KR100437626B1

KR100437626B1 - 인간 유두종바이러스 유전자형 검사 방법과 이를 위한검사 키트

Info

Publication number: KR100437626B1
Application number: KR10-2001-0035466A
Authority: KR
Inventors: 정운원; 김현숙; 한인권; 방인석; 문인걸; 한기옥; 강영순
Original assignee: 주식회사 마이진; 문인걸; 강영순; 정운원; 한기옥; 한인권; 김현숙
Priority date: 2001-06-21
Filing date: 2001-06-21
Publication date: 2004-06-26
Also published as: KR20020096663A

Abstract

본 발명은 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction:PCR)방법과 올리고염기 칩(Oligonucleotide Chip)을 이용한 자궁경부암의 원인 균인 인간 유두종바이러스(Human Papillomavirus:HPV) 유전자형(genotype) 검사방법 및 그에 사용되는 키트에 대한 발명으로, 자궁경부 세포에 존재하는 19종류의 HPV 유전자형을 특이도(specificity)높게 검사 할 수 있으며 기존의 검사 방법으로는 확인 할 수 없는 HPV가 중복 감염된 경우도 신속하게 검사 할 수 있는 효과가 있다.

Description

인간 유두종바이러스 유전자형 검사 방법과 이를 위한 검사 키트{Methods for Dectecting Human Papillomavirus and Detection Kit Thereof}

본 발명은 자궁경부암의 원인 균인 인간 유두종바이러스(Human Papillomavirus:HPV) 유전자형(genotype) 검사방법 및 그에 사용되는 키트에 대한 발명으로, 특히 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction:PCR)방법과 올리고염기 칩(Oligonucleotide Chip)을 이용한 HPV 유전자형을 검사방법과 그에 사용되는 키트에 관한 발명이다.

즉 본 발명은 HPV가 감염된 환자의 자궁경부로부터 채취된 시료에서 HPV의 검출과 유전자형을 검사 할 수 있는 방법 및 검사를 위한 시약을 포함한다.

자궁경부암 검사는 주로 세포 도말(PAP semear)과 현미경을 이용하여 자궁경부 세포의 이형성 여부로 검사하고 있다. 그렇지만 이 방법은 사람의 시각에 의존하고 있어 위 양성 및 위 음성의 결과가 생기는 경우가 많다. 또한 세포 도말법은 세포의 이형성을 구별 할 수 있는 고도의 숙달된 인력이 필요하기 때문에 자궁경부암을 정확하고 쉽게 검사 할 수 있는 방법이 필요하다. 최근 분자생물학적 방법을 통하여 자궁경부암의 원인이 인간 유두종바이러스(Human Papillomavirus:HPV)임이 규명되어 HPV 유전자 검사가 세포 도말 검사법보다 효과적이라는 보고가 있다. HPV는 약 8,000개의 염기쌍으로 이루어진 환상의 이중 나선 DNA 바이러스로써 지금까지 약 80여 종류의 서로 다른 유전자형의 HPV가 알려져 있으며 자궁경부암의 원인에 따라 크게 저 위험군(HPV-6,-11,-42,-43,-44,-55형)과 고 위험군(HPV -16,-18.-31.-33.-35,-39,-45,-51,-52,-56,-58,-59형)유전자형으로 분류되어 있다.(참고문헌: Schiffiman MM;J Natl Cancer Inst1992; 84:394-398, IARC working Group, IRAC, Lyon; 1995, Bosch FX et al.,J Natl Cancer Inst1995; 87; 796-802, Ferenczy A,Int J Gynecol Cancer1994; 4; 73-78, Kataja V, et al., 1992; Sex Transm Dis; 19; 154) 따라서 HPV 유전자형 검사는 자궁경부암의 진단과 예방에 매우 중요한 검사이다. 지금까지 HPV 유전자형을 검사하는 분자생물학적 방법은 써던 블롯팅 교잡(Southern blotting hybridization)법, 중합효소 연쇄반응-제한효소 분절길이 다형성(Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism), DNA-RNA교잡법을 이용한 하이브리드 켑쳐법(Hybride Capture, Digene사, 미국)등을 이용하고 있다.(참고문헌:Smith HL, et al.,J Gen Virol,1992; 73;3236-3268, Lungnu OX, et al.,JAMA1989; 267; 2493-2496, Manos MM, et al.,Cancer Cell1989; 7; 209-214, Lorincz AT,J Obstet Genaecol Res,1996; 22; 629-639) 그렇지만 이들 방법들은 방사선 동위원소와 암 유발성 유전자 염색 시약 등의 사용으로 인한 위험성, 검체 처리과정의 어려움, 많은 시간과 노력의 소요 등의 문제점들은 일상적 검사 법으로 사용하는데 어려움이 있다. 최근 많은 검사실에서 사용되고 있는 미국의 Digene사의 Hybride Capture HPV 검사 키트는 HPV 유전자형을 고 위험군과 저 위험군으로만 분류 검사하고 각 유전자형을 검사 할 수 없으며 소요 비용도 고가이다. 따라서 HPV 유전자형을 대량의 검체로부터 상기의 문제점들이 없이 일상적으로 누구나 편리하게 사용 할 수 있는 HPV 유전자형 검사 법이 필요하다. 최근 한 장의 현미경용 유리판 위에서 수십에서 수만 종류의 유전자를 동시에 검사 할 수 있는 유전자 칩(DNA Chip)이 개발 되었다.(참고문헌:Schena M, et al.,Science1995; 270; 467-470, Ramsay G,Nat Biotechnol. 1998; 16; 40-44, Joos BAnal Biochem1997; 247; 96-101) 이를 이용하여 수십 종류의 HPV 유전자형을 동시에 검사 할 수 있는 HPV 유전자 칩의 개발을 가능하게 하였다.

본 발명은 상기한 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 수십 종류의 HPV 유전자형을 동시에 검사 할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 사용되는 HPV 유전자 칩을 포함하는 키트를 제공하는 것이다.

도 1은 HPV 유전자형 검사 올리고염기 칩을 나타낸 사진.

도 2는 HPV 유전자형 검사를 위한 올리고염기 칩 키트를 구성하고 있는 성분을 나타내고 있는 사진.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 자궁경부로부터 세포를 채취하는 단계, 상기 세포로부터 DNA를 추출하는 단계, 상기 DNA를 PCR을 이용하여 증폭하는 단계, 증폭된 HPV유전자를 HPV 올리고칩에 교잡반응을 시키는 단계 및 상기 반응에서 특이적으로 결합된 HPV 유전자형을 확인하는 단계를 포함하는 HPV 유전자형 검사방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기의 DNA추출에 사용되는 시약은 단백질분해효소를 포함하고, 상기의 PCR에 사용되는 HPV유전자 PCR 프라이머의 서열은 서열정보 1∼2에 기재된 서열이고, 상기의 올리고칩에 붙어 있는 유전자형 탐침은 서열정보 3∼21인 것을 특징으로 한다.

또, 본 발명은 a) 자궁경부검체 채취기구 및 DNA 추출 시약, b) HPV-PCR용 시약, 및

c) HPV 유전자형검사용 올리고 칩을 포함하는 HPV 유전자형 검사용 키트를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 구성은 3개 부분으로 나룰 수 있는데 첫째는 자궁경부로부터 세포를 채취하여 DNA를 오염 없이 손쉽게 추출하는 과정과, 둘째는 추출된 DNA로부터 PCR을 이용하여 HPV 유전자들을 특이적으로 증폭하는 과정, 그리고 셋째는 증폭된 HPV 유전자의 유전자형을 분석하기 위해 HPV 유전자형 검사 올리고염기 칩을 제작하고 검사하는 방법으로 이루어져 있다.

또한 각 과정에서 필요한 시약과 기구들을 편리하게 사용 할 수 있게하여HPV 유전자형 검사를 위한 올리고염기 칩 검사 키트를 개발하였다.

본 발명의 HPV 유전자형 검사 올리고염기 칩 검사 방법은 하기와 같은 기술로 구성된다.

1) 자궁경부로부터 세포를 채취하고 보관하기 위해 세포 채취용 솔(PAP-brush)를 이용하여 세포를 채취하고 세포 보존액이 담겨진 튜브에 보존하고,

2) 원심분리하여 세포만 모은 다음 DNA을 추출하기 위해 세포 용해액으로 세포를 용해하여 DNA을 얻고,

3) 이것의 일부를 HPV 유전자에 특이적인 프라이머(primer)인 GP+5와 5 말단에 Cy3 형광 물질이 붙어 있는 GP+6(Cy3-GP+6)프라이머와 PCR 시약을 사용하여 PCR과정으로 HPV 유전자를 증폭 한 후,

4) 증폭된 HPV 유전자의 유전자형을 분석하기 위한 올리고염기 칩 제작은 19종류의 HPV 유전자에 특이적으로 결합하는 19종의 HPV 탐침(Probe)올리고염기 들을 약 30개의 염기(nucleotide)크기로 5 말단에 아민기(-NH2)가 붙어 있도록 합성하여 제작 한 후,

5) 마이크로어레이어(Microarray)장치를 이용하여 각 탐침을 일정한 간격과 배열로 칩 제작용 유리판 위에 붙인뒤 세척하여 고착시키고,

6) 여기에 3)의 HPV 유전자 PCR 산물을 일정한 온도에서 교잡반응(Hybridization)시킨 다음 세척하여 비 특이적으로 결합된 것들을 저거한 후,

7) 칩 스캐너(Scanner)에서 HPV 탐침에 특이적으로 결합된 HPV 유전자형을확인하는 과정의 HPV 유전자형 검사를 위한 올리고염기 칩 검사 방법이다.

상기의 HPV 유전자의 PCR에 사용되는 프라이머인 GP+5와 Cy3-GP+6의 염기서열 구조는 표 1에, 19종류의 HPV 유전자형에 특이적인 탐침 19종의 염기서열 구조는 표 2에 기재되어 있다.

본 발명의 HPV 유전자형 검사 올리고염기 칩 검사 키트를 제작하기 위해 하기와 같은 시약, 기구 및 장치로 구성하였다.

1) 자궁경부에서의 세포 채취와 세포 보존을 위하여,

① 자궁경부 세포 채취용 솔(PAP-brush, 상아메디컬, 한국)

② 세포 보존액과 보존액 튜브

2) 세포로부터 DNA추출하기 위하여,

① 단백질 분해효소(proteinase K)와 세포용해 완충용액

3) HPV 유전자의 PCR을 위하여,

① HPV PCR 프라이머 GP+5와 Cy3-GP+6 각 20p㏖/㎕

② 10XPCR 완충용액

③ Taq DNA polymerae 250unit(Amplitaq, PE, 미국)

4) HPV 유전자형을 검사하기 위한 올리고염기 칩 제작을 위하여,

① 5 말단에 아민기를 붙인 19종류의 HPV 유전자 올리고 탐침들, 농도 50p㏖/㎕

② 표면에 알데하이드(aldehyde)기로 코팅된 현미경용 유리슬라이드

③ 마이크로어레이어 장치(Bio-Robotics, UK)

④ 유리슬라이드를 8구역으로 분활하기 위한 교잡반응 챔버(Multiwell hybridization chamber, Sigma, 미국)

⑤ 0.2%SDS 용액, NaBH4(Sigma, 미국), PBS용액, 100% 에탄올

5) HPV 올리고염기 칩에 HPV 유전자 PCR 산물 교잡반응을 위하여,

① 4)에서 제작된 8구역으로 분활된 HPV 유전자형 검사 올리고염기 칩

② 12XSSPE 교잡반응 완충용액

③ 3N NaOH

④ 3N HCl

⑤ 1M Tris-HCl(pH 7.2)

⑥ 10% SDS

6) 교잡반응이 끝난 올리고염기 침 세척을 위하여,

① 3XSSPE 용액, 1XSSPE 용액

7) HPV 올리고염기 칩 판독을 위하여,

① 마이크로어레이어 스캐너(GSI Lumonics, USA)등으로 구성되어 있다.

상기 시약, 기구 및 장비들로 HPV 유전자형 검사를 위한 올리고염기 칩을 제작하여 자궁경부에서 채취된 검체로부터 HPV유전자형을 할 수 있으며 이를 바탕으로 하기와 같은 구성으로 HPV 유전자형 검사를 위한 올리고염기 칩 검사를 키트화 하였다.

1) 자궁경부에서 세포채취와 보존을 위한,

① 자궁경부 세포 채취용 솔(PAP-brush)

② PBS 세포보존액이 담겨져 있는 15㎖ 튜브

2) 세포로부터 DNA 추출을 위한,

① 단백질 분해효소(proteinase K, Sigma, 미국)가 담겨진 1.5㎖ 튜브

3) HPV 유전자 PCR을 위한,

① GP+5와 Cy3-GP+6 프라이머가 각 각 20p㏖/㎕ 농도의 1.5㎖ 튜브

② 10XPCR 완충용액의 1.5㎖튜브

③ Taq DNA polymerase 250unit(Ampli Tag., PE, 미국)의 1.5㎖튜브

4) HPV 유전자 PCR 산물의 HPV 유전자형 검사를 위한,

① HPV 유전자형 검사 올리고염기 칩

② 8 well 교잡반응 챔버(Multiwell hybridization chamber, sigma, 미국)

상기의 키트를 사용하여 자궁경부로부터 세포를 채취된 세포에서 DNA를 간편히 추출하고 HPV 유전자를 PCR로 증폭 한후 HPV 유전자형을 HPV 올리고염기 칩으로 검사하는데 약 8시간이 소요된다. 또한 한 장의 HPV 올리고염기 칩에서 8검체를 동시에 검사 할 수 있다.

본 발명의 HPV 유전자형 검사 올리고염기 칩 키트를 이용하여 HPV 유전자형 검사를 일상적 검사 방법으로 사용 될 수 있으며 현재 HPV 유전자 검사를 위해 수입되고 있는 HPV 검사 키트 (Hybride Capture, Digene, 미국)를 대체 할 수 있는 산업적으로 매우 유용한 발명이다.

이하 본 발명을 비한정적인 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다.

실시예 1 : 자궁경부로부터 세포의 채취와 보존

자궁경부세포 채취 솔을 이용하여 자궁경부로부터 세포를 채취하여 5㎖ PBS 보존액이 담겨져 있는 15㎖튜브에 넣고 솔의 끝 부분을 절단 한 후 마개를 닫고 4℃ 에 보관하였다.

실시예2 : 세포로부터 DNA 추출 방법

실시예1의 튜브를 2분 동안 강력하게 교반하여 솔에 붙어 있는 세포가 보존액으로 떨어져 나오도록 하였다. 원심분리기에서 3,000g로 10분간 원심분리하여 세포를 침전 시키고 상층액을 제거하였다. 세포는 혈청 분리관(메디랜드, 한국)을 사용하여 1.5㎖ 원심분리 튜브로 옮긴 후, 여기에 100ul 세포 용해완충용액(10mM Tris-HCl, 50mM KCl, 2.5mM MgCl₂, 0.5% Tween20, 200㎍/㎕ proteinase K, pH8.3)을 첨가하여 55℃ 항온조에서 2시간 동안 가온 한 후 95℃ 에서 10분간 더 가온하여 proteinase K의 활성도를 제거하였다.

이상은 자궁경부로부터 채취된 세포에서 HPV유전자의 PCR과정에 사용하기 위한 DNA 추출 방법으로 수십개의 검체를 2시간30분 정도로 신속하고 편리하게 처리 할 수 있으며 검체 상호간에 오염을 방지하여 위 양성의 결과가 없었다. 또한 기존의 추출 방법에서 사용하는 유기용매를 사용하지 않기 때문에 환경오염의 위험성과 불편함을 제거 할 수 있었다.

실시예 3 : PCR에 의한 HPV 유전자의 증폭 방법.

500ul PCR 튜브에 실시예2의 추출된 DNA 5㎕를 GP+5, Cy3-GP+6 프라이머 각각 20p㏖씩, dATP, dGTP, dCTP, dTTP 각각 200㎕ 씩, 그리고 Tag DNA polymerase ℃ 2.5unit가 포한된 1XPCR 완충용액(50mM KCl, 10mM Tris-HCl pH8.4, 1,5mM MgCl₂, 0.1% TritonX-100)에 첨가 한 후 증류수로 총 부피가 50㎕되게 하였다. 간단한 혼합과 원심분리하여 자동온도 조절 장치(9600 thermal cycler, PE, 미국)에서 95℃ 4분 동안 가온 한 다음 95℃ 50초, 55℃ 20초, 72℃ 20초의 반복되는 과정을 42회 실시하고 마지막회는 72℃ 에서 7분 동안 더 가온하여 4℃에 보관하였다. 이때의 소요되는 시간은 2시간30분 정도이다.

[표 1] HPV 유전자 PCR 프라이머 염기서열 구조

프라이머 명	염기서열 구조(5→ 3 )
GP+5	5'-TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC-3'
Cy3-GP+6	5'Cy3-GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC-3

실시예 4 : HPV 유전자형 검사 올리고염기 칩 제작 방법.

가) 마이크로어레이어 장치에서 상기의 시약, 기구 및 장비항에서 준비된 현미경용 유리 슬라이더를 8개 구역으로 분활하여 50p㏖/㎕농도로 맞춰진 19종류의 HPV 유전자형 탐침(염기서열 구조는 표2에 기재함)을 각 구역 마다 19종류의 탐침을 동일하게 붙여 주었다.

나) 상기 가)의 탐침이 붙어 있는 유리 슬라이더를 500㎖ 0.2% SDS 용액에서2분 동안 2번씩 세척하고 증류수로 2번 세척 한 후 1.3g NaBH4와 375㎖ PBS 그리고 125㎖ 에탄올이 혼합된 용액에 넣고 5분 동안 격렬히 교반하여 준 후, 다시 0.2% SDS 용액에서 1분 씩 3번의 세척과 증류수로 1분씩 2번 세척 한 후 물기를 제거하여 건조 후 밀봉된 상자에 보관하여 사용하였다.

[표 2] HPV 유전자형 탐침의 염기서열 구조(5'- 3' )

탐침명	염기서열 구조(5- 3 )
HPV6	ATC CGT AAC TAC ATC TTC CAC ATA CAC CAA
HPV11	ATC TGT GTC TAA ATC TGC TAC ATA CAC TAA
HPV16	GTC ATT ATG TGC TGC CAT ATC TAC TTC AGA
HPV18	TGC TTC TAC ACA GTC TCC TGT ACC TGG GCA
HPV31	TGT TTG TGC TGC AAT TGC AAA CAG TGA TAC
HPV33	TTT ATG CAC ACA AGT AAC TAG TGA CAG TAC
HPV34	TAC ACA ATC CAC AAG TAC AAA TGC ACC ATA
HPV35	GTC TGT GTG TTC TGC TGT GTC TTC TAG TGA
HPV39	TCT ACC TCT ATA GAG TCT TCC ATA CCT TCT
HPV40	GCT GCC ACA CAG TCC CCC ACA CCA ACC CCA
HPV42	CTG GAA CAT CTG GTG ATA CAT ATA CAG CTG
HPV43	TCT ACT GAC CCT ACT GTG CCC AGT ACA TAT
HPV44	GCC ACT ACA CAG TCC CCT CCG TCT ACA TAT
HPV45	ACA CAA AAT CCT GTG CCA AGT ACA TAT GAC
HPV51	AGC ACT GCC ACT GCT GCG GTT TCC CCA ACA
HPV52	TGC TGA GGT TAA AAA GGA AAG CAC ATA TAA
HPV54	TAC AGC ATC CAC GCA GGA TAG CTT TAA TAA
HPV56	GTA CTG CTA CAG AAC AGT TAA GTA AAT ATG
HPV58	ATT ATG CAC TGA AGT AAC TAA GGA AGG TAC

실시예 5 : HPV 유전자형 검사 올리고염기 칩을 이용한 HPV 유전자 PCR산물의 유전자형 검사 방법.

가) HPV 유전자형 검사 올리고염기 칩 준비 방법.

실시예4에서 제작된 HPV 올리고염기 칩에 시약 및 기구 항에서 준비된 8well 교잡반응 챔버를 단단히 부착시켜 8개 구역으로 분활된 올리고염기 칩을 준비하였다.

제1도.

나) HPV 유전자 PCR 산물과 올리고염기 칩의 교잡반응 방법.

500㎕ PCR 튜브에 PCR 산물 20㎕, 증류수 30㎕ 그리고 3N NaOH 5㎕를 첨가 한 후 상온에서 5분 동안 방치하여 HPV 유전자 PCR 산물를 단일 염기가닥(single strand DNA)으로 변성(denaturation)시킨 다음 1M Tris-HCl(pH7.2) 완충용액 2.5㎕와 3N HCl 5㎕를 첨가하여 얼음 위에서 5분간 방치하여 중화시킨 후, 여기에 12XSSPE 교잡반응 완충용액 50㎕와 10% SDS 용액 0.5㎕를 첨가하여 최종 농도가 6XSSPE으로 되게하고 총 부피가 100㎕된 교잡반응 물을 가)에서 준비된 올리고염기 칩의 각 well의 구멍에 1 well당 1검체씩 조심스럽게 주입하였다. well의 구멍은 테이프로 밀봉하여 증발을 방지 한 후 42℃ 항온 Oven에서 2시간 동안 30회/분의 속도로 회전하였다.

다) 교잡반응 후 올리고염기 칩의 세척 방법.

3XSSPE 세척 완충용액 200㎖에서 2분간, 1XSSPE 세척 완충용액 200㎖에서 2분간 씩 50회/분으로 흔들어 주면서 세척 한 후 물기를 조심스럽게 제거하여 빛이 차단된 곳에 보관하였다.

라) 세척 후 올리고염기 칩의 HPV 유전자형 확인 방법.

칩 스켄너를 550㎖의 여기 파장과 570㎚의 방출 파장을 검출 할 수 있도록 설정한 후 다)에서 세척된 올리고염기 칩을 넣고 HPV 유전자형의 탐침에 HPV 유전자 산물이 결합하여 발색된 탐침의 위치를 판독함으로서 HPV 유전자형을 확인하였다(표 3).

[표 3] HPV 유전자형 검사 올리고 칩에 의해 확인된 HPV 유전자형 및 위치

HPV Type	PCR	DNA Chip	결과
저위험군	HPV 6형
	HPV 11형
	HPV 34형
	HPV 40형
	HPV 42형
	HPV 43형
	HPV 44형
고위험군	HPV 16형
	HPV 18형
	HPV 31형
	HPV 33형
	HPV 35형

HPV Type	PCR	DNA Chip	결과
고위험군	HPV 39형
	HPV 45형
	HPV 51형
	HPV 52형
	HPV 54형
	HPV 56형
	HPV 58형
기타	HPV에 감염되었으나 19종 이외
음성	HPV에 감염되지 않은 경우

HPV 코인펙션

HPV Type	PCR	DNA Chip	결과
HPV 코인펙션	HPV54, 58형
	HPV16, 18형
	HPV18, 31형

실시예 6 : HPV 유전자형 검사 올리고염기 칩을 이용한 자궁경부 세포 검체의 검사

가) 실시예4에서 제작된 HPV 유전자형 검사 올리고염기 칩을 실시예5의 검사 방법에 따라 자궁경부로부터 채취된 세포 검체들 중에서 세포 도말법으로 상피 이형증으로 판명된 149개의 검체를 대상으로 HPV 유전자형을 검사하였다.(표 4)

[표 4] HPV 올리고염기 칩 검사에 의한 자궁경부 세포 검체의 HPV 유전자형

HPV 유전자형
	저위험군	고위험군	중복감염	음성	총계
	6	11	34	음성	총계	40	42	43	44	16	18	31	33	35	39	45	51	52	54	56	58	2종이상
검체수	1	2			4		1	48	2	9	6	3	1	1	5	4	3	4	10	17	42	163

이상의 자궁경부의 세포 검체는 삼성 제일병원의 산부인과에 내원한 환자들로부터 채취하여 검사한 결과이다.

더욱이, 본 발명의 HPV 유전자형 검사를 위한 올리고염기 칩과 시약들을 키트화 하면 다량의 검체에 대한 HPV 유전자형 검사를 시간과 노력을 줄이며 손쉽게 할 수 있는 바, 본 발명의 보호 범위에는 검사 방법 및 검사 키트 역시 포함되는 것으로, 키트화하는 방법을 하기 실시예 7에 기재한다.

실시예 7:

HPV 유전자형 검사를 위한 검사 방법과 올리고염기 칩의 검사 키트화 방법.

본 발명의 HPV 유전자형 검사를 위한 올리고염기 칩의 검사 키트는 자궁경부로부터 세포를 채취하여 DNA를 추출하는 기구와 시약을 키트화 한 부분과, HPV 유전자를 PCR하는 과정의 시약을 키트화 한 부분, 그리고 HPV 유전자 PCR산물의 유전자형을 확인하기 위한 HPV 유전자 올리고 칩의 3부분으로 구성된다. (도 3)

가) 자궁경부로부터 세포 채취와 DNA 추출 방법의 키트화

실시예 1과 2에서 기재 한바에 따라 제조된 기구와 시약을 키트화 하는데, 그 구성은 ①.자궁경부 채취 솔과 ②.5ml PBS용액이 담겨진 15ml 튜브, ③.단백질 분해효소(protienase K, Sigma, 미국)가 20mg/ml 농도로 담겨진 1.5ml 튜브로 구성되어 있는데 ①.은 실온에 보관하고 ②.는 4℃에 그리고 ③.은 -20℃에 보관한다. 이 키트는 50개의 자궁경부 세포 검체를 처리 할 수 있는 분량이며 처리 조작 및사용 방법은 실시예1 및 2에서와 동일하다.

나) HPV 중합효소연쇄반응(PCR)을 위해 구성된 시약의 키트화

실시예 3에 기재 한 바에 따라 HPV 유전자의 HPV 유전자의 PCR을 위해 사용되는 시약을 키트화 하였다. 그 구성은 ①. HPV 유전자 PCR 프라이머 인 GP+5와 Cy3-GP+6 프라이머 가 각 각 20pmol/l, 50ul 부피로 담겨진 1.5ml 튜브, ②. 10X PCR 완충용액 1ml가 포함된 1.5ml 튜브, ③. 10mM dNTP(dATP, dGTP, dCTP, dTTP들의 혼합 용액)용액 100ul가 포함된 1.5ml튜브, ④. Taq. DNA중합효소(Amplitaq, PE, 미국)가 200unit 포함된 1.5ml 튜브로 구성되어 있다. 이들 모두는 -20℃ 냉동고에 보관하고 사용 방법은 실시예 3에서와 동일하다.

다) HPV 유전자 올리고염기 칩 키트화

실시예 4의 제작 방법에 따라 제작 한 HPV 올리고염기 칩은 1장으로 8개의 검체를 처리 할 수 있는 올리고염기 칩 10장으로 구성하였고 사용 방법은 실시예 5에서와 동일하다.

이상의 HPV 유전자형 검사를 위한 올리고염기 칩 키트는 50개의 자궁경부 세포 검체를 처리 할 수 있도록 구성하였다(도 2).

본 발명의 HPV 유전자형 검사 올리고염기 칩에 의한 HPV 유전자형 검사 결과 표 3과 표 4에서 볼 수 있는 바와 같이 자궁경부 세포에 존재하는 19종류의 HPV 유전자형을 특이도(specificity)높게 검사 할 수 있으며 기존의 검사 방법으로는 확인 할 수 없는 HPV가 중복 감염된 경우도 검사 할 수 있었다. 또한 자궁경부 세포 검체로부터 DNA를 추출하여 올리고염기 칩에 의한 HPV 유전자형을 확인하기까지 약 8시간 내로 신속하게 검사 할 수 있는 산업적으로 매우 유용한 HPV 유전자형 검사 방법임을 알 수 있다.

<110> MYGENE;HAN IN KWON <120> Methods for Dectecting Human Papillomavirus and Detection Kit Thereof <160> 21 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for HPV gene;GP+5 <400> 1 tttgttactg tggtagatac tac 23 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for HPV gene;Cy3-GP+6 <400> 2 gaaaaataaa ctgtaaatca tattc 25 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for HPV6 <400> 3 atccgtaact acatcttcca catacaccaa 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for HPV11 <400> 4 atctgtgtct aaatctgcta catacactaa 30 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for HPV16 <400> 5 gtcattatgt gctgccatat ctacttcaga 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for HPV19 <400> 6 tgcttctaca cagtctcctg tacctgggca 30 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for HPV31 <400> 7 tgtttgtgct gcaattgcaa acagtgatac 30 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for HPV33 <400> 8 tttatgcaca caagtaacta gtgacagtac 30 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for HPV34 <400> 9 tacacaatcc acaagtacaa atgcaccata 30 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for HPV35 <400> 10 gtctgtgtgt tctgctgtgt cttctagtga 30 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for HPV39 <400> 11 tctacctcta tagagtcttc cataccttct 30 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for HPV40 <400> 12 gctgccacac agtcccccac accaacccca 30 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for HPV42 <400> 13 ctggaacatc tggtgataca tatacagctg 30 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for HPV43 <400> 14 tctactgacc ctactgtgcc cagtacatat 30 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for HPV44 <400> 15 gccactacac agtcccctcc gtctacatat 30 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for HPV45 <400> 16 acacaaaatc ctgtgccaag tacatatgac 30 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for HPV51 <400> 17 agcactgcca ctgctgcggt ttccccaaca 30 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for HPV52 <400> 18 tgctgaggtt aaaaaggaaa gcacatataa 30 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for HPV54 <400> 19 tacagcatcc acgcaggata gctttaataa 30 <210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for HPV56 <400> 20 gtactgctac agaacagtta agtaaatatg 30 <210> 21 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for HPV58 <400> 21 attatgcact gaagtaacta aggaaggtac 30

Claims

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서열번호 3 내지 서열번호 21로 기재되는 HPV 탐침 올리고염기가 일정한 간격과 배열로 칩제작용 유리판 위에 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 DNA 칩.
제 2항에 있어서, 상기 HPV 탐침 올리고염기는 5' 말단에 아민기가 붙어 있는 것을 특징으로 하는 DNA 칩.
a) 자궁경부로부터 세포를 채취하는 단계;

b) 상기 세포로부터 DNA를 추출하는 단계;

c) 상기 DNA를 PCR을 이용하여 증폭하는 단계;

d) 증폭된 DNA를 제 2항의 DNA 칩에 교잡반응을 시키는 단계; 및

e) 상기 반응에서 특이적으로 결합된 HPV의 유전자형을 확인하는 단계를 포함하는 HPV 유전자형의 검사 방법.
a) 자궁경부검체 채취기구 및 DNA 추출 시약;

b) HPV-PCR용 시약; 및

c) 제 2항의 DNA 칩을 포함하는 것을 특징으로 하는 HPV 유전자형 검사용 키트.
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