JPH02501442A - ヌクレオチドプローブによるヒト乳頭腫の型の診断 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヌクレオチドプローブによるヒト乳頭腫の型の診断発明の分野 本発明は一般的にウィルス感染の診断、特に核酸ｉｎ　５ｉｔｕハイプリダイゼ ーシヨンアセイを用いたヒト乳頭腫ウィルスの検出（（関する。

発明の背景 １９４０年以前には癌で死ぬ女性の主な原因は頚部癌であった。１９４３年には 早期及び後期の頚部癌の検出に着色された剥落細胞の細胞学を用いることが、パ パニコロウによって示された。１９５４年以降は自バンプスミア”が癌スクリー ニング法として用いられ、西側諸国の女性が頚部癌によって死亡する率を減少さ せ、現在では頚部癌による死亡は乳癌、腸瘍、胃腸前癌及び卵巣癌の次にランク されている。

頚部癌は形態的々変化によるものである。前優しゅう性の段階では軽症異形成、 重症異形成及び１ｎｓｉｔｕ癌である（これらの形態は上皮細胞新生物（ＣＩＮ ）と言われ、程度の軽いものからＣＩＮＩ　、　ＣＩＮＩＩ　。

ＣＩＮＩＩ　と表っている）。これらに続く形態は微少優しゅう性癌及び優しゅ う性癌である。

バンプスミア法では、費用をかけず容易に前優しゅう形態及び優しゅう形態の頚 部癌の両方が検出され、細胞も十分に準備することができる方法である。このテ ストでは擬陽性となることはほとんどないが、擬陰性となることはしばしばあり 、異常なバンプスミアの１０−２０チが正常であると診断されてしまう（文献、 Ｂｅｎｅｄｅｔ　。

Ｊｏｈｎ　Ｌ−及びＭｕｒｐｈｙ、Ｋａｔｈｅｒｉｎｅ　Ｊ、にょる“頚部癌１ ９７０年以降は頚部癌の第１の原因はヒト乳頭腫（ＨＰＶ）であることが証拠づ けられている（文献、Ｄｕｒｓｔ、Ｍ、　、Ｇｉｓｓｍａｎｎ、Ｌ、、　Ｉｋｅ ｍｂｅｒｇ、Ｈ，、及びｚｕｒＨａｕｓｅｎ　、Ｈ，Ａ、による“頚部癌由来の 乳頭腫ウィルスＤＮＡ及び地域の異なる癌生検サンプルのこのウィル３８８１５ （１９８３）に記載、Ｂｏｓｈａｒｔ　、　Ｍ、、Ｇｉｓｓｍａｎｎ　、　Ｌ、 。

Ｉｋｅｎｂｅｒｇ　、　Ｈ，、Ｋｌｅｉｎｈｅｉｎｚ　、　Ａ、　、５ｃｈｅｕ ｒｌｅｎ、Ｗ、、及びｚｕｒ　Ｈａｕｓｅｎ、Ｈ，Ａ、による“新しい型の乳頭 腫ウィルスＤＮＡ　：生殖癌生検及び頚部癌由来の細胞系でのそのウィルスの存 在”、　ＥＭＢＯＪ、、３：１１５１−１１５７（１９８４）に記載、及びＫｒ ｅｉｄｅｒ、Ｊ、Ｗ、、Ｈｏｗｅｔｔ、Ｍ、に、、Ｗｏｌｆｅ、Ｓ。

Ａ、、Ｂａｒｔｌｅｔｔ、Ｇ、Ｌ、、Ｚａｉｎｏ、Ｒ，Ｊ、、５ｅｄｌａｃｅｋ 、Ｔ、Ｖ、、及びＭｏｒｔｅｌ、Ｒ，による“尖圭コンジローム由来の乳頭腫ウ ィルスによるヒト子宮頚部の生体内の形態上の悪性転換”　、　Ｎａｔｕｒｅの ３１７：６３９−６４１（１９８５）　に記載）。

現在わかっているウィルスの型は４６以上であり、頚部で検出されているのは６ ．１１，１６，１８，３１゜３３及び３５　型である。これらのウィルスの内頚 部ゆうぜいの６０％には６型及び１１型のウィルスが見られ（文献、Ｋｒｅｊｄ ｅｒ　、　Ｊ、Ｗ、等（てよる５ｕｐｒａ及びＧｔｓｓｍａｎｎ　、Ｌ、、Ｗｏ ｌｎｉｋ、Ｌ、、Ｉｋｅｎｂｅｒｔ、Ｈ，Ｋｏｌｄｏｖｓｋｙ。

Ｕ、　、５ｃｈｎｕｒｃｈ、Ｈ，Ｇ、　、及びｚｕｒ　Ｈａｕｓｅｎ　、　Ｈ， による“生殖及び喉頭乳頭腫及びある頚部癌における６型及び１１型のヒト乳頭 腫ウィルスのＤＮＡ配列”、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｅｉ、　、８０ ：５６０−５６３（１９８３））、また前侵しゆう性おるいは優しゅう性の頚部 癌として特徴づけられる組織０９０％　以上には１６型及び１８型の乳頭腫ウィ ルスが見られる（Ｄｕｒｓｕｔ　、　Ｍ、、等による５ｕｐｒａ、Ｂｏｓｈａｒ ｔ、Ｍ、、　等による５ｕｐｒａ、ＭｃＣａｎｃｅ。

Ｄ、Ｊ、、及びＣ１ａｒｋａｏｎ、Ｐ、に、による“頚部の上皮細胞異形酸及び 優しゅう性頚部癌の１６型ヒト乳頭腫つＭ、Ｍ、、Ｄｕｎｎｅ、Ｊ、、Ｈｏｇａ ｎ、Ｇ、、Ｇｈａｔａｇｅ、Ｐｒａｆｕｌｌ、及びｐａｔｅｒ、　Ａによる“早 期頚部異形酸での１６型及び１８型ヒト乳頭腫フィルスＤＮＡ配列”　、　Ｖｉ ｒｏｌｏｇｙ。

１５５：１３−１８（１９８６）に記載）。残りの１０％　の頚部癌には、３１ ．３３及び３５型（及び他の関連する未分類の種類のＨＰＶ　）のウィルスが見 られる（文献、Ｌｏｒｉｎｃｚ　ＳＡ、Ｔ、、Ｌａｎｃａｓｔｅｒ、Ｗ、Ｄ、、 Ｋｕｒｍａｎ、Ｒ，Ｊ、。

Ｊｅｎｓｏｎ、Ａ、Ｂ、、及びＴｅｍｐｌｅ、Ｇ、Ｆ、による“頚部異形酸にお けるヒト乳頭腫ウィルスの特徴付けとルーテン臨床スクリーニングによるこのウ ィルスの検出”、“頚部癌のライに７．病因”、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ ｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ出版、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　 、　Ｂｒａｎｂｕｒｙ３ｔｒｅｅｃｋ　、　Ｒ−Ｅ−による“頚部癌に関係する ３３型ヒト乳頭腫ウィルスのゲノム組織及びヌクレオチド配列°°、Ｊ、Ｖｉｒ ｏｌｏｇｙ　、５８．３：９９１−９９５（１９８６）に記載）。

最近の仮設ではＨｐｖ−６及びＨＰＶ−１１は頚部（あるいは外陰部や膣）の良 性増殖（ゆうぜい病変）と関連があわ、１６．１８，３１．３３及び３５型と、 関連するちるいはまだ未分類のＨＰＶは頚部癌の病因と々っている。

頚部癌はまた性病である。性生活全持たない女性ではこの病気は見られ々いが、 性生活のある女性、特に若年時に性生活を持ったシ多数のセンクスパートナー全 持つ女性には高頻度に発症する。このような現象と呼応して、男性の陰茎軸ある いは尿道にはＨＰＶによるゆうぜいはほとんど見られず、精子にはＨＰＶが見ら れる（文献、Ｏｓｔｒｏｗ　、　Ｒ，Ｓ、　、Ｚａｃｈｏｗ　。

Ｋ、Ｒ，、Ｎｉｉｍｕｒａ　、　Ｍ、、　Ｏｋａｇａｋｉ　、　Ｔ、　、　Ｍｕ ｌｅｅｒ、　Ｓ、。

１３ｅｎｄｅｒ、　Ｍ、ｙ及びＦａｒａｓ、　Ａ、Ｊ、による“ヒト精液におけ る乳頭腫ウィルスＤＮＡの検出”、５ｃｉｅｎｃｅ　１２３１　ニア３ｌ−７３ ３（１９８６）に記載）。

ヒト細胞におけるＨＰＶ検出法には抗体あるいはＤＮＡプローブを用いる方法が ある。増殖するＨＰＶの培養系はないため抗体を生成することは難しく、ウィル ス蛋白質を十分に生成する方法はない。最近はＨＰＶタンパク質が太陽菌発現系 で生成されるため、ＨＰＶ特定ポリクローナルあるいはモノクローナル抗体が生 成されている（文献、Ｎａｔｌａｓｈｅｗｓｋｉ　、　Ｇ。

Ｂａｎｋｓ　、　Ｌ、、　Ｗｕ−Ｌｉａｏ　、Ｊ、、　５ｐｅｎｃｅ、　Ｐ、　 、Ｐｉｍ　、　Ｄ、。

ｏｙｏｂｉｃｒａｗｆｏｒｄ　、　Ｌ、による０１８型ヒト乳頭腫ウィルスのＥ ６タンパク質の細菌での発現及び抗Ｅ６抗体の生成″、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｊｒｏｌ 、　６７：１９０９−１９１６（１９８６）に記載）。しかし検出可能なＨＰＶ 抗原は通常後期のＨＰＶ感染では見られないため、ＨＰＶ感染の診断には抗体は 適切ではない（文献、Ｎａｋａｊｉｍａ　、　Ｔ−＋等による“日本における頚 部前癌病変部の乳頭腫ウィルス感染の頻度：免疫パーオキシダーゼ研究”＋　Ｊ ｐｎ。

Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　７７：８９１−８９５（１９８６）に記載）。

対照的に）（ＰＶは感染のあらゆる段階でＤＮＡプローブによって検出すること ができることが言われており、望まし７い診断方法となってきている（Ｓｃｈｎ ｅｉｄｅｒ、　Ａ、。

Ｋｒａｕｓ、　Ｈ，、５ｃｈｕｒｎａｎｎ及びＧｉｓｓｍａｎｎ、　Ｌ、による “下部生殖管の乳頭腫ウィルス感染：婦人科綿棒におけるウィルスＤＮＡの検出 ”、Ｉｎｔｊ、Ｃａｎｃｅｒ、　３５：４４３−４４８（１９８５）と、Ｂｕｒ ｋ、　Ｒ，Ｄ、、　Ｋａｄｉｓｈ、　Ａ、　Ｓ、。

Ｃａ１ｄｅｒｉｎ　ＸＳ、及びＲａｒｎｎｅｙ　、　Ｓ、Ｌ、による“膣頸管洗 浄及び分子二・イブリダイセーションによって検出される頚部のヒト乳頭腫ウィ ルス感染：生検結果とパパニコラウスミアとの関係”、　Ａｍ、Ｊ、　０ｂｓｔ ｅｔ。

最近のＤＮＡグローブ研究では、米国民のＨＰＶ感染が広範囲であ）非常１て変 動していることが示されている。米国、ワシントン、シアトルで行なわれた調査 では、郊外の上級クラス及び都市の下級クラスの女性のＨＰＶ感染の発生率はそ れぞれ６％及び１３％であった。男性でのＨＰＶ感染率についての報告は現在ま での所行なわれていない。

頚部癌と特定の型のＨＰＶとの間には強い関連性がおるため、良性のものである かあるいはこのウィルスの腫瘍形態のものであるか全区別する核酸グローブ診断 テストの必要性が示されている。ＤＮＡプローブテストは、第１にバンプスミア が陽性と出た後に臨床サンプルの範囲ではＨＰＶＯ型がどれであるかを識別する ための二次テストとして用いることができる。第２に、スクリーニングソールと してバンプスミアと関連して用い、異常なＨＰＶ感染頚部細胞のルーチン協働検 出を行なうことができる。Ｒ後にＨＰＶが頚部癌の病因であることが明瞭であシ 、頚部スミアフォーマントを用いることができる、高速で信頼性が高く経済的な ＨＰＶアセイが商品化されていれば、バンプスミアテストに代わりてＤＮＡグロ ーブテストが行なわれる。

医療関係者の中には、頚部細胞のＨＰＶの存在及び型のテストが頚部癌の早期検 出及びこれらの癌の治療選択に大きなインノくクトを与えると主張する人々がい る。さらに高速診断ＨＰＶテストによって男性のＨＰＶ感染の検出及びウィルス の型の検出も行なわれる。男性及び女性の両方でＨＰＶの特定的な感受性テスト を用い、適切なカウンセリング及び／または治療試薬を開発することで、このウ ィルス感染の拡大が抑制されることは重要である。

発明の概要 本発明では、アルデヒド基礎架橋試薬の存在下で担体上に固定された非凍結細胞 スミアのような生体サンプル内のヒト乳頭腫ウィルス（ＨＰＶ）の存在あるいは 型を検出するための高速ｉｎ　５ｉｔｕハイプリダイゼーシヨンアセイが提供さ れている。このアセイは、固定生体サンプルからの核酸を、望ましくは約５０か それ以上の検出可能なヌクレオチドかあるいはその類似体でニックトランスレー ションを行なつ？Ｊ）なくとも１つの検出可能なプローブと結合させ、このプロ ーブが１つ以上の型のＨＰＶ由来の実質的に相補的な領斌と特定なハイブリダイ ゼーションを行なう工程と、プローブハイブリダイゼーション複合体の存在ある いは不存在を検出する工程とから成る。

アセイ全体は約４時間で完了させることができ、約２時間かそれ以下の時間で完 了させることが最も望ましい。アセイは６，１１，１６，１８，３１．３３及び ３５型の内の１つか２つ、あるいはそれ以上の異なる型のＨＰＶの検出に特に有 効である。

生体サンプル、例えば頚部スミアは通常アルコールバスで処理されて、ガラスス ライドのような担体上に固定される。ガラススライド上に固定された頚部スミア サンプルを用いたアセイは、（１）競合する内因性酵素活性を不活化し、（ｉｉ ）サンプル内の核酸を変性させ、（ｉｉｉ）　１つの型のＨＰＶＤＮＡ　６るい はｍＲＮＡ　に相補的な２００ないし６００あるいはそれ以上のヌクレオチド配 列から成る検出可能なプローブをターゲット核酸とハイブリダイズさせ％　（ｉ ｖ）サンプルを洗浄して非結合グローブを除き、（Ｖ）サンプルを検出試薬で培 養し、（ｖｌ）例えば顕微鏡によってサンプルを視覚的に観察する工程から構成 されることが望ましい。

本発明によるアセイはキット方式で与えられる。

例えば典型的なキットでは、６型らるいは１１型のＨＰＶの核酸配列と相補的な 少なくとも５０のヌクレオチドのビオナン標識されたプローブ及び／または１６ ．１８，３１．３３Ａ＋るいは３５型＋７）　ＨＰＶ　１７）核酸配列と相補的 な少なくとも約５０のヌクレオチドの第２のプローブから成る第１のプローブ試 薬と、二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに変換する変性試薬と、ハイブリダイゼーシ ョン反応混合物が備えられている。

キットにはまたアビジン標識された、あるいはストレプトアビジン標識された酵 素とこの酵素の基質を備えることができる。

本発明による他の特徴及び利点は例示によって本発明を説明している以下の詳細 な説明から明らかである。

図面の簡単な説明 第１図は良性頚部ゆうぜい（ＨＰＶ−６）と関連する型のヒト乳頭腫ウィルス（ ＨＰＶ）と、頚部癌の病因と信じられている２つの型ＯＲＰＶ（ＨＰＶ−１６及 びＨＰＶ−３３）の間の部分的なヌクレオチド配列比較を示す。各ＨＰＶゲノム のぎ末端の約７００のヌクレオチド配列は以下のように示される：第１ａ　図に はＨＰＶ−６とＨＰＶ−１１との比較が示され、第１ｂ　図にはＨＰＶ−６とＨ ＰＶ−１６との比較が示され、第１Ｃ図にはＨＰＶ−６とＨＰＶ−３３との比較 が示され、第１ｄ　ｉｉ９にはＨＰＶ−１６とＨＰＶ−３３の比較が示されてい る。

詳細な説明 本発明によると、少なくとも約５０のヌクレオチドの核酸プローブが高速で信頼 性が高く経済的なｉｎ　５ｉｔｕハイブリダイゼーシヨンアセイで用いられ、頚 部あるいは他の細胞のスミアのような生体サンプルに存在するＨＰＶの存在及び 型を検出する。アセイは、テスト全体が約４時間以内で非同位体との予め決めら れたハイブリダイゼーション状態で行なわれ、またわずかな工程で約２時間足ら ずで行なわれるように合理化することができる。さらにすべての工程は室温で行 なわれるため、温度制御インキュベータの必要度を緩和する。

本発明によるｉｎ　５ｉｔｕハイブリダイゼーシヨンテストは、例えば頚部細胞 の非染色スミアを用いた場合、サザンプロットの“ゴールドスタンダード°より も感受性が高いことが多く、特にスライド上で行なわれた場合はごく微量の陰性 細胞内のわずかな陽性細胞を検出することも可能である。さらにこのアセイは短 期間で大きなバッチで行なうことができ、サザンプロントあるいはドツトプロッ ト法を用いたハイブリダイゼーション方式カニ通常必要とする数日の日数よシも 短期間で実行される。

望ましい実施例ではテストされる生体サンプルは、スクレーピングのような標準 法によって得られる細胞スミアか、あるいは（カリフォルニア州、パノラマシテ ィにあるメディカルパンケージングコーポレーションによるシトトランクシステ ムのようなシステムによって）スミアに変換される生検サンプルである。

一般的には細胞スミアサンプルが集められると、ガラス表面（例えばガラススラ イド）、プラスチック（例えばポリカーボネート）、あるいは他の透明不活性基 板のような担体に固定される。固定試薬はピクリン酸及び水銀酸、エタノール、 エタノール／酢酸、メタノール及びメタノール−アセトン混合物のような沈澱剤 である。最も望ましい沈澱固定溶液には、エタノール及びカルノアＢ溶液がある 。標準アルデヒド基礎固定化は一般的には必要ではない。

細胞を予め処理してグローブ拡散を増大させることは有効であり、これには酸処 理あるいはプロテアーゼ処理がおる。検出試薬として酵素を用いる場合は、この 前処理が競合する酵素活性を不活化するにも有効である。

当該分野ではウィルス感染を検出するためのいろいろなｉｎ　５ｉｔｕハイブリ ダイゼーシヨンプロトコールが知られておシ、本発明に従って細胞スミア内のＨ ＰＶを分析するために用いることができる。以下の２つの参考文献によってｉｎ 　５ｉｔｕハイブリダイゼーシヨン法の概観が得られる：文献、Ｓｉｎｇｅｒ　 ＸＲ，Ｈ，。

等による生物技術、　４　（３１：　２３０−２５０（１９８０）と。

）（ａａｓｅ、　Ａｏ等によるウィルス学の方法、第４巻。

ｐｐ１８９−２２６（１９８４）に記載され、両方の文献とも参考文献としてこ こに記載されている。

ターゲットのポリヌクレオチドは、検出される特定のＨＰＶＯ型に依存して広い 範囲から得ることができる。例えばこのようカブロープは結合しているかるるい はそうでなければ生体サンプル内にある任意のＨＰＶを特定する核酸配列とする ことができ、表現型が発現したかどうかに関係なく、野生型ウィルス固体群の突 然変異が含まれる。

プローブはＤＮＡあるいはＲＮＡポリヌクレオチドかオリゴヌクレオチド、ある いはその類似体であり、ターゲットのポリヌクレオチドと十分な相補性を有し、 ターゲットとプローブ間が安定に結合するようになっている。ホモデュプレクシ ング、すなわち完全塩基適合が望ましいが、長いプローブを用いる場合及び／ま たは多重ＨＰＯ型を検出する場合には不可能であることが多い。検出可能な結合 に必要な相同性の程度はハイブリダイゼーション媒体及び／または洗浄媒体のス トリンジエンシーによって変化スる。

本発明で有効なプローブの長さは少なくとも１５塩基でおるが、５０ないし１０ ０塩基か、さらには２００ないし６００塩基かそれ以上が望ましい。基本的には プラスミドベクター配列を含んでもまた含まなくても、約８０００のヌクレオチ ドから成るＨＰＶウィルスのゲノム全体が標識ヌクレオチドの存在下で二ンクト ランスレーションに用いられて、平均約４００塩基の長さのプローブが得られる 。

ＤＮＡプローブは細菌宿主細胞でクローニングされ、ｐＢｒ３２２　あるいはＭ １３のような適切な複製ベクターか、おるいはＳＰ６ブロモータのよりなＲＮＡ ポリメラーゼ特定プロモータを含有するベクターに挿入され、細胞溶解、ＤＮＡ 抽出によって宿主細胞から精製される。さらに抽出する場合は選択された制限酵 素によって消化し、ゲルおるいはカラム分画法によって分離する。

本発明で用いられるプローブはまた市販されている方法及び装置を用いて化学的 にあるいは酵素的に合成しても良い。例えば小さなプローブを生成するには固相 螢光アミド法が特に有効である（文献、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ等によるＣｏ１ｄ　 Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｓｙｍｐ。

ＤＮＡプローブは又ｍ　ＲＮ　Ａの逆転写が、クローニングされりＨＰＶ遺伝子 のニンクトランスレーショ７によって合成することもできる。

化学的あるいは酵素的合成法によって挿入されるＨＰＶ特定配列の範囲のヌクレ オチド類似体には、１−（２−デオキシ−ａ−Ｄ−リボフラノシル）−２ピリミ ジノン、２−デオキシノシン、２−デオキシ−７−ゾアサグアノシン、２−デオ キシ−５〜置換ウリジン、あるいはこれらを適切にブロックした螢光アミドがあ る。これらの泡似体は、例えばプローブの標識や合成の過程で自然に生成される ヌクレオチドで代替することもできるが、プローブのハイブリダイゼーション特 性を許容できるものに維持している。同様の機能を持つ別の類似体も、もちろん 当該分野の良く知られた方法で生成すること力；できる。

特定のターゲット用のプローブを合成する場合、テストの特定性は配列の選択に よって決まる。例えばいくつかのウィルス分離株由来のＤＮＡ　’ｅ比較するこ とによって、型に特定かあるいは遺伝子に特定のいずれかのウィルス検出用の配 列を選択することかできる。ＤＮＡ領域及び配列の比較は市販のコンピュータプ ログラムを用いて行なうことができる。一般的にプローブ用に選択される配列の 特異性が大きい程、バンクグランドノイズは小さい。

プローブは、ハイブリッドポリヌクレオチドの存在を検出するために通常用いら れるいくつかの方法の内の任意の方法によって標識することができる。

一般的な！出方法ｉｄ　８Ｈ，ＩＩＩＪ　、　”ｓ、ｌ’ｃ　、、Ｓ　ルいは　 Ｐで標識されたグローブおるいはプローブ様によるオートラジオグラフィである 。他のｍＨには、直接結合された螢光体、化学発光試薬、酵素及び酵素基質があ る。またはこれらの成分を、標識結合液体と反応する抗体のようなリガンド／抗 リガンド複合体によって間接的に結合しても良い。標識の選択は、要求される特 異性、グローブとの接合の容易性、必要な安全性及び入手できる装置によって決 まる。

選択した標識によって標識をプローブに挿入する方法も決する。放射性プローブ は、通常望ましい放射性同位体を有する市販のヌクレオチドを用いることによっ て生成される。放射性ヌクレオチドは、例エバＤＮＡ合成、ニンクトランスレー ション、ターミナルトランスフェラーゼによるプローブのご末端への放射性塩基 の修飾、放射性ｄＮＴＰの存在下でＤＮＡポリメラ〜ゼのフレノウフラグメント による特定の挿入配列を有するＭ１３プラスミドの複製、るるいは放射性ｒＮＴ Ｐの存在下でＲＮＡポリメラーゼを用いてテンプレートからＲＮＡ　’ｉ転写す ることによって、プローブに挿入することができる。

非放射性プローブはシグナル（例えば螢光体、化学発光体るるいは酵素）によっ て直接に標識するか、あるいはリガンドによる結合によって間接的に標識するこ とができる。そしてこのリガンドは、元々検出可能からるいは酵素か光反応物質 のような検出可能なシグナルと共有結合するレセプター分子に結合する。リガン ド及び抗リガンドは広範囲に変化することがある。リガンドが自然に“抗リガン ドを有している場合、すなわちビオチン（アビジンあるいはストレプトアビジン によって認識される）、チロキシン、及びフルテゾールのようなリガンドの場合 は、標識され、自然に生成されたレセプターとの結合に用いることができる。ま たは、ハプテンあるいは抗原化合物を適切な標識された抗体と組み合わせて用い ることもできる。Ｌａｎｇｅｒ　、　Ｐ、及びＷａｌｄｒｏｐ。

Ａ、によって開示されているポリヌクレオチドのビオチン標識類似体を用いる標 識方法は望ましい（文献、Ｐｒｏｅ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｅｉ　、Ｕ、Ｓ、Ａ 、、７８：６６３３−６６３７．１９８１参照）。望ましい標識方法としては別 に、酵素（西洋マサピパーオキシダーゼおるいはアルカリフォスファターゼ）ｆ 、ＤＮＡプローブ（二本鎖らるいは一本鎖のいずれか）のＤＮＡ　Ｋ　［接結合 させる方法かある（文献、Ｒｅｎｇ、　Ｍ、及びＫｕｒｚ、Ｃ−“ＤＮＡハイブ リダイゼーションの比色法”、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ、−４ソ、　１２：３ ４３５−３４４４（１９８４）参照）。

標識として興味ある酵素はまず、特にフォスファターゼ、エステラーゼ、ウレア ーゼ及びグリコシダーゼのような加水分解酵素か、あるいはパーオキシダーゼの ような酸化還元酵素である。螢光化合物にはフルオレシャインとその誘導体、ロ ーダミンとその誘導体、ダンシル、ウベリフエロン等がある。化学発光体にはル シフェリン及びルミノールのような２．３−ジヒドロフタアジネジオン−ニスが ある。

ハイブリダイゼーション溶液内の標識プローブの量は、標識の性質、細胞ターゲ ット核酸１て適度に結合することができる標識プローブの量、及びハイブリダイ ゼーション媒体及び／または洗浄媒体の正確なストリンジエンシーによって広範 囲に変化する。

一般的にグローブの量がターゲットの化学量を過剰に越える場合、プローブがタ ーゲット核酸に結合する率は促進される。

細胞にハイブリダイゼーション溶液及び標識グローブを添加する前に、競合する 可能性のある内因性酵素活性（すなわちプローブのシグナル検出システムとオー バーランプする活性）を不活化する。不活化は通常はエタノール及び酢酸の混合 物によって行なわれるが、良く知られた阻害剤ならばどれを用いても良い。

一般的なハイブリダイゼーション溶液及び方法は、Ｇａ１ｌ及びＰａｒｄｕｅ（ １９６９）にょるＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ　、Ａｅａｄ・Ｓｃｉ、、　Ｕ、Ｓ、Ａ、 、６３：３７８−３８３と、　Ｊｏｈｎ　、　Ｂｕｒｎｓｔｅｉｌ及びＪｏｎｅ ｓ（１９６９）によるＮａｔｕｒｅ　、　２２３：５８２−５８７及び“核酸ハ イブリダイゼーション：実際的７ブローチ”、Ｅｄｓ、Ｈａｍｅｓ、Ｂ、及びＨ ｉｇｇｉｎｓ、　Ｓ、　ＩＲＬ　プレｙ、　（１９３５）　、　Ｗａｓｈｉｎｇ ｔｏｎ、　Ｄ、　Ｃ，に記載されている。

ハイブリダイゼーション技術は改良されていくため、十分に適用することができ る。

ハイブリダイゼーション溶液は本発明に従って高速に、すなわち２あるいは３時 間以下か１時間以下で、最も望ましくは２０ないし３０分でハイブリダイゼーシ ョンを行なうものなら何でも良い。この溶液は２０ないし６０％の、望ましくは ３０％の極性溶媒を含有しても良い。通常のストリンジェントハイブリダイゼー ション溶液は約５０％のホルムアミド、約０．５ないしＩＭの塩化ナトリウム、 約０．０５ないし０．１Ｍのクエン酸ナトリウム、トリス、ＨＥＰＥＳ　６るい はＰ　Ｉ　ＰＥＳの緩衝液、約０，０５ないし０．２チのンイーン２０あるいは ドデシル硫酸ナトリウムのような非イオン系おるいはイオン系界面活性剤か、ろ るいは少量のＥＤＴＡ　、フィコール（約３００ないし５００キ゛ロダルトン） 、ポリビニルピロリドン（約２５０ないし５００キロダルトン）及び血清アルブ ミンを含有することができる。またハイブリダイゼーション溶液は、約０．１な いし５　ｍ　ｇ　７ｍ　１の非標識担体核酸、例えば子牛の胸腺か鮭の精子ＤＮ ＡのようなフラグメントＤＮＡ　、及び／または酵母ｔ　ＲＮＡがあるいは部分 的々分画ｒ　ＲＮＡを含有し、約０．５ないし２％ｗ　ｔ　−／　ｖ　ｏ　１− のグリシンを選択的に含有することもできる。またポリアクリレートある１ハは ポリメタクリレートのアニオンポリマーのような水溶性あるいは膨張性試薬、デ キストランサルフェート（約１０％が望ましい）のような帯電糖類ポリマー、及 びテトラアルキルアンモニウム塩あるいはトリエチルアミン塩を含む容量排除試 薬のような他の添加物を含有することもできる（文献、Ｍｅ　１ｃｈｏｒ　、　 Ｗ、Ｂ、及びＶｏｎ　Ｈｉｐｐｅｌ　、　Ｐ。

Ｈｏによる“ＤＮＡのｄＡ、　ｄＴ及びｄＧ、　ｄＣ塩基対の相７０：２９８− ３０２と、０ｒｏｓｚ及びＷｅｔｍａｒによる。

Ｂｉｏｐｌｙｍｅｒｓ　、１１８３−１１９９　（１９７７）　ｔ−参照）。

ストリンジェントハイブリダイゼーション状態は、ハイブリダイゼーションある いは洗浄のいずれかの工程で望ましいものである。通常ストリンジエンシーの程 度はイオン強度、部分的な変性溶媒及び温度によって制御される。ハイブリダイ ゼーションあるいは洗浄のストリンジエンシーは、約２０％ないし５０％、通常 は高い割合の範囲内で、ホルムアミドの↓うな部分変性溶媒の濃度を操作するこ とで反応溶液の極性を変えることによって、都合良く変化させることができる。

ストリンジエンシーはまた温度を変えることによっても変化させることができ、 通常は２０℃ないし７５℃の範囲内であるが、本発明では約２０℃ないし３７℃ であることが望ましい。発明の説明に続く実験ｔでよシ、特定のアセイ方式で室 温でハイブリダイゼーションを行なう状態を限定することができる。

担体に固定された細胞がノ・イブリダイゼーション溶液と接触した後、通常はセ ロを予め決められた濃度の塩、緩衝液及び界面活性剤を含有する洗浄溶液にいれ る。洗浄時間は変化するが、５分ないし１時間以上である。通常は最もストリン ジエンシーを決定し不適合二本鎖体の解離を促進するのは、洗浄溶液でおる。ハ イブリダイゼーション複合体全希薄緩衝塩化す）　ＩＪウム溶液で室温にて洗浄 した後、標識の性質に従って二本鎖体（例えば結合プローブ）の存在を検出する ために、複合体が分析される。仁の検出工程は通常１ないし３時間で完了するが 、検出システムによっては１５ないし３０分で行なうこともできる。

標識が放射性の場合は、担体を乾燥させＸ線フィルムに露出させる。または核ト ランク懸濁液を暗所で担体に被覆し、現像、洗浄、染色を行なって顕微鏡下で観 察する（　１（ａａｓｅ等によるＭｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ。

第４巻、ｐｐ、２０９−２１０）。

酵素検出は通常ビオナン化パーオキシダーゼあるいはアルカリフォスフェートの ようなビオチンとの結合で行なわれる。酵素結合アビジンあるいはストレプトア ビジンを用いて酵素をプローブに結合させる。適切な酵素基質が添加された後、 細胞を視覚的に観察してＨＰＶの存在を見る。

本発明の別の実施例は、本発明のアセイを実行するための手段］ンポーネントを 有するコンパートメント（例えばガラス瓶）から成るキットである。望ましい実 施例ではキットは、少なくとも１つの型のＲＰＶ　（例えば６ないし１１型）の 核酸配列と相補的な約２００ないし６００以上の核酸のプローブ及び／または１ つ以上の異なる型のＨＰＶ　（例えば１６．１８゜３１．３３及び３５）の核酸 配列と相補的な約２００々いし６００以上の核酸の第２のプローブから成る第１ のプローブ試薬と、細胞の二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに変換させる変性工程（ 加熱かおるいは化学変性試薬が望ましい〕から構成されている。キットにはまた アビジンあるいはストレプトアビジンで標識された酵素及びこの酵素の基質が、 当該分野で良く知られるように備えられている。キットの成分はすべて通常液体 で構成されるか、おるいは凍結乾燥し、分析段階で水と再構成するようになって いる。

以下の例は発明の説明のためのもので発明を限定するものではない。

実験 ＤＮＡグローブは同一のＤＮＡ源由来の試薬によう、バイオシステムＤＮＡ合成 機（モデル３８０Ｂ　、カリフォルニア州、フォスターシティ）で合成された。

ＤＮＡプローブ精製は、１）逆相カラムを用いた高圧液体クロマトグラフィシス テムによるトリチル化生成物の分画、あるいは２）７Ｍ尿素を含む２０％ポリア クリルアミドゲルのゲル電気泳動による分画によって行なわれた。ＨＰＶヌクレ オチド配列のコンピュータ分析は、マイクロジエニープログラム（ペンクマニン ストルメント、カリフォルニア州、パルアルド）によって行なわれた。

３ｍ、６ｂ、６ｖｃ、８，８ｃ、ＩＯ，Ｉｌｍ、１２．１３＋１４ａ、１５，１ ６．１７ｍ、１８，１９，２０，２１，２２゜２３．２４及び２５型のＨＰＶ　 ｆ含む分子クローンが、日本、ヨーロッパ及び米国の研究所で得られた。

Ｃａ５ｋｉ及びＡ−５４９細胞系はアメリカ型培養コレクションで得られた。

ＳＳＣ緩衝液は０．０１５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ７，０）、０１１５ＭＮａＣ １でｓｂ、ＰＢＳは０．０１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７，４）、０．１３ＭＮ ａＣｌでロシ、デン／Ｓルト溶液は０．０２１フィコール４００，０．０２％ポ リビニルビクリトン（ＭＷ３６０．０００）、０．０２％ＢＳＡ　である。カル ノイＢ溶液は１０％１（ＱＡｃ１３０％りｏロホルム、６０％ＥｔＯＨである。

ＨＲＰ基質溶液はＱ、４ｍｇ／ｍｌ　アミノエチルカルバゾール、０．０２５％ 過酸化水素、０．１ＭＮａ０Ａｃ　（ｐＨ４５）でおる。

！、ＨＰＶゲノムのクローニング ｍ、ＤＮＡ源 患者からの細胞は頚部清浄、洗浄、加水分解して、核酸を分離する（Ｂｕｒｋ、 　Ｒ，Ｄ、、Ｋａｄｉｓｈ　、　Ａ、Ｓ、、Ｃａ１ｄｅｒｉｎ、　Ｓ、及びＲｍ ｎｅｙ、　Ｓ、Ｌ、によるＡｍ、Ｊ、０ｂｓｔｅｔ。

Ｇｙｎｅｃｏｌ、　１５４：９８２９８９．１９８６）。異なる型のウィルスの ゲノムを持金的な長さのフラグメントに切断する制限酵素で°らるＰｓｔＩによ ってＤＮＡ標本の分画を消化するサザンプロット法によ、ｊ）、ＲＰＶゲノムが 検出され型が決められる。消化されたＤＮＡはアガロールゲルによる電気泳動を かけ、それからニトロセルロールフィルタにかけられる（　５ｏｕｔｈｅｒｎ　 、　Ｅ。

によるＪ、Ｍｏｌ　、Ｂｉｏｌ　、　９８　：　５０３．１９７３）　、このフ ィルタは６．１１．１６及び１８　型のニンクトランスレーションＨＰＶゲノム の混合物によってプローブされ、低いストリンジエンシーで洗浄され（Ｌｏｒｉ ｎｃｚ、Ａ、Ｔ、、Ｌａｎｃａｓｔｅｒ、　Ｗ、Ｄ、及びＴｅｍｐｌｅ、　Ｇ、 Ｆ、によるＪ、Ｖｉｒｏｌ。

５８：２２５−２２９）、オートラジオグラフィによって現像される。ＤＮＡは ＨＰＶＯ型、コピー数、及びエピゾーム状態全基礎に選択されてクローニングさ れる。

ｂ、ＨＰＶ配列 以下の８考文献には６．１１．１６．１８．３３型ＨＰＶの配列が記載されてい る：　Ｓｃｈｗａｒｚ、　Ｅ、等による“生殖ヒト乳頭腫ウィルス６ｂ型のＤＮ Ａ配列及びゲノム組織”、ＥＭＢＯＪ、　２：２３６１−２３６８（１９８３） 　１Ｓｅｅｄｏｒｆ　Ｋ、等による“ヒト乳頭腫ウィルス１６型ＤＮＡ配列”、 ウィルス学　１４５：１８１−１８５、（１９８５）；Ｄｉｒｔｒｎａｎｎ　、 　Ｋ、等による“ヒト乳頭腫ウィルスｌｌ型のヌクレオチド配列及びゲノム組織 ”、ウィルス学、１５１　：１２４−１３０、（１９８６）　；　ｃｏｌｅ、　 Ｓ、Ｔ、及びＲ８Ｅ、５ｔｒｅｅｋ　による“頚部癌と関連するヒト乳頭腫ウィ ルス３３型のゲノム組織及びヌクレオチド配列”、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　５８：９ ９１９９５、（１９８６）？及びＣｏ１ｅ、Ｓ、Ｔ。

及びＯ，Ｄａｎｏｓによる“ヒト乳頭腫ウィルス１８型ゲノムのヌクレオチド配 列及び比較分析”、Ｊ、Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、　１９８３：５９９−６０８（１９８７）。

ｅ、６．１１．１６及び１８型ヒト乳頭腫ウィルスゲノムのクローニング ６．１１あるいは１６型ウイルスを含む約１０μｇクロロホルム（１：　１　） 、クロロホルムテ抽出シ、エタノールによシ沈澱させた。約２ないし５μｇの各 ＤＮＡをサザンプロット法によシ分析し、適切なガンマ−３２Ｐ−ＡＴＰ標識さ れた２４オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせた（表１参照）。オ リゴヌクレオチドには約５０％　のＣ残基及びＣ残基が含まれていた。ハイブリ ダイゼーションはオリゴハイブリダイゼーション溶ｉ（０，５ないＬｌ、Ｏｎｇ ／ｍｌ　のオリゴ、０．６ＭＮａＣ１，９０ｍＭ　）リスＨＣＩ、　ｐＨ８，１ ０ｍＭＥＤＴＡ、０．５％５ｘデンハルト、３０％ホルムアミド、９．１　ｍ　 ｇ　／　ｍ　１　加水分解酵母ＲＮＡ　）内で、４３℃において１５時間行なわ れた。フィルタは１ｘオリゴ洗浄溶液（０，０９ＭＮａＣ１，０，００９Ｍ　ト リス、ｐＨ８，０６ｍＭＥＤＴＡ、　０．１％５ＤＳ）で室温にて１５分間、１ ｘ洗浄溶液で室温にて２分賀洗浄した。プローブハイブリダイゼーションはオー トラジオグラフィで検出した。はとんどの場合、検出されたＨＰＶゲノムは全長 でアシ、適切なオリゴヌクレオチドに相補的である。

各サンプルの残シの長さは約２ないし５μｇ　であるが、１８型の場合は１μｇ のラムダＤＡＳＨ−Ｒ１に、６．１１及び１６型の場合は１μｇのＤＡＳＨ／Ｂ ＡＭにリゲートされた（ストシタジエン、カリフォルニア州、サンジエゴ）。反 応物を包み（ストシタジエン製ギガパンクプラス）、組換えファージを選択する 宿主であるＥ、ｃｏｌｉＰ２３９２　で力価測定された。約３ｘ１０　のプラー ク形成ユニットがフィルタフ１イブリダイゼーシヨンによってスクリーニングさ れた（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ　％Ｅ、Ｆ、及びＳ　ａｍｂ 　ｒ　ｏ　ｏ　ｋ　。

Ｊ、による分子クローニング：研究所マニュアル、１９８２年、コールドスプリ ングハーバ−研究所）。

ハイブリダイゼーション及び洗浄状態はサザンプロット法として確立された。陽 性クローンは１ｏ　に約１の頻度で検出された。

ＴＡＢＬＥ　Ｉ Ｐｒｏｂｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ＨＰＶ　Ｔｙｐｅｌ、５’ＧＧＴＴＧＡＡＣＣ ＧＴＴＴＴＣＧＧＴＣＣＣＴＣＣご　６／１１２、　５’ＧＡＧＴＴＡＣＡＧＧ ＡＣＴＡＡＡＧＧＧＴＧＴＴＣ了　６／１１３、　５’ＣＴＧＴＣＡＣＡＴＣＣ ＡＣＡＧＧＡＡＣＡＧＧＴＣ３’　６／１１４、　５’ＣＡＧＡＡ　ＴＡＧＣＣ ＡＴＡＴＣＣＡＣＴＧＴＣＣＧ３’　６／１１５、　５’ＧＴＧＧＴＡＴＣＴＡ ＣＣＡＣＡＧＴＡＡＣＡＡＡＣ３’　６／１１６、　５ＣＴＴＣＡＧＧＡＣＡＣ ＡＧＴＧＧＣＴＴＴＴＧＡＣ３’　１６７、　５’ＧＡＡＧＣＧＴＡＧＡＧＴＣ ＡＣＡＣＴＴＧＣＡＡＣ３’　１６８、　５’ＣＡＡＣＧＣＡＴＧＴＧＣＴＧＴ ＣＴＣＴＧＴＴＴＣ了　１６９、　５’ＣＡＣＴＴＣＣＡＣＴＡＣＴＧＴＡＣＴ ＧＡＣＴＧＣ３’　１６１０、　５’ＧＴＣＴＣＣＡＴＣＡＡＡＣＴＧＣＡＣＴ ＴＣＣＡＣ３’　１６１１、　５’ＣＴＧＴＧＣＡＡＣＡＡＣＴＴＡＧＴＧＧＴ ＧＴＧＧざ　１６１２、　５’ＣＡＧＡＣＡＣＡＣＡＡＡＡＧＣＡＣＡＣＡＡＡ ＧＣ３’　１６１３、ぎＣＡＧＴＡＣＧＣＣＴＡＧＡＧＧＴＴＡＡＴＧＣＴＧざ 　１６１４、　５’ＣＴＡＧＡＡＴＴＡＧＡＧＡＡＴＴＡＡＧＡＧＡＴＴ３’　 １８１５、　５’ＧＣＧＧＴＧＣＣＡＧＡＡＡＣＣＧＴＴＧＡＡＴＣＣ３’　１ ８１６、　５’ＴＣＧＴＣＧＧＧＣＴＧＧＴＡＡＡＴＧＴＴＧＡＴＧ３’　１８ １７、　５’ＧＡＡＴＧＣＴＣＧＡＡＧＴＣＧＴＣＴＧＣＴＧＡＧ３’　１８１ ８、　５’ＡＡＴＧＴＣＴＴＡＡＴＴＣＴＣＴＡＡＴＴＣＴＡＧ３’　１８１９ 、　５’ＧＧＡＴＴＣＡＡＣＧＧＴ’ｆ’ＴＣＴＧＧＣＡＣＣＧＣ３’　１８２ ０、　５’ＣＣＴＧＴＣＧＴＧＣＴＣＧＧＴＴＧＣＡＧＧＡＣＧ３’　１８２１ 、　５’ＡＴＴＴＴＧＧＧＧＣＴＣＴＡＡＡＴＧＣＡＡＴＡＣ３’　１８ｄ、３ １．３３及び３５型のクローニング３１型あるいは３５型を含む約１０μｇのＤ ＮＡをＥｃｏＲｌで切断し、３３型を含むＤＮＡはＢｇｌｌＩで切断シタ。ＤＮ Ａ　’ｉミツエノール：クロロホルム１：１）、クロロホルムで抽出し、エタノ ールで沈澱させた。

各サンプルの約半分？ニンクトランスレーションＨＰＶＩ　６ＤＮＡ　にハイブ リダイゼーションさせるサザンプロット法で分析した。ハイブリダイゼーション は低いストリンジエンシー（３０％ホルムアミド、０．６ＭＮａＣ１，９０ｍＭ 　）リススフェロプラスト、ｐＨ８゜１０ｍＭＥＤＴＡ、　０．５％ＳＤＳ　、 　５Ｘデンハルト、０．１ｍｇ／ｍｌ酵母ＲＮＡ１４３℃にて）で行なった。次 にフィルタを１ｘ洗浄溶液（０，２ｘＳＳＣ、０，１％ＳＤＳ　、ただし１３Ｃ ８ＳＣは０．１５ＭＮａＣ１，０，０１５Ｍ酢酸ナトリウム）で室温にて１５分 、ｌｘ　洗浄溶液で５０℃にて１５分、セして１ｘＮＴ洗浄溶液で６５℃にて１ ０分洗浄した。オートラジオグラフィによってハイブリダイゼーションを検出し た。フィルタを高いストリンジエンシーで（０，０３ＸＳＳＣ，０，１１ＳＤＳ 、６５℃、１５分）再度洗浄し、オートラジオグラフィによって分析した。すべ ての場合、ＨＰＶゲノムは全長で４ｐ、１６型に関連しているが、同等ではない 。

次に各サンプルの残りの半分を適切なラムダＤＡＳＨベクターに結合させ、パッ ケージし、上記のように力価測定した。約３Ｘ１０　のプラーク形成ユニットが フィルタハイブリダイゼーションによってスクリーニングされた。ハイブリダイ ゼーション及び洗浄状態は上記のようにサザンプロットとして確立したものであ る。

ｅ、ＨＰＶクローンの分析及びサブクローヒング陽性クローンからバクテリオフ ァージＤＮＡ　を分離あるいは１ｉｆｅ　ｏＲｌ　によって切断した。はとんど すべての場合、クローンにはヒトゲノムＤＮＡから成る付加挿入物が含まれてい た。次にＤＮＡを、ラムダ及びヒ）　ＤＮＡからＨＰＶゲノムを切除する制限酵 素によって切断した。１８．３１及び３５型にはｇｅｏＲｌ　が用いられ、６． １１、及び１６型にはシ」旧　が用いられ、３３型にはＢｇｌＩＩ　が用いられ た。切断されたＤＮＡはアガロースゲルによる電気泳動にかけられ、標準法に従 ってＮＡ−４５ペーパー（シュライヒヤー・アンド・シュエル、キーン、ニュー ハンプシャー州）で溶出することによシ分離した。

ゲノムはＥｅ　ｏＲｌ　かおるいはＢａｍＨｌ　で消化され子牛の腸のフォスフ ァターゼ（ボエリンガー、インジアナポリス、マンハイム）で処理されたプルニ スクリプトＭ１３ＤＮＡ（ストシタジン）に結合された。

プルニスクリプトベクターは２６の特異制限部位を有する大きなポリリンカーで ある。このポリリンカにあるＴ７及びＴ３ポリメラーゼプロモータによって側面 から守られる。ベクターはまｆｃ４５４ヌクレオチド遺伝子間遺伝子開領域に関 連する）を有する。結合反応は、Ｅ、ｃｏｌｊＢＢ−４（ストシタジェン）及び そのＤＮＡの制限分析によって識別される組替えコロニー（Ｍａｎｉａｔｉｓ　 等による上記の文献）に変換される。

ＨＰＶ５を除いてすべてのコロニーは公開されている制限マツプと適合する。Ｈ ＰＶ６は予想された５、３ｋｂＰｓｔＩフラグメントは有しないが、３．６及び １．７ｋｂフラグメントを有している。組替えプラスミドはいっばいの長さのＨ ＰＶゲノムを有しておシ、ヒト染色体から遊離していた。

■、培養細胞と長いＤＮＡ　７’　Ｏ−ブとのｉｎ　５ｉｔｕ　ハイブリダイゼ ーション ａ、細胞のガラススライド上への固定 １００μｌの適切な培養媒体内のガラススライド上に哨乳動物細、抱（約１００ ００　）をスポットし、３７℃にて１８−２４　時間増殖させた。この方法は、 約５ｏｏｏｏ　のｍ胞がガラス表面にしつかシと固着しているスライドを多数準 備して行なうことができた。

ｉｎ　５ｉｔｕハイブリダイゼーシヨンの前にＰＢＳ溶液に２回侵し、次にカル ノイＢ溶液（１０％ＨＯＡｃ。

３０チクロロホルム、６０％ＥｔＯＨ）に３分間固定した。このスライドと軽く プロンティングして過剰溶液を除き、１０分間風乾させ、使用するまで一２０℃ で保存した。この処理にょシ固定細胞の形態保存性を良好にし、安定性を高め、 また３ｎ　５ｊｔｕハイブリダイゼーシヨンにおける短い及び長いプローブの細 胞ＤＮＡへのアクセス性を高めることができる。

ｂ、長いクローンＤＮＡプローブにょるｉｎ　５ｉｔｕハイブリダイゼーシヨン 長いグローブ（すなわち５０塩基よシ長い）の３２ｐによる標識をニックトラン スレーションによって行ない（Ｒｉｇｂｙ、　Ｐ、　、　Ｒｈｏｄｅｓ、　Ｄ、 、　Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ、Ｍ、。

及（Ｊ　Ｂｅｒｇ、　Ｐ、による“特定性を高めるために、ＤＮＡポリメラーゼ ＩのニックトランスレージョンにｄＵＴＰを用いたニックトランスレーションに ょるビオチン標識を行なった（Ｌａｎｇｅｒ　、　Ｐ、Ｒ，、Ｗａｌｄｒｏｐ、 Ａ。

Ａ、及びＷａｒｄ、　Ｄ、Ｃ，による“新規ビオチン標識されたポリヌクレオチ ドの酵素的合成：核酸アフイニテイプロープ”、Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔ、　Ａｃａ ｄ、　Ｓｃｉ、　、　７８：６６３３−６６３７（１９８１）参照）。ガラスス ライド上に固定された細胞に３０μｍの長いプローブハイブリダイゼーション溶 液（ｐＨ７，４の２０ｍＭＰＩＰＥＳ、　５００ｍＭのＮａＣ１１０，０５％の ＮａＰＰ１，５０％ホルムアミド、１ｘデフ　ハＡ／ト溶液、１０％硫酸デキス トラン、２００ｍｇ／ｍｌの牛胸腺ＤＮＡ、　２００ｍｇ／ｎｌ酵母ＲＮＡ及び １０ｎｇの３２Ｐあるいはビオチン標識した長いプローブ）を積層させた。この 溶液にシリコン化カバースリングを置き、湿らせたチャンバ内で３７℃にて１時 間インキュベートシた。２χｓｓｃに浸すことにょシカバースリップを除いた後 、サンプルをストリンジエンドリーに（緊縮調節を行なって）　２ＸＳＳＣで室 温にて２回洗浄した（５分／洗浄）。

３２Ｐ標識グローブの検出はオートラジオグラフィによシ行い、ビオチン標識グ ローブの検出は以下の２つの方法のいずれかで行なった。

方法＆１：西洋２サビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ　）とストレプトアビジン（７ ５μｌ）の結合体をサンプルに添加し、室温にて３０分インキュベートした。こ のサンプルを２ＸＳＳＣで５分間洗浄し、さらに２ｘＳＳＣ１０，１％　）　１ ．１　トンＸ−１００で５分間洗浄した。サンプルを経くプロッティングし、７ ５μＩＨＲＰ基質溶液を添加して室温にて３０分インキュベートした。

次にサンプルｉ　ＰＢＳで１分間洗浄し、顕微鏡にて観いが、よシ多くの工程が 必要である）。サンプルを７５μｌのプロンキング溶液（１０％清浄ウサギ血清 、４％ＢＳＡ、　２ｘＳＳＣ）で３７℃にて１０分間処理し、２ｘＳＳＣで室温 にて２回洗浄する。ビオチン化ヤギ抗アビジン１ｇＧ（０，１％ＢＳＡ　Ｋ　ｒ ｎｇ／ｍｌ　ｌ）たり７５μｌ）を添加し、３７℃にて３０分間インキュベート し、２ｘＳＳＣで室温における３回の洗浄（３分／洗浄〕Ｋｊつて除いた。最後 に７５μｌのアビジン／ビオチンＨＲＰ複合体（ＡＢＣｉ合体、ベクター研究所 ）を添加し、３７℃にて１５分間インキュベートした。

２ｘＳＳＣで室温にて３回洗浄しく３分／洗浄）、７５μｌの基質溶液を添加し 、暗所で室温にて３０分インキュベートし、　ＰＢＳにて１分間リンスした。サ ンプルを軽くプロンティングし、観察した。

ｍ、結果 ａ、既知のＨＰＶヌクレオチド配列のコンピュータ分析 ＨＰＶの既知のヌクレオチド配列でＩＩＬ型のもの（Ｄａｎｏｓ、　Ｏ，、Ｋａ ｔｉｎｋａ、　Ｍ、及びＹａｎｉｖ、　Ｍ、による“ヒト乳頭腫ウィルスｌａ型 の完全ＤＮＡ配列：パボ（Ｓｃｈｗａｒｚ、　Ｅ−等による“生殖ヒト乳頭腫ウ ィルス６ｂ型のＤＮＡ配列及びゲノム組織”、　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ　。

２、１２：２３４１−２３４８（１９８３）、　８型のもの（Ｆｕｅｈｓ。

Ｐ、　Ｇ、　等による“ヒト乳頭腫ウィルス８型に関連するゆうぜい様表皮発育 異常症ニゲツム配列及び比較分析”、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　５８．２： ６２６−６３４（１９８６）。

１１型のもの（Ｄａｒｔｍａｎｎ、　Ｋ、等による“ヒト乳頭腫ウィルス１１型 のヌクレオチド配列及びゲノム組（５ｅｅｄｏｒｆ、　Ｋ−等による“ヒト乳頭 腫ウィルス１６型のＤＮＡ配列”、　Ｖｉｒｏ、ｏｇｙ、　１４５：１８１−１ ８５（１９８５））。

３３型のもの（Ｃｏ１ｅ、　Ｓ、Ｔ、、及び５ｔｒｅｅｃｋ、　Ｒ，Ｅ、。

Ｓｃｈｗａｒｚ、　Ｅ、による“異なるヒト頚部癌細胞系が示すヒト乳頭腫ウィ ルス１８型初期遺伝子の転写パターンは同様である°”　、　ＥＭＢＯＪｏｕｒ ｎａｌ、　５．９：２２８５−２２９２（１９８６）及びＣｏ１ｅ、　Ｓ、Ｔ、 及びＤｅｎｏｓ、　Ｏ，による“ＨＰＶ１８　型のゲノムのヌクレオチド配列及 び比較分析”、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　、　１９３：５９９−６０８（ １９８７））の既知の領域をマイクロジエニープログラム（ペンクマニンストル メント）全円いてクロス比較した。

これは一部には色々々ＨＰＶの型でヌクレオチド配列の相離がどの程度であるか 全決め、またとの相離が特定性の高い合成りＮＡ　７’　Ｃ−ブ全調整する戦略 にどのような影響を与えるかに決めるためのものである。

ＨＰＶの各々の型は第１図のａ　−ｄ　Ｋ　ＨＰＶ６型と１１型、６型と１６型 、６型と３３型及び１６型と３３型が示されるように、ヌクレオチド配列に驚く 程の相離がある。（ここで示されているのは各ウィルスのぎ末端から約７０（ｌ のヌクレオチドのみである）。

６型及び１１型の間にはかなシ配列保存があることが明かである。対照的に６型 と１６型、６型と３３型、１６型と３３型の間にはあまり配列保存は見られない 。これらのウィルスのゲノム全体を通して見ると、６型と１１型、６型と１６型 、６型と３３型、１６型と３３型の相同性はそれぞれ、８２％、５９％、５８％ 、６６チである。

利用のモデルシステムは、頚部癌由来でＨＰＶ−１６を多数有するＣａ５ｋｉ　 ｍ胞系である（Ｙｅｅ等による“ヒト頚部癌細胞系のヒト乳頭腫配列の存在及び 発及びＦａｔｅｒ　、　Ｍ、　Ｍ、とｐａｔｅｒ、　Ａ、による“頚部癌細胞系 のヒト乳頭腫１６型及び１８型の配列″、胞の培養は容易であるため、固定細胞 を有する“標準化”ガラススライドを多数作るには適切である。

このような標準化サンプルはｉｎ　５ｉｔｕ　／％イブリダイゼーションに利用 するには非常に有効でおる。標準化ガラススライドはガラススライド上に直接に 細胞を一晩成長させることによって準備するのが都合が良いことがわかった。こ の成長の間に細胞はスライドにしつかシと付着し、続くいろいろな工程で細胞を 損失せずに処理することができた。

Ｃａ５ｋｉ細胞が固定されたスライドは一晩増殖させた後、カルノイＢ溶液に５ 分間固定させ、ＥｔＯＨでリンスし、風乾させ、使用するまで一２０℃で保存し た。バラホルムアルデヒドあるいはグルタルアルデヒドによる固定を含むいろい ろな工程をテストしたが、カルノイＢ溶液による固定は、１）細胞の形態を維持 する、及び２）西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）検出システムを用いてＨ ＰＶ　ＤＮＡを検出する際にはっきりと限定された着色沈澱が与えられる、とい う理由から他の方法よりも優れていることがわがハイブリダイゼーションを行な った。又前記方法（ＭｃＤｏｕｇａｌｌ、Ｊ、　Ｋ、　、Ｍｙｅｒｓｏｎ、　Ｄ 、及びＢｅｃｋｍａｎｎ。

による“ピオチン標識ハイブリダイゼーションプローブを用いた培養細胞のウィ ルスゲノム及びパラフイアン埋め込み組織部分の検出”、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　１ ２６：３２−５０（１９８３））を用いて長いピオチン化プローブによる非同位 性ハイブリダイゼーションも行なった。

ピオチン化ハイブリダイゼーションＤＮＡグローブに結合するＨＲＰアビジン複 合体の存在によって、Ｃａ５ｋｉ細胞の核に陽性官号（茶色沈澱）が観察された 。この酵素に↓つてアミンエチルカルバゾールは着色物質に変換される。グロー ブとしてビオチン化ＨＰＶ−６、ＨＰＶ−１１及びＨＰＶ−１８ｔ−用いた対照 実験では着色が見られないため、ｉｎ　５ｊｔｕハイブリダイゼーシヨンの特定 性が高いことが示されている。同様にＨＰＶ−１６を含まないＡ−５４９細胞に よるビオチン化ＨＰＶ−１６ＤＮＡの陰性対照ｉｎ　５ｉｔｕハイブリダイゼー シヨンも、細胞内に発色が見られ々かった。

長いピオチン化プローブによる実験の結果、Ｃａ５ｋｉ　細胞核には核内に弁別 的な信号パターンがあることが示された。一般的に核ごとに７ないし８の大きな 茶色の粒子があった。Ｃａ５ｋｉ細胞には染色体の６ないし７つの部位に約７０ ０のＨＰＶ−１６のコピーが縦列に集積していると報告されているため、この粒 子は各々単一染色体内のＨＰＶ集積ポイントを表わしていると考えられる。従っ て各集積部位（すなわち核沈澱）にはおおよそ１００のＨＰＶのＤＮＡコピーが 含まれている。

粒子ごとに１００のＨＰＶコピーがおると仮定し、このｉｎ　５ｉｔｕハイブリ ダイゼーシヨンの感受性をテストするためにプローブ希釈実験を行なった。Ｃａ ５ｋｉ細胞を用いたｆｎ　ｓｉｔυハイブリダイゼーションで、ビオチン化ＨＰ Ｖ−１６ＤＮＡを非ヒオチン化ＲＰＶ−１６ＤＮＡテ希釈シたものをいくつか用 い、シグナル２＞Ｅ　消失ｆる点を決めた。ビオチン化ＨＰＶ−１６ＤＮＡを６ 倍に希釈すると感受性の限界点でアシ、細胞の縦タ１ｊコピー数が１５ないし２ ０　（１００／６＝１７　）　２＞ｆ検出の限界であることが示された。

ビオチン化ＨＰＶ　ＤＮＡプローブを用いたｌｈ　５ｌｔｕ　ハイブリダイゼー ションは、例えばビオチン化ヒト胎盤ＤＮＡをプローブとして用いることにより 、着色あるいは非着色頚部スミアサンプルに直接性なうことができる。ヒ）　Ｄ ＮＡの全体はヒト細胞の高度反復ＤＮＡ配列と高速にハイブリダイズし、最適な ｉｎ　５ｉｔｕハイブリダイゼーシヨンを速やかに決めることができるため、プ ローブとして用いた。１０１ｇのビオチン化ヒト胎盤ＤＮＡを用いた頚部スミア のｉｎ　５ｉｔｕノ１イプリダイゼーシヨンで、検出可能な非同位性シグナルを 取シ出すことができる。

このＤＮＡプＦ−プを用いて、頚部スミアサンプル由来のｉｎ　５ｉｔｕハイブ リダイゼーシヨンシグナルを得るための望ましい最小限の処理は、以下の実験で 行なわれた。

産婦人科医によって４つの頚部スミアサンプルを得、標準工程によって９５％エ タノールに浸したニーサンプル１は直接に処理した。

一サンプル２はカルノイＢ溶液に浸してから処理した。

一サンプル３はバラホルムアミドに固定し、洗浄してから処理した。

一サンプル４はバラホルムアミドに固定し、トリトンＸ　−１００で処理し、再 度ノ（ラホルムアミドに固定し、洗浄し、処理した（この工程は頚部スミアｉｎ 　５ｉｔｕハイブリダイゼーシヨンのために以前に開発されたものである）。

ビオチン化ヒト胎盤ＤＮＡとアニーリングした後、これらのスライドにはそれぞ れサンプル１．２．３．４でＯ，Ｓ、１．０．０４２及び０．２の相対シグナル が示された。この結果によシ、前処理を除去しても良く、また産婦人科医がエタ ノールに標準浸せきした後直接頚部スミアを処理しても良いことが示された。

また長いビオチン化ＨＰＶ−１６プロープ及びＣａ５ｋｉ細胞系全用い、室温に てｉｎ　５ｉｔｕノ・イブリダイゼーションの実験を行なった。基本的には、室 温で得られた非同位性シグナルと従来の温度（例えば３７℃）におけるアセイを 行なった際に得られたシグナルとの間には相違は見られなかった。さらに、ＨＰ Ｖ−６及びＨＰＶ−１８プローブはＣａ５ｋｉ細胞核ではシグナルを生成しなか ったため、室温でもハイブリダイゼーションの特定性は失われない。以上のよう な結果により、室温でも高速で、感受性のあるｉｎ　５ｉｔｕアセイが完全に方 式化できることが示されている。

他の実験ではワシントン、シアトルにある／）−バービューホスピタルでの性病 の臨床で得られた非着色頚部スミアにｉｎ　５ｉｔｕハイブリダイゼーシヨンが 行なわれた。この病因の患者は６５チがＲＰＶに患染している。この患者から得 られた非着色頚部スミアをｉｎ　５ｉｔｕハイブリダイゼーシヨンによって分析 し、以下の結果を得た：１）１０のサンプルはＨＰＶの６型、１】型、】６型及 び１８型の混合プローブで分析し、５つがＨＰＶ陽性（６０％）テあッた１２） ５−）のサンプルはＨＰＶの６型及び１１型の混合プローブで分析し、３つがＨ ＰＶ陽性であった；３）５つのサンプルはＨＰＶの１６型及び１８型の混合プロ ーブで分、析し、１つのＨＰＶ陽性（２０チ）でおった。陽性テストのほとんど すべての場合、陽性細胞は多数の陰性細胞にわずかの割合で含まれているものだ った。

異常によシ、本発明では、従来の細胞スミア法で用いることができるハイブリダ イゼーションプローブによるＨＰＶ診断テストが提供されており、特に頚部スミ アの感染サンプル内のＨＰＶの存在及び／またはその型を識別するためのもので ある。本発明のアモイは高速で信頼性が高く、また経済的であシ、臨床研究に十 分に方式化することができる。

本発明は理解を明確にするために例を示して詳細に説明したが、添付請求の範囲 の技術範囲内で変化及び変形を行なうことができることは明かでおろう。

１（ＰＶ−３３ ＨＰｆ６ ＦＩＧ、−１ｃ。

ＦＩＧ、Ｉま 手続補正書ζ′￥式つ １°事件０表示　ｒ乙Ｔ／Ｕ、！ｌ；ｇｇ＃’３％”１３、補正をする者 事件との関係　特　許出願人 名称（氏名）マイ７０２υΩ−フ′・フーホクレー＞ヨシ５、に諜シの８４寸　 ２年　１月　３０日こ 国ＷＡｙＪ査報告 ｏｒ−〒ｌｎｅ＋ＱＱ／ｎｊｌに７

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. （１）アルデヒド基礎架橋試薬の存在下て担体に固定された非凍結細胞スミアに あるヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）の存在あるいは型を検出するための高速ｉｎ ｓｉｔｕハイプリダイゼーシヨンアセイにおいて、このアセイが、 固定生体サンプルからの核酸を約５０あるいは５０以上のヌクレオチドあるいは その類似体の少なくとも１つの検出可能なプローブと結合させ、このプローブが １つあるいはそれ以上の型のＨＰＶの実質的に相補的な部分と特定にハイプリダ イズすることができる工程と、 混合及び検出工程が約４時間以下で行なわれる、プローブハイプリダイゼーシヨ ン複合体の存在あるいは不存在を検出する工程とから成るアセイ。
2. （２）生体サンプルがアルコールパス内の処理によつて固定される請求の範囲第 １項に記載のアセイ。
3. （３）担体がガラスかあるいはプラスチツクスライドである請求の範囲第１項に 記載のアセイ。
4. （４）すべての工程が約２０℃ないし３７℃の範囲で行なわれる請求の範囲第１ 項に記載のアセイ。
5. （５）細胞スミアを細胞洗浄、スクレーピング、あるいは生検から得る請求の範 囲第１項に記載のアセイ。
6. （６）プローブがニツクトランスレーションフラグメントから成る訴求の範囲第 １項に記載のアセイ。
7. （７）ハイブリダイゼーションがホモデユプレクシングである請求の範囲第１項 に記載の方法。
8. （８）結合工程がテトラアルキルアンモニウムあるいはトリエチルアミン塩の存 在下で行なわれる請求の範囲第１項に記載のアセイ。
9. （９）結合工程が容量排除試薬の存在下で行なわれる請求の範囲第１項に記載の 方法。
10. （１０）前記結合工程が約１時間以下で行なわれる請求の範囲第１項に記載のア セイ。
11. （１１）前記工程のすべてが約２時間以下で行なわれる請求の範囲第１項に記載 のアセイ。
12. （１２）関連するＨＰＶの型が６、１１、１６、１８、３１、３３あるいは３５ である請求の範囲第１項に記載のアセイ。
13. （１３）組成物が少なくとも２つの検出可能なプローブから成り、各プローブが 異なる型のＨＰＶと特定にハイプリダイゼーシヨンすることができる請求の範囲 第１項に記載のアセイ。
14. （１４）結合ＨＰＶが隠れている可能性のある細胞を有する生体サンプルのヒト 乳頭腫（ＨＰＶ）感染を診断する方法において、この方法が、 生体サンプルを非アルデヒド基礎固定試薬で処理し、生体サンプルの細胞由来の ＤＮＡを非凍結状態で担体上の細胞を通して固定し、核酸プローブとハイプリダ イゼーシヨンできるようにする工程と、ストリンジエントハイプリダイゼーシヨ ン条件において、実質的にＨＰＶの型と相補する固定核酸及び５０かそれ以上の ヌクレオチドからなるプローブか、あるいはその類似体を結合させる工程と、洗 浄して非複合プローブを除去する工程と、ＤＮＡ／プローブ複合体の存在あるい は不存在を決定する工程とから成り、結合及び決定工程が約３０分ないし２時間 の間で行なわれ、少なくとも１つの工程がストリンジエントハイプリダイゼーシ ヨン条件で室温にて行なわれる方法。
15. （１５）エタノール溶液内でガラススライドに固定された頸部のスミアサンプル にあるヒト乳頭腫（ＨＰＶ）の存在及びその型を検出する高速ｉｎｓｉｔｕハイ プリダイゼーシヨンテストにおいて、この方法が、（ｉ）競合内因性酵素活性を 不活化する工程と、（ｉｉ）サンプル内の核酸を変性させる工程と、（ｉｉｉ） ターゲツト核酸に標識プローブをハイプリダイゼーシヨンし、プローブが１つの 型のＨＰＶのＤＮＡかあるいはｍＲＮＡに相補的な少なくとも約５０のヌクレオ チド配列から成る工程と、 （ｉｖ）サンプルを洗浄して非結合プローブを除去する工程と、 （ｖ）サンプルを検出試薬とインキユベートする工程と、 （ｖｉ）サンプルを視覚的に観察する工程から成る方法。
16. （１６）アルコール固定頸部細胞スミアのｉｎｓｉｔｕハイプリダイゼーシヨン によるヒト乳頭腫（ＨＰＶ）検出のためのキツトにおいて、このキツトが６型あ るいは１１型ＨＰＶの核酸配列に相補的な少なくとも５０ないし６００のヌクレ オチドのビオチン修飾されたプローブから成る第１のプローブ試薬コンポーネン ト及び／あるいは１６型、１８型、３１型、３３型あるいは３５型のＨＰＶの核 酸配列とそうほ的な約５０ないし６００のヌクレオチドから成る第２のピオチン 修飾されたプローブと、細胞内の二重鎖ＤＮＡを一重鎖ＤＮＡに変換するための 変性試薬とから構成されているヒト乳頭腫検出キツト。
17. （１７）さらにアビジンあるいはストレプトアビジンで標識された酵素及び酵素 基質を備えた請求の範囲第１６項に記載のキツト。