に並べるために、時
としてアミノ酸配列中に空白を挿入することが必要であ
る。
【0039】アミノ酸配列を調整するとき、各配列にお
いて対応する残基の位置と正確な相同関係を示す個々の
配列内の特異的領域が用いられる。数字で参照するため
に塩基配列としてBPV−1(図6〜7)アミノ酸配列を
用い、再び図6〜7に着目すると、正確な配列相同関係
を示す6つの乳頭腫ウイルス全部についてアミノ酸配列
内に5つの領域が存在することが容易に認められる。こ
れらの領域は、両端も含めて、残基105および110
間(6−アミノ酸配列、RGQPLG、以後領域Aとす
る)、残基193および196間(4−アミノ酸配列、D
GDM、以後領域Bとする)、残基200および203
間(4−アミノ酸配列、、GFGA、以後領域Cとす
る)、残基227および230間(4−アミノ酸配列、Y
PDY、以後領域Dとする)および残基292および2
95間(4−アミノ酸配列、PSGS、以後領域Eとす
る)である。
【0040】図6〜7からわかるように、そこに示され
たPVの各々の主たるキャプシド蛋白質についてのアミ
ノ酸配列を調整すると(各々のポリヌクレオチドを配列
させることにより測定)、特に配列の相同性が全く無い
一領域が存在するが、それはBPV−1残基251〜2
91、好ましくは262〜283に対応する残基間の領
域である。領域Dのテトラペプチドおよび領域Eのテト
ラペプチドにおける一致並びに可能な場合領域Dおよび
Eにより結合されたアミノ酸残基における一致に特に注
意することにより、図6〜7に示されたスペーシングを
測定した(およびすることができる)。この方法で、どの
PVの場合でも型特異的配列を容易に決定することがで
きる。
【0041】BPV−1について上記で示されたよう
に、両端を含めた位置251〜291、好ましくは26
2〜283に対応するPVのアミノ酸配列は、PVのL
1キャプシド蛋白質内の型特異性領域を定める。同様
に、L1キャプシド蛋白質をコードするポリヌクレオチ
ド配列内の対応する領域は型特異的なDNA領域を定め
る。
【0042】前述し、また示唆したように、どのような
PVについても型特異性DNA配列(およびアミノ酸配
列)を容易に測定することができる。必要なことはた
だ、主たるキャプシド蛋白質をコードする遺伝子のDN
Aを配列し、そこから蛋白質のアミノ酸配列を推測し、
BPV−1のような既知の配列を用いて配列を調整し
(特に「標識配列」、領域A−Eを利用する)、そしてBP
V−1アミノ酸配列のアミノ酸残基250〜291、好
ましくは262〜283に対応するDNAセグメント
(または対応するアミノ酸セグメント)を選択することで
ある。
【0043】この発明の意図として、「型特異的乳頭腫
ウイルスDNA」または「既知の乳頭腫ウイルス型につい
て特異的なポリヌクレオチド配列」の語は、BPV−1
アミノ酸配列または同様に型特異性を示す場合にはその
アミノ酸配列の誘導体の残基251〜291、好ましく
は262〜283に対応する主キャプシド蛋白質の型特
異的部分をコードするポリヌクレオチドを包含するもの
とする。当技術分野に精通していれば理解できることで
あるが、前記の語は、天然配列、天然配列に由来する合
成配列、遺伝コードの結果としての同義配列(degenera
te sequence)および「ゆらぎ(wobble)」による第3番目
の塩基における可変性による変形体である配列[ワトソ
ン等、「リコビナントDNA:ア・ショート・コース」(R
ecombinant DNA:A Short Course)、38頁(19
83年)(フリーマン・アンド・カンパニー、ニューヨー
ク)参照、以後「ゆらぎ誘導体」とする]を包含するものと
する。
【0044】さら前記の語は、型特異性を与えるのに充
分なヌクレオチドを目的とするポリヌクレオチド配列内
に含むDNA配列、すなわちどちらかの端部で重複する
ことによりPVゲノムの「型特異性フラグメント」を表わ
す配列を包含する。「型特異的な」または「型特異性」を示
すこの発明のポリヌクレオチドには、常套のハイブリダ
イゼーション技術を用いてPV型(ただしPVは50%
未満のDNA配列相同性を有する)を識別する能力を示
すポリヌクレオチドが含まれる。
【0045】この発明の範囲内の特異的ポリヌクレオチ
ドには、BPV−1配列上の位置251〜291、好ま
しくは262〜283に対応するポリペプチドをコード
する前記ポリヌクレオチド、遺伝コードの結果としての
同義配列および「ゆらぎ」による変形体が含まれる。
【0046】この発明の別の具体例ではまた、乳頭腫ウ
イルスの主キャプシド蛋白質をコードするDNAの特異
的ポリヌクレオチドセグメントは乳頭腫ウイルスにおけ
る「共通抗原」であるポリペプチドをコードすることが見
出された。
【0047】「型特異的」ポリヌクレオチドおよびポリペ
プチドについて前述したものと同じ方法論を用いると、
BPV−1が番号付けを目的として塩基アミノ酸配列を
示す場合、標識領域Aとして前記で決められた残基10
5および112間のヘキサペプチドに対応する全PVの
アミノ酸配列が相同性であることが決定された。コード
されたこの6−アミノ酸配列は「共通抗原」を表わす、す
なわち種特異的な抗体を産生する。これらの種特異的抗
体は全PVと交差反応性を示し、様々なイムノアッセイ
において有用なものである。標識されたペプチド配列お
よびその誘導体もまたイムノアッセイにおいて有用であ
る。要するに、型特異的ポリペプチドに対して予想され
た有用性はまた種特異的ポリペプチドにも当てはまるの
である(すなわち、標識抗体、アッセイキット等)。同様
に、B、C、D、Eまたは他の「共通」領域から選ばれた
相同性領域を含むヘキサペプチドもまたこの発明の範囲
内に含まれる。
【0048】図6〜7からわかるように、この発明の態
様の一具体例は、ヘキサペプチド Arg−Gly−Gln−Pro−Leu−Gly を含むものである。当技術分野に精通しておれば容易に
わかるように、それをコードする種特異的ポリヌクレオ
チドもまた含まれる。「誘導体」の語は、配列の種特異性
は不変であるが、対応する天然ポリペプチドとは異なる
アミノ酸配列を意味する。
【0049】〔イムノアッセイ〕一具体例において、主
キャプシド蛋白質の型特異的および種特異的アミノ酸配
列に対してあげられた抗体は当業界においてよく知られ
た常用の標識技術を用いて検出可能に標識され得る。す
なわち、抗体は、例えば3H、125I、131Iおよび35
のような放射性同位元素を用いて放射能標識され得る。
同様に、ペプチド配列自体も例えば放射性同位元素によ
り検出可能標識され得る。
【0050】型特異的もしくは種特異的抗体または種も
しくは型特異的なペプチド配列抗原もまた蛍光標識、酵
素標識、遊離基標識またはバクテリオファージ標識を用
い、当業界で周知の技術(チャード、前出)により標識さ
れ得る。一般的な蛍光標識には、フルオレセインイソチ
オシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコ
シアニン、アロフィコシアニンおよびテキサスレッドが
ある。
【0051】特異的酵素は共有結合により他の分子に結
合され得るため、トレーサー物質の製造における標識と
して用いられ得るという可能性も存在する。適当な酵素
には、アルカリホスファターゼ、ベーターガラクトシダ
ーゼ、グルコース−6−ホスフェートデヒドロゲナー
ゼ、マレエートデヒドロゲナーゼおよびペルオキシダー
ゼがある。2種の主な酵素イムノアッセイは、エンザイ
ムリンクトイムノソルベントアツセイ(ELISA)およ
びエンザイムマルチプライドイムノアッセイ(EMI
T、シバ・コーポレイーション)としても知られている
ホモジニャスエンザイムイムノアッセイである。ELI
SAシステムの場合、例えば固相に結合した抗体を用い
ることにより分離が行なわれ得る。EMITシステムは
トレーサー抗体複合体における酵素の不活性化によるも
のである。すなわち分離段階を必要とせずに活性を測定
することができる。
【0052】さらに、化学ルミネッセンス化合物も標識
として用いられ得る。一般的な化学ルミネッセンス化合
物には、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジ
ニウムエステル類、イミダゾール類、アクリジニウム塩
類およびオキシレートエステル類がある。同様に、生物
発光化合物も標識に用いられ得、ルシフェリン、ルシフ
ェラーゼおよびエクオリンが挙げられる。
【0053】一度標識されると、抗原ポリペプチドまた
はこれに対する抗体は、当業界でよく知られた技術を用
いて免疫カウンターパート(抗体または抗原ポリペプチ
ド)を同定および定量化するのに用いられ得る。 ラジ
オイムノアッセイ(RIA)に関する詳しい記載は、ワー
ク等による「ラボラトリー・テクニクス・イン・バイオ
ケミストリー・アンド・モレキュラー・バイオロジー」
(Laboratory Techniques in Biochemistry and Mol
ecular Biology)中、特にチャードによる「アン・イン
トロダクション・トウ・ラジオイミューン・アッセイ・
アンド・リレイテッド・テクニクス」と題する章に見い
出され(ノース・ホーランド・パブリッシング・カンパ
ニー、ニューヨーク、ニューヨーク、1978年)る
が、これを引用して説明とする。
【0054】様々な型の一般的免疫測量アッセイに関す
る詳しい記載は、次の米国特許、4376110(デビ
ッド等)または4098876(ピアシオ)に見ることが
できる。特に興味深いアッセイは、PVを含有する疑の
ある試験液の小試料をPV型特異的抗原と反応性のある
精製抗体で被覆された不溶性ディスクとインキュベート
することを含む。PV型特異的抗原(アミノ酸配列)が液
中に存在する場合、免疫化学結合が抗原および固定化抗
体間に生じる。可溶性物質をすべて洗浄除去後、不溶性
ディスクを今度は酵素または放射能標識されたコンジュ
ゲート試薬と2回目のインキュベーションに付す。試料
中に抗原が存在する場合、第2免疫化学結合がディスク
上の固定化抗原および標識抗体間に生成する。再び非結
合物質をすべて洗浄除去後、ディスクを測定、例えば基
質と3回目のインキュベーションに付し、固定化酵素の
触媒影響下で化学反応させることにより検出可能な最終
生成物を製造する。この最終生成物は抗原が試料中に存
在する場合のみ溶液中に存在し得るものであり、抗原が
存在しないと固定化された標識が存在しないため最終生
成物は製造され得ない。
【0055】さらに、この発明のアッセイに用いられる
物質は理想的にはキットの製造に適したものである。こ
のようなキットは、バイアル、試験管等のような1個ま
たはそれ以上の容器手段を閉鎖制限状態で受け入れるよ
うに区画された担体手段を有し得るものであり、前記容
器手段の各々は、方法で使用される分離要素の1つを含
む。
【0056】例えば、前記容器手段の1つは、凍結乾燥
形態または溶液に可溶性の検出可能標識抗体を含有し得
る。別の容器の場合不溶性抗体を含有し得る。また担体
手段もさらに複数の容器を含み得、各容器は相異なる予
め測定された既知量の抗原を含む。次にこれら後者の容
器を用いて未知量の抗原を含む試料から得られた結果を
間にはさむことのできる標準曲線をつくることができ
る。
【0057】〔DNAハイブリダイゼーションアッセ
イ〕ウイルスゲノムは、独特で複雑さが限られているた
め、様々なハイブリダイゼーションアプローチに特によ
く用いられる。これらの技術は、プローブとして用いら
れる核酸の放射能標識、固定化核酸を用いたDNA−D
NAおよびRNA−DNAハイブリダイゼーション、サ
イトハイブリダイゼーション並びに溶液におけるDNA
−DNAおよびRAN−DNAハイブリダイゼーション
の反応速度分析方法をともなう。プローブとして用いら
れた核酸の純度および比放射能は非常に重要であり、一
般に高い比放射能を有する核酸を用いる。
【0058】プローブとして用いられる核酸の純度は特
異的ハイブリダイゼーションにおける非常に重要な要素
である。感染細胞ではなく細胞外流体から得られたウイ
ルスを用いるのが好ましく、特に相補RAN(cRAN)
または相補DNA(cDNA)が用いられる。細胞から得
られたウイルスは、汚染された細胞DNAをともなう
が、これはデオキシリボヌクレアーゼ処理により必ずし
も除去されない。すなわち、第1段階は、デオキシリボ
ヌクレアーゼ処理が封入されたゲノムの分断をひき起こ
さないようにウイルス粒子の完全さを保つ当業界で周知
の方法により高度に精製されたウイルスを製造すること
である。抽出されたウイルスDNAをこの時点で厳密に
精製するべきであり、精製後に現われるゲノムは大して
分断されていないため、大きさおよび密度またはスーパ
ーコイル状態のような物理特性に基づいて細胞核酸から
分離され得る。この後、高度精製エンドヌクレアーゼで
処理して同フラグメントとし、次に型特異的または種特
異的ウイルス蛋白質をコードする所望のヌクレオチド配
列を含むフラグメントを単離および回収する。別法とし
て、特異的ポリヌクレオチドプローブを独立して合成す
ることができる。最後に、プローブを検出可能標識する
が、最も用いられる標識は3H、32P、125I、酵素、ビ
オチン/アビジン等である。核酸ハイブリダイゼーショ
ン技術のさらに完全な説明は、ファング等、第6巻、4
57〜497頁(1977年)で見ることができるが、こ
れを引用して説明とする。
【0059】ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチ
ドプローブは原子または無機基で標識され得るが最もよ
く用いられるのは放射性核種であり、また、重金属も用
い得る。場合により、一本鎖DNAに交雑(ハイブリダ
イズ)されたプローブに特異結合する抗体を用いること
も可能である。オリゴヌクレオチドプローブ技術は、ス
ゾスタック等、「メソッズ・イン・エンザイモロジー」
(Meth. Enzymol.)68巻419ー428(1979
年)に記載されているが、これを引用して説明とする。
【0060】最も、一般的には、放射性標識が用いら
れ、適当な放射性標識には32P、3H、14C等がある。
充分なシグナルを発し、充分な半減期を有するものなら
いずれの放射性標識でも用いられ得る。他の標識には、
配位子、蛍光剤、化学ルミネッセンサー、酵素、抗体等
がある。
【0061】6種の単独PV型、BPV−1、DPV、
HPV−1a、HPV−6b、CRPVおよびBPV−2
のヌクレオチド配列のコンピュータ分析により、完全に
非相同性であり、抗原型特異的蛋白質をコードするヌク
レオチド配列を確認した。配列は次の通りである。
【0062】
【表3】 BPV−1 TCGGAGAAACAAGCCCCTACCACAGATTT TTATTTAAAGAATAATAAAGGGGATGCCA CCCTTAAA DPV ACTGACAAAGAACTCCCACCCGAGGCCTA TTATCTGAAGCCACCGGGGGAGATGGAAC TCAAA HPV−1a TCGTTGGGTGATAGGGAGGCAGTCCCACA AAGCTTGTATTTAACAGCAGATGCTGAAC CAAGAACAACTTTA CRPV GGGGACAAGGAAAATGTGAAGAGCAGGGC CTACATAAAACGCACACAGATGCAGGGAG AGGCAAATGCCAACATT HPV−6b GAGGTGGGGGAACCTGTGCCTGATACACT TATAATTAAGGGTAGTGGAAATCGCACGT CTGTA BPV−2 TCTGAAAAAGAAGCACCCAGTAAAGACTT CTACCTCAAAAATGGTAGAGGTGAAGAAA CTCTAAAA
【0063】標識DNAプローブ製造の公知技術を用い
ると、ハイブリダイゼーションを目的とする型特異的D
NAプローブを構築することができる。すなわち、この
発明の一態様は、PV型特異的DNA配列であり、これ
は配列分析の結果として確認することができる。
【0064】この発明の意図するところでは、「型特異
的DNA配列」の語は、免疫学上特異的な主キャプシド
構造蛋白質をコードするPVゲノムにおける高度可変領
域を包含するものとする。従って、所望のヌクレオチド
配列は側面に位置する天然ヌクレオチドも含むが、ただ
し、これらの側面に位置するヌクレオチドはDNA配列
のハイブリダイゼーション特異性を変えるような数では
存在し得ないものとする。一般に、DNA配列は少なく
とも18個のヌクレオチドを含む。さらに、最低限18
個のヌクレオチドからなり、また免疫学上特異的な構造
蛋白質をコードするヌクレオチドであればいかなるもの
もすべてこの発明の範囲内に含まれるものとする。
【0065】ペプチド配列自体の生成に有用であること
に加えて、PVの型特異的DNA配列はまた、当業界で
よく知られた技術を用いてDNAプローブを製造する場
合にも有用である。一般的なDNAプローブ製造技術
は、マンアチスによる「モレキュラー・クローニング」
(Molecular Cloning)(コールド・スプリング・ハーバ
ー・ラボラトリー、1982年)に記載されている。記
載された一技術の場合、エシエリヒア・コリ(E.coli)
DNAポリメラーゼIを用いて、二本鎖DNA分子の一
方の鎖に切り込みを入れたときに生じる3′−ヒドロキ
シ末端にヌクレオチド残基をつけ加えることができる。
さらに、酵素は、その5′〜3′外核小体活性により、
ニックの5′側からヌクレオチドを除去し得る。5′側
からヌクレオチドを除去後、3′側へヌクレオチドをつ
け加えるとDNAに沿ってニックが形成(ニック翻訳)さ
れる[ケリー等、「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー(J.Biol.Chem.)245巻、39(197
0年)]。先在するヌクレオチドを高放射性ヌクレオチド
と置き換えることにより、108cpm/μgを超える量の
特異活性を有する標識DNAを製造することができる
[リグビー等、「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイ
オロジー」(J.Mol.Biol.)113巻237頁(1977
年)]。
【0066】分子ハイブリダイゼーションの幾つかの技
術が組織におけるウイルスDNA配列の検出に用いられ
る。各々が何らかの利点および不都合さを有する。大量
の組織が利用できる場合、ハイブリダイゼーション反応
速度論分析により、存在するウイルスDNAの量を正確
に定量し、またプローブと緊密な関連性はあるが同一で
はない配列を識別し、パーセント相同性を測定する機会
が得られる。反応は、プローブの再会合速度が最適とな
るハイブリダイゼーション条件(Tm−25℃)下で行な
われる[ウエトマー等、「ジャーナル・オブ・モレキュラ
ー・バイオロジー」(J.Mol.Biol.)31巻、349〜
370頁(1968年)]。組織の配列がプローブの配列
と同一であるとき、反応速度は2次的である。しかしな
がら、プローブ配列が組織の配列と部分的相同性を有す
る場合、反応は複雑な反応速度を示す[シャープ等、「ジ
ャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジ−」(J.Mo
l.Biol.)86巻、709〜726頁(1974年)]。
【0067】一般的に、DNAは、冷凍器上で切断し、
SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)のようなデタージエン
トおよびEDTAのようなキレート剤を用いて薄片を溶
解させ、所望により一液プロテイナーゼK(50μg/m
l)で消化することにより組織が単離され得る。蛋白質は
フェノールおよびクロロホルム抽出により除去され、核
酸はエタノールにより沈殿する。RNAは、加熱処理さ
れたリボヌクレアーゼ(RNase)Aで処理することによ
り除去され、DNAはフェノールおよびクロロホルムに
より再抽出される。反応速度研究のために、DNA溶液
を音波処理により一律の一本鎖片サイズ(約500ヌク
レオチド)に切る。3H−チミジントリホスフェートまた
はアルファ32P−デオキシヌクレオチドホスフェートを
用いてニック翻訳によりプローブDNAを標識して高比
活性とする(リグビー等、前出)。細胞DNAに対するプ
ローブの濃度を所望の感度で測定する。1細胞当たり1
乳頭腫ウイルスゲノムを検出するためには細胞DNA1
μg当たり1.3pgのプローブが必要である(ゲルブ等、
「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー」(J.
Mol.Biol.)、57巻、129〜145頁(1971
年)]。DNAを混合し、変性させ、適当な塩濃度および
温度にし、様々な時間放置してハイブリダイズさせる。
水酸化リン灰石クロマトグラフィー[ブライテン等、「サ
イエンス」(Science)、161巻、529〜540頁(1
968年)]またはS1ヌクレアーゼ消化[サトン、「ビオ
キミカ・エ・ビオフィシカ・アクタ」(Biochim.Biophy
s.Acta)、240巻、522〜531頁(1971年)]
によりハイブリダイズされたプローブの量を定量するこ
とにより再会合速度を測定することができる。
【0068】ハイブリダイゼーションのさらに簡単な方
法は、サザーンブロッティング技術である[サザーン、
「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー」(J.
Mol.Biol.)、93巻503〜617頁(1975
年)]。この技術は、ハイブリダイゼーション反応のスト
リンジェンシーにおける可変性および分析下の試料にお
けるウイルス配列状態の決定をもたらす。細胞DNA
(5〜20μg)は、制限エンドヌクレアーゼにより消化
されるかまたは未消化のままでアガロースゲル電気泳動
に付され得る。DNAをその場でアルカリにより変性さ
せ、中和し、ニトロセルロース膜に移す。未消化または
FoI配列を含むゲルにおけるDNAの移動を容易にす
るために、変性前に希HClでゲルを処理することによ
りDNAを除プリン化する[ワール等、「プロシーディン
グズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンシーズ」(Proc.Natl.Acad.Sci.)76巻、368
3〜3687頁(1979年)]。洗浄後、膜を80℃で
2時間真空下で焼き、60℃で4時間50μg/mlの音
波処理および変性したサーモン精液DNAを含む4×S
SC(SSC=0.15モルNaCl、0.05モルクエン
酸ナトリウム)中10×デンハルツ(Denhardts)溶液(フ
イコル、うし血清アルブミン、ポリビニルピロリドン各
々0.2%)においてプレハイブリダイズする。ストリン
ジエントハイブリダイゼーション(Tm−25℃)は、3
7℃で16〜24時間1−5×106カウント/分32
標識ニック翻訳DNA(1−2×108カウント/m/μg
(DNA)の比活性)、1モルNaCl、1×デンハルツ、
0.15モルTES[トリス(ヒドロキシメチル)メチル−
2−アミノエタンスルホン酸]、pH7.5、50μg/ml
の音波処理および変性したサーモン精液DNAおよび5
0%ホルムアミドを含む溶液中で行なわれる。0.1×
SSCにおいて52℃で膜を広範に洗浄し、風乾し、X
線フイルムにあてる、非ストリンジエントハイブリダイ
ゼーション(Tm−43℃)の場合、全細胞DNAはHP
V配列の検出を妨げる基底値ハイブリダイゼーションを
もたらす。これらの反応の場合、前述と同様、ただし除
蛋白質前に組織薄片を溶解させることにより、上清フラ
クションを単離し、粘稠溶液を1モルNaClに導入し、
一夜4℃に保つことにより高分子量配列が沈殿する。高
および低分子量フラクションを低温で20分間1200
0×gの遠心分離により分離する。上清を除蛋白質し、
沈殿したDNAをサザーン分析に用いる。反応は前記と
同様に行なわれるが、ただしサーモン精液DNAの代わ
りにヒトリンパ球DNAを用い、ハイブリダイゼーショ
ンは30%ホルムアミドを含む。膜を52℃で4×SS
C中広範に洗浄し、風乾し、X線フイルムにさらす。乳
頭腫ウイルスは非ストリンジエントハイブリダイゼーシ
ョン条件下で検出され得るDNA配列を維持しているた
め、非ストリンジエントハイブリダイゼーションは型特
異的PVではないPVを同定するのに有用である。
【0069】乳頭腫ウイルスのハイブリダイゼーション
分析にともなう主たる問題は、研究試料に存在する配列
とプローブの関連度である。このことはサザーンブ・ロ
ッティング技術の場合に重要である。その理由は、試料
におけるプローブおよび配列が異なるウイルス型を示し
ている場合でもハイブリダイゼーションのストリンジエ
ント条件下で配列相同性の程度が適度であれば強いシグ
ナルを得ることができるからである。HPV−6および
HPV−11のストリンジエント条件下における配列相
同性のシエアは約25%であり[ギスマン等、「ジャーナ
ル・オブ・バイロロジー(J.Virol.)、44巻、39
3〜400頁(1982年)]、また制限酵素分析が行な
われなければ、シグナルがHPV−6またはHPV−1
1配列によるものであるかどうかを決定するのは困難で
ある。これらの2種のウイルスタイプおよびそれらのサ
ブタイプを区別するためにはPstI消化が有用であると
判明した[ギスマン等、「プロシーディングズ・オブ・ザ
・ナショナル・アカデミー、オブ・サイエンシーズ」(P
roc.Natl.Acad.Sci.)80巻、560〜563頁(1
983年)]。このクロスハイブリダイゼーションの例
を後記実施例2および図8に示す。
【0070】前述のように、標識プローブは、型特異的
PV検出の一般的分析方法を提供する。この方法は、適
当な速さであり、簡単なプロトコルでよく、市販キット
として標準化され、提供され得る試薬を用いるものであ
り、大量の試料を速くスクリーニングできるものであ
る。処理を行なう一方法の場合、ゲノムを含む臨床単離
物を処理することにより一本鎖ゲノム核酸を得、次いで
一本鎖ポリヌクレオチドを支持体に固定する。付着した
核酸、DNAまたはRNAを、型特異的キャプシド蛋白
質をコードする遺伝子のコード(解読)鎖に相補的な塩基
配列を有する標準ポリヌクレオチドと接触させる。
【0071】主たる試薬はRNAまたはDNAであり得
る標識プローブである。一般に、プローブは少なくとも
約25個の塩基を、さらに通常は少なくとも約30個の
塩基を有し、それ以上の場合もあり得る。この点に関す
る制限は、プローブがコードされる蛋白質に関するPV
型特異性を維持するのに要求される最低数より多いヌク
レオチドを含まないということである。
【0072】概して、プローブは、メッセンジャーRN
Aから、逆転写酵素によるメッセンジャーRNAの逆転
写またはゲノムの開裂により得られたcDNAから、好
都合にはエンドヌクレアーゼ消化を行ない、次いで公知
技術にしたがって遺伝子もしくは遺伝子フラグメントの
クローニングにより得ることができる。例えばコーンバ
ーグ、「DNAレプリケーション」(DNA Replicatio
n)、ダブリュー・エッチ・フリーマン・アンド・カンパ
ニー・サンフランシスコ、1980年、670〜679
頁参照。別法として、遺伝子は、メリフィールドによる
「ジャーナル・オブ・M・ケミカル・ソサエティー」(J.
M.Chem.Soc.)85巻2149頁(1962年)に記載
された技術にしたがい合成され得る。DNAフラグメン
トの単離後、フラグメントをプローブ製造に用いること
ができる。
【0073】特定のハイブリダイゼーション技術はこの
発明において本質的なものではなく、当業界で一般に用
いられている技術はすべてこの発明の範囲内に含まれ
る。代表的なプローブ技術は、米国特許4358535
(ファルコウ等)に記載されているが、これを引用して説
明とする。
【0074】前記イムノアッセイの場合のように、この
発明のハイブリダイゼーションアッセイは、キット形態
の体裁で商品化するのに特によく適しており、前記キッ
トは1個またはそれ以上の容器手段(バイアル、試験管
等)を閉鎖制限状態で受け入れるように区画された担体
手段を含み、また、前記容器手段の各々はハイブリダイ
ゼーションアッセイで使用される分離要素の1つを有す
るものである。例えば、1個のバイアルが可溶性で検出
可能標識された型特異的または種特異的DNA配列(標
識プローブ)を含み、1個またはそれ以上の異なるバイ
アルが相異なる予め測定された量のPV抗原を含み得
る。後者の容器は、未知の試料から得られたデータを間
に入れるための標準曲線をつくるのに用いられ得る。
【0075】〔ワクチン類〕この発明の一態様は、PV
型特異的ワクチンの開発を含む。ウイルスに対するワク
チンの様々な製造方法がある。ワクチンおよびワクチン
の製造方法に関する基本的な好ましい必要条件は、(1)
生成したワクチンが宿主において抗体形成を誘発するの
に必要な抗原決定因子を含むこと、(2)ワクチンが高い
免疫原能を有すること、(3)生成したワクチンが受容側
または受容側の接触に関して臨床感染の危険を一切とも
なわずに投与されるほど充分安全なものであり、したが
って(危険性が)完全には除去されない場合予防接種にと
もなう危険性を最少減にすること、(4)生成したワクチ
ンが有毒な副作用、例えば死んだ細胞または抽出された
細胞に存在するエンドトキシンによる発熱を一切もたら
さないこと、(5)生成したワクチンが有効な径路による
投与、例えば経口、鼻腔内、局所または非経口投与に適
していること、(6)生成したワクチンが自然感染状況に
よく似ていること、(7)生成したワクチンが長期貯蔵条
件下で安定しており、しかも前記長期貯蔵が室温でなさ
れていること、並びに(8)生成したワクチンが常用の不
活性ワクチン担体と融和性であることである。それらの
条件はこの発明のワクチンにより達成され得る。
【0076】この発明の一具体例において、L1リーデ
ィングフレームの免疫原的型特異的アミノ酸配列から製
造されたワクチンは、ワクチンの抗原成分を含む。抗原
を免疫原担体すなわちうし血清アルブミンまたはキーホ
ールリンペットヘモシアニンと共有結合させるのが必要
であるかまたは好ましい。この発明のワクチンは乳頭腫
ウイルスに感染されやすい哺乳動物すべてに投与され得
る。ヒトおよびヒト以外の哺乳動物に宿主として利益が
もたらされ得る。
【0077】自然の感染径路により異なり、非経口投与
され得るが、好ましくは経口または鼻腔内投与される。
投与量は、年齢、健康状態、体重、同時処置をしている
とすればその種類および乳頭腫ウイルスの性質により変
化し得る。ワクチンは、経口投与の場合カプセル、液
剤、けん濁液またはエリキシルのような投与形態で用い
られ、非経口または鼻腔内投与の場合液剤またはけん濁
液のような滅菌液体製剤で用いられ得る。好ましくは食
塩水または燐酸緩衝食塩水のような不活性の免疫原的に
許容される担体が用いられる。
【0078】この発明の方法は、L1キャプシド蛋白質
の免疫原的活性ヘプチドをコードする核酸配列の特異的
部分が既知のPVに対するワクチンの製造を可能にする
ものである。さらに、同概念によりPVのDNA内にお
ける任意の免疫原型特異的核酸配列からのワクチン製造
も可能となる。総括的に発明の記載を行ない、次に実例
として下記実施例を挙げるが、特記しない限りこれらに
限定するわけではない。
【0079】実施例1 BPV−1 L1配列の274〜283部分由来のデカ
ペプチド、lys−asn−asn−lys−gly−asp−ala−thr−
leu−lys(N末端から)を合成した。クロマトグラフィー
分析はデカペプチドの純度を98%を越えるものとして
示した。このデカペプチドをポリ−DL−アラニン−ポ
リ−L−リジンに連結し、このコンジュゲートをアジュ
バントペプチドN−アセチルムラミル−L−アラニン−
D−イソグルタミンに連結した。コンジュゲートをフロ
インド完全アジュバント中においてホモジネートした。
ウサギにコンジュゲートデカペプチドを筋肉内接種、す
なわち2週間隔でこの製剤を3回注射し、次いで非コン
ジュゲートデカペプチドを2週間隔でさらに3回注射し
た。3度目のコンジュゲート注射の2週間後、非常に弱い
抗体応答がBPV-1線維乳頭腫のアセトン固定凍結部分
の免疫蛍光により検出された。3度目のコンジュゲート
ペプチド注射後、抗体応答が1:50希釈率で免疫蛍光
により検出され得た。これとは対照的に、インタクト(i
ntact)なBPV−1に対してあげられた高度免疫ウサギ
血清は、免疫蛍光により約10倍高い滴定濃度アッセイ
を有する。このような高度免疫血清はBPV−1と反応
したが、これはまた約1:125の希釈率で線維乳頭腫
を含むBPV−2とも反応した。しかしながら、デカペ
プチドに対してあげられた抗体は、1:2の希釈率でB
PV−2線維乳頭腫と反応しなかった。これらの結果
は、デカペプチドに対する抗体がBPV−1型特異的で
あることを示す。図9は、デカペプチドに対する抗血清
によるBPV−1形質転換活性の中和反応速度を示す。
デカペプチド(O)に対する抗血清、デタージエント崩壊
BPV−1( )に対する抗血清または正常なウサギ血
清(O)の存在下にBPV−1をインキュベートした。C
127マウス細胞の単層を血清処理ウイルスで感染さ
せ、3週間後にフォーカス形成を調べた。デタージエン
ト崩壊BPV−1に対する抗血清のウイルス形質転換活
性の50%中和は約1:10000であり、正常なウサ
ギ血清はBPV−1形質転換活性を抑制しなかった。
【0080】発明について詳しく記載したが、当技術分
野にある程度精通しておれば請求の範囲である種の変化
および修正がなされ得ることは明白であろう。
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、BPV−1、HPV−1aおよびHP
V−6bのL1開放読み取り枠のDNA配列相同性の比
較を示すためのものであり、具体的にはBPV−1(X
軸)対HPV−1aの比較を示す。
【図2】図2は、BPV−1、HPV−1aおよびHP
V−6bのL1開放読み取り枠のDNA配列相同性の比
較を示すためのものであり、具体的にはBPV−1(X
軸)対HPV−6bの比較を示す。
【図3】図3は、BPV−1、HPV−1aおよびHP
V−6bのL1開放読み取り枠のDNA配列相同性の比
較を示すためのものであり、具体的にはHPV−6b
(X軸)対HPV−1aの比較を示す。
【図4】図4は、BPV−1およびDPVについてのL
1読み取り枠のアミノ酸配列を示す。
【図5】図5は、BPV−1、DPVおよびBPV−2
の一部についてのL1読み取り枠のアミノ酸配列を示
す。
【図6】図6は、BPV−1、DPV、HPV−1a、
HPV−6b、CRPVおよびBPV−2の一部につい
てのL1読み取り枠のアミノ酸配列を並べたものを示
す。相同マーク領域A、B、C、DおよびE、ならびに
好ましい、そしてより好ましい型特異的(TS)領域を示
してある。
【図7】図7は、BPV−1、DPV、HPV−1a、
HPV−6b、CRPVおよびBPV−2の一部につい
てのL1読み取り枠のアミノ酸配列を並べたものを示
す。相同マーク領域A、B、C、DおよびE、ならびに
好ましい、そしてより好ましい型特異的(TS)領域を示
してある。
【図8】図8は、BPV−1ゲノムとBPV−2ゲノム
の6040および6754ヌクレオチド間のDNA配列
の相同性の比較である。
【図9】図9は、型特異的デカペプチドに対する抗血清
によるBPV−1の形質転換活性が中和される動力学を
示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C07K 7/06 8318−4H 7/08 8318−4H 14/025 8318−4H 16/08 8318−4H C12P 21/00 Z 9282−4B C12Q 1/68 A 9453−4B 1/70 9453−4B G01N 33/53 D 33/569 L 33/574 C (72)発明者 ベネット・エイ・ジェンソン アメリカ合衆国メリーランド20853、ロッ クビル、ブライアウッド・テラス14220番

Claims (26)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 特定の乳頭腫ウイルスに特異的なアミノ
    酸配列を有し、天然産生L1オープンリーディングフレ
    ームポリペプチドの比較的小さなフラグメントまたはそ
    の誘導体を表わすポリペプチド。
  2. 【請求項2】 6〜14個のアミノ酸を含む特許請求の
    範囲第1項記載のポリペプチド。
  3. 【請求項3】 ポリペプチドの各端の側面に位置する天
    然配列として3個以下の天然アミノ酸を含む、特許請求
    の範囲第2項記載のポリペプチド。
  4. 【請求項4】 アミノ酸配列KNNKGDATLKを含
    む特許請求の範囲第2項記載のポリペプチド。
  5. 【請求項5】 検出可能標識形態をした特許請求の範囲
    第2項記載のポリペプチド。
  6. 【請求項6】 ポリペプチドが放射能標識、酵素標識、
    蛍光標識、化学ルミネッセンス標識、抗体標識および遊
    離基標識からなる群から選ばれた標識により標識され
    た、特許請求の範囲第5項記載のポリペプチド。
  7. 【請求項7】 標識形態をした特許請求の範囲第4項記
    載のポリペプチド。
  8. 【請求項8】 放射能標識された特許請求の範囲第7項
    記載のポリペプチド。
  9. 【請求項9】 特許請求の範囲第1〜4項のいずれかに
    記載のポリペプチドに対して生起したPV型特異的抗
    体。
  10. 【請求項10】 標識形態をした特許請求の範囲第9項
    記載の抗体。
  11. 【請求項11】 抗体が放射能標識、酵素標識、蛍光標
    識、化学ルミネッセンス標識、抗体標識または遊離基標
    識された、特許請求の範囲第10項記載の抗体。
  12. 【請求項12】 型特異的PVを含有する試料を前記ウ
    イルスの抗体に免疫原的に特異的な配列を有する標識さ
    れたアミノ酸フラグメントおよび前記ウイルスに対する
    抗体と接触させ、抗体およびフラグメント間の結合程度
    を測定することからなる型特異的PVの確認方法。
  13. 【請求項13】 型特異的PVを含有する試料を前記ウ
    イルスに免疫学的に特異的な標識された抗体と接触さ
    せ、抗体とウイルスの結合程度を測定することからなる
    型特異的PVの確認方法。
  14. 【請求項14】 特許請求の範囲第1〜4項のいずれか
    に記載のポリペプチドおよびワクチン担体を共に用いて
    うさぎを高度免疫化することからなる型特異的PVウイ
    ルス抗体の製造方法。
  15. 【請求項15】 特許請求の範囲第1〜4項のいずれか
    に記載のポリペプチドを含む乳頭腫ウイルス型特異的ワ
    クチン。
  16. 【請求項16】 さらに生理学的に許容される担体また
    はアジュバントを含有する特許請求の範囲第15項記載
    のワクチン。
  17. 【請求項17】 動物に特許請求の範囲第15項記載の
    ワクチンの有効量を投与することからなる、動物におけ
    る乳頭腫ウイルスに対する免疫化方法。
  18. 【請求項18】 アミノ酸の属特異的配列を有するL1
    キャプシド蛋白質のポリペプチドフラグメントまたはそ
    の誘導体。
  19. 【請求項19】 6〜14個のアミノ酸を含む請求の特
    許範囲第18項記載のポリペプチド。
  20. 【請求項20】 ポリペプチドの各端の側面に位置する
    天然配列に3個以下の天然アミノ酸を含む特許請求の範
    囲第18項記載のポリペプチド。
  21. 【請求項21】 アミノ酸配列:RGQPLGを有する
    特許請求の範囲第18項記載のポリペプチド。
  22. 【請求項22】 検出可能標識形態をした特許請求の範
    囲第18項記載のポリペプチド。
  23. 【請求項23】 ポリペプチドを放射能標識、酵素標
    識、蛍光標識、化学ルミネッセンス標識、抗体標識およ
    び遊離基標識からなる群から選ばれた標識により標識し
    た、特許請求の範囲第22項記載のポリペプチド。
  24. 【請求項24】 特許請求の範囲第22項に記載のポリ
    ペプチドに対して生起した属特異的PV抗体。
  25. 【請求項25】 標識形態をした特許請求の範囲第24
    項記載の抗体。
  26. 【請求項26】 抗体が放射能標識、酵素標識、蛍光標
    識、化学ルミネッセンス標識、抗体標識または遊離基標
    識された、特許請求の範囲第25項記載の抗体。
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