본 발명의 HPV 분석용 프로브, DNA , 키트, 및 이를 이용한 분석방법은 다음 과 같이 9 단계로 완성되었다.
1. 표준 및 대조군 검체의 준비
주요형의 HPV에 감염이 된 인체 자궁경부암 세포주와 한국인의 자궁경부암 조직 68례, 그리고 4,898례의 한국인의 자궁경부세포 검체를 채취하여 준비하였다. 이로부터 양성 대조군 및 음성 대조군 표본을 구하였다(실시예 1)
2. DNA 분리
상기 1단계의 다양한 각종 검체로부터 적정 방법을 수립하여 DNA를 분리하였다(실시예 2)
3. PCR
HPV의 E6/E7 유전자와 L1 유전자, 그리고 인체형 베타글로빈 유전자의 증폭을 위한 올리고뉴클레오타이드 프라이머(oligonucleotide primer)를 선택 및 고안하고 적정 PCR 조건을 수립하였다. PCR은 단일(single PCR)과 듀플렉스(duplex PCR), 트리플렉스(triplex PCR)로 달리하여 각각의 조건을 수립하였다. 아울러 상기 2 단계에서 분리된 DNA를 주물로 하여 HPV E6/E7 유전자와 HPV L1, 인체형 베타글로빈유전자에 대해 PCR을 수행하였다(실시예 3).
4. 시퀀싱 분석 및 클론 확보
상기 PCR후 시퀀싱반응으로 HPV-E6/E7과 HPV L1의 염기서열을 분석하고 그 자료를 정리하여 데이터베이스를 구축하였다. 아울러 각 HPV형이 확인된 PCR 산물은 플라스미드 벡터에 클로닝(cloning) 하였다. 이 클론은 이후 본 발명의 DNA칩의 반응조건 수립시 표준 및 대조군 검체로 사용하였다. HPV 유전자형이 확인된 임상 DNA 검체는 보관해 두었다가 본 발명의 DNA칩의 정확도 분석에 사용하였다(실시예 4와 5).
5. DNA칩의 프로브 디자인
앞의 4 단계의 한국인의 자궁경부세포의 HPV 유전자형 분석용 임상 검체에서 발견된 HPV의 E6/E7 및 L1의 데이터베이스와 외국의 HPV 관련 데이터베이스에 따라 가장 중요하며, 40 가지 유형의 외성기 HPV의 L1과 E6/E7, 그리고 인체 베타글로빈을 각각 DNA 칩 위에서 히브리다이제이션 반응으로 파악할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브(oligonucleotide probe)를 고안하였다(실시예 6).
6. DNA칩의 제작
상기 5단계에서 디자인된 프로브를 집적할 그리드(Grid)를 고안하였다. 이에 따라 적정 버퍼(buffer)에 혼합한 프로브를 현미경용 유리슬라이드 위에 집적(arraying or spotting) 하였다. 이후 적정 처리를 거쳐 안정화시키고 품질관리를 거쳐 검사 시까지 보관하였다(실시예 7).
7. DNA 칩에서 반응 및 분석 조건 수립
앞의 4에서 수립된 HPV의 각 유형별 클론을 하나, 혹은 두개 내지 세 개까지 다양한 조합과 농도로 조성한 표준 검체를 주물로 하여 HPV E6/E7와 HPV L1, 베타글로빈의 유전자를 멀티플렉스 PCR로 증폭한 후 그 산물을 DNA칩 위에 올려 놓고 히브라다이제이션 반응을 여러 차례 수행한 후 형광스캐너로 분석하여 적정 조건을 수립하였다(실시예 8).
8. DNA 칩에서 임상 검체 분석
상기 3단계 및 4단계에서 PCR후 시퀀싱 반응으로 HPV의 유무와 그 유형이 확인된 바 있는 임상 검체의 DNA를 대상으로 다시 멀티플렉스 PCR을 수행한 후 그 PCR산물을 상기 6단계에서 제작된 DNA 칩 위에 올려 놓고 제 7단계에서 수립된 조건하에서 히브라다이제이션 반응을 수행한 후 세척을 거쳐 형광스캐너로 분석하였다. 이로서 본 DNA 칩의 민감도와 특이도, 재현성을 분석하였으며, HPV의 유전자형의 진단을 위한 본 발명의 DNA 칩의 최적조건을 다시 수립하였다(실시예 9)
9. DNA 칩에서 임상 검체 분석 후 임상자료와의 상관관계 분석
상기 8단계에서 PCR후 DNA 칩으로 분석한 결과를 자궁경부 세포진 검사 등 임상자료와 비교하여 상관관계를 조사하였으며, 본 DNA칩으로 자궁경부의 암이나 전암병변의 예측에 유용한지를 분석하였다. 이로서 본 DNA 칩이 HPV의 유전자형의 분석 뿐 아니라 자궁경부암의 선별(screening)에도 유용함이 확인되었다 (실시예 10).
본 발명의 DNA칩을 이용한 진단 키트는 1) 자궁경부의 스왑 등 임상 검체의 채취 기구와 검체로부터의 DNA 추출 시약, 2) HPV의 E6/E7과 L1, 베타글로빈 유전자의 PCR 증폭 관련 시약, 3) HPV 유전자 증폭시에 양성 대조군으로 사용할 플라스미드 DNA 클론, 4) HPV 유전자형 검사용 올리고 DNA 칩, 5) 상기 DNA 칩을 이용한 히브라다이제이션 반응에 필요한 반응액과 반응 후의 세척액을 모두 포함하는 올인원("all in one")으로 제공된다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 자세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 구성 및 효과를 입증하기 위한 실시예일 뿐 본 발명이 하기 실시예 에 한정된 것은 아니다.
실시예 1: 표준 및 대조군 검체의 준비
먼저 이후의 유전자형 검사와 분석에 표준이자 기준 및 대조군이 되어 줄 검체를 준비하였다.
첫 번째 검체로는 기왕에 HPV에 감염이 되어 있는 지 여부와 그 HPV의 형이 밝혀져 있으며, HPV 유전자형 연구에 널리 사용되어 온 인체 자궁경부암 세포주를 미 ATCC 사(Manassas, VA20108, USA)와 한국 세포주은행(KCLB)(서울대학교 의과대학 암연구소, KOREA)으로부터 구입한 후 단층(monolayer)으로 배양하여 사용하였다. 이들의 내역은 표 1과 같다.
두 번째 검체로는 자궁경부암이나 자궁경부의 상피내암 병변으로 생검 및 수술을 받고 확진된 한국인 여성 68명의 자궁경부 조직을 얻어 사용하였다. 포르말린 고정 후 파라핀포매 상태(formalin-fixed, paraffin-embedded status)로 보관되어 있던 조직을 10μm의 두께의 절편으로 5-10개씩 얻은 후 현미경용 유리슬라이드위에 붙여 놓고 암세포만 미세박리(microdissection) 하였다. 이들 자궁경부암 병변 68례 중 61례는 침윤성 편평상피암(cervical squamous cell carcinoma), 7례는 상피내암(cervical intraepithelial neoplasma, CIN)의 증례이었다. 이들의 연령 분포는 32~69세, 평균 연령은 49세이었다.
셋째, 2003년부터 함춘진단센터(서울, 대한민국)와 한국부인암재단(서울, 대한민국)을 통해 국내 산부인과 클리닉에 내원하여 자궁경부의 스왑(swab) 및 세포진 검사를 받은 4,898명의 자궁경부 검체를 얻었다. 이들의 연령 분포는 16세에서 19세가 0.2%이고, 20대가 18%, 30대가 38%, 40대가 32%, 50대가 7%, 60대가 1%, 기타가 3%이었다. 이들 중 4741례에서는 HPV검사와 함께 자궁경부의 세포진 및/또는 생검 검사를 함께 받아서 세포 및 조직학적 진단도 제공되었던 경우이다. 자궁경부세포의 채취는 상아메디칼(서울시 송파구, 대한민국)의 Pap 브러시나 그에 준하는 면봉형 기구를 자궁경부 내부에 삽입해서 좌우로 돌려서 경부세포가 잘 집적되게 하여 채취하였다. 이후 Pap 브러시나 면봉의 끝을 멸균된 이동용 완충액이 들어있고, 톱니 형 뚜껑(screw cap)이 있는 튜브 내에 솔의 끝을 넣어서 이동 및 보관시켰다. 여기에서 이동용 완충액으로는 CytoLyt Solution(CYTYC Corporation, MA 01719, USA) 3ml을 주로 사용하였다.
표 1. 대조 세포주의 내역
세포주 명 |
HPV 감염 여부 |
감염된 HPV의 형 |
ATCC 45022 |
+ |
HPV-2a |
ATCC 45150 |
+ |
HPV-6b |
ATCC 45151 |
+ |
HPV-11 |
ATCC 45113 |
+ |
HPV-16 |
ATCC CRL-1550(CaSki) |
+ |
HPV-16 |
ATCC 45152 |
+ |
HPV-18 |
ATCC CCL-2(HeLa) |
+ |
HPV-18 |
ATCC 65446 |
+ |
HPV-31 |
ATCC 40331 |
+ |
HPV-35 |
ATCC 40338 |
+ |
HPV-43 |
ATCC 45353 |
+ |
HPV-44 |
ATCC 45548 |
+ |
HPV-56 |
KCLB-10243* |
- |
|
실시예 2: DNA 분리
실시예 1에서 수집한 다양한 각종 검체로부터 적정 방법을 수립하여 DNA를 다음과 같은 방법으로 분리하였다.
세포주로부터 DNA를 분리하기 위하여 단층으로 배양된 세포주를 분리하여 50ml 원심분리튜브에 넣고 3500rpm 에서 30분간 원심분리하여, 상층액을 버리고 PBS 용액 500㎕로 펠렛 (pellet)을 풀어서 1.5ml 원심분리튜브에 옮긴 후, 다시 12,000rpm에서 2분간 원심 분리후 세척하여 남아 있는 배지의 잔액을 제거하였다. 이후 세포 펠렛에 200㎕ 의 PBS 용액과 20㎕의 단백질분해효소 K (20㎍/㎕ )를 넣고 진탕혼합기로 섞어준다. 다시 200㎕ 의 GC 용액을 첨가하여 섞어준 뒤 60℃ 가열기구(heating block)에 20분간 용해시킨다. 반응이 끝난 시료에 100㎕ 의 이소프로판올을 첨가하여 섞는다. 여과용 컬럼(column)에 용액을 전부 넣고 10000rpm에서 1분간 원심 분리하고, 컬럼을 통과한 여과액은 버린 후 W1버퍼 500㎕를 넣고 원심 분리한다. 그 다음 W2 버퍼 500㎕를 넣고 다시 원심 분리하였고, 빈 컬럼은 12,000rpm에서 2분간 원심분리하여 에탄올을 완전히 제거하였다. 이후 60㎕의 멸균증류수를 첨가하여 10분간 놓아 둔 뒤 1200rpm에서 2분간 원심분리하여 DNA를 얻었다.
또한, 파라핀포매 자궁경부조직으로부터 DNA를 분리하기 위하여 현미경용 유리슬라이드에 10㎛ 두께로 붙여 놓은 자궁경부 조직을 핀포인트 슬라이드 DNA 분리시스템(Pin point Slide DNA Isolation System)(Zymo Research, CA, USA)을 이용하여 암세포만을 미세박리하였다. 각 슬라이드 별로 약 1000개 내지 2000개의 세포를 액상으로 얻었으며 이들을 모두 모아서 미세원심분리튜브로 옮긴 후 1ml 자일렌(xylene)으로 2차례 처리하여 파라핀을 제거하고 잉여 자일렌은 무수에탄올로 처리 하여 제거하고 100㎕의 DNA 분리 및 세포용해용 버퍼(DNA extraction and cell lysis buffer)(50mM KCl, 10mM Tris-HCl[pH 8.3], 2.5mM MgCl2, 젤라틴(gelatin), 0.45% IGEPAL, 0.45% 트윈 20, 프로티나아제 K[60㎍/ml])로 처리한 후 55℃에서 3시간 동안 반응시켰다가 10분 동안 95℃로 가온하여 프로티나아제 K를 비활성화시켰다. 원심분리 후 상층액을 PCR에 사용하였다.
자궁경부 스왑 검체로부터 DNA를 분리하기 위해서는 어큐프랩 게노믹 DNA 추출 키트 (Accuprep Genomic DNA extraction kit, Cat. No. K-3032, Bioneer 사, 한국)를 이용하여 DNA를 농축, 정제하였으며 그 방법은 다음과 같다. 자궁경부 세포 도말 검체 1.5ml을 취해 원심분리기에서 12.000rpm으로 2분간 원심침전 시킨 후 침전된 세포에 1.5ml의 인산완충용액(PBS)을 첨가하여 세척 후 적량의 프로티나제 K와 세포 용해 버퍼를 가한 후 60℃에서 20분간 배양한다. 반응이 끝난 반응액을 DNA 바인딩 컬럼에 원심분리기를 이용하여 통과시키고 세척액 1과 2(washing buffer 1, 2)로 원심분리기를 이용하여 세척후 100ul의 DNA 용출액(elution buffer)을 첨가하여 DNA를 회수하였다.
실시예 3: PCR 증폭
HPV의 유전자형을 검사하기 위해서 먼저 HPV의 E6/E7 유전자와 L1 유전자를 PCR로 증폭하고, 내부 대조유전자(internal control)로 인체형 베타글로빈 유전자를 증폭하였다.
이들 PCR 증폭을 위하여 올리고뉴클레오타이드 프라이머(oligonucleotide primer)를 먼저 선택 및 고안하였다. 상기 프라이머는 HPV의 E6/E7 유전자를 검출하는 HPCF/ HPCR 프라이머와 L1 유전자를 검출하는 MY11 및 GP6-1 프라이머(서열번호 1) 그리고 DNA의 추출과 PCR의 효율을 확인하기 위해 사용된 인체의 베타그로부린유전자의 HBBF/HBBR 프라이머로 구성되어 있다. GP6-1 프라이머는 고안된 것이고 나머지 프라이머는 공지된 프라이머들중에서 선택된 것이다. HPV의 E6/E7 유전자의 PCR은 약 225 bp의 길이의 산물을 증폭하게 되며, HPV의 L1 유전자의 PCR은 182 bp 그리고 베타글로블린유전자의 PCR은 110 bp 길이의 산물을 각각 증폭하게 된다. 각 유전자 별 PCR 프라이머의 염기서열은 표 2에 정리하였으며, PCR의 반응 조건은 다음과 같다.
PCR은 단일과 듀플렉스(duplex), 트리플렉스(triplex)로 달리하여 각각에 대해 적정 조건을 수립하였다. 이에 따라 앞의 실시예 2에서 분리된 DNA를 주물로 하여 HPV E6/E7과 HPV L1, 인체 베타글로빈 유전자에 대해 PCR을 수행하였다. PCR의 방법은 다음과 같다.
1. 단일 PCR
HPV 감염 여부 검출을 위한 PCR 반응조성은 슈퍼바이오사(Super Bio, 서울, 대한민국)로부터 구입한 SuperTaq plus pre-mix(10 ×buffer 2.5㎕, 10 mM MgCl2 3.75㎕, 10 mM dNTP 0.5㎕, Taq 중합효소 0.5㎕) 15㎕을 기초로 하고 여기에 표 2에 기재된 대로 MY11/GP6-1, HPCF/HPCR과 HBBF/HBBR의 프라이머를 각각 1㎕(10 pmoles/㎕)씩 넣었으며, 여기에 검체의 주형(template) DNA 4.0㎕(150ng/㎕)을 추 가하고 증류수로 전체 반응액을 총 30㎕로 조정하였다.
인체 베타글로빈의 PCR을 위해 HBB 프라이머가 들어간 반응액은 95℃에서 5분 간 예비변성(predenaturation)을 한 후, 95℃ 30초, 50℃ 30초, 72℃ 30초로 40 주기(cycles) 동안 반복하고, 72℃에서 5분간 연장(extension) 하여 수행하였다.
HPV의 E6/E7의 PCR을 위해 HPCF/ HPCR 프라이머가 들어간 반응액은 95℃에서 5분 간 예비변성 한 후, 95℃ 30초, 56℃ 30초, 72℃ 30초로 40 주기 동안 반복하고, 72℃에서 5분간 연장하여 수행하였다.
HPV의 L1의 PCR을 위해 MY11 및 GP6-1 프라이머가 들어간 반응액은 95℃에서 5분 간 예비변성 한 후, 95℃ 30초, 50℃ 30초, 72℃ 30초로 40 주기 반복하고, 72℃에서 5분간 연장하여 수행하였다.
2. 듀플렉스 PCR
HPV 감염 여부 검출을 위한 듀플렉스 PCR의 프라이머 조합은 (1) HPV의 E6/E7 유전자를 검출하는 HPCF/HPCR 프라이머와 베타글로빈유전자의 HBBF/HBBR 프라이머의 조합과 (2) HPV의 L1 유전자를 검출하는 MY11/GP6-1프라이머 그리고 베타글로빈의 프라이머의 조합의 2가지로 구성되어 있다.
HPV E6/E7 과 HBB 유전자 듀플렉스 PCR 은 다음과 같이 진행하였다. PCR 반응조성은 SuperTaq plus pre-mix 용액 15㎕에 HPCF/HPCR 프라이머와 HBBF/HBBR 프라이머를 각 1㎕(10 pmoles/㎕)씩 혼합하고 여기에 주형 DNA 4.0㎕(150ng/㎕)를 추가하고 증류수를 첨가하여 총 30㎕로 반응액을 조성하였다. PCR 반응의 조건은 95 ℃에서 5분 간 예비변성 한 후, 95℃ 1분, 47℃ 1분, 72℃ 1분으로 10 주기 동안 반복한 후, 95℃ 1분, 50℃ 1분, 72℃ 1분으로 30 주기 동안 다시 반복하고, 72℃에서 5분간 연장하여 수행하였다.
HPV L1과 베타글로빈 유전자의 듀플렉스 PCR 은 다음과 같이 진행하였다. PCR 반응조성은 SuperTaq plus premix 용액 15㎕에 MY11/GPG-1과 HBBF/HBBR 프라이머를 각 1㎕(10 pmoles/㎕)씩 혼합하고, 여기에 주형 DNA 4.0㎕(150ng/㎕)을 추가하고 증류수를 첨가하여 총 30㎕로 반응액을 조성하였다. PCR 반응의 조건은 95℃에서 5분 간 예비변성 한 후, 95℃ 1분, 47℃ 1분, 72℃ 1분으로 10 주기동안 반복한 후, 95℃ 1분, 50℃ 1분, 72℃ 1분으로 30 주기동안 반복하고, 72℃에서 5분간 연장하여 수행하였다.
3. 트리플렉스 PCR
HPV E6&E7, L1 과 HBB 유전자의 트리플렉스 PCR 은 다음과 같이 수행하였다.
PCR의 반응 조성은 SuperTaq plus pre-mix 용액 15㎕에 MY11/GP6-1, HPCF/HPCR, HBBF/HBBR의 3가지 프라이머 종류를 각각 1㎕(10 pmoles/㎕) 씩 함께 넣고 여기에 주형 DNA 4.0㎕(150ng/㎕)를 넣고 증류수를 추가하여 총 30㎕로 반응액을 조성하였다. PCR 반응의 조건은 95℃에서 5분 간 예비변성 한 후, 95℃ 1분, 47℃ 1분, 72℃ 1분으로 10 주기동안 반복한 후, 95℃ 1분, 50℃ 1분, 72℃ 1분으로 30 주기 동안 반복하고, 72℃에서 5분간 연장하여 수행하였다.
본 실험의 결과는 도 1에서 5까지에 예시하였다. 도 1에서 도 5까지에서 본 HPV의 단일, 듀플렉스 및 트리플렉스 PCR의 조건이 적절하게 수립되었음을 확인할 수 있었고, 자궁경부 스왑 검체와 파라핀포매 자궁경부암 조직에서도 PCR이 잘 이루어짐을 보여주고 있다.
자궁경부세포의 임상 검체 4,898례에 대한 HPV의 L1과 E6/E7유전자의 PCR 결과는 표 3에 나와 있다. 1,414례에서 PCR이 양성으로 나왔으며, 특기할 사실은 그 중 L1으로 검색이 된 것은 약 50%, E6/E7으로 검색이 된 것은 약 66%에 지나지 않았고, L1과 E6/E7유전자 중 어느 하나만 검색할 경우 HPV를 발견치 못하는 빈도가 각각 50.2%, 34.7%로 나타났다. 이는 임상에서 자궁경부세포를 대상으로 HPV검색을 할 때 상업화된 HPV 역혼성화 분석용(reverse line hybridization) 키트나, 이와 대동소이한 여타 DNA칩에서와 같이 L1만 검색한다면 상당수의 HPV를 놓칠 수 있음을 강력하게 시사한다. 또한 HPV의 정확한 검색을 위해서는 L1 뿐 아니라 E6/E7도 함께 PCR로 증폭하여 그 염기서열을 확인할 필요가 있음을 가리킨다. 이는 곧 본 발명의 독자적인 HPV 유전자형 DNA 칩을 고안하게 된 중요한 근거가 되었다.
표 2. PCR용 프라이머
유전자 |
SEQ.ID.No. |
명칭 |
염기서열(5' - 3') |
길이 |
HPV L1 |
1 |
MY11(정방향) |
GCMCAGGGWCATAAYAATGG |
20mer |
2 |
GP6-1(역방향) |
AATAAACTGTAAATCATATTCCTC |
24mer |
HPV E6/E7 |
3 |
HPCF(정방향) |
TGTCAAAAACCGTTTGTGTTC |
21mer |
4 |
HPCR(역방향) |
GAGCTGTCGCTTAATTGTCC |
20mer |
베타글로빈 |
5 |
HBBF(정방향) |
ACACAACTTGTGTTCACTAGC |
21mer |
6 |
HBBR(역방향) |
CAAACTTCATCCACGTTCACC |
21mer |
표 3. 한국인의 자궁경부세포 검체의 HPV PCR의 결과(총 4,898례)
감염 DNA |
PCR 결과 양성(%) |
시퀀싱 확인 결과 양성(%) |
HPV-E6/E7 |
924(65.3) |
649(64.1) |
HPV-L1 |
704(49.8) |
553(54.6) |
양자 모두 |
214(15.1) |
96(9.5) |
양자 중 하나 |
1200(84.9) |
917(90.5) |
전체 |
1414(100) |
1013(100) |
실시예 4: 시퀀싱 분석 및 데이터베이스 구축
실시예 3의 PCR 증폭후 PCR산물을 가지고 자동 시퀀싱 분석(automated sequencing analysis)을 수행하여 HPV-E6/E7과 HPV L1의 염기서열을 분석하고 그 자료를 정리하여 데이터베이스를 구축하였다. 아울러 HPV 유전자형이 확인된 임상 DNA 검체는 보관해 두었다가 이후 본 발명의 DNA칩의 정확도 분석에 사용하였다.
시퀀싱 반응의 방법은 다음과 같다.
PCR 산물을 ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit(Perkin Elmer Biosystems, USA)를 이용하여 시퀀싱반응을 수행한 후 ABI Prism 377 자동염기서열 분석기(Perkin Elmer, USA)로 염기서열을 분석하였다. 이는 다음의 순서로 이루어 졌다.
(1) 실시예 4에서 얻어진 각 검체에서 얻어진 PCR 산물을 시퀀싱반응의 주물로 이용하기 위해, 가장 적합한 농도로 맞춘다. 예컨대 100-200bp 길이라면, 1-3ng/㎕가 필요하고, 200-500bp길이라면, 3-10ng/㎕정도가 필요하다).
(2) 미세원심분리튜브(thin wall microcentrifuge tube)에 각 PCR 산물과 프라이머 3.2 pmole, terminator ready reaction mix 8㎕를 넣고 최종 20㎕가 되게 멸균 증류수를 넣어 약하게 잘 혼합한다.
(3) (2)의 혼합물을 96℃에서 10 초, 50℃에서 5초, 그리고 60℃에서 6분간 25 주기로 진앰프 2700(PE Biosystems, USA)을 사용하여 순환염기결정반응(cycle sequencing)을 수행하였다.
(4) 얻어진 반응물을 에탄올로 침전시키고 원심분리 하여 유리 프라이머(free primer)와 반응혼합물(terminator ready reaction mix) 안의 형광 부착 디데옥시뉴클레오티드(fluorescence labeled ddNTPs)를 제거 한 후 건조시켰다.
(5) (4)에서 얻어진 DNA를 포름아미드: 25mM EDTA (pH 8.0):블루덱스트란혼합물과 로딩 버퍼 10㎕에 혼합하여, 끓는 물에서 5분 간 변성(denaturation)시킨 후, 검체를 냉각 보관한다.
(6) 미리 5.5% 롱 레인저 겔(BMA, Cat No. 50611, USA)로 캐스팅한 플레이트의 각 웰에 (5)의 변성 DNA검체를 넣고(loading), 2-4시간 동안 전기영동을 수행하여 상기 서열분석기로 염기서열을 분석하였다.
자궁경부암 검체의 PCR-시퀀싱 분석 결과 전체 68례 중 68례 모두에서 HPV가 발견되었다. 발견된 형은 모두 소위 고위험형이었으며, 그 중 HPV 16형이 33례, 58형이 12례, 31형이 11례, 18형과 35형이 각각 4례, 33형이 3례로 이들 7가지 형이 99%를 차지하였다. 복합 감염형은 PCR-시퀀싱으로 발견할 수 없었다.
한국 성인 여성중 산부인과 클리닉에서 자궁경부암 조기검진을 위해 채취한 자궁경부 스왑 검체 4,898례 중 PCR 후 양성반응을 보인 1,414례를 시퀀싱 반응으로 분석한 결과 나타난 각 HPV 형의 L1과 E6/E7의 염기서열분석의 결과는 표 4에 정리하였으며, 그 실례는 도 7부터 27에 나타내었다.
한국의 일반 성인여성의 자궁경부세포 검체 4,898례 중 1,013례에서 최종적으로 HPV 감염이 확인되었으며, 그 빈도는 20.6%이었다. 발견된 HPV의 형에는 35가지가 있었으며, 그 중 15개형이 고 위험형, 11개가 저 위험형, 4개가 중정도 위험 형, 5개는 미상으로 나타났다. 발견된 HPV 중 소위 고 위험형은 838례(82.7%)로 대부분을 차지하였고, 전체적으로 볼 때 빈도는 17.1%로 나타났다. 이러한 고 위험형의 HPV에 편향된 결과는 본 검사의 대상의 여성들이 모두 자궁경부암의 조기 검진을 목적으로 HPV검사를 받았으며, 상당수는 자궁경부에 병변이 있던 고 위험형이었기 때문으로 판단되며, 고 위험형의 HPV를 정확하게 파악하는 것이 주목적인 본 연구와 잘 부합된다 할 수 있다. 발견된 HPV의 유형을 볼 때 빈도상 역시 HPV 16형이 가장 흔하나 그 다음으로는 HPV-58이 가장 흔하며 다음으로 HPV-31, HPV-52, HPV-33, HPV-53, HPV-35, HPV-18의 순으로 나타났다. 이러한 자료는 구미의 경우 HPV-16 다음으로는 HPV-18이 가장 흔하며, 그 다음이 45, 52, 31, 33, 58의 순서인 것과는 뚜렷한 차이가 있다(Murinoz N et al., N Engl J Med , 2003, 348:518-27).
또 하나 특기할 사실은 본 발명의 연구에서 발견된 HPV E6/E7의 염기서열 중에는 구미의 HPV 데이터베이스에 기재된 야생형(wild type) 염기서열과 다르며, 국내에서도 지금까지 보고 된 바 없는 돌연변이형의 염기서열도 다수 나타났다는 점이다. 이들은 특히 고 위험형의 HPV의 E6/E7에서 주로 발견되었다. 이들은 한국인의 자궁경부암 발병에 중요한 역할을 하는 것일 수 있다.
아울러 앞의 실시예 3에서 기술한 대로 자궁경부세포의 스왑 검체의 경우 PCR후 시퀀싱으로 분석할 때 전체 HPV감염 확인례 중 HPV L1 하나만의 검사로 발견되는 경우는 50%에 지나지 않으며, 나머지의 경우 HPV E6/E7을 함께 검사해야 발견이 가능함을 알 수 있었다. 아울러 곧 국내 여성 특유의 HPV 염기서열을 고려해야 함을 알 수 있었다. 이러한 국내여성의 HPV 유전자형에 대한 상세한 사전 연구의 결과는 곧 (1) HPV의 L1과 E6/E7을 함께 분석하며, (2) 국내 여성 HPV의 염기서열을 고려한 독자적인 본 발명의 DNA 칩의 고안의 근거가 되었다.
표 4. 한국 성인여성 자궁경부 스왑 검체에서 HPV의 PCR-시퀀싱 분석 결과
총 검체수 |
4898 |
HPV 발견 검체수(%) |
1414 (28.9%) |
발견된 HPV 유형 및 검체수(%) |
1013(20.7%) |
위험성 |
HPV 형 |
Case |
% |
고위험형 |
16 |
351 |
35 |
18 |
27 |
3 |
31 |
83 |
8 |
33 |
52 |
5 |
34 |
1 |
0 |
35 |
35 |
3 |
39 |
8 |
1 |
52 |
59 |
6 |
53 |
40 |
4 |
56 |
5 |
0 |
58 |
131 |
13 |
66 |
22 |
2 |
67 |
8 |
1 |
68 |
10 |
1 |
70 |
6 |
1 |
저위험형 |
6 |
25 |
2 |
11 |
15 |
1 |
54 |
2 |
0 |
61 |
28 |
3 |
62 |
13 |
1 |
63 |
1 |
0 |
64 |
1 |
0 |
72 |
3 |
0 |
74 |
1 |
0 |
83/MM7 |
6 |
1 |
LVX160 |
19 |
2 |
중위험형 |
82/MM4 |
2 |
0 |
84/MM8 |
14 |
1 |
CP4173 |
6 |
1 |
Cp8304 |
19 |
2 |
Unknown |
71 |
8 |
1 |
87 |
1 |
0 |
CP8061 |
6 |
1 |
IS887 |
4 |
0 |
JC9710 |
1 |
0 |
전체 |
|
1013
|
100
|
도 26 및 27의 경우 전기영동도 상의 정점(peak)이 겹쳐서 나타나며 이는 여 러 개의 서로 다른 주물 DNA를 분석할 때, 즉 다수의 유형의 HPV가 혼합되어 있을 때 나타나는 현상이며, 이 경우 일부분만을 블라스트 검색(blast search)으로 확인할 수 밖에 없다. 이것은 PCR 산물을 클로닝하여 다수의 클론을 다시 시퀀싱 분석해야 함을 가리킨다. 이런 경우에는 복합 HPV감염을 진단할 수 있는 본 발명의 DNA칩이 매우 유용하며 본 증례의 경우 본 발명의 DNA칩으로 각각 HPV-18과 HPV-70의 복합 감염(도 51참조) 및 HPV-16과 HPV-52의 복합 감염(도 52참조)이 있음이 나중에 확인되었다.
실시예 5: HPV분석 위한 클론 확보
실시예 4의 PCR후 시퀀싱반응으로 특정 HPV 유전자형이 확인된 PCR 산물은 플라스미드 벡터와 대장균을 이용하여 클로닝(cloning) 하였다. 이 클론은 이후 본 발명의 DNA칩의 반응조건 수립 시 표준 및 대조군 검체로 사용하였다. 클로닝 방법은 다음과 같다.
1) 상기에서 PCR 증폭된 E6/E7 유전자와 L1 유전자의 PCR 산물을 아가로즈 겔에서 Gel recovery kit (Zymo Research, USA)를 이용하여 분리한 후, 그 농도를 분광광도계나 아가로스 겔상에서 측정하였다.
2) -20℃에 보관되어 있던 pGEM?-T Easy Vector (Promega, A1360, USA)와 2 x Rapid Ligation Buffer는 녹여 손끝으로 튜브를 살짝 흔들어 섞어준 후, 약하게 원심분리를 하여 클로닝 하고자 하는 삽입(insert) DNA와 함께 다음의 비율로 혼합하여 0.5ml 튜브에 넣고 연결반응(ligation)을 준비하였다.
표 5.
|
표준 반응 |
양성대조군 |
Background 대조군 |
2x Rapid Ligation Buffer, T4 DNA Ligase |
5㎕ |
5㎕ |
5㎕ |
pGEM?-T Easy Vector (50ng) |
1㎕ |
l㎕ |
1㎕ |
PCR product
|
X㎕*
|
- |
- |
Control Insert DNA |
- |
2㎕ |
- |
T4 DNA Ligase(3 Wess units/㎕) |
1㎕ |
1㎕ |
1㎕ |
Final volume |
10㎕ |
10㎕ |
10㎕ |
* PCR 산물과 플라스미드 벡터를 3:1의 비율이 되도록 조절함 즉, 3.0 kb의 크기의 벡터 50ng에 0.25 또는 0.45 kb 크기의 PCR 산물을 각각 12.4ng과 22.5ng을 혼합함. |
3) 각 반응액을 피펫으로 잘 섞어 준 후, 실온에서 한 시간 정도 연결 반응을 시켰다. 다수의 산물을 원할 경우에는 4℃에서 하룻밤 동안 반응 시켰다.
4) 이렇게 연결된 샘플은 영하 70℃에 보관된 JM109 competent cell(≥1x108 cfu/㎍ DNA)50㎕를 이용하여 형질전환(transformation)을 하였다.
5) 우선 1.5ml 튜브에 상기에서 연결시킨 산물 2㎕를 넣고, 직전에 얼음탕 (ice bath)에서 녹인 4)의 competent cell 50㎕를 넣어, 잘 섞어 준 후, 얼음에서 20분간 반응을 한다.
6) 42℃ 항온수조에서 45-50초 간 열쇼크를 주고, 즉시 다시 얼음탕 속에 넣어 2 분간 방치를 한다
7) 여기에 실온으로 맞춰진 SOC 배지 950㎕를 넣어, 37℃의 진탕기에서 약 1시간 반 정도를 배양한다.
8) 이 가운데 약 100㎕를 LB/ampicillin/IPTG/X-Gal plate에 깔아 준 다음, plate를 뒤집어서 37℃ 진탕기에서 16-24 시간 정도 배양을 해 준 후, 콜로니 계수(colony counting)를 한 후, 백색 콜로니(White colony)만을 선택해서 3ml LB/ampicillin broth에서 배양한 후 플라스미드 DNA를 미니프렙(mini prep) 하여 PCR 이나 혹은 제한효소를 이용하여 삽입 DNA가 제대로 들어갔는지를 확인하고, 더 정확히 하기위해 상기에서 얻어진 클론 모두를 자동염기서열 분석기를 이용하여 분석하였다.
실시예 6: DNA칩의 프로브 고안
이는 본 발명의 가장 핵심이 되는, DNA칩 위에 올려 놓을 올리고뉴클레오타이드 프로브를 고안하는 과정이다. 상기 실시예 4와 5에서 한국인의 양성 및 악성 자궁경부 검체에서 DNA를 분리하여 PCR후 시퀀싱으로 확인된 1,013례의 HPV의 E6/E7 및 L1의 염기서열에 대한 방대한 데이터베이스와 미국의 HPV 데이터베이스를 분석한 후 각 인종에 따른 HPV 유전형의 빈도 수와 유전형에 따른 각각의 유전자에 존재하는 변형(intra variant) 염기서열도 분석하였다. 이에 따라 자궁경부를 침범하는 성기형(genital type) HPV의 40개 유형을 선정하고 이의 유전자형의 검색을 위한 올리고프로브를 고안하였으며, 그 염기서열은 표 5에 정리하였다.
프로브 디자인은 본 발명의 목적에 따라 40가지 유형의 다양한 HPV의 L1유전자 및 E6/E7유전자의 DNA와 특이적으로 결합할 수 있는 유형 특이적 프로브(genotype specific probe)로서의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)를 설계하였다.
먼저, (1) 미국 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 HPV 데이터베이스와 와 (2) 미 국립 로스 알라모스 HPV 데이터베이스, 그리고 (3) 실시예 4의 국내 여성의 자궁경부에서 발견된 35개 유형의 HPV의 데이터베이스를 모두 종합하여 HPV-1a, -2a, -3, -4, -5, -6b, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -15, -16, -16r, -17, -18, -19, -20, -21, -22, -23, -24, -25, -26, -27, -28, -29, -30, -31, -32, -33, -34, -35, -35h, -36, -37, -38, -39, -40, -41, -42, -44, -45, -47, -48, -49, -50, -51, -52, -53, -54, -55, -56, -57, -58, -59, -60, -61, -63, -65, -66, -67, -68, -70, -72, -73, -75, -76, -77, -80, MM4, MM7, MM8, CP8304의 총 76가지 HPV 유형의 게놈 DNA 염기서열을 확보하였다. 확보한 DNA 서열을 컴퓨터 프로그램 DNASTAR(MegAlignTM 5, DNASTAR Inc.)을 활용하여 ClustalW 방법으로 쌍정렬(pairwise alignment) 및 다중서열정렬(multiple sequence alignment)을 실행한 후 분류계통도(Phylogenetic tree)를 작성하고 각 그룹별 유형 특이적 염기서열을 선별한 다음, 다시 컴퓨터 프로그램 프라이머 프리미어 5(primer premier 5, PREMIER Biosoft International Co.)를 활용하여 유형 특이적 프로브를 설계하였다. 이때 프로브의 길이는 20±2 및 18±2 bp의 올리고 뉴클레오티드로 설정하여 110종의 유형 특이적 프로브를 1차 설계하였다. 본 발명에 의한 HPV의 유전자형 진단 DNA칩과 키트는, 상기 DNA 프로브가 고위험성 HPV 8가지의 E6&E7 유전자와 20개의 고 위험성 HPV의 L1유전자, 17개의 저 위험형 HPV의 L1유전자, 3개의 중정도 위험형 HPV의 L1유전자까지 도합 40종의 HPV의 L1 유전자를 검색 표적으로 하는 것을 특징으로 한다. 여기에서 고 위험형HPV로는 HPV-16 과 HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-52, HPV-58, HPV-67, HPV-26, HPV-30, HPV-34, HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-53, HPV-56, HPV-57, HPV-66, HPV-68, HPV-70이 포함되어 있으며, 저위험형 HPV로는 HPV-6, HPV-7, HPV-10, HPV-11, HPV-27, HPV-32, HPV-40, HPV-42, HPV-44, HPV-54, HPV-55, HPV-59, HPV-61, HPV-62, HPV-72, HPV-73, HPV-83을 선택하였고, 중정도 위험형 HPV로는 HPV-MM4/82, HPV-MM8/84, HPV-CP8304/81이 선택되었다.
상기 과정에서 설계한 총 110종의 프로브를 대상으로 컴퓨터 프로그램(Amplify 1.2, University of Wisconsin)을 사용하여 설계 과정에서 이미 확보한 총 76가지의 다른 HPV 유형을 대상으로 가상 결합 능을 분석하였다. 본 실시예에서는 한국인에서 흔하며 자궁경부암과 직접 관련된 HPV-16, HPV-58, HPV-31, HPV-33 프로브를 디자인하였다. 그 다음은 HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-56, HPV-59, HPV-61, HPV-68, HPV-70, HPV-73, HPV-74, HPV-6, HPV-7, HPV-11, HPV-32, HPV-34, HPV-40, HPV-42, HPV-44, HPV-55 및 HPV-66에 대해 각각 HPV 유형과 특이적으로 결합할 수 있는 것에 우선 순위를 두고 선택하였다. 프로브의 명칭과 서열번호 및 유형은 표 5에 정리하였다.
표 6. 올리고뉴클레오타이드 프로브의 염기서열
SEQ. ID. No. |
명칭 |
Sequences (5' - 3') |
길이 |
7 |
16W |
TTGTTGCAGATCATCAAGAA |
20mer |
8 |
18W |
CACGACAGGAACGACTCC |
18mer |
9 |
31W |
CAAGTGTAAACATGCGTGG |
19mer |
10 |
33W |
CTGTGACGTGTAAAAACGCC |
20mer |
11 |
35W |
GTCCTGTTGGAAACCAAC |
18mer |
12 |
52W |
GACCCCGACCTGTGACC |
17mer |
13 |
58W |
CCGACGTAGACAAACAC |
17mer |
14 |
67W |
GAAGCCATGCGTGGAG |
16mer |
15 |
16L1 |
TGCCATATCTACTTCAGAAACT |
22mer |
16 |
18L1 |
TGTTTGCTGGCATAATCAATTA |
22mer |
17 |
31L1 |
GTCTGTTTGTGCTGCAATT |
19mer |
18 |
33L1 |
CAGTACTAATATGACTTTATGCACA |
25mer |
19 |
35L1 |
TCTGCTGTGTCTTCTAGTGACAGTA |
25mer |
20 |
52L1 |
TGACTTTATGTGCTGAGGTTAAA |
23mer |
21 |
58L1 |
GCACTGAAGTAACTAAGGAAGGTAC |
25mer |
22 |
67L1 |
AAAATCAGAGGCTACATACAAAA |
23mer |
23 |
26L1 |
CCTTACCATTAGTACATTATCTGCA |
25mer |
24 |
30L1 |
AACCACACAAACGTTATCCA |
20mer |
25 |
34L1 |
CCACAAGTACAACTGCACC |
19mer |
26 |
39L1 |
ACCTCTATAGAGTCTTCCATACCTTCTAC |
29mer |
27 |
45L1 |
CACAAAATCCTGTGCCAAG |
19mer |
28 |
51L1 |
GGTTTCCCCAACATTTACTC |
20mer |
29 |
53L1 |
GCAACCACACAGTCTATGTCTACA |
24mer |
30 |
56L1 |
GACTATTAGTACTGCTACAGAACAGTTAAGTAAA |
34mer |
31 |
57L1 |
CCACTGTAACCACAGAAACTAATT |
24mer |
32 |
66L1 |
AATGCAGCTAAAAGCACATTAACTAA |
26mer |
33 |
68L1 |
CTACTACTACTGAATCAGCTGTACCAAATAT |
31mer |
34 |
70L1 |
CCGAAACGGCCATACCT |
17mer |
35 |
MM4L1/82 |
CATTTGCTGGAATAATCAGC |
20mer |
36 |
MM8L1/84 |
TATATGCTGGTTTAATCAATTGTT |
24mer |
37 |
CP8304L1/81 |
GCTACATCTGCTGCTGCAGA |
20mer |
38 |
6L1 |
TTTGTTGGGGTAATCAACTG |
20mer |
39 |
7L1 |
ACACCAACACCATATGACAATA |
22mer |
40 |
10L1 |
GCAGTACCAATATGTGCTGTG |
21mer |
41 |
11L1 |
ATTTGCTGGGGAAACCAC |
18mer |
42 |
27L1 |
CAGCTGAGGTGTCTGATAATACTAAT |
26mer |
43 |
32L1 |
GACACATACAAGTCTACTAACTTTA |
25mer |
44 |
40L1 |
AGTCCCCCACACCAAC |
16mer |
45 |
42L1 |
CACTGCAACATCTGGTGA |
18mer |
46 |
44L1 |
TACACAGTCCCCTCCGTC |
18mer |
47 |
54L1 |
TACAGCATCCACGCAGG |
17mer |
48 |
55L1 |
CTACAACTCAGTCTCCATCTACAA |
24mer |
49 |
59L1 |
TCTATTCCTAATGTATACACACCTACCAG |
29mer |
50 |
61L1 |
TGCTACATCCCCCCCTGTAT |
20mer |
51 |
62L1 |
ACTATTTGTACCGCCTCCAC |
20mer |
52 |
72L1 |
CACAGCGTCCTCTGTATCAGA |
21mer |
53 |
73L1 |
AGGTACACAGGCTAGTAGCTCTACTAC |
27mer |
54 |
MM7L1/83 |
TGCTGCTACACAGGCTAATGA |
21mer |
55 |
HBB |
GAGGAGAAGTCTGCCG |
16mer |
실시예 7: DNA칩의 제작
앞의 실시예 6에서 디자인된 프로브에 따라 그리드(Grid)를 고안한 후 적정 버퍼(buffer)에 혼합한 프로브를 현미경용 유리슬라이드 위에 집적하였다. 이후 적정 처리를 거쳐 안정화시키고 품질관리를 거쳐 검사 시까지 보관하였다.
DNA칩의 제작 과정은 다음과 같다.
1. DNA 칩 위에 올릴 HPV 유전자형 분석 프로브의 순서 그리드 작성
본 발명에서는 하나의 칩 위에서 HPV 유전형에 따른 검색된 유전형이 고위험형인지, 중정도위험형인지 아니면 저위험형인지를 바로 쉽게 알 수 있게 그룹화 하여 그리드(grid)를 작성하였다. 그 순서도는 도 28과 같다. 도 28에 따르면 좌측에는 HPV 고위험형 8가지 유형의 E6/E7의 프로브와 HPV 고위험형 20가지 유형의 L1의 프로브를 집적시키고, 중앙에는 HPV 중정도 위험형의 L1의 프로브를 집적시켰으며, 우측에는 HPV 저위험형 17가지 유형의 L1의 프로브를 집적시켰다. 또한 코너 마커(corner marker)와 DNA 분리 및 PCR 증폭과정의 적정성 여부를 점검(quality control, QC)하기 위한 인체형 베타글로빈 유전자에 특이한 올리고뉴클레오타이드 프로브는 좌측상단에 2개, 중앙에 아래 위로 집적시켰으며, 우측에는 하단에 위치하도록 집적하였다.
상기 인체형 베타글로빈 유전자 외에도 액틴 및 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)유전자 등을 기준마커 프로브로 사용할 수도 있다.
각각의 올리고뉴클레오타이드 프로브는 어레이어(arrayer)를 이용하여 직접하였다. 이 때 동일한 프로브를 이중(duplicate)으로 집적하여 각각의 HPV의 유전 자형이 최소 2번, 최대 4번씩 나오도록 고안하였다. 본 발명에서 8가지의 HPV 의 E6/E7유전자에 특이적인 올리고프로브를 추가한 이유는 크게 네 가지가 있다. 첫째, 본 8가지 유전자형이 한국인을 포함하여 세계 각국에서 가장 높은 빈도로 존재하는 유형들이다. 둘째, 본 8가지 유형의 HPV는 대표적인 고 위험형으로 자궁경부암의 발병과 밀접한 연관이 있다. 셋째, 고위험형 HPV에 대한 치료용 백신을 투여코자 할 때 이들의 E6/E7의 유전자형을 정확히 아는 것이 중요하다. 넷째, 이들 유형의 경우 PCR 과정에서 유전자 내 변형(intragenic variation) 때문에 L1 유전자가 PCR로 증폭이 안 될 우려가 있으며, 이러한 맹점을 E6/E7 유전자의 증폭으로 그 결과를 보완할 필요가 있다. 이는 본 발명의 DNA 칩의 독자적 고안의 근거가 되며, 본 DNA 칩의 HPV유전자형의 분석 정확도를 높이는 데에도 중요한 역할을 하고 있다.
본 발명의 DNA 칩의 중요한 특징 중 하나는 구획카버를 이용하여 도 28에서 나타난 것과 같은 그리드가 하나의 칩 위에 6개 내지 8개의 구획으로 나눠져 반복하여 존재하도록 하는 것이다(도 29 참조). 이로서 하나의 칩 위에 6개 내지 8개의 서로 다른 검체를 검색할 수 있고, 이는 시간과 인력 및 비용을 절감하는 데 매우 유용하다.
2. 합성된 올리고프로브를 스파팅할 용액의 제조와 마스터플레이트(master plate)로의 분주
실시예 6에 따라 고안하여 C6부위에 아민을 붙여 제작한 올리고뉴클레오타이드는 합성 후 HPLC를 이용하여 정제하여 그 최종 농도를 200 pmole/㎕이 되게 멸균 된 3차 증류수를 이용하여 녹였다. 이렇게 준비된 올리고프로브들을 스파팅(spotting) 용액인 micro spotting solution Plus (Telechem, TC-MSP, USA)와 혼합하여 농도를 38 pmole/㎕이 되게한다. 즉, 200pmole/㎕ 올리고프로브 7.7㎕에 스파팅액 32.4㎕를 혼합하여 40㎕이 되게 한다. 이렇게 준비된 혼합물은 각각 순서대로 96웰(96-well)의 마스터플레이트에 분주를 하였다.
3. 어레이어를 이용하여 올리고프로브를 유리슬라이드 위에 집적
상기에서 준비한 96웰의 마스터 플레이트로부터 올리고프로브 함유 스파팅 용액을 어레이어를 이용하여 특수 코팅된 유리슬라이드위에 이중(double hit)으로 집적(spotting, arraying)한다. 하나의 스팟에는 평균 약 0.005㎕ 정도의 용적의 프로브 용액이 집적된다. 칩의 원료가 되는 슬라이드로는 super aldehyde가 코팅되어 있는 BMT aldehyde glass slide(Biometrix technology, Korea)가 적합하다. 어레이어로는 GMS 417 arrayer (Pin-Ring Type, Affymetrix, USA)나 MGII (Biorobotics Inc, MA01801, USA), 혹은 이에 준하는 장비가 적합하다.
4. 집적된 올리고프로브와 유리슬라이드의 알데히드 그룹간의 시프 염기 반응(Schiff base reaction) 유도 및 후 처리 과정
상기한 대로 유리슬라이드에 프로브를 집적하여 제작한 DNA칩을 습도 80%로 유지되는 유리단지((glass jar) 내에 넣고 15분간 실온에서 반응한다. 반응이 끝난 후 고정화된 슬라이드를 건조기(dry oven)에 넣고 120℃에서 1시간 30분 동안 구은 후(baking) 슬라이드를 0.2% 소디움 도데실설페이트(sodium dodecyl sulfate, SDS) 용액에서 2분간 2회 세척한 후 3차 증류수로 옮겨 2분간 2회 세척하고, 95℃의 뜨 거운 3차 증류수에 3분간 담가 고정화된 올리고뉴클레오티드 프로브를 변성(denaturation) 시키고 다시 3차 증류수로 옮겨 1분간 세척한다. 세척을 마친 슬라이드는 환원용액(blocking solution, 1g NaBH4, 300ml 인산완충용액 (PBS), 100ml 에탄올)에서 15분간 환원시킨 후 0.2% 소디움 도데실설페이트 용액에서 2분간 2회 세척한 후 3차 증류수로 옮겨 2분간 2회 세척하고, 800rpm에서 1분 30초 동안 원심분리기를 이용하여 슬라이드의 물기를 제거하고 슬라이드 상자(slide box)에 담아 데시케이터에 넣어 실온에 보관한다.
상기에서 제작된 본 발명의 칩은 다음의 실시예 8과 같은 방법을 이용하여 상태를 파악하고 품질을 관리한다.
실시예 8: DNA 칩에서 히브리다이제이션 반응 및 분석 조건 수립
상기 실시예 5에서 수립된 HPV의 각 유형별 클론을 하나, 혹은 두개 내지 세 개까지 다양한 조합과 농도로 조성한 100개의 인공 표준 검체를 주물로 하여 HPV E6/E7와 HPV L1, 베타글로빈의 유전자를 PCR 증폭한 후 실시예 6과 7에 따라 제작된 칩위에 올려 놓고 히브리다이제이션 반응을 3차례 이상 수행한 후 형광스캐너로 분석하여 적정 조건을 수립하였다. 그 방법은 순서대로 다음과 같다.
1. PCR
HPV의 E6/E7과 L1, 그리고 인체 베타글로빈 유전자의 PCR은 상기 실시예 3의 방법을 따랐으며, 단 프라이머 조합 중 역방향의 프라이머, 즉 GP6-1와 HPCR, HBBR의 경우 Cy-5 형광을 표지한 올리고뉴클레오타이드를 사용하였다.
상기 표지수단으로는 Cy-3, 비오틴-결합물질, EDANS(5-2'-아미노에틸)아미노-1-나프탈렌 황산), 테트라메틸로다민(TMR), 테트라메틸로다민 이소시아네이트(TMRITC), x-로다민 및 텍사스 레드를 사용하는 것도 가능하다.
2. 히브리다이데이션 반응
다양한 HPV 올리고뉴클레오티드 프로브를 고정시킨 슬라이드 기판에 PCR에 의하여 증폭된 HPV PCR 산물을 올려 놓고 히브리다이제이션 반응을 실시한다. 이 때100㎕ 용량의 8웰 구획 챔버(perfusion 8 wells chamber, Schleicher & Schuell BioScience, German)를 히브리다이제이션 반응실(Hybridization reaction chamber)로 이용하였다.
E6/E7, HBB 와 L1 유전자의 증폭산물을 각각 10㎕씩 혼합하고 여기에 3차 증류수를 가해 최종 용적 50㎕이 되게 만들고, 95℃에서 5분간 변성시킨 후 즉시 얼음에 3분간 방치한 다음 히브리다이제이션 반응 용액 (20X SSC 2ml, 90% 글리세롤 1.7ml, 50mM 인산완충용액 6.3ml을 넣어 최종 10ml로 만들어서 조성함) 50㎕를 첨가하여 최종 부피를 100㎕로 조정한 후 45℃에서 슬라이드에 고정된 프로브와 30분간 반응시켰다.
3.세척 (Washing)
히브리다이제이션 반응 종료 후 DNA 칩에서 구획 카버(well cover)를 제거하고, 슬라이드를 3X SSPE (Sodium chloride, Sodium Phosphate, EDTA; 소듐 클로라이드, 소듐 포스페이트, EDTA) 용액에 담근 후 실온에서 2분간 세척하고 다시 1X SSPE 용액으로 상온에서 2분간 세척한 다음 상온에서 800 rpm 으로 1분30초 동안 원심분리를 하여 건조시켰다.
4. 스캐닝 분석(Scanning)
히브리다이제이션 후 세척을 거쳐 비특이적인 신호는 제거한 후 건조된 슬라이드는 콘포칼 레이저 형광스캐너(confocal laser fluorescence scanner)를 이용하여 그 형광신호와 이미지를 분석하였다. 이 때의 스캐너로는 Affymetrix 428 Array Scanner(Affymetrix, USA)나 ScanArray Lite(Packard Bioscience, USA), 또는 이에 준하는 장비이면 적합하다.
실시예 9: DNA 칩에서 임상 검체 분석
상기 실시예 3과 4에서 PCR 후 시퀀싱 반응으로 HPV의 유무와 그 유형이 확인된 바 있는 자궁경부의 임상 검체의 DNA를 대상으로 실시예 3에서 기술된 방법대로 다시 트리플렉스 PCR을 수행한 후 그 PCR 산물을 상기 실시예 6과 7에 따라 제조된 DNA 칩 위에 올려 놓고 실시예 8의 방법에 따라 히브라다이제이션 반응을 수행한 후 세척을 거쳐 형광스캐너로 분석하였다. 이로서 본 DNA 칩의 민감도와 특이도, 재현성을 분석하였으며, HPV의 유전자형의 진단을 위한 본 발명의 DNA 칩의 최적조건을 다시 점검 하였다. 그 결과의 실례를 도 30 내지 도 53에 나타내었다.
도 30, 31, 32는 각각 CaSki, HeLa 및 K-562를 대상으로 본 발명에서 합성된 30조의 HPV 타입 프로브를 이용한 DNA 마이크로어레이 하이브리디제이션 실험 결과 사진이다. 도면의 원은 프로브 종류에 따른 위치를 나타낸다. 상기 도면들에서는 서로 다른 프로브사이에 교차-하이브리디제이션(cross-hybridization) 반응을 일으키지 않고 각각 HPV-16과 HPV-18 프로브에서만 특이적으로 깨끗하게 발현됨을 관찰할 수 있었다.
도 33 에서 도 52까지의 도면은 본 발명의 DNA칩에 집적된 48개 조의 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용하여 다양한 유형의 HPV를 가진 검체를 대상으로 하여 히브리디제이션 반응을 한 결과의 사진이다. 도면에서 보는바와 같이 상기 플라스미드 DNA 증폭산물에 기인한 하이브리디제이션 반응 결과 상호간에 교차-하이브리디제이션 반응을 일으키지 않고 각각 고유의 프로브에서만 유형 특이적으로 깨끗하게 발현됨을 관찰할 수 있었다.
즉 본 발명에서 제작한 DNA 칩 내 48조의 각 HPV 유형별 프로브들은 각각 특정 HPV 유형의 DNA에 대해 특이적으로 결합하며 프로브들간에 교차 하이브리디제이션 반응을 나타내지 않았다. 아울러 하나 이상의 유형의 HPV가 혼합된 복합 감염 검체도 모두 정확하게 진단해 냈다. 즉 단일 내지 복합 감염 HPV의 유전자형 진단에 있어서 본 발명의 DNA 칩은 100%의 민감도와 100%의 특이도를 나타내었다. 아울러 시간 간격을 두고 서로 다른 검사자가 3차례 이상 반복 검사하였을 때 모두 동일한 결과를 보여 100%의 재현성을 보였다. 이를 바탕으로 볼 때 본 발명에서 합성한 48조의 프로브들은 본 DNA 마이크로어레이 하이브르디제이션 반응 실시예에서 다루지 못한 수 많은 HPV 유형의 조합에 대해서도 모두 정확하게 분석할 수 있을 것으로 판단된다.
특히, 도 51은 자궁경부에 고등급편평상피내병변이 확인된 한국 성인여성의 자궁경부 스왑검체에서 추출한 DNA를 이용하여 HPV의 E6/E7과 L1 유전자 및 인체베타글로빈 유전자를 멀티플렉스로 PCR 하여 본 발명의 HPV 유전자형 분석용 DNA 칩을 이용하여 분석한 스캐닝 이미지의 사진이다. 본 검사 결과 HPV-18과 HPV-70이 중복 감염되었음을 알 수 있었다. 이 경우 1차의 직접 시퀀싱(direct sequencing) 분석에서는 HPV-70만 발견되었으며, 클로닝 후 2차 시퀀싱분석에서는 HPV-18도 추가로 발견되었다. 그러나, 본 발명의 HPV 유전자형 분석용 DNA칩으로는 한번의 분석만으로 HPV-18과 HPV-70의 복합감염이 신속하고 용이하게 확인되었다.
또한, 도 52는 자궁경부에 상피내암이 존재함이 나중에 생검으로 확인되었던 증례로 이 경우 자궁경부 스왑검체에서 추출한 DNA를 이용하여 HPV의 E6/E7과 L1 유전자 및 인체베타글로빈 유전자를 멀티플렉스로 PCR 하여 본 발명의 HPV 유전자형 분석용 DNA 칩을 이용하여 분석한 후 스캐닝 한 이미지의 사진이다. 본 검사 결과 HPV-16과 HPV-52가 중복 감염되었음을 알 수 있었다. 이 경우 1차의 직접 시퀀싱 분석에서는 판독이 불가능하였으나, 클로닝 후 2차 시퀀싱분석에서는 HPV-16과 HPV-52이 함께 발견되었다. 그러나, 본 발명의 HPV 유전자형 분석용 DNA칩으로는 한번의 분석만으로 HPV-18과 HPV-70의 복합감염이 신속하고 용이하게 확인되었다.
즉 본 발명에서 제작한 DNA칩은 임상에서 자궁경부 스왑검체로부터 각 유형의 HPV를 정확하게 판별함을 알 수 있었다. 각 HPV 유형별 프로브들은 임상 검체에서 각각 특정 HPV 유형의 DNA에 대해 특이적으로 결합하며 프로브들간에 교차 히브리디제이션 반응을 나타내지 않았다. 아울러 직접 시퀀싱으로는 진단이 어렵고 클로닝 후 다수의 시퀀싱 분석을 해야 알 수 있는, 하나 이상의 유형의 HPV가 혼합된 복합 감염 검체도 본 발명의 DNA칩은 모두 정확하게 진단해 냈다. 즉 단일 내지 복합 감염 HPV의 유전자형 진단에 있어서 본 발명의 DNA 칩은 각각 100%의 민감도와 거의 100%의 특이도를 나타내었다. 아울러 시간 간격을 두고 서로 다른 검사자가 3차례 이상 반복 검사하였을 때 모두 동일한 결과를 보여 100%의 재현성을 보였다.
실시예 10: DNA 칩에서 임상 검체 분석 후 임상자료와의 상관 관계 분석
앞의 실시예 9에서 PCR후 DNA 칩으로 분석한 결과를 자궁경부의 조직 검사 및 자궁경부의 세포진 검사 등 임상자료와 비교하여 양자의 상관관계를 조사하였으며, 본 DNA칩으로 자궁경부의 암이나 전암병변의 예측에 유용한지를 분석하였다. 이로서 본 DNA 칩이 HPV의 유전자 형의 분석 뿐 아니라 자궁경부암의 스크리닝에도 유용함을 입증하였다.
먼저 파라핀에 포매된 자궁경부암 조직 68례와 정상 자궁경부 조직 49례의 검체에서 본 발명의 DNA 칩과 시퀀싱법으로 HPV 유형을 분석하였다. 본 분석 결과 자궁경부암 조직 68례 모두에서 고위험형의 HPV이 발견되었다. 이에 대해 정상 자궁경부 조직의 경우 고위험형의 HPV는 전혀 발견되지 않았고, 저 위험형의 HPV만이 5례(10.2%)의 낮은 빈도로 발견되었다. 이와 같은 결과는 본 HPV DNA 칩이 자궁경부의 병태를 예측하며, 특히 자궁경부암 및 자궁경부 상피내암의 선별검사에 유용함을 가리킨다. 아울러 한국 부인암재단과의 협조를 통해 국내 선부인과병원에 내원한 20명의 성인 여성에서 자궁경부의 질확대경검사, 자궁경부촬영, 자궁경부 도말 세포진, 자궁경부 생검과 함께 자궁경부 스왑 검체에 대해 본 발명의 HPV DNA칩과 시퀀싱의 분석을 시행하는 연구를 선행성 맹검 검사(prospective blind study)로 수행하여 그 결과를 분석하였다. 대상인들의 자궁경부 세포진 및 생검결과와 HPV 칩검사 및 시퀀싱 결과의 상관관계는 표 7에 정리하였다. 본 분석 결과 자궁경 부암 뿐 아니라 전암 병변인 HSIL과 LSIL 모두에서 단일 내지 복합 감염 형태로 고 위험형의 HPV가 발견되었고, 이에 대해 정상 자궁경부 검체의 경우 HPV는 전혀 발견되지 않았다. 이와 같은 결과도 본 HPV DNA 칩이 자궁경부의 병태를 예측하며, 특히 자궁경부암 뿐 아니라 자궁경부의 전암병변인 HSIL과 LSIL을 예측하는 데 유용함을 가리킨다. 아울러 시퀀싱으로 판독이 불가능하였던 복합 HPV감염의 경우에도 정확히 판독할 수 있음을 재확인하였다.
이상에서는 본 발명의 실시예를 부분적으로 기술하였으나, 이는 어디까지나 예시일 뿐, 본 발명의 정신을 훼손하지 않는 범위에서 다양한 변형과 변경이 가능하다는 사실은 당업자에게는 자명한 사실이라 할 것이다. 또한 그와 같은 변형과 변경은 모두 본 발명의 권리범위에 속한다는 점은 첨부된 청구의 범위를 통하여 보다 명백해질 것이다.
표 7. 선행성 맹검검사와 DNA 칩 진단 결과와 비교
검체 번호 |
병리 판독 |
DNA칩 판독 |
시퀀싱 판독 |
1 |
상피내암 |
HPV-16 |
HPV-16 |
2 |
고등급편평상피내병변(HSIL) |
HPV-31 |
HPV-31 |
3 |
고등급편평상피내병변(HSIL) |
HPV-58 |
HPV-58 |
4 |
고등급편평상피내병변(HSIL) |
HPV-34 |
HPV-34 |
5 |
상피내암 |
HPV-68 |
HPV-68 |
6 |
고등급편평상피내병변(HSIL) |
HPV-56 |
HPV-56 |
7 |
저등급편평상피내병변(HSIL) |
HPV-35 |
HPV-35 |
8 |
고등급편평상피내병변(HSIL |
HPV-18 & 70 |
HPV-18 |
9 |
편평상피암 |
HPV-16 & 52 |
불명 |
10 |
고등급편평상피내병변(HSIL |
HPV-18 |
HPV-18 |
11 |
정상 |
음성 |
음성 |
12 |
정상 |
음성 |
음성 |
13 |
정상 |
음성 |
음성 |
14 |
정상 |
음성 |
음성 |
15 |
정상 |
음성 |
음성 |
16 |
정상 |
음성 |
음성 |
17 |
정상 |
음성 |
음성 |
18 |
정상 |
음성 |
음성 |
19 |
정상 |
음성 |
음성 |
20 |
정상 |
음성 |
음성 |