KR101462643B1

KR101462643B1 - 인유두종바이러스 유전자형 분석용 ｄｎａ 칩， 이를 포함하는 키트 및 이를 이용한 인유두종바이러스 유전자형 분석방법

Info

Publication number: KR101462643B1
Application number: KR1020120093685A
Authority: KR
Inventors: 임성식; 김연수; 이은정
Original assignee: (주)다이오진
Priority date: 2012-08-27
Filing date: 2012-08-27
Publication date: 2014-12-04
Also published as: KR20140027736A

Abstract

본 발명은 인유두종바이러스의 유전자형을 분석하기 위한 DNA 칩, 상기 DNA 칩을 포함하는 진단 키트 및 이를 이용하여 인유두종바이러스의 유전자형을 분석하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 합성된 올리고뉴클레오티드는 종양원성 HPV 유형의 HPV 핵산과 상보적으로 결합하여 상기 HPV 유형의 핵산을 특이적으로 증폭할 수 있는 신규한 유형 특이적 프라이머로 사용될 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 DNA 칩의 제조에 사용되는 올리고뉴클레오티드는 샘플 내에 HPV 핵산의 존재 여부 및 유형을 검출/진단하는데 활용될 수 있으므로 HPV에 의하여 야기되는 자궁경부암 등의 조기 검진에 활용될 수 있다. 본 발명에 따른 유전체(genome)를 이용한 유전자 접근 방법을 통하여 조기에 HPV 감염 여부를 진단할 수 있기 때문에 추후 지속적이고 장기적으로 정확한 검진을 실시할 수 있어 자궁경부암의 예방효과가 기대된다. 또한, 비교적 저렴한 비용으로 HPV 진단을 수행할 수 있을 뿐 아니라 검진 대상자에게 첨단결과를 조기에 알려줄 수 있으므로 신뢰도 및 만족감을 줄 수 있고, 국가적 차원에서 큰 문제가 되고 있는 자궁경부암과 같은 국민 건강에 일익을 담당할 수 있을 것으로 생각된다.

Description

인유두종바이러스 유전자형 분석용 ＤＮＡ 칩， 이를 포함하는 키트 및 이를 이용한 인유두종바이러스 유전자형 분석방법{DNA CHIP FOR DETERMINING GENOMIC TYPES OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS, KIT COMPRISING THE SAME AND DETERMINING METHOD OF GENOMIC TYPES OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS USING THE SAME}

본 발명은 인유두종바이러스의 유전자형을 분석하기 위한 DNA 칩, 상기 DNA 칩을 포함하는 진단 키트 및 이를 이용하여 인유두종바이러스의 유전자형을 분석하는 방법에 관한 것이다.

자궁경부암(Cervical Cancer)은 여성의 자궁경부에서 발생하는 악성 종양으로서 전체 자궁암 발생 빈도의 95% 이상을 차지하고 있으며, 전세계 여성암 가운데 유방암 다음으로 발생빈도가 높아 매년 약 44만 건 정도의 신규환자가 보고되고 있다.

국내의 경우 2000년도 보건복지부 암 등록 조사통계를 참고하면, 1년에 약 5,000명 가량의 새로운 환자들이 발생하는 것으로 확인되고 있다. 이는 전체 여성암에 있어서 약 10.6%를 차지하는 것으로 발생 빈도상 위암(15.7%)과 유방암(15.1%)에 이어 3위를 차지하고 있는 것이다. 특히, 최근에는 20~30대의 젊은 여성의 감염률이 크게 증가하여 전체 자궁경부암 환자의 약 32%를 차지하는 등 국민보건상 심각한 문제로 대두되고 있다. 이 때문에 성인 여성에서 주기적인 HPV검사는 필수적이며, 성병 검사시 HPV 검사는 기본적으로 포함된다(U.S.DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES, Centers for Disease Control and Prevention National Center for HIV/AIDS, Viral Hepatitis, STD, and TB. Prevention Division of STD Prevention. Sexually Transmitted Disease Surveillance 2008. Division of STD Prevention. 2009: November; Tchernev G. Sexually transmitted papillomavirus infections: epidemiology pathogenesis, clinic, morphology, important differential diagnostic aspects, current diagnostic and treatment options. An Bras Dermatol. 2009; 84(4): 377-89).

HPV는 인체 감염 부위에 종양을 일으킬 수 있으며, 암을 유발함이 명백하게 입증된 바이러스이다. HPV는 인간의 접촉부위 상피세포에 감염이 된 후 과잉증식(hyperproliferation)을 일으킨다. 이때의 과잉증식은 단순한 피부의 사마귀(wart)나 외성기, 항문 주위의 곤지름 혹은 첨규콘딜롬(condyloma accuminata)과 같은 양성종양인 경우가 대부분이다. 그러나, HPV는 발암의 원인이 될 수도 있으며, 실제 거의 모든 자궁경부암(uterine cervix cancer or cervical cancer)과 구강암이나 인두암, 후두암의 상당수, 그리고 다수의 항문암(anal cancer)이 HPV에 의해 발병함이 확인되고 있다. HPV는 암을 유발하여 생명을 앗아갈 수 있다는 점에서 그 중요성이 더할 나위 없이 크며, 한편으로는 HPV를 검사하면 자궁경부 및 항문 등의 암과 전암병변을 조기 진단할 수 있다. 실제 HPV 검사는 자궁경부암 조기검진의 표준검사인 Papa nicolaou 세포검사(Pap smear) 보다 자궁경부암의 예측 민감도가 더 우수함이 밝혀지고 있고, 이에 따라 미국 FDA 등 여러 나라에서 자궁경부암 선별검사로 인정되고 있다(Howley PM. Virology. Vol 2, 1996, 2045-2109; Murinoz N et al., N Engl J Med, 2003, 348:518-27; Parkin M, F. Bray F, J. Ferlay J and P. Pisani P. Global cancer statistics, 2002. C.A. Cancer J. Clin. 2005; National Network of STD/HIV Prevention Training Center. Genital human papillomavirus infection). 이러한 이유들로 인해 HPV 관련 분야의 시장은 매우 크며, HPV 검사의 경제적 가치도 매우 큰 것으로 보고되고 있다.

자궁경부암은 인유두종바이러스(Human Papillomavirus, HPV)와 밀접한 관련이 있는 것으로 보고되고 있다. 즉, HPV가 자궁경부 상피기저 세포에 감염한 후 저급 상피 이형성증(Low-grade SIL), 고급 상피 이형성증(High grade SIL), 상피내암(squamous intraepithelial lesion, SIL) 등의 오랜 전구 단계를 거쳐 최종 침윤암으로 발전하게 되는데, 이처럼 암으로 발전하기 전 단계인 전암 단계 병변이 존재하기 때문에, 이들 병변을 조기에 효과적으로 치료함으로써 자궁경부암을 예방할 수 있다.

인유두종바이러스(Human Papillomavirus, HPV)는 8kb의 환상의 이중나선 DNA 바이러스로서, 모든 유형의 HPV 바이러스는 유사한 성질의 단백질을 합성하는 DNA 부분인 열린해독틀(open reading frames, ORFs)을 가지며, 크게 초기 유전자(early gene)와 후기 유전자(late gene)로 구분된다. 약 4.5kb의 초기 유전자는 바이러스 DNA 복제(E1), 숙주 세포의 악성화 변형(malignant transformation)을 야기하는 단백질을 형성하는 DNA의 작용을 유발하거나 억제(E2), 숙주세포와 바이러스 성장과 관련된 단백질의 합성(E4), EGF(epidermal growth factor)와 CSF(colony stimulator factor) 수용체의 작동유발(E5), 세포의 영구생존 및 암 유전자의 활성과 암 억제인자의 비활성화 기전에 의한 악성화 변형(E7) 등으로 나눌 수 있다. 특히, HPV가 숙주의 상피세포를 감염시킨 후에 발현되는 종양원성(oncogenic) 단백질인 E6와 E7은 각각 숙주세포의 종양 억제 단백질인 p53과 pRB와 결합하여 이들 종양억제 단백질의 기능을 억제함으로써, 결과적으로 감염 세포의 형질전환에 따른 종양 형성으로 발전하는 것으로 규명되고 있다. 한편, 2.5kb의 후기 유전자는 바이러스 주외피 단백질(L1)과 부외피 단백질(L2)의 합성을 담당하는 DNA와 이들의 전사와 번역 기능을 조절하는 비발현 부분(non-coding region)인 1kb 크기의 LCR(long control region)로 이루어져 있다.

현재까지 HPV는 120가지 이상의 각각 다른 유형(type)들이 발견되었고, 이 가운데 약 36종의 HPV 유형(HPV-2, -3, -6, -10, -11, -13, -16, -18, -26, -30, -31, -32, -33, -34, -35, -39, -40, -42, -43, -44, -45, -51, -52, -53, -54, -55, -56, -57, -58, -59, -61, -66, -67, -68, -69, -70, -73)은 자궁경부암을 야기하는 이른바 종양원성 HPV 유형으로 밝혀졌다.

그 중에서 HPV-16, -18, -26, -30, -31, -33, -35, -39, -45, -51, -52, -53, -56, -58, -59, -66, -67, -68, -69, -70, 및 -73과 같은 유형의 HPV는 자궁경부암으로의 진행률이 상대적으로 높은 것으로 밝혀져 있어 고위험군(high-risk) HPV로 분류되며, HPV -2, -3, -6, -7, -10, -11, -13, -32, -34, -40, -42, -43, -44, -54 및 -61과 같은 유형의 HPV는 자궁경부암으로의 진행률이 낮아 저위험군(low-risk) HPV로 분류되고 있다(Garrenstroom et al., J. Gynecol. Cancer 4:73-78, 1994).

HPV와 관련하여 또 하나 중요한 사실은 최근 백신이 개발됨에 따라 바이러스의 예방과 함께 바이러스로 인한 암의 예방이 가능해지고 있다는 것이다. 현재 시판되는 HPV 예방 백신에는 2종류가 있다. 하나는 Gardasil(Merck & Co. Inc., Whitehouse Station, NJ, USA)로, 이는 HPV 16, 18, 6, 11형의 4종의 HPV를 예방하기 위해 만들어진 4가 백신이다. 또 다른 하나는 Cervarix(GlaxoSmithKline Biologicals, Rixensart, Belgium)로 types 16과 18의 2종의 HPV를 예방하기 위해 만들어진 2가 백신이다. 이들 백신은 성관계를 갖기 전의 청소년 여성에 가장 효과적이며, 이전에 HPV 16형이나 HPV 18형에 감염된 적이 있는 여성의 경우 효과가 떨어진다. 이 때문에 성인 여성에 대한 적응 여부에 논란이 있으나, HPV에 감염된 적이 있더라도 그 형이 type 16이나 18이 아닌 경우 HPV 백신이 적응 가능할 수도 있다. 따라서, HPV의 감염 유무뿐만 아니라 그 형(type)도 정확히 아는 것이 더욱 더 중요해지고 있다(Selva L, Gonzalez-Bosquet E, Rodriguez-Plataa MT, Esteva C, Sunol M and Munoz-Almagro C. Detection of human papillomavirus infection in women attending a colposcopy clinic. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 2009; 64: 416-421; Reynales-Shigematsu LM, Rodrigues ER, Lazcano-Ponce E. Costeffectiveness analysis of a quadrivalent human papilloma virus vaccine in Mexico. Arch Med Res. 2009 Aug;40(6):503-13).

현재 자궁경부암과 그 전구 병변의 일차 진단과 관련하여 기본적으로 세포진 검사(Papanicolaou(Pap) Smear)가 1940년대 이후 표준 검사법으로 시행되고 있다. 세포진 검사는 자궁 경부 세포진의 세포학적 형태를 기초로 하여 자궁경부암을 진단하는 것으로 이를 통하여 자궁경부암으로 인한 사망률을 크게 감소시키는데 공헌하였다. 그러나, 검사자의 숙련도에 의존하여 검사의 정확도가 떨어지는 단점이 있다(Menezes et al., Acta Cytol. 45:919-926, 2001). 또한, 질확대경을 시행하면 HPV의 감염을 70%까지 진단할 수 있으나, 수련된 전문가와 고가의 장비가 필요하며 인유두종바이러스의 유전자형을 분류할 수 없는 단점이 있다(Reidet al., Clin Obstet Gynecol. 32:157-179, 1989).

한편, 자궁경부 세포진의 HPV DNA와 RNA 탐침(probe) 간의 액상 상보 결합을 항체 효소 발색에 의하여 검출하는 "HPV hybrid capture" 방법이 1994년 개발된 이후, 자궁경부암과 그 전구 병변의 보조적 선별 또는 추적 검진의 한 방법으로 활용되고 있으며, 최근 미국 FDA로부터 자궁경부암의 일차 선별을 위한 사용 승인까지 받은 상태이다.

이와 같이, hybrid capture를 포함하여 자궁경부암을 진단하기 위한 다양한 분석방법들이 존재하지만 전 세계적으로 자궁경부암으로 인하여 매년 5~50만 명의 사망자가 발생하는 것에서 알 수 있듯이 자궁경부암 및 그 전구 병변의 포괄적 조기 검출 또는 진단을 위한 범용적 방법의 개발이 시급한 것이 현실이다.

최근, 다양한 HPV 유형의 감염 여부를 검출/진단함에 있어서 특정 염기서열의 DNA 단편을 신속하고 간단하게 증폭할 수 있는 중합효소연쇄반응(PCR) 기법이 보편화되면서 이를 이용하여 지금까지 밝혀진 모든 유형의 HPV를 포괄적으로 검출하고자 하는 노력이 활발하게 시도되고 있다.

또, L1 부위를 PCR(polymerase chain reaction)로 증폭한 후에 제한효소를 사용하는 PCR-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)는 간단하고 쉽게 결과를 얻을 수 있는 장점이 있으나 사용하는 제한효소가 변이부분을 인식하지 못하면 분석하지 못하는 단점이 있다(Lungu et al., JAMA 267:2493-2496, 1992).

PCR 기법은 목적 병원체의 핵산 염기 서열에 특이적으로 결합하는 상보적 핵산 단편 서열(프라이머)을 가하여 온도에 따른 변성(denaturation), 재결합(annealing) 및 중합(polymerization) 과정을 반복하여 미량의 병원체 핵산을 증폭시켜 그 존부를 검출할 수 있는 기술로서(미합중국 특허 제4,683,195호 및 제683,202호), 다양한 유형의 HPV 감염 여부를 진단하는데 사용되는 대표적인 기술 중 하나이다.

이러한 PCR 기법은 임상 진단의 실용적 측면에서 세포진 검사(Pap smear)의 세포학적 검사와 달리 객관적인 대규모 검사가 가능하며, 측정원리상 세포검사나 액상 hybrid capture에 비해 검사비용, 실험 절차, 검출 감도(sensitivity) 및 특이도(specificity) 등에서 상대적 우위를 가지고 있는 것으로 확인되어 있다. 그러나, 현재까지 HPV 감염 여부를 조기에 광범위하게 1차적으로 검출/진단하기에 적합한 공통 프라이머(general primer)가 부족하여 PCR을 이용하여 HPV의 감염 여부를 임상적으로 적용하기에는 많은 어려움을 겪고 있다.

현재, 전 세계적으로 임상에서 HPV 감염 여부를 검출/진단하기 위하여 널리 사용되는 대표적인 공통 프라이머로는 크게 북아메리카, 남아메리카 및 아시아에서 주로 사용되는 MY09/MY11 프라이머 세트와, 유럽 지역에서 주로 사용되는 GP5⁺/GP6⁺ 프라이머 세트 및 SPF1/SPF2 프라이머 세트로 구분될 수 있다. 이 밖에 최근 새롭게 개발되어 사용되고 있는 FAP59/FAP64 프라이머 세트와 PGMY09/PGMY11 프라이머 세트가 있으며, 일부 연구 목적으로 사용되는 많은 HPV 검출/진단을 위한 공통 프라이머 세트가 있으나, 현재까지 밝혀진 바 있는 다양한 HPV 유형과 비교할 때, 극히 제한된 유형의 HPV 검출/진단에만 국한되어 있을 뿐 아니라 HPV 유형에 따라 검출의 민감도가 크게 떨어지는 등 많은 문제점을 가지고 있는 것으로 판명되었다. 또한, HPV 유전자형에 따라서 PCR 증폭의 효율이 달라 검사의 정확도가 문제될 수 있다. 아울러, 현재 KFDA에 승인된 모든 DNA칩의 경우 분석시 스크리닝 프라이머와 인터널 콘트롤 프라이머를 개별 증폭하여 혼합한 후 교잡반응을 시켜야 하므로 경제적인 비용이 많이 들어갈 수밖에 없다(Qu et al., J. Clin. Microbiol. 35:1304-1310, 1997; Karksen et al., J. Clin. Microbiol. 34:2095-2100, 1996; Gravitt et al., J. Clin. Microbiol. 38:357-361).

이에 따라, 인유두종바이러스의 검출에 따른 자궁경부암을 예방하기 위한 현재의 검출 시스템은 그 가치와 필요성이 있음에도 불구하고 실제 임상 목적에서의 활용에 큰 제약이 있다. 특히, 새롭게 동정, 분류된 HPV 유형이 자궁경부암과 밀접한 관련이 있는 종양원성의 HPV 유형인지 또한 고위험군인지에 대해서는 단서를 찾을 수 없기 때문에 HPV 검출/진단과 관련하여 많은 혼란을 야기하고 있다.

대한민국 등록특허공보 등록번호 10-0786637 대한민국 공개특허공보 공개번호 10-2011-0126076

본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 종양원성 HPV DNA의 검출/진단을 위한 인유두종바이러스 유전자형 분석용 DNA 칩을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 다른 과제는 인유두종바이러스의 유형 특이적 E6/E7 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 세트를 제공하고자 한다.

본 발명의 또 다른 과제는 인유두종바이러스 유전자형 분석용 DNA 칩 및 인유두종바이러스 유형 특이적 E6/E7 유전자를 증폭하기 위한 프라이머를 포함하는 진단 키트를 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 또 다른 과제는 본 발명의 인유두종바이러스 유전자형 분석용 DNA 칩 및 프라이머를 이용한 인유두종바이러스 유전자형의 분석방법을 제공하고자 하는 것이다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 29의 염기서열 또는 이들의 상보적인 염기서열로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택되는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 검체의 인유두종바이러스(HPV) 유전자형 분석용 DNA 칩을 제공한다.

상기 DNA 칩은 고위험군 HPV로서 HPV-16, HPV-18, HPV-26, HPV-30, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-52, HPV-53, HPV-56, HPV-58, HPV-59, HPV-66, HPV-67, HPV-68, HPV-70, 및 HPV-73과 저위험군 HPV로서 HPV-6, HPV-11, HPV-34, HPV-40, HPV-43, HPV-44, HPV-54, HPV-55 및 HPV-61을 포함하는 HPV 유전자형의 분석용이다.

상기 올리고뉴클레오티드는 HPV의 유형 특이적인 E6/E7 유전자 부위와 상보적으로 결합한다.

상기 DNA 칩은 양성 대조군으로서 인체 GAPDH 유전자와 상보적으로 결합하는 서열번호 30의 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

상기 DNA 칩은 올리고뉴클레오티드를 집적할 수 있는 웰(well)이 8개로 구획되어 있는 것이 바람직하다.

상기 올리고뉴클레오티드의 농도는 50pmol 이상인 것이 바람직하다.

상기 올리고뉴클레오티드는 링커로서 C6의 아민 변형된 디데옥시티미딘을 결합시켜 수퍼알데히드(superaldehyde)기로 코팅된 지지체 위에 집적시킨 것이 바람직하다.

상기 지지체는 유리슬라이드, 페이퍼, 니트로셀룰로오스막, 마이크로플레이트 웰, 플라스틱,실리콘, DVD 및 비드로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하다.

상기 검체는 자궁경부 또는 질의 스왑; 자궁경부의 조직; 남성 성기의 조직; 소변; 항문, 직장, 인두, 구강 또는 두경부의 스왑으로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하다.

상기 검체는 남성 성기의 암, 남성 요로의 암, 항문암, 두경부암 및 이들의 전암 세포로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 서열번호 31 내지 88의 염기서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 HPV E6/E7 유전자 증폭용 프라이머를 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 상기 DNA 칩, 본 발명의 프라이머 및 증폭된 DNA를 검출하기 위한 표지수단을 포함하는 인유두종바이러스(HPV)의 유전자형 분석용 키트를 제공한다.

상기 프라이머는 서열번호 89 및 90의 염기서열을 갖는 인체 GAPDH 유전자 증폭용 프라이머를 더 포함할 수 있다.

상기 표지수단은 Cy3, Cy5, Cy5.5, Bodipy, Alexa 488, Alexa 532, Alexa 546, Alexa 568, Alexa 594, Alexa 660, 로다민(Rhodamine), TAMRA, FAM, FITC, Fluor X, ROX, Texas Red, Orange green 488X, Orange green 514X, HEX, TET, JOE, Oyster 556, Oyster 645, Bodipy 630/650, Bodipy 650/665, Calfluor Orange 546, Calfluor red 610, Quasar 670, 비오틴, Au, Ag 및 폴리스티렌으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 (a) 서열번호 31 내지 88로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프라이머를 이용하여 검체의 타겟 유전자를 다중(multiplex) PCR 방법에 의해 증폭하는 단계; (b) 제 1항 또는 제 2항에 따른 DNA 칩에 상기 증폭된 PCR 산물을 혼성화하는 단계; 및 (c) 상기 혼성화에 의해 얻어진 혼성화물을 검출하는 단계를 포함하는 인유두종바이러스(HPV)의 유전자형 분석방법을 제공한다.

상기 DNA 칩은 올리고뉴클레오티드에 Cy3, Cy5, Cy5.5, Bodipy, Alexa 488, Alexa 532, Alexa 546, Alexa 568, Alexa 594, Alexa 660, 로다민(Rhodamine), TAMRA, FAM, FITC, Fluor X, ROX, Texas Red, Orange green 488X, Orange green 514X, HEX, TET, JOE, Oyster 556, Oyster 645, Bodipy 630/650, Bodipy 650/665, Calfluor Orange 546, Calfluor red 610, Quasar 670 및 비오틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질로 표지하는 것이 바람직하다.

상기 분석방법은 HPV 유형의 E6/E7 유전자를 삽입한 플라스미드 벡터들을 양성 대조군 클론으로 이용하여 분석하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 검체는 상기 검체는 자궁경부 또는 질의 스왑; 자궁경부의 조직; 남성 성기의 조직; 소변; 항문, 직장, 인두, 구강 또는 두경부의 스왑으로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하다.

본 발명에서 합성된 올리고뉴클레오티드는 종양원성 HPV 유형의 HPV 핵산과 상보적으로 결합하여 상기 HPV 유형의 핵산을 특이적으로 증폭할 수 있는 신규한 유형 특이적 프라이머로 사용될 수 있다.

특히, 본 발명에 따른 DNA 칩의 제조에 사용되는 올리고뉴클레오티드는 샘플 내에 HPV 핵산의 존재 여부 및 유형을 검출/진단하는데 활용될 수 있으므로 HPV에 의하여 야기되는 자궁경부암 등의 조기 검진에 활용될 수 있다.

본 발명에 따른 유전체(genome)를 이용한 유전자 접근 방법을 통하여 조기에 HPV 감염 여부를 진단할 수 있기 때문에 추후 지속적이고 장기적으로 정확한 검진을 실시할 수 있어 자궁경부암의 예방효과가 기대된다.

또한, 비교적 저렴한 비용으로 HPV 진단을 수행할 수 있을 뿐 아니라 검진 대상자에게 첨단결과를 조기에 알려줄 수 있으므로 신뢰도 및 만족감을 줄 수 있고, 국가적 차원에서 큰 문제가 되고 있는 자궁경부암과 같은 국민 건강에 일익을 담당할 수 있을 것으로 생각된다.

도 1은 HPV 전체 유전자 서열에서 종래 DNA 칩 유전자 서열 위치와 본 발명의 DNA 칩에서 사용된 유전자 서열 위치를 나타낸다.
도 2a 내지 도 2c는 본 발명에 따라 합성된 프라이머 세트를 사용하여 HPV-16 감염 세포주인 Caski(ATCC CRL-1550), HPV-18 감염 세포주인 HeLa(ATCC CCL-2) 및 HPV 비감염 세포주인 K562(KCLB-10243, Korean Cell Line Bank)를 표적 DNA로 하여 PCR을 실시한 후 DNA 칩 분석을 수행한 사진이다.
도 3a 내지 도 3o는 각각 본 발명에 따라 합성된 프라이머 세트를 사용하여 10개의 자궁경부암 관련 검체와 5개의 정상 검체를 대상으로 PCR을 실시한 후 DNA 칩 분석을 통해 그 유형을 확인한 사진이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 서열번호 1 내지 29의 염기서열 또는 이들의 상보적인 염기서열로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택되는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 검체의 인유두종바이러스(HPV) 유전자형 분석용 DNA 칩을 제공한다.

상기 DNA 칩은 상기 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 1종 이상 포함하며, 분석하고자 하는 유전자형에 따라 적절한 수로 올리고뉴클레오티드를 제한할 수 있다.

바람직하게는, 상기 DNA 칩은 고위험군 HPV로서 HPV-16, HPV-18, HPV-26, HPV-30, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-52, HPV-53, HPV-56, HPV-58, HPV-59, HPV-66, HPV-67, HPV-68, HPV-70, 및 HPV-73과 저위험군 HPV로서 HPV-6, HPV-11, HPV-34, HPV-40, HPV-43, HPV-44, HPV-54, HPV-55 및 HPV-61을 포함하는 HPV 유전자형의 분석용이다.

종래 PCR 기법을 활용하여 샘플 내에 존재하는 여러 유형의 HPV DNA와 혼성화(hybridization) 또는 상보적 결합(complementary binding)할 수 있는 공통적인 올리고뉴클레오티드 프라이머는 현재까지 발견된 HPV 유형의 수와 비교할 때, 검출/진단할 수 있는 유형의 수가 크게 제한될 뿐 아니라, HPV 유형에 따라 민감도가 크게 떨어진다. 이와 같이, 현존하는 HPV 검출/진단을 위한 PCR 공통 프라이머는 HPV 게놈 중 L1 영역과 상보적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 대상으로 한 것이었기 때문이었다.

상기한 것과 같이, HPV 게놈을 구성하는 E6 유전자 및 E7 유전자는 각각 숙주 세포의 종양 억제 단백질 중의 하나인 p53 또는 pRb와의 결합부위를 암호화(encoding)하는 특정 핵산 서열을 가지고 있는데, 자궁경부암의 진행과 밀접한 관련이 있는 종양원성 HPV 유형, 예컨대 고위험군의 HPV 유형에서는 p53 또는 pRb와의 결합부위를 암호화하는 핵산 서열이 잘 보전되어 있다. 또한, HPV 게놈의 E1 유전자는 HPV 게놈의 복제를 개시하는 단백질을 암호화하고 있으므로, HPV가 숙주 세포에서 생장하기 위한 필수적인 서열이다.

본 발명자들은 이와 같은 발견을 토대로 종양원성 HPV 유형의 핵산 서열과 상보적으로 결합할 수 있고, 이에 따라 해당 HPV 유형의 핵산 서열을 증폭시킬 수 있는 유형 특이적 프라이머를 설계하였다. 본 발명에 따라 합성된 유형 특이적 프라이머는 특히 HPV 게놈 중의 E6/E7 영역과 상보적으로 결합할 수 있기 때문에, 샘플 내의 이들 유전자의 증폭 여부를 통하여 샘플 내에 HPV DNA의 존부를 확인할 수 있다.

따라서, 본 발명에 따라 합성된 유형 특이 프라이머를 사용하면 1회의 PCR 과정을 통하여 종양원성 HPV 유형의 존재 여부를 분석/검출할 수 있음은 물론 이들 유형을 정확하게 동정할 수 있다.

상기 집적되는 각 올리고뉴클레오티드의 농도는 50pmol 이상인 것이 바람직하다.

이하에서는 구체적인 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명을 상세하게 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

1. 인유두종바이러스 유형 분석 칩( chip ) 제작

인유두종바이러스 유형 진단을 위한 DNA 칩(chip)은 29종의 인유두종바이러스 유형을 고-특이도로 판별할 수 있는 총 29종의 프로브(probe)가 집적되어 있다(표 1). 내부 대조군(internal control)으로 인간 갭디에이치(GAPDH) 유전자에 대한 프로브가 고정화되어 있다. 하나의 칩 기판 위에 총 29종의 유전자 고-처리량 분석이 가능한 그리드(grid)가 8개씩 포함되도록 칩 레이아웃을 고안하였으며, 8 웰 혼성화 반응 챔버(8 well hybridization reaction chamber)를 통해 8개의 개별 검체에 대한 분석을 동시에 진행할 수 있도록 고안하였다. -70℃로 보관중인 프로브 스탁(stock)을 실온에서 해동한 후, 탈이온 멸균 3차 증류수에 최종농도 100 M이 되도록 희석하여 워킹 스탁(working stock)으로 사용하였다. 워킹 스탁을 50배 희석한 각각의 프로브들을 3X SSC 스포팅 용액(500 mM NaCl, 3 mM sodium citrate, 1.5 M N,N,N-trimethylglycine, pH 6.8)과 1 : 5 - 10 비율(v/v)로 혼합하여 최종 96 웰 플레이트(well plate)에 분주되는 프로브의 농도범위가 20 - 30 pmole/uL가 되도록 하였다. 상기 플레이트를 Microssys 5100 microarrayer(Cartesian Technologies, Ann Arbor, MI, USA)에 장착하고 이로부터 알데하이드(aldehyde)-, 티오이소시아네이트(thioisocyanate)-활성화된 글라스 슬라이드(CEL associates Inc.,Houston, TX, USA), 에폭시(epoxy)-활성화된 플라스틱 칩, 또는 골드 필름 표면에 프로브들을 순서에 따라 2개씩 duplicate으로 스포팅하였다. 스팟(spot)의 평균 크기(diameter)는 80-140 마이크로미터(micrometer)이며, 스팟간 크로스-토크(cross-talk)효과를 최소화하기 위해 스팟 간의 거리는 350 - 500 마이크로미터를 유지하였다. 칩 제작은 75% 습도(humidity)를 유지하는 클래스 10,000 룸에서 실시하였다. 프로브가 스팟팅된 칩은 120℃에서 1시간 동안 베이킹(baking)한 후, 0.25% SDS(Sodium dodecyl sulfate)용액에서 3분간 세척하고 멸균 3차 증류수로 다시 세척하였다. 이후, 칩을 0.2% 소디움 보로하이드라이드(NaBH₄)를 포함하는 용액에 반응시켜 프로브를 블럭킹(blocking)하였다. 이후, 3차 증류수로 2회 세척하고 물기를 제거한 후 사용시점까지 데시케이터(dessicator)에 보관하였다.

서열번호	명칭	서열(5'→3')	위치(bp)
1	HPV-16	ATCATGCATGGAGATACACCTACATTGCATG	559-589
2	HPV-18	CAACATTGCAAGACATTGTATTGCATTTAGAG	606-637
3	HPV-26	CAGTGGAAAGGGTTGTGTACAAATTGTTGG	565-596
4	HPV-30	CGTCCACTGAGACAGCAGTATAATCATGC	624-655
5	HPV-31	CTGACCTCCACTGTTATGAGCAATTACCC	618-646
6	HPV-33	ACGTAGAGAAACTGCACTGTGACGTGTAAA	537-566
7	HPV-35	TGTATTACATGTCAAAAACCGCTGTGTCCAGTT	416-448
8	HPV-39	AAGAGAAACCCAAGTATAACATCAGATATGCG	565-596
9	HPV-45	TGCATTTGGAACCTCAGAATGAATTAGATCCT	624-655
10	HPV-51	ATGTACCACAATTAAAAGATGTAGTATTGCAT	570-601
11	HPV-52	ACCCCGACCTGTGACCCAAGTGTAAC	524-549
12	HPV-53	CACTTCCACAATATATTATAGAACTTATACCA	588-619
13	HPV-56	CTGCAAGACGTTGTATTAGAACTAACACCT	593-622
14	HPV-58	CCATGAGAGGAAACAACCCAACGCTAAG	572-599
15	HPV-59	AACAATGCATGGACCAAAAGCAACACTTTG	538-567
16	HPV-66	TACCAACGTTGCAAGAGGTTATATTAGAACTTG	588-618
17	HPV-67	AGTGTGTTGGAGACCTCAACGAACG	512-538
18	HPV-68	TGCAATGAAATAGAGCCGGTCGACCTTG	4428-4455
19	HPV-70	CGGTCGACCTTGTATGTCACGAGCAATTAGA	659-689
20	HPV-73	AGGCGATATAGACAATCAGTATATGGCACT	333-362
21	HPV-6	AGGTAAAACATATACTAACCAAGGCGCGG	448-476
22	HPV-11	TTACCTGTGTCACAAGCCGTTGTGTGAAA	413-441
23	HPV-34	TAGAAGATATAACCAATCAGTGTATGGACGG	332-362
24	HPV-40	CTGCACCCTGAACCTGTATGTCTAAACT	569-596
25	HPV-43	CATGGAAAAAAGCCGACGATCAGAGACTATG	591-616
26	HPV-44	GAAACAAATAAGTCAATTCTGGACGTGCTG	378-407
27	HPV-54	ACACAGGCATAAGGGTACTGCAGGAACTG	558-589
28	HPV-55	CGTTCGGCTGGTTGTGCAGTGCACAGGAAC	595-612
29	HPV-61	AACCATAAAGGACATAGTCCTTGAAGAGCG	535-564
30	Internal Control	CTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACT

2. HPV E6 / E7 특이 유전자 증폭용 프라이머의 합성

본 발명에서 프라이머(primer)는 유형별, 즉, 인유두종바이러스 타입 특이적인 증폭이 가능하도록 타겟 부위(target region)를 선별하였다. 또한, 필요한 경우 유형별 타겟 부위 염기서열을 ClustalW method를 이용하여 다중정렬(multiple alignment)을 실시하고, 이에 따라 각 유형 특이적인(specific) 프라이머 타겟 부위를 선별하였다. 이후, 선별된 프라이머 타겟 부위로부터 프라이머 프리미어(Primer premier version 5, Premier Biosoft International, Palo Alto, CA, USA), 디엔에이시스 맥스(DNASIS MAX Version 2.7, MiraiBio Group, South San Francisco, CA, USA) 프로그램을 응용하여 유형-특이적 또는 유전자-특이적 프라이도(Tm)는 74-80℃가 되게 하였으며, 3' 말단의 GC 함량이 높지 않아야 하며, 프라이머 서열내 염기 4개 이상 연속해서 상보적이지 않도록 해서 hairpin 이차구조 형성을 방지하였으며, 3'말단에 동일한 염기가 3개 이상 연속해서 위치하지 않도록 해서 프라이머 이합체(dimer)의 형성을 방지하였다. 그리고, 타겟 부위내에 단일염기 다형성(single nucletide polymorphism, SNP)이 포함되지 않도록 하여 높은 특이도를 확보하였다. 또한, 해당 프라이머 염기서열이 본 발명이 목적하는 칩을 구성하는 타 유전자 또는 병원체 염기서열들과 cross-reactive한 특성을 나타내지 않음을 미국 NCBI 염기서열 데이터베이스 등 다양한 염기서열 검색 툴(tool)을 활용하여 검증하였다. 본 발명에 사용하는 프라이머(primer)는 미국 IDT(Integrated DNA Technologies, Inc., San Jose, CA, USA)를 통해 합성하였다(표 2).

타입	서열번호	forward primer(5'-3')	서열번호	reverse primer(5'-3')
TSP-16	31	GAGCGACCCAGAAAGTTACCACAGTTATGCACAGAG	32	GCACACAATTCCTAGTGTGCCCATTAACAGGTC
TSP-18	33	GAGGATCCAACACGGCGACCCTACAAGCTAC	34	TGCTGAGCTTTCTACTACTAGCTCAATTCTGGC
TSP-26	35	GAGCTATGTGAAAGCTTGAATACTACTTTGC	36	GTGCAGCACACTGATGGCACACC
TSP-30	37	CACCATCTTTGTGAGGTACAAGAAACATCGTTGC	38	GCACACAGGGGACACACTAGCTCCAG
TSP-31	39	CCTGCAGAAAGACCTCGGAAATTGCATGAAC	40	GGCACACGATTCCAAATGAGCCCA
TSP-33	41	GCAGTAAGGTACTGCACGACTATGTTTCAAGACACTG	42	TAGGTCACTTGCTGTACTGTTGACACATAAACGAACTG
TSP-35	43	TTACAAACTGCATGATTTGTGCAACGAGGTAGAAG	44	GAACAGCCGGGGCACACTATTCCAAATG
TSP-39	45	TAGCCTGTGTCTATTGCAGACGACCAC	46	GTTGCACACCACGGACACACAAATCCTAGTG
TSP-45	47	TACAAGACGTATCTATTGCCTGTGTATATTGCAAAGC	48	ACGGACACACAAAGGACAAGGTGCTC
TSP-51	49	CAAGAGGGAAAGACCACGAACGCTGCATG	50	TAACATCTGCTGTACAACGCGAAGGGTGTC
TSP-52	51	CGGCCATGTTTGAGGATCCAGCAACAC	52	CAACAGCATTTGCTGTAGAGTACGAAGGTCCGTC
TSP-53	53	GCACTGTGTACAACACCCAGGACATCC	54	CTGCACCAACGACTCACACCTACAACACTG
TSP-56	55	CCACAATTCAACAATCCACAGGAACGTCCACG	56	CAGGTCCTCTTTGGTACTCTGAATGTCCAACTG
TSP-58	57	GATTTGTGTCAGGCGTTGGAGACATCTGTGCATG	58	GTGCACAGCTAGGGCACACAATGGTACATG
TSP-59	59	ATTTGAGCACAACATTGAATATTCCTCTGCATGATATTCGC	60	CAGCTGCTGTAAGGCTCGCAATCCGTC
TSP-66	61	CCATATTCAGCAATACACAGGAACGTCCACGAAGC	62	CGTAGCTCCTCTTTGGTACTCTGAATGTCCAACTGC
TSP-67	63	CAGACGAAAAACCACGCAACCTGCACGAATTGTG	64	CTATTCCTAGTGTGTTCATAAGCATCTGCTGGATTGTTCGG
TSP-68	65	CATTGGACACCACATTGCATGACGTTACAATAGACTG	66	GTCCATAAACAGCAGTTCTACGTTCCGCAGG
TSP-70	67	TAGACTGTGTCTATTGTAAAACACAGCTACAGCAAAC	68	GATGCACACCAGGGACACACAAATGACAGTG
TSP-73	69	GTTTCCCAATTCAGAAGAACGACCATACAAGCTAC	70	GGCACACAATACCTAGTGTACCCATAAGCAACTC
TSP-6	71	GGCATTATGGAAAGTGCAAATGCCTCCACGTCTGCAAC	72	GGTCTTCGGTGCGCAGATGGGACACACTATGTTTAG
TSP-11	73	GCAGACGAGGCATTATGGAAAGTAAAGATGCCTCCACG	74	GTGTGCCCAGCAAAAGGTCTTGTAGTTGTCTGATGTCTC
TSP-34	75	CAATCCTGAGGAACGGCCATACAAGCTACCAGC	76	CACCCATAAGCAGGTCTTCTAACACTAATAGGTCAGCG
TSP-40	77	CCAGGACCCTGTATGAACTGTGTGACCAGTGC	78	CACTCTGTAGCTGCACAGTTGGGGCACACTATATGTAATGTG
TSP-43	79	GACTGCACGTAGCTGCTCCCAAAACG	80	CCCAACAGCAGGTCTTCTAGCTTCTTGATG
TSP-44	81	GCAAGCGGGGCATAATGGAAAGTGCAAATGC	82	CACACAGGACACAATATATCCAGTGAACCCAGCAG
TSP-54	83	CCGAAACCGGTACATATAAAAGCGGTTGTAGAAAACAG	84	GTCGTGAAGCACAGGTGGGACACACTATTTGCAGTGC
TSP-55	85	GCAAGCGGGGCATAATGGAAAGTGCAAATGC	86	CAGGACACAGTATTTCCAGTGAACCCAGCAGAAGCGTATG
TSP-61	87	CGTAGGGTCAGCAAAGCACACTCATCTATGGGACCG	88	CAGCCAGGACACACTATGGACAAGTCGCCCAGCAG
internal control	89	CCCACAAGTATCACTAAGCTCGCTTTCTTGCTGTCC	90	GCAGAATCCAGATGCTCAAGGCCCTTCATAATATCC

인유두종바이러스 유형 진단을 위한 프라이머는 DNA 염기서열의 5'말단 또는 3'말단에 형광색소가 표지된 프라이머를 사용하거나, 또는 형광색소가 표지되지 않은 일반적인 프라이머를 사용하고 멀티플렉스 PCR 반응 중에 형광색소가 표지된 디옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트가 증폭산물에 삽입되게끔 유도하여 증폭산물을 표지하는 두가지 방법을 모두 확인하였다. 또한, 인유두종바이러스 유형 진단을 위해서는 일차 스크리닝 후 2차 PCR 단계에서 형광색소가 표지된 프라이머를 사용하거나 또는 증폭반응 중에 형광색소를 표지하게 된다.

본 발명에 사용하는 형광색소는 6-FAM(6-carboxyfluorescein), Cy5, Cy3, Cy5.5, JOE(6-carboxy-4', 5'-dichloro-2', 7'-dimethoxyfluorescein), Rhodamine Green, TAMRA NHS(N-hydroxysuccinimide) Ester, Texas Red 이다. 프라이머의 농도는 ND-1000 분광광도계(NanoDrop Technologies, Rockland, Maine, USA)를 통해 확인하고 최종 50 - 200 pmole/uL 범위의 농도가 되도록 3차 탈이온 멸균 증류수로 재현탁(resuspension)하고 aliquots으로 -70℃에서 냉동보관하였다.

3. 임상검체 채취 및 이로부터 DNA 분리

비침습적(non-invasive) 진단을 위해서 자궁경부세포진, 소변 등의 검체로부터 효율적인 DNA 분리가 주요 선행조건 중의 하나였다. 검체는 채취 후 바이러스 수송배지(viral transport media)에 넣어서 검사실로 운송하였다. 인유두종바이러스 유형 진단을 위해 검체로부터 세균 게노믹 DNA(genomic DNA)를 분리하였으며, 상용화된 DNA 추출 키트(LaboPass Tissue kit, 코스모진텍, 서울, 한국)를 사용하였다. 자궁경부세포진을 비롯한 여타 검체가 점도가 낮아서 바로 pipetting이 가능하면 2N 수산화나트륨(NaOH)을 사용하지 않고 검체 0.3mL을 1.5 mL 에펜도르프 튜브로 옮겼다. 점도가 높은 검체의 경우, 2N NaOH를 검체와 동량으로 첨가하여 검체를 액화시켰다. NaOH를 넣어 줄 때 tip으로 저어주면서 검체를 풀어야 하며, pipette으로 0.5 mL을 정확히 취할 수 있을 정도로 풀어 주었다. 시료를 포함하는 에펜도르프 튜브를 한일 1524M 고속 원심분리기(high-speed centrifuge, Hanil Scientific., Korea)를 이용해서 12,000 rpm(revolutions per minute, 분당회전수), 1분 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 침전물을 300 μL의 PBS 용액에 풀어준 뒤 다시 동일 조건에서 원심분리하여 세척과정을 거쳤다. 상기 침전물에 시료를 분해하는 TG 완충용액(buffer) 200 μL를 첨가하여 풀어주고 단백분해효소 K(Proteinase K, 100mg/mL) 20 μL를 첨가하고 약하게 교반(vortex)한 후 70℃, 10분간 반응시켰다. 이후, 반응물에 TB 완충용액 400μL를 첨가하고 교반하여 반응물을 혼합하였다. 이어서, 반응물을 스핀 칼럼(spin column)의 상층부에 로딩(loading)하고 12,000 rpm, 2분 원심분리하였다. 컬렉션 튜브(collection tube)를 새로 교체하고 멤브레인으로부터 불순물을 제거하는 WB 완충용액 500 μL를 첨가하고 12,000 rpm, 2분 원심분리하였다. 이후, 스핀 칼럼 상층부를 새로운 에펜도르프 튜브로 옮긴 뒤 DNA를 용출시키기 위해 탈이온(de-ionized) 멸균 3차 증류수 70 μL를 로딩하고 실온에서 2분 처리하고 12,000 rpm, 2분 원심분리하여 순수한 DNA를 분리하였다.

4. 멀티플렉스 PCR 을 통한 인유두종바이러스 타겟 유전자 증폭

올리고 DNA 칩(chip) 분석에 앞서, 임상 검체로부터 분리한 바이러스 DNA를 주형으로 멀티플렉스 PCR 반응을 통해 칩 반응의 타겟 유전자들을 증폭하였다. 이후, 증폭된 앰플리콘들은 칩(chip)표면의 DNA 프로브들과 듀플렉스(duplex)를 형성함으로써 인유두종바이러스 원인균별 유형 판정결과가 확인된다. 본 발명의 바람직한 일 양태에 따른 멀티플렉스 PCR은 내부 대조군(internal control)으로 인간 GAPDH 유전자를 포함한다.

본 실시예에 바람직하게 기술하는 인유두종바이러스 29종 멀티플렉스 PCR 반응액 혼합물에 포함되는 PCR 완충용액의 최종농도는 50 mM KCl, 3.5 mM MgCl₂, 10mM Tris-HCl, pH 8.2이며, 2.5 unit의 Taq 중합효소, 300 μM dNTPs(Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany), 10 mg/mL 소혈청알부민(Bovine serum albumin)을 포함한다. 인유두종바이러스 유형 진단을 위한 멀티플렉스 PCR에 포함되는 개별 유전자들의 정방향(sense) 프라이머는 5'- 또는 3'-말단에 Cy3 또는 Cy5 형광색소를 표지시켜 합성하거나, 또는 양 말단의 변형(modification)없이 nascent 올리고뉴클레오티드로 합성하였다(Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA).

본 발명의 또한 바람직한 일 양태에 따른 말단에 형광색소 변형이 없는 프라이머를 포함하는 멀티플렉스 PCR 키트는 PCR 과정중에 Cy3 형광색소가 표지된 디옥시사이토신 트리포스페이트(Cy3-dCTP)가 증폭산물을 구성하는 뉴클레오티드로 첨가되도록 하여 반응의 민감도와 특이도를 향상시킬 수 있었다. Cy3-dCTP를 사용하는 29종 멀티플렉스 PCR 반응에 사용하는 PCR 완충용액은 최종농도 50 mM KCl, 3.5 mM MgCl₂, 10mM Tris-HCl, pH 8.2 이였으며, 2.5 unit의 Taq 중합효소, 300 μM dATP, 300 μM dGTP, 300 μM dTTP, 25 μM dCTP, 275 μM Cy3-dCTP(FluoroLink Cy3-dCTP, Amersham Pharmacia Biotech AB, Piscataway, NJ, USA), 10 mg/mL 소혈청알부민(Bovine serum albumin)을 첨가하여 타겟 유전자들을 특이적으로 증폭하였다.

5. 인유두종바이러스 유형 분석 칩 교잡반응 및 결과 분석

본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 29종 인유두종바이러스 멀티플렉스 PCR 증폭산물을 각각 10 - 20 μL씩 총 30 - 60 μL를 이와 동일한 volume의 탈이온 3차 멸균 증류수가 미리 첨가된 1.5 mL 에펜도르프 튜브에 첨가하였다. 이 mixture를 softly vortex하고, 95℃, 5분간 열변성시킨 후 얼음 위에 5분간 보존하고 원심분리기로 스핀다운(spin down)하였다. 칩(chip) 표면에는 8 웰 혼성화 반응 챔버(8 well hybridization chamber)를 위치시키고 웰 커버(cover)로 웰 상층부를 덮어두었다. 이후, 반응시키고자 하는 웰(well)에 상기 반응 혼합용액에 혼성화 반응 온도인 56℃로 미리 가열해둔 60 - 80μL의 혼성화 반응 용액(3X SSC, 0.1% SDS, 0.2 mg/mL 소혈청알부민, pH 7)을 첨가하여 혼합한 후 웰 커버의 구멍(hole)을 통해 반응액 혼합물을 주입하고 버블(bubble)이 발생하지 않도록 주의하였다. 챔버 리드(lid)를 고정시킨 후 56℃, 30분간 혼성화 반응을 통해 칩 표면의 프로브와 멀티플렉스 PCR 반응산물 간 특이적인 뉴클레오티드 상보적(complementary) 결합을 유도하였다. 혼성화 반응이 종료된 칩 표면의 웰 커버를 제거하고 칩을 세척버퍼 1(0.1X SSC, 0.05% SDS)용액에 담그고 2분간 2,000 rpm에서 교반하면서 세척(washing)하고 이를 반복하였다. 이후, 세척용액 2(2X SSC, 0.1% SDS) 용액에 2분간 2,000 rpm에서 교반하면서 세척(washing)하고 이를 반복하였다. 이후, 탈이온 3차 멸균 증류수에 담가 2회 세척하고 1,000 rpm에서 원심분리하여 칩을 건조하였다. 상기 칩을 스캔어래이 라이트(ScanArray Lite, Packard Instrument Co., Meriden, CT, USA) 스캐너를 이용하여 판독하였고, 분석 소프트웨어(QuantArray 2.0)를 이용하여 양성 대조군 스팟들의 평균 형광강도(fluorescence intensity) 및 표준오차를 스팟 주변의 값들과 비교하여 signal-to-noise(S/R) 비율을 구한 뒤 그 값이 4 이상일 경우 양성 값으로 스코어링(scoring) 처리하였다.

6. 프로브 테스트

표 3은 29종의 HPV에 대한 프로브(서열번호 1 내지 29)의 최소 검출 한계를 확인하기 위한 DNA칩을 나타낸다. 형광신호를 분석을 위해 Genepix 4100A(Epson, USA)를 이용하여 프로브 간의 형광신호의 강도를 측정하여 분석하였다.

표 3에서 보는 바와 같이, Genepix 4100A(Epson, USA) 소프트웨어를 이용하여 프로브간의 형광신호의 강도를 분석한 결과 S/N 값이 11.25~13.32의 감도가 최소 검출 한계치로 나타나고 있다.

7. HPV -16, -18 감염 세포주 및 비감염 세포주 실험

도 2a 내지 도 2c는 본 실시예에 따라 합성된 프라이머를 사용하여 HPV-16 감염 세포주인 Caski, HPV-18 감염 세포주인 HeLa 및 HPV 비감염 세포주인 K562를 대상으로 PCR 실시 후 칩 분석을 수행한 사진이다. HPV-16 감염 세포주인 Caski와 HPV-18 감염 세포주인 HeLa에 대해서만 칩 교잡반응에서 해당 프로브가 반응을 보였고 HPV 비감염세포주은 K562 세포에 대해서는 칩 교잡반응에서 프로브에 대해 반응을 나타내지 않았다.

8. 임상 검체 실험

본 실시예에서는 임상시료를 대상으로 종래의 세포 검사법에 따른 HPV 감염 여부 및 자궁경부암 관련 여부를 검진하였다. 이를 위하여 이원의료재단으로 의뢰된 검체 15건을 대상으로 담당 임상의의 책임 하에 질확대경진(colposcopy) 검사, 자궁경부촬영진(cervicography) 검사, 조직생검(biopsy) 및 세포진도말(pap-smear) 검사 등의 전문적 검진을 수행하였다. 본 실시예에 따른 세포 검사법에 따른 검진 결과는 하기 표 4에 표시하였다.

피검자 No.	병리성적
1	LSIL^*
2	LSIL
3	LSIL
4	HSIL^**
5	LSIL
6	HSIL
7	HSIL
8	SCC^***
9	SCC
10	HSIL
11	Squamous^****
12	Squamous
13	Squamous
14	Squamous
15	Squamous

^*: 저급 상피 이형성증 (Low-grade SIL);

^**: 고급 상피 이형성증 (High-grade SIL);

^***: 상피내암(Squamous intraepithelial lesion)

^****: 편평 세포

검진 결과, 표 5에 도시된 것과 같이, 피검자 1, 2, 3 및 5는 저급 상피 이형성증(Low-grade SIL), 피검자 4, 6, 7 및 10은 고급 상피 이형성증(High-grade SIL), 피검자 8 및 9는 상피내암(squamous intraepithelial lesion, SIL) 환자로 진단되었다. 나머지 피검자(피검자 11 내지 피검자 15)는 본 실시예에 따른 자궁경부암 세포진 도말 검사에서 정상 세포를 가지는 자궁경부암 비관련 환자로 진단되었다.

본 실시예에서는 상기 임상시료를 대상으로 HPV DNA의 존재 여부를 선별(screening)하였다. 이를 위해서 HPV DNA와 상보적으로 결합하는 본 발명의 DNA 칩을 사용하였으며 그 결과는 하기 표 5와 도 3a 내지 도 3o에 표시하였다.

피검자 No.	DNA 검사
1	양성
2	양성
3	양성
4	양성
5	양성
6	양성
7	양성
8	양성
9	양성
10	양성
11	음성
12	음성
13	음성
14	음성
15	음성

본 실시예에 따른 HPV DNA 검사에서 상기 실시예에서의 검진 결과 자궁경부암과 관련 있는 피검자(피검자 1 내지 피검자 10)로부터 얻은 시료에서는 모두 HPV DNA가 선별되었으며, 자궁경부암과 관련이 없는 피검자(피검자 11 내지 피검자 15)로부터 얻은 시료에서는 모두 HPV DNA가 선별되지 않았다.

상기에서 본 발명의 바람직한 실시예를 기술하였으나, 이는 어디까지나 예시일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 분야의 당업자라면 본 발명의 정신을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형과 변경이 가능하다는 점은 자명하다. 그러나, 그와 같은 변형과 변경은 모두 본 발명의 권리범위에 속한다는 사실은 첨부하는 청구의 범위를 통하여 보다 분명해질 것이다.

<110> daiogene <120> DNA chip for determining genomic types of human papillomavirus, kit comprising the same and determinig method of genomic types of human papillomavirus using the same <160> 90 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-16 probe <400> 1 atcatgcatg gagatacacc tacattgcat g 31 <210> 2 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-18 probe <400> 2 caacattgca agacattgta ttgcatttag ag 32 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-26 probe <400> 3 cagtggaaag ggttgtgtac aaattgttgg 30 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-30 probe <400> 4 cgtccactga gacagcagta taatcatgc 29 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-31 probe <400> 5 ctgacctcca ctgttatgag caattaccc 29 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-33 probe <400> 6 acgtagagaa actgcactgt gacgtgtaaa 30 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-35 probe <400> 7 tgtattacat gtcaaaaacc gctgtgtcca gtt 33 <210> 8 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-39 probe <400> 8 aagagaaacc caagtataac atcagatatg cg 32 <210> 9 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-45 probe <400> 9 tgcatttgga acctcagaat gaattagatc ct 32 <210> 10 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-51 probe <400> 10 atgtaccaca attaaaagat gtagtattgc at 32 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-52 probe <400> 11 accccgacct gtgacccaag tgtaac 26 <210> 12 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-53 probe <400> 12 cacttccaca atatattata gaacttatac ca 32 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-56 probe <400> 13 ctgcaagacg ttgtattaga actaacacct 30 <210> 14 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-58 probe <400> 14 ccatgagagg aaacaaccca acgctaag 28 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-59 probe <400> 15 aacaatgcat ggaccaaaag caacactttg 30 <210> 16 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-66 probe <400> 16 taccaacgtt gcaagaggtt atattagaac ttg 33 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-67 probe <400> 17 agtgtgttgg agacctcaac gaacg 25 <210> 18 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-68 probe <400> 18 tgcaatgaaa tagagccggt cgaccttg 28 <210> 19 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-70 probe <400> 19 cggtcgacct tgtatgtcac gagcaattag a 31 <210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-73 probe <400> 20 aggcgatata gacaatcagt atatggcact 30 <210> 21 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-6 probe <400> 21 aggtaaaaca tatactaacc aaggcgcgg 29 <210> 22 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-11 probe <400> 22 ttacctgtgt cacaagccgt tgtgtgaaa 29 <210> 23 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-34 probe <400> 23 tagaagatat aaccaatcag tgtatggacg g 31 <210> 24 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-40 probe <400> 24 ctgcaccctg aacctgtatg tctaaact 28 <210> 25 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-43 probe <400> 25 catggaaaaa agccgacgat cagagactat g 31 <210> 26 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-44 probe <400> 26 gaaacaaata agtcaattct ggacgtgctg 30 <210> 27 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-54 probe <400> 27 acacaggcat aagggtactg caggaactg 29 <210> 28 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-55 probe <400> 28 cgttcggctg gttgtgcagt gcacaggaac 30 <210> 29 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-61 probe <400> 29 aaccataaag gacatagtcc ttgaagagcg 30 <210> 30 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH probe <400> 30 ctattaaagg ttcctttgtt ccctaagtcc aact 34 <210> 31 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP-16 forward primer <400> 31 gagcgaccca gaaagttacc acagttatgc acagag 36 <210> 32 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP-16 reverse primer <400> 32 gcacacaatt cctagtgtgc ccattaacag gtc 33 <210> 33 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP-18 forward primer <400> 33 gaggatccaa cacggcgacc ctacaagcta c 31 <210> 34 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP-18 reverse primer <400> 34 tgctgagctt tctactacta gctcaattct ggc 33 <210> 35 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP-26 forward primer <400> 35 gagctatgtg aaagcttgaa tactactttg c 31 <210> 36 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP-26 reverse primer <400> 36 gtgcagcaca ctgatggcac acc 23 <210> 37 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP-30 forward primer <400> 37 caccatcttt gtgaggtaca agaaacatcg ttgc 34 <210> 38 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP-30 reverse primer <400> 38 gcacacaggg gacacactag ctccag 26 <210> 39 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP-31 forward primer <400> 39 cctgcagaaa gacctcggaa attgcatgaa c 31 <210> 40 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP-31 reverse primer <400> 40 ggcacacgat tccaaatgag ccca 24 <210> 41 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP-33 forward primer <400> 41 gcagtaaggt actgcacgac tatgtttcaa gacactg 37 <210> 42 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP-33 reverse primer <400> 42 taggtcactt gctgtactgt tgacacataa acgaactg 38 <210> 43 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP-35 forward primer <400> 43 ttacaaactg catgatttgt gcaacgaggt agaag 35 <210> 44 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP-35 reverse primer <400> 44 gaacagccgg ggcacactat tccaaatg 28 <210> 45 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP-39 forward primer <400> 45 tagcctgtgt ctattgcaga cgaccac 27 <210> 46 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP-39 reverse primer <400> 46 gttgcacacc acggacacac aaatcctagt g 31 <210> 47 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP-45 forward primer <400> 47 tacaagacgt atctattgcc tgtgtatatt gcaaagc 37 <210> 48 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP-45 reverse primer <400> 48 acggacacac aaaggacaag gtgctc 26 <210> 49 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP-51 forward primer <400> 49 caagagggaa agaccacgaa cgctgcatg 29 <210> 50 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP-51 reverse primer <400> 50 taacatctgc tgtacaacgc gaagggtgtc 30 <210> 51 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP-52 forward primer <400> 51 cggccatgtt tgaggatcca gcaacac 27 <210> 52 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP-52 reverse primer <400> 52 caacagcatt tgctgtagag tacgaaggtc cgtc 34 <210> 53 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP-53 forward primer <400> 53 gcactgtgta caacacccag gacatcc 27 <210> 54 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP-53 reverse primer <400> 54 ctgcaccaac gactcacacc tacaacactg 30 <210> 55 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP-56 forward primer <400> 55 ccacaattca acaatccaca ggaacgtcca cg 32 <210> 56 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP-56 reverse primer <400> 56 caggtcctct ttggtactct gaatgtccaa ctg 33 <210> 57 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP-58 forward primer <400> 57 gatttgtgtc aggcgttgga gacatctgtg catg 34 <210> 58 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP-58 reverse primer <400> 58 gtgcacagct agggcacaca atggtacatg 30 <210> 59 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP-59 forward primer <400> 59 atttgagcac aacattgaat attcctctgc atgatattcg c 41 <210> 60 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP-59 reverse primer <400> 60 cagctgctgt aaggctcgca atccgtc 27 <210> 61 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP-66 forward primer <400> 61 ccatattcag caatacacag gaacgtccac gaagc 35 <210> 62 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP-66 reverse primer <400> 62 cgtagctcct ctttggtact ctgaatgtcc aactgc 36 <210> 63 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP-67 forward primer <400> 63 cagacgaaaa accacgcaac ctgcacgaat tgtg 34 <210> 64 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP-67 reverse primer <400> 64 ctattcctag tgtgttcata agcatctgct ggattgttcg g 41 <210> 65 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP-68 forward primer <400> 65 cattggacac cacattgcat gacgttacaa tagactg 37 <210> 66 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP-68 reverse primer <400> 66 gtccataaac agcagttcta cgttccgcag g 31 <210> 67 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP-70 forward primer <400> 67 tagactgtgt ctattgtaaa acacagctac agcaaac 37 <210> 68 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP-70 reverse primer <400> 68 gatgcacacc agggacacac aaatgacagt g 31 <210> 69 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP-73 forward primer <400> 69 gtttcccaat tcagaagaac gaccatacaa gctac 35 <210> 70 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP-73 reverse primer <400> 70 ggcacacaat acctagtgta cccataagca actc 34 <210> 71 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP-6 forward primer <400> 71 ggcattatgg aaagtgcaaa tgcctccacg tctgcaac 38 <210> 72 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP-6 reverse primer <400> 72 ggtcttcggt gcgcagatgg gacacactat gtttag 36 <210> 73 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP-11 forward primer <400> 73 gcagacgagg cattatggaa agtaaagatg cctccacg 38 <210> 74 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP-11 reverse primer <400> 74 gtgtgcccag caaaaggtct tgtagttgtc tgatgtctc 39 <210> 75 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP-34 forward primer <400> 75 caatcctgag gaacggccat acaagctacc agc 33 <210> 76 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP-34 reverse primer <400> 76 cacccataag caggtcttct aacactaata ggtcagcg 38 <210> 77 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP-40 forward primer <400> 77 ccaggaccct gtatgaactg tgtgaccagt gc 32 <210> 78 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP-40 reverse primer <400> 78 cactctgtag ctgcacagtt ggggcacact atatgtaatg tg 42 <210> 79 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP-43 forward primer <400> 79 gactgcacgt agctgctccc aaaacg 26 <210> 80 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP-43 reverse primer <400> 80 cccaacagca ggtcttctag cttcttgatg 30 <210> 81 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP-44 forward primer <400> 81 gcaagcgggg cataatggaa agtgcaaatg c 31 <210> 82 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP-44 reverse primer <400> 82 cacacaggac acaatatatc cagtgaaccc agcag 35 <210> 83 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP-54 forward primer <400> 83 ccgaaaccgg tacatataaa agcggttgta gaaaacag 38 <210> 84 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP-54 reverse primer <400> 84 gtcgtgaagc acaggtggga cacactattt gcagtgc 37 <210> 85 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP-55 forward primer <400> 85 gcaagcgggg cataatggaa agtgcaaatg c 31 <210> 86 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP-55 reverse primer <400> 86 caggacacag tatttccagt gaacccagca gaagcgtatg 40 <210> 87 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP-61 forward primer <400> 87 cgtagggtca gcaaagcaca ctcatctatg ggaccg 36 <210> 88 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP-61 reverse primer <400> 88 cagccaggac acactatgga caagtcgccc agcag 35 <210> 89 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer <400> 89 cccacaagta tcactaagct cgctttcttg ctgtcc 36 <210> 90 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse primer <400> 90 gtccataaac agcagttcta cgttccgcag g 31

Claims

하기의 HPV 유형 분석용 올리고뉴클레오티드 세트가 지지체 상에 집적된 HPV 유형 분석용 DNA 칩:
서열번호 1 내지 서열번호 29의 염기서열 또는 이들의 상보적인 염기서열로 이루어지고, 상기 염기서열 중에서 서열번호 1 및 이의 상보적인 염기서열은 HPV(human papilloma virus)-16, 서열번호 2 및 이의 상보적인 염기서열은 HPV-18, 서열번호 3 및 이의 상보적인 염기서열은 HPV-26, 서열번호 4 및 이의 상보적인 염기서열은 HPV-30, 서열번호 5 및 이의 상보적인 염기서열은 HPV-31, 서열번호 6 및 이의 상보적인 염기서열은 HPV-33, 서열번호 7 및 이의 상보적인 염기서열은 HPV-35, 서열번호 8 및 이의 상보적인 염기서열은 HPV-39, 서열번호 9 및 이의 상보적인 염기서열은 HPV-45, 서열번호 10 및 이의 상보적인 염기서열은 HPV-51, 서열번호 11 및 이의 상보적인 염기서열은 HPV-52, 서열번호 12 및 이의 상보적인 염기서열은 HPV-53, 서열번호 13 및 이의 상보적인 염기서열은 HPV-56, 서열번호 14 및 이의 상보적인 염기서열은 HPV-58, 서열번호 15 및 이의 상보적인 염기서열은 HPV-59, 서열번호 16 및 이의 상보적인 염기서열은 HPV-66, 서열번호 17 및 이의 상보적인 염기서열은 HPV-67, 서열번호 18 및 이의 상보적인 염기서열은 HPV-68, 서열번호 19 및 이의 상보적인 염기서열은 HPV-70, 서열번호 20 및 이의 상보적인 염기서열은 HPV-73, 서열번호 21 및 이의 상보적인 염기서열은 HPV-6, 서열번호 22 및 이의 상보적인 염기서열은 HPV-11, 서열번호 23 및 이의 상보적인 염기서열은 HPV-34, 서열번호 24 및 이의 상보적인 염기서열은 HPV-40, 서열번호 25 및 이의 상보적인 염기서열은 HPV-43, 서열번호 26 및 이의 상보적인 염기서열은 HPV-44, 서열번호 27 및 이의 상보적인 염기서열은 HPV-54, 서열번호 28 및 이의 상보적인 염기서열은 HPV-55 및 서열번호 29 및 이의 상보적인 염기서열은 HPV-61의 E6 및 E7 유전자 부위와 상보적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 HPV 유형 분석용 올리고뉴클레오티드 세트.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
다음의 단계를 포함하는 HPV(human papilloma virus)의 유전자형 분석방법:
(a) 검체로부터 HPV 유형별 E6 및 E7 유전자를 다중(multiplex) PCR 방법에 의해 증폭하되, 상기 증폭에 사용되는 프라이머 세트는 서열번호 31 내지 서열번호 88의 염기서열로 이루어지고, 상기 염기서열 중에서 서열번호 31 및 서열번호 32는 HPV(human papilloma virus)-16, 서열번호 33 및 서열번호 34는 HPV-18, 서열번호 35 및 서열번호 36은 HPV-26, 서열번호 37 및 서열번호 38은 HPV-30, 서열번호 39 및 서열번호 40은 HPV-31, 서열번호 41 및 서열번호 42는 HPV-33, 서열번호 43 및 서열번호 44는 HPV-35, 서열번호 45 및 서열번호 46은 HPV-39, 서열번호 47 및 서열번호 48은 HPV-45, 서열번호 49 및 서열번호 50은 HPV-51, 서열번호 51 및 서열번호 52는 HPV-52, 서열번호 53 및 서열번호 54는 HPV-53, 서열번호 55 및 서열번호 56은 HPV-56, 서열번호 57 및 서열번호 58은 HPV-58, 서열번호 59 및 서열번호 60은 HPV-59, 서열번호 61 및 서열번호 62는 HPV-66, 서열번호 63 및 서열번호 64는 HPV-67, 서열번호 65 및 서열번호 66은 HPV-68, 서열번호 67 및 서열번호 68은 HPV-70, 서열번호 69 및 서열번호 70은 HPV-73, 서열번호 71 및 서열번호 72는 HPV-6, 서열번호 73 및 서열번호 74는 HPV-11, 서열번호 75 및 서열번호 76은 HPV-34, 서열번호 77 및 서열번호 78은 HPV-40, 서열번호 79 및 서열번호 80은 HPV-43, 서열번호 81 및 서열번호 82는 HPV-44, 서열번호 83 및 서열번호 84는 HPV-54, 서열번호 85 및 서열번호 86은 HPV-55 및 서열번호 87 및 서열번호 88은 HPV-61의 E6 및 E7 유전자를 특이적으로 증폭하는 것인 단계;
(b) 제 1항에 기재된 DNA 칩에 상기 증폭된 PCR 산물을 혼성화하는 단계; 및
(c) 상기 혼성화에 의해 얻어진 혼성화물을 검출하는 단계.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제