KR100988755B1 - 네스티드 рсｒ을 이용한 ｈｐｖ ｌ1 유전자 검출방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 여성 자궁경부암의 원인병원체인 인유두종 바이러스(HPV : Human papilloma virus) 검출을 위한 네스티드 PCR 방법에 관한 것이다. 상세하게는 1차 PCR 전위 프라이머로서 서열번호: 1로 표시되는 염기서열 및 역위 프라이머로서 서열번호: 2로 표시되는 염기서열 및 2차 PCR을 위한 전위 프라이머로서 서열번호: 3으로 표시되는 염기서열 및 역위 프라이머로서 서열번호: 4로 표시되는 염기서열을 갖는 프라이머 세트을 이용하여 HPV L1 유전자를 검출하는 방법이다. 본 발명에 따른 네스티드 PCR 방법은 종래의 네스티드 PCR보다도 양성 진단률이 효과적이다. 또한, 민감도가 높고, 특이적이며 신속한 처리 과정(high throughput processing)을 갖는다.

HPV, 자궁경부암(cervical cancer), 네스티드 PCR

Description

네스티드 РСＲ을 이용한 ＨＰＶ Ｌ1 유전자 검출방법 {Method of detection for HPV L1 gene using nested PCR assay}

본 발명은 네스티드 PCR을 이용하여 인유두종 바이러스(HPV)의 L1 유전자를 효과적으로 검출하는 방법에 관한 것이다.

인유두종 바이러스(Human Papillomavirus, HPV)는 약 8 kb의 이중나선 원형의 유전자를 가진 직경 55 nm의 DNA 바이러스이다. HPV는 사람의 편평상피를 침범하는데 자궁경부암 환자의 90% 이상에서 HPV가 발견되었고, 자궁경부암의 상피 이형증 및 자궁경부암의 주된 발생 원인으로 알려졌다[참고 문헌: Gissmann L, Boshart M, Durst M, Ikenberg H, Wagner D,zur Hausen H. Presence of human papillomavirus in genital tumors. J Invest Dermatol 1984;83 (1 suppl):26S-8S. Lorincz AT, Reid R, Jenson AB, Greenberg MD, Lancaster W, Kurman RJ. Human papillomavirus infection of the cervix: relative risk association of 15 common anogenital types. Obstet Gynecol 1992;79:328-37.1,2].

HPV의 게놈에는 숙주 세포를 감염시킨 후 초기과정에 관여하는 E1 ~ E7 유전자 및 후기 과정에 관여하는 L1 및 L2 유전자가 존재한다. E1, E2, E4, E5, E6 및 E7 유전자는 자신의 DNA 복제 및 세포의 형질 전환에 적용되고, L1 및 L2 유전자는 오직 분화하는 상피세포에서만 발현하여 캡시드 단백질을 만든다[참고 문헌: Hubbard RA. Human papillomavirus testing methods. Arch Pathol Lab Med. 2003 Aug;127(8):940-5. Review.]. 특히 2.5 kb의 후기 유전자는 바이러스 주외피 단백질(L1)과 부외피 단백질(L2)의 합성을 담당하는 DNA와 이들의 전사와 번역 기능을 조절하는 비발현 부분(non-coding region)인 1 kb 크기의 LCR(long control region)로 이루어져 있다.

ORF(Open reading frame)의 뉴클레오티드 서열이 10%이상 다르면 새로운 유형(genotype)으로 정의되고, 2%이상 10%미만 다르면 아형(subtype)으로, 2%미만이 다른 경우에는 변이체(variant)로 정의된다. 현재 HPV의 ORF 서열에 따른 HPV 아형이 약 200여종 알려져 있다[참고문헌: Kaliterna V, Andelinovi┤ S, Pejkovi┤ L, Hofman ID. Human papillomavirus DNA typing in the cervical specimens among women of Split and Dalmatian County. Coll Antropol. 2007 Apr;31 Suppl 279-82.] 이 가운데 15개 아형이 자궁경부암 발생과 연관성이 있다고 보고되고 있다[참고문헌:　Munoz N, Bosch FX, de Sanjose S, Herrero R, Castellsague X, Shah KV, Snijders PJ, Meijer CJ; International Agency for Research on Cancer Multicenter Cervical Cancer Study Group. Epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with cervical cancer.N Engl J Med. 2003 Feb 6;348(6):518-27]. 자궁경부암은 이들 중 고위험성 HPV 바이러스를 대표하는 HPV 16형 및 18형이 전체의 70 ~ 80%를 차지하고, 나머지 20%가 HPV 31, 33, 35, 52 및 58형 등의 다양한 아형에 의하여 발생되며, 이러한 아형의 분류는 지리적, 인종적 요인에 의해 많은 차이를 보인다.[참고 문헌: Hilldesheim A, Gravitt P, Schiffman MH, et al. Determinants of genital papillomavirus infection in lowincome women in Washington, D.C. Sex Trans Dis 1993; 20: 279-285. Labropoulou V, Diakomanolis E. Type-specific prevalence of genital human papillomaviruses in benign,premalignant, and malignant biopsies in patients from Greece. Sex Transm Dis 1997; 24(8): 469-474. Becker TM, Wheeler CM, McGough NS, et al. Sexually transmitted diseases and other risk facotrs forcervical dysplasia among southwestern Hispanic and non-Hispanic white women. JAMA 1994; 271: 1181-1187.]. 또한, 한국인 고위험 여성의 경우 HPV 16, 18, 35, 51, 52 및 58형이 전체의 80%를 차지하고, 나머지 20%는 31, 33, 39, 56, 59, 68 및 69형이 차지하고 있다.[참고문헌 : Choi BS, Kim O, Park MS, Kim KS, Jeong JK, Lee JS. Genital human papillomavirus genotyping by HPV oligonucleotide microarray in Korean commercial sex workers. J Med Virol. 2003 Nov;71(3):440-5.]

자궁경부암은 전 세계적으로 두 번째로 흔한 여성암으로서, 이로 인한 사망률은 60%에 이른다. 자궁경부암의 원인인자가 밝혀지면서 효과적인 진단 및 치료 방안들이 개발되고 있는데, 1940년대 Papanicolaou(Pap) smear에 의해 개발되어 표준 검사법으로 시행되어 온 세포진 검사와 보조적인 방법으로 1994년 개발된 HPV DNA 검사가 병행되면서 자궁경부암 전 단계에서의 진단 및 치료가 이루어짐으로써 자궁경부 침윤암 발생은 현저히 감소되었다[참고 문헌: Dillner J, Lehtinen M, Bjorge, et al. Prospective seroe pidemiologic study of human papillomavirus infection as a risk factor for invasive cervical cancer. J Natl Cancer Inst 1997; 3: 89(17): 1293-1299. Walboomers JM. Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide. J Pathol 1999; 189(1): 12-19.].

최근에는 다수의 HPV 유형의 감염 여부를 검출함에 있어서 특정 염기서열의 DNA 단편을 신속하고 간단하게 증폭시킬 수 있는 PCR 진단법이 보편화되면서 지금까지 밝혀진 모든 HPV를 포괄적으로 검출하고자 하는 노력이 활발하게 시도되고 있다. PCR 진단법은 목적 병원체의 핵산 염기서열에 특이적으로 결합하는 상보적 핵산(올리고머 프라이머)을 가하여 온도에 따른 변성(denaturation), 재결합(annealing) 및 중합(polymerization) 과정을 반복하여 미량의 병원체 핵산을 증폭시켜 그 존부를 검출할 수 있는 기술로서(미합중국 특허 제 4683195호 및 제 4683202호) HPV 감염 여부를 진단하기 위하여 쓰이는 대표적인 기술 중 하나이다. 이러한 PCR 진단법은 임상 진단의 실용적 측면에서 Pap smear의 세포진 검사와 달리 객관적인 대규모 검사가 가능하며, 측정원리상 세포검사에 비해 비용, 실험 절차, 검출 감도 및 특이도 등에서 상대적 우위를 갖는 것으로 보고되고 있다. 이러한 사실에 비추어 볼 때 HPV PCR 검진은 자궁경부암과 전구 병변의 포괄적 일차 선별을 위한 집단 탐색 프로그램을 위한 하나의 매력적인 방법으로 그 활용 여지가 높을 것으로 기대하고 있다. 그러나 아직까지 HPV 감염 여부를 광범위하게 1차적 으로 검색하기에 적합한 공통 프라이머(General Primer)가 부족하여 이의 적극적인 임상적 적용에는 많은 어려움을 겪고 있는 실정이다. 현재 전 세계적으로 임상에서 널리 쓰이고 있는 대표적인 공통 프라이머로는 크게 북아메리카와 남아메리카 그리고 아시아에서 주로 사용되고 있는 MY09/11 프라이머 세트와 유럽지역에서 주로 사용되고 있는 GP5+/6+ 프라이머 세트 그리고 SPF1/SPF2 프라이머 세트로 구분할 수 있다. 이 외에 최근에 새롭게 개발되어 사용되고 있는 FAP59/FAP64와 PGMYO9/11 등과 같은 프라이머 세트가 현재 널리 사용되어지고 있다. 그러나 자궁경부암의 일차 선별을 위한 방법으로서 현존하는 PCR 프라이머 세트는 다수의 HPV 유형 수에 비하면 제한된 수의 유전형 검출에만 국한되어 있고 HPV 유형에 따라 민감도가 떨어지는 등 많은 문제점을 내포하고 있어 본래 공통 프라이머가 지니고 있는 가치와 필요성이 있음에도 불구하고 실제 임상 목적에서의 활용에 큰 제약을 받고 있는 게 현실이다. [참고문헌: Husnjak K, Grce M, Magdic L, Pavelic K. Comparison of five different polymerase chain reaction methods for detection of human papillomavirus in cervical cell specimens.J Virol Methods. 2000 Aug;88(2):125-34.]

따라서 수십 가지 유형의 종양원성 HPV DNA를 동시에 증폭시키고, 검출할 수 있고, HPV 유형에 따른 민감도를 개선시킴으로써 자궁경부암을 조기 선별시킬 수 있는 HPV 공통 프라이머를 개발할 필요성이 커지고 있다. 이에 의해 본 발명자들은 HPV L1 유전자의 신속·정확한 검출을 위하여 네스티드 PCR에 근간을 둔 고도로 민감하고 특이한 HPV DNA PCR방법을 개발하여 진단함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 인유두종 바이러스(HPV) 유전자를 동정하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 HPV에 특이적으로 반응하는 검출용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 HPV 유전자를 동정하기 위한 키트를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, (ⅰ) 임상 샘플로부터 DNA를 추출하는 단계; (ⅱ) 단계 ⅰ)에서 수득한 핵산을 서열번호: 1 과 서열번호: 2로 표시되는 염기 서열을 프라이머로 사용하는 1차 PCR을 수행하는 단계; (ⅲ) 단계 ⅱ)의 PCR 산물로부터 서열번호: 3 과 서열변호: 4로 표시되는 염기 서열을 프라이머로 사용하는 2차 PCR을 수행하는 단계; 및 (ⅳ) 단계 ⅲ)의 PCR 산물로부터 HPV의 L1 유전자를 확인하는 단계를 제공한다.

또한 본 발명은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5 및 6(이상, HPV L1 유전자 특이염기서열)의 프라이머 염기서열;, 이들과 상동인 염기서열, 또는 이들과 엄격한 혼성화 조건에서 특이적으로 혼성화되는 염기서열을 제공한다.

또한 본 발명은 HPV L1 유전자 검출방법에서, 1차 PCR 전위 프라이머로서 서 열번호: 1로 표시되는 염기 서열, 역위 프라이머로서 서열번호: 2로 표시되는 염기 서열; 2차 PCR을 위한 전위 프라이머로서 서열번호 : 3으로 표시되는 염기 서열; 역위 프라이머로서 서열번호 : 4로 표시되는 염기 서열을 제공한다.

또한 본 발명은 네스티드 PCR을 위한 서열번호: 3 내지 서열번호:　4의 프라이머 세트를 제공한다.

또한 본 발명은 HPV의 감염 여부 확인을 위한 HPV L1 유전자 검출방법에 사용되는 서열번호 3 및 4의 프라이머 염기서열, 이들과 상동인 염기서열, 또는 이들과 엄격한 혼성화 조건에서 특이적으로 혼성화되는 염기서열을 갖는 HPV L1 유전자의 특이적 프라이머를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 프라이머 서열을 이용한 HPV L1 유전자 검출방법을 제공한다.

또한 본 발명은 HPV L1 유전자를 네스티드 PCR에 의해 검출하기 위한 프라이머 (서열번호: 3 내지 서열번호: 4)를 포함하는 HPV의 L1 유전자 검출용 키트를 제공한다.

상기 프라이머는 인유두종 바이러스의 유형 분류의 기준이 되는 L1 영역의 DNA 서열과 특이적으로 결합할 수 있는 것을 특징으로 한다.

상기 네스티드 PCR은 1차 PCR 수행 후 그 산물을 주형DNA로 사용하여 증폭 범위 안쪽에 위치하는 프라이머 쌍을 이용하여 2차 PCR을 수행함을 특징으로 한다.

L1 유전자를 증폭하기 위해 기존의 MY09/11 프라이머 및 본 발명자들이 독립적으로 만든 프라이머를 사용하여 네스티드 PCR 진단법을 고안하였다. HPV의 양성 기준으로 CasKi, SiHa 세포주를 사용하였으며, HPV의 음성 기준으로 C33A 세포주를 사용하였다. 또한 임상적 평가를 위해 2006/2007 협력병원으로부터 수집한 검체를 대상으로 HPV MY09/11과 L1 151을 이용한 DNA 네스티드 PCR을 수행하였다. 임상적 평가를 위하여 현재 널리 사용되고 있는 HPV MY09/11과 GP5+/6+를 이용한 DNA PCR과 HPV DNA 칩 검사상 HPV 감염된 환자 49명, HPV 비감염자 22명을 대상검체로 선정하였으며, 교차반응을 평가하기 위하여 다른 바이러스(HIV)에 감염된 환자 5명과 바이러스 음성인 대상자 8명을 추가하였다. 검출 한계는 25 바이러스 카피 수였으며, 다른 바이러스와 교차 반응은 없었다. 이와 같이, 본 발명에 따른 네스티드 PCR은 HPV 감염에 대해서 민감하고 특이적으로 진단할 수 있는 것으로 확인되었다.

양성 기준을 결정하기 위해, 본 발명자들은 세포에서 추출한 DNA로 3차례 반복 테스트하고, 가능한 위(false)양성을 배제하기 위해 3개의 독립된 분석결과 양성인 것을 양성으로 간주하였다.

또한, 시험과정에서의 오염을 방지하기 위하여 PCR 프리믹스, 대조 플라스미드 DNA 및 임상샘플 처리를 별도의 장소에서 수행한 다음 네스티드 PCR을 수행하였다. HPV 감염으로 진단된 환자로부터 수득한 49개의 검체로 수행한 분석의 임상적 평가는 42(85.7%)개의 검체에서 HPV 양성 결과를 보였다. 반면 종래의 네스티드 PCR과 HPV DNA 칩 검사 결과 음성 검체 중 추가적으로 1명의 환자가 양성으로 진단되었다. (표 2 참조)

상기 결과는 본 발명에 따른 네스티드 PCR이 종래의 MY 09/11 및 GP5+/6+를 이용한 네스티드 PCR방법보다 양성 진단률이 더욱 효과적임을 알 수 있었고, 감염 된 환자에서 검출된 HPV 진단을 모두 고려할 때, 종래의 PCR 분석보다 더 감도가 높고, 특이적이며 신속한 처리 과정 (high throughput processing)을 갖는 검출 방법임을 알 수 있었다. 이에 의해 본 발명자들은 HPV 감염 검체의 진단에 유용한 민감하고 특이적인 네스티드 PCR 진단을 최적화함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 네스티드 PCR을 이용한 유전자 검출방법에 따르면, 양성 진단률이 종래 기술보다 더욱 효과적이다. 또한, 감염된 환자에서 검출된 HPV 진단을 모두 고려할 때, 종래의 PCR 분석보다 더 감도가 높고, 특이적이며 신속한 처리 과정 (high throughput processing)을 갖는 강력한 검출 방법이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1 : 샘플준비

HPV 양성 및 음성의 기준샘플로써 HPV에 감염된 세포인 Caski(ATCC No. CRL-1550)와 SiHa cell(ATCC No. HTB-35)을 양성 기준샘플로, HPV에 비감염된 세포인 C33A cell(ATCC No. HTB-31)을 음성기준 샘플로 사용하였다. 각각의 세포에서 추출한 DNA를 이용하여 네스티드 PCR을 수행하였으며, 이는 HPV의 감염에 대한 양성과 음성의 기준으로써 사용되었다.

HPV 감염성 샘플 채취는 2006년 1월부터 2007년 1월 사이에 한양대 산부인과에서 HPV PCR 양성으로 판정된 검체 중 HPV 칩의 진단 결과 HPV 감염으로 판명된 검체로 수행하였다. 샘플 채취는 환자군 본인의 동의 하에 수행했다. 샘플 채취 후 24시간 이내에, 각각 200ul의 샘플로부터 QIAamp 혈액 미니 키트(Blood Mini Kit) (Qiagen사, 독일)를 사용하여 DNA를 추출하고 -70℃에서 보관하였다.

실시예 2 : 프라이머 및 프로브 설계 및 합성

프라이머 및 프로브 디자인을 위해, HPV 전체 서열을 인두유종 바이러스 (HPV : Human papillomavirus-GeneBank Accession No, NC_001526)로부터 입수했다. HPV L1 유전자는 프라이머 익스프레스 소프트웨어(Primer Express software version 2.0) (어플라이드 바이오시스템즈사, Foster City, CA, USA)를 사용하여 네스티드 PCR에 적용할 수 있는 표적 부위를 검색하였다. 어플라이드 바이오시스템즈(Foster City, CA, 미국)사에 의해 주요 비특이적 상동성이 없고, 이중 또는 헤어핀 형성 가능성이 최소인 최적의 프라이머 세트가 합성되었다. (도 1 및 표 1)

HPV-16 L1 유전자에 대한 네스티드 PCR에 사용된 프라이머
PCR	프라이머/프로브	서열(5'-3')	위치*	서열번호
MY 09/11	전위	CGT CCM ARR GGA WAC TGA TC	7015-7034	1
MY 09/11	역위	GCM CAG GGW CAT AAY AAT GG	6583-6602	2
L1 151	전위	TTT TCA ACT GTG CAA AAT AAC CTT AAC T	6713-6737	3
L1 151	역위	CAA TTG CCT GGG TTA CAA ACC T	6841-6863	4
GD 5+/6+	전위	TTT GTT ACT GTG GTA GAT ACT AC	6624-6649	5
GD 5+/6+	역위	GAA AAA TAA ACT GTA AAT CAT ATT C	6719-6746	6
* 뉴클레오티드 위치는 Human papillomavirus(GeneBank Accession No.NC_001526)에 따라 지정되었다.

실시예 3 : 네스티드 PCR 에 의한 HPV L1 유전자 검출방법

HPV 양성 DNA 표준은 HPV에 감염된 세포인 Caski와 SiHa에서 추출한 DNA를 사용하였으며, HPV 음성 DNA 표준은 HPV에 비감염된 세포인 C33A에서 추출한 DNA를 사용하였다. 각각의 세포에서 DNA 추출은 QIamp midi prep kit (QIAGEN, 독일) Qubit^TM 형광계(인비트로젠, 미국)를 사용하여 정량했다. 정량을 2회 수행하고, 평균 정량을 표준화 하였다(100 ug/㎕). 추출한 DNA는 -70℃에서 저장했다.

1㎕ HPV 양성 표준 DNA로써 Caski와 SiHa에서 추출한 DNA, 음성 표준 DNA로써 C33A에서 추출한 DNA와 함께 환자 군에서 추출한 DNA를 이용하여 1차 프라이머 세트 : MY 09 (5'-CGT CCM ARR GGA WAC TGA TC-3', 서열번호: 1) 및 MY 11 (5'- GCM CAG GGW CAT AAY AAT GG - 3', 서열번호: 2). 1 ㎕ DNA 추출물, 5 ㎕ 10x PCR 완충액, 1 ㎕ dNTP 혼합액 (각 dNTP의 최종농도는 400 μM), 1 ㎕ Taq (Roche, Mannheim, 독일), 각각의 프라이머 1 ㎕ (10 pM), 및 뉴클리아제-비함유 증류수를 함유하는 50 ㎕ 반응 용적으로 각각의 샘플에 대한 PCR 분석을 수행했다. PCR은 95℃에서 10 분간, 20 싸이클 증폭 (94℃에서 30초, 45℃에서 30초, 72℃에서 30초)하여 수행했으며, 최종 연장 단계는 GeneAmp PCR system 9700 thermal cycler (어플라이드 시스템즈사, Foster City, CA, USA)를 사용하고 72℃에서 10분간 수행했다.

2차 프라이머 세트 : L1 유전자 (5'-TTT TCA ACT GTG CAA AAT AAC CTT AAC T-3', 서열번호: 3) 및 L1 유전자 (5'- CAA TTG CCT GGG TTA CAA ACC T- 3', 서열번호: 4) 각각의 1차 PCR 결과물 1 ㎕ DNA 추출물, 5 ㎕ 10x PCR 완충액, 1 ㎕ dNTP 혼합액 (각 dNTP의 최종농도는 400 μM), 1 ㎕ Taq (Roche, Mannheim, 독일), 각각의 프라이머 1 ㎕ (10pM), 및 뉴클리아제-비함유 증류수를 함유하는 50 ㎕ 반응 용적으로 각각의 샘플에 대한 PCR 분석을 수행했다. PCR은 95℃에서 10 분간, 30 싸이클 증폭 (94℃에서 1분, 58℃에서 1분, 72℃에서 1분)하여 수행했으며, 최종 연장 단계는 GeneAmp PCR system 9700 thermal cycler (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하고 72℃에서 10분간 수행했다. PCR 생성물을 2% 아가로스젤에 전개하고 EtBr으로 염색하여 UV 광선 하에서 육안관찰 하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, HPV 양성의 세포 레인에서 밴드를 확인하였다. 도 2에서 레인 1은 NTC, 레인 2는 Human DNA, 레인 3은 C33A, 레인 4는 CasKi, 레인 5는 SiHa 세포이다.

상기 실시예 3의 2차 프라이머 세트(서열번호 3 내지 4)를 포함하는 프라이 머 혼합액을 만들어 다음과 같이 검출키트를 구성하였다.

* 키트 구성성분

프라이머 혼합액(서열번호 1 내지 4)

10x PCR 완충액(buffer)

dNTP 혼합액

Taq DNA 중합효소

EtBr 염색

실시예 4: 리얼타임(real-time) PCR을 이용한 증폭산물 검증

SiHa 세포는 HPV 바이러스를 세포당 1개 가지며, 인티그래이티드 형태(integrated form)로써 E2의 유전자는 포함하지 않고, E6의 유전자만 포함하는 세포이다. HPV 네스티드 PCR의 바이러스 검출 카피수를 측정하고자 혈액 미니 키트를 이용하여 SiHa 세포에서 DNA을 추출한 후 Qubit (inbitrogen)으로 DNA의 농도를 측정하고 -70℃에 저장하였다.

리얼타임 PCR의 신뢰성을 얻기위해 pHPV-16(ATCC No. 45113D) 전체 유전자에서 5x10⁶ ~ 5x10² 각각의 카피를 가진 DNA를 이용하여 리얼타임 PCR 표준 곡선을 확인하였고, 그 결과 slope값이 -3.40, R2값이 0.99로써 유의한 신뢰도 구간에 들어있는 것을 확인하였으며, 이 신뢰도를 바탕으로 SiHa 세포에서 추출한 DNA의 카피수를 확인하였다.

도 3은 총 카피수를 확인한 DNA를 이용하여 HPV-16 DNA 유전자 중 E2의 카피 수를 확인한 결과 SiHa 세포의 E2가 없는 특징을 확인하였고, 리얼타임 PCR로 분석하여 A)와 같은 표준 곡선(standard curve)을 확인하였으며, B)에 나타낸 바와 같이 slop값이 -3.40, R2 값이 0.99임을 알 수 있었다.

도 4는 총 카피수를 확인한 DNA를 이용하여 HPV-16 DNA 유전자중 E6의 카피수를 확인한 결과 SiHa 세포의 E6의 유전자만 갖는 특징을 확인하였으며, 리얼타임 PCR로 분석하여 A)와 같은 표준 곡선을 확인하였고, B)에 나타낸 바와 같이 slop값이 -3.45, R2 값이 0.99임을 알 수 있었다.

이 카피수를 이용하여 네스티드 PCR의 검출 범위를 확인하고자 DNA를 희석하고 1㎕ SiHa DNA를 이용하여 1차 프라이머 세트 : MY 09 (5'-CGT CCM ARR GGA WAC TGA TC-3', 서열번호: 1) 및 MY 11 (5'- GCM CAG GGW CAT AAY AAT GG - 3', 서열번호: 2). 1 ㎕ DNA 추출물, 5 ㎕ 10x PCR 완충액, 1 ㎕ dNTP 혼합액 (각 dNTP의 최종농도는 400 μM), 1 ㎕ Taq (Roche, Mannheim, 독일), 각각의 프라이머 1 ㎕ (10pM), 및 뉴클리아제-비함유 증류수를 함유하는 50 ㎕ 반응 용적으로 각각의 샘플에 대한 PCR 분석을 수행했다. PCR은 95℃에서 10 분간, 20 싸이클 증폭 (94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초)하여 수행했으며, 최종 연장 단계는 GeneAmp PCR system 9700 thermal cycler (어플라이드 시스템즈사, Foster City, CA, USA)를 사용하고 72℃에서 10분간 수행했다.

2차 프라이머 세트 : L1 유전자 (5'-TTT TCA ACT GTG CAA AAT AAC CTT AAC T-3', 서열번호: 3) 및 L1 유전자 (5'- CAA TTG CCT GGG TTA CAA ACC T- 3', 서열번호: 4) 각각의 1차 PCR 결과물 1 ㎕ DNA 추출물, 5 ㎕ 10x PCR 완충액, 1 ㎕ dNTP 혼합액 (각 dNTP의 최종농도는 400 μM), 1 ㎕ Taq (Roche, Mannheim, 독일), 각각의 프라이머 1 ㎕ (10pM), 및 뉴클리아제-비함유 증류수를 함유하는 50 ㎕ 반응 용적으로 각각의 샘플에 대한 PCR 분석을 수행했다. PCR은 95℃에서 10 분간, 30 싸이클 증폭 (94℃에서 1분, 58℃에서 1분, 72℃에서 1분)하여 수행했으며, 최종 연장 단계는 GeneAmp PCR system 9700 thermal cycler (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하고 72℃에서 10분간 수행했다. PCR 생성물을 2% 아가로스젤에 전개하고 EtBr으로 염색하여 UV 광선 하에서 육안관찰 하였다.)의 반응조건에서 네스티드 PCR을 수행하였다. 그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 최종 검출 바이러스 카피수는 25 카피로 확인하였다. 도 5는 리얼타임 PCR의 유효한 값인 표준 곡선을 바탕으로 확인한 HPV 양성세포에서 추출한 DNA를 이용하여 HPV 네스티드 PCR의 측정 범위를 확인하였다. 그 결과 HPV 네스티드 PCR 측정 바이러스 검출 범위는 25 카피임을 확인할 수 있었다. 도 5에서 레인 1은

, 레인 2는

, 레인 3은 , 레인 4는

, 레인 5는

, 레인 6은

, 레인 7은

, 레인 8은

, 레인 9는

, 레인 10은

, 레인 11은

, 레인 12는

, 레인 13은

, 레인 14는

, 레인 15는 NTC, 레인 16은 C33A 세포이다.

실시예 5: 네스티드 PCR에 의한 HPV 민감도 검증

<5-1> 종래의 HPV 네스티드 PCR

네스티드 PCR의 감도를 비교하기 위해, 종래의 네스티드 PCR을 다음의 프라 이머 세트를 사용하였다.

1차 프라이머 세트 : MY 09 (5'-CGT CCM ARR GGA WAC TGA TC-3', 서열번호: 1) 및 MY 11 (5'- GCM CAG GGW CAT AAY AAT GG - 3', 서열번호: 2). 1 ㎕ DNA 추출물, 5 ㎕ 10x PCR 완충액, 1 ㎕ dNTP 혼합액 (각 dNTP의 최종농도는 400 μM), 1 ㎕ Taq (Roche, Mannheim, 독일), 각각의 프라이머 1 ㎕ (10pM), 및 뉴클리아제-비함유 증류수를 함유하는 50 ㎕ 반응 용적으로 각각의 샘플에 대한 PCR 분석을 수행했다. PCR 반응은 95℃에서 10 분간, 20 싸이클 증폭 (94℃에서 30초, 45℃에서 30초, 72℃에서 30초)하여 수행했으며, 최종 연장 단계는 GeneAmp PCR system 9700 thermal cycler (어플라이드 바이오시스템즈사, Foster City, CA, USA)를 사용하고 72ㅀC에서 10분간 수행했다.

2차 프라이머 세트 : GP 5+ (5'-TTT GTT ACT GTG GTA GAT ACT AC - 3', 서열번호: 5) 및 GP 6+ (5'- GAA AAA TAA ACT GTA AAT CAT ATT C - 3', 서열번호: 6). 각각의 1차 PCR 결과물 1 ㎕ DNA 추출물, 5 ㎕ 10x PCR 완충액, 1 ㎕ dNTP 혼합액 (각 dNTP의 최종농도는 400 μM), 1 ㎕ Taq (Roche, Mannheim, 독일), 각각의 프라이머 1 ㎕ (10pM), 및 뉴클리아제-비함유 증류수를 함유하는 50 ㎕ 반응 용적으로 각각의 샘플에 대한 PCR 분석을 수행했다. PCR 반응은 95℃에서 10분간, 30 싸이클 증폭 (94℃에서 30초, 45℃에서 30초, 72℃에서 1분)하여 수행했으며, 최종 연장 단계는 GeneAmp PCR system 9700 thermal cycler (어플라이드 바이오시스템즈사, Foster City, CA, USA)를 사용하고 72℃에서 10분간 수행했다. PCR 생성물을 2% 아가로스젤에 전개하고 EtBr으로 염색하여 UV 광선 하에서 육안관찰 하였다.

<5-2> 민감도 검증

상기 실시예 2에서 고안된 프라이머 세트가 검출하고자 하는 HPV L1 유전자에 특이성을 나타내는지 확인하기 위해 HPV 감염이 의심되는 임상검체를 이용하여 본 발명에 따른 HPV L1 유전자 특이 프라이머를 적용한 유전자 검출방법을 수행하였다.

HPV 칩을 이용하여 HPV 감염자 49명, HPV 비감염자 22명을 대상검체로 선정하였고, side virus effect의 확인을 위하여 HIV 감염된 혈액 샘플의 임상검체를 선정하였다. 또한, HIV 비감염된 혈액 샘플에서 임상 검체를 선정하여 각각의 샘플을 혈액 미니 키트를 이용하여 DNA를 추출한 다음 1㎕ HPV 양성 표준 DNA로써 Caski와 SiHa에서 추출한 DNA, 음성 표준 DNA로써 C33A에서 추출한 DNA와 함께 환자 군에서 추출한 DNA를 이용하여 1차 프라이머 세트 : MY 09 (5'-CGT CCM ARR GGA WAC TGA TC-3', 서열번호: 1) 및 MY 11 (5'- GCM CAG GGW CAT AAY AAT GG - 3', 서열번호: 2). 1 ㎕ DNA 추출물, 5 ㎕ 10x PCR 완충액, 1 ㎕ dNTP 혼합액 (각 dNTP의 최종농도는 400 μM), 1 ㎕ Taq (Roche, Mannheim, 독일), 각각의 프라이머 1 ㎕ (10 pM), 및 뉴클리아제-비함유 증류수를 함유하는 50 ㎕ 반응 용적으로 각각의 샘플에 대한 PCR 분석을 수행했다. PCR은 95℃에서 10 분간, 20 싸이클 증폭 (94℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 30초)하여 수행했으며, 최종 연장 단계는 GeneAmp PCR system 9700 thermal cycler (어플라이드 시스템즈사, Foster City, CA, USA)를 사용하고 72℃에서 10분간 수행했다.

2차 프라이머 세트 : L1 유전자 (5'-TTT TCA ACT GTG CAA AAT AAC CTT AAC T-3', 서열번호: 3) 및 L1 유전자 (5'- CAA TTG CCT GGG TTA CAA ACC T- 3', 서열번호: 4) 각각의 1차 PCR 결과물 1 ㎕ DNA 추출물, 5 ㎕ 10x PCR 완충액, 1 ㎕ dNTP 혼합액 (각 dNTP의 최종농도는 400 μM), 1 ㎕ Taq (Roche, Mannheim, 독일), 각각의 프라이머 1 ㎕ (10pM), 및 뉴클리아제-비함유 증류수를 함유하는 50 ㎕ 반응 용적으로 각각의 샘플에 대한 PCR 분석을 수행했다. PCR은 95℃에서 10 분간, 30 싸이클 증폭 (94℃에서 1분, 59℃에서 1분, 72℃에서 1분)하여 수행했으며, 최종 연장 단계는 GeneAmp PCR system 9700 thermal cycler (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하고 72℃에서 10분간 수행했다. PCR 생성물을 2% 아가로스젤에 전개하고 EtBr으로 염색하여 UV 광선 하에서 육안관찰 하였다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, HPV 칩에서 양성인 샘플(49개) 중에서 종래의 HPV 네스티드 PCR 수행결과 양성인 샘플(25개)을 본 발명에 따른 HPV 네스티드 PCR 수행결과 21개 84%의 민감도를 나타냈다. 도 7에서 레인 1은 HPV 16 및 18, 레인 2는 HPV 18, 42 및 66, 레인 3은 HPV 56, 레인 4는 HPV 16 및 18, 레인 5는 HPV 16 및 18, 레인 6은 HPV 16, 레인 7은 HPV 11, 16 및 33, 레인 8은 HPV 16 및 31 감염된 임상검체이다.

도 8에 나타낸 바와 같이, HPV 칩에서 양성인 샘플 중에서 종래의 HPV 네스티드 PCR 수행결과 음성인 샘플을 본 발명에 따른 HPV 네스티드 PCR 수행결과로 87.5%의 민감도를 나타냈다. 도 8에서 레인 1은 HPV 18, 레인 2는 HPV 16 및 35, 레인 3은 HPV 16, 레인 4는 HPV 16, 레인 5는 HPV 51, 레인 6은 HPV 39, 레인 7은 HPV 16, 레인 8은 HPV 16 및 51 감염된 임상검체이다.

도 9에 나타낸 바와 같이, HPV 칩에서 음성인 샘플 중에서 종래의 HPV 네스티드 PCR 수행결과 음성인 샘플을 본 발명에 따른 HPV 네스티드 PCR 수행결과로 95%의 특이도를 나타냈다. 도 9에서 레인 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8은 HPV 비감염된 임상검체이다.

도 10에 나타낸 바와 같이, HIV 비감염된 샘플을 본 발명에 따른 HPV 네스티드 PCR을 수행한 결과 밴드가 나타나지 않았다. 도 10에서 레인 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8은 Control human DNA 이다.

도 11에 나타낸 바와 같이, HIV 감염된 샘플을 본 발명에 따른 HPV 네스티드 PCR을 수행한 결과 밴드가 나타나지 않았다. 도 11에서 레인 1, 2, 3, 4 및 5는 HIV 감염된 Human DNA 이고, 레인 6은 Blank 이다.

상기 실시예 3에서 고안된 HPV L1 유전자 검출방법의 민감도를 종래기술과 비교실험을 실시하였다. HPV 칩 분석에 따른 49개의 양성 검체를 비교한 결과 종래기술에 의한 네스티드 PCR에서는 25개의 양성 검체를 확인한 반면 본 발명에 따른 네스티드 PCR에서는 42개에서 양성의 결과를 확인하였다. 또한, HPV 칩 분석에 따른 22개의 음성 검체를 비교한 결과 종래기술에 의한 네스티드 PCR에서는 2개의 양성 검체를 확인한 반면 본 발명에 따른 네스티드 PCR에서는 3개에서 양성의 결과를 확인하였다. 이에 의해 종래 기술과 비교하여 추가적으로 확인된 1개의 양성 결과를 시퀀싱(sequencing)하여 HPV 16을 확인하였으며, 본 발명에 따른 검출방법이 HPV 종래 기술의 오류를 수정하는 부분으로써 사용될 수 있음을 확인하였다.(표 2)

표 2. 종래의 네스티드 PCR 과 본 발명에 따른 네스티드 PCR 의 비교실험
종래기술 ( HPV 네스티드 PCR )	HPV 칩 분석		민감도/특이도
	양성	음성
양성	25	2	51.0%/90.9%
음성	24	20
합계	49	22
HPV 네스티드 PCR	HPV 칩 분석		민감도/특이도
	양성	음성
양성	42	3	85.7%/86.4%
음성	7	19
합계	49	22

기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당기술 분야의 숙련된 당업자는 하기의 특허 청구의 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

도 1은 HPV의 전체적인 유전자의 서열 및 프라이머 위치를 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명에 따른 HPV 네스티드 PCR의 결과를 나타낸 것이다.

도 3은 HPV 16 DNA 유전자의 E2 카피수를 확인하기 위한 리얼타임 PCR의 결과를 나타낸 것이다.

도 4는 HPV 16 DNA 유전자의 E6 카피수를 확인하기 위한 리얼타임 PCR의 결과를 나타낸 것이다.

도 5는 리얼타임 PCR의 유효한 값인 표준곡선을 바탕으로 확인한 HPV 양성 세포에서 추출한 DNA를 이용하여 HPV 네스티드 PCR의 결과이다.

도 6은 HPV 칩에서 양성인 샘플 중 종래 HPV 네스티드 PCR을 수행하였을 경우 양성인 샘플을 HPV 네스티드 PCR을 이용하여 실험한 결과이다.

도 7은 HPV 칩에서 양성인 샘플 중 종래 HPV 네스티드 PCR을 수행하였을 경우 음성인 샘플을 HPV 네스티드 PCR을 이용하여 실험한 결과이다.

도 8은 HPV 칩에서 양성인 샘플 중 종래 HPV 네스티드 PCR을 수행하였을 경우 음성인 샘플을 HPV 네스티드 PCR을 이용하여 실험한 결과이다.

도 9는 HIV 음성인 샘플을 이용하여 virus cross-reactivity(교차반응)를 확인하기 위하여 HPV 네스티드 PCR을 이용하여 실험한 결과이다.

도 10은 HIV 양성인 임상 검체을 이용하여 virus cross-reactivity(교차반응)를 확인하기 위하여 HPV 네스티드 PCR을 이용하여 실험한 결과이다.

<110> Korea centers for disease control and prevention <120> Method of detection for HPV L1 gene using nested PCR assay <130> IPM-34662 <140> 10-2007-0139843 <141> 2007-12-28 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> MY09/11 forward primer <400> 1 cgtccmarrg gawactgatc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> MY09/11 reverse primer <400> 2 gcmcagggwc ataayaatgg 20 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> L1 151 forward primer <400> 3 ttttcaactg tgcaaaataa ccttaact 28 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> LI 151 reverse primer <400> 4 caattgcctg ggttacaaac ct 22 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> GP 5+/6+ forward primer <400> 5 tttgttactg tggtagatac tac 23 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> GP 5+/6+ reverse primer <400> 6 gaaaaataaa ctgtaaatca tattc 25

Claims (3)

1. ⅰ) 임상 샘플로부터 DNA를 추출하는 단계;

   ⅱ) 단계 ⅰ)에서 수득한 핵산을 서열번호: 1 및 서열번호: 2의 프라이머 세트로 1차 PCR을 수행하는 단계;

   ⅲ) 단계 ⅱ)의 PCR 산물을 서열번호: 3 및 서열번호: 4의 프라이머 세트로 2차 PCR을 수행하는 단계; 및

   ⅳ) 단계 ⅲ)의 PCR 산물로부터 HPV(Human papilloma virus)의 L1 유전자를 확인하는 단계를 포함하는 HPV L1 유전자 검출방법.
2. 제1항의 방법에 사용되는 네스티드 PCR을 위한 서열번호: 3 및 서열번호: 4의 프라이머 세트.
3. 서열번호: 3 및 서열번호: 4로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는 HPV의 L1 유전자 검출용 키트.

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