WO2013015609A2 - 인유두종바이러스 검출 방법 및 키트 - Google Patents

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WO2013015609A2
WO2013015609A2 PCT/KR2012/005934 KR2012005934W WO2013015609A2 WO 2013015609 A2 WO2013015609 A2 WO 2013015609A2 KR 2012005934 W KR2012005934 W KR 2012005934W WO 2013015609 A2 WO2013015609 A2 WO 2013015609A2
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hpv
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exonuclease
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안웅식
배수미
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주식회사 진코스
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/708—Specific hybridization probes for papilloma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/01—DNA viruses
    • G01N2333/025—Papovaviridae, e.g. papillomavirus, polyomavirus, SV40, BK virus, JC virus

Definitions

  • the present invention uses (1) a first primer specific for the L1 gene of human papillomavirus (HPV) and a second primer labeled with a marker specific for the L1 gene of human papillomavirus (HPV) and recognized by an exonuclease.
  • the present invention provides the HPV L1 gene-specific first primer, the HPV L1 gene-specific second primer labeled with an exonuclease, and the HPV L1 gene-specific marker recognized by exonuclease.
  • a kit for detecting a human papillomavirus type comprising an unlabeled second primer, a probe for detecting a human papillomavirus type, an exonuclease and a reaction buffer.
  • HPV Human papillomavirus
  • STD sexually transmitted disease
  • HPV causes hyperproliferation after infection of human epithelial cells.
  • the excessive hyperplasia is mostly a simple skin wart or external stage, a lump or a condyloma accuminata around the iris.
  • HPV may be a cause of cancer, and in fact, almost all uterine cervix cancer or cervical cancer, a large number of head and neck cancers, and many anal cancers have been confirmed to be caused by HPV.
  • Cervical cancer is one of the leading causes of death among women worldwide, with the highest incidence of cancer among women worldwide after breast cancer, with about 440,000 new cases reported each year.
  • the most common female cancer in developing countries about 300,000 people die of cervical cancer each year.
  • the incidence rate has recently decreased, but according to the 2000 Ministry of Health and Welfare Cancer Registration Survey, about 5,000 new patients are reported.
  • cervical cancer (10.6%) ranks third after gastric cancer (15.8%) and breast cancer (15.1%).
  • the incidence of HPV has increased significantly among young women in their 20s and 30s, accounting for 32% of all sexually transmitted diseases.
  • HPV genotypes have been reported, of which about 30 HPVs can cause disease in humans, which are largely high risk (16, 18, 31, 33, 35, etc.) and low risk (6, 11, 42, 43, 44, etc. (De V Amsterdam, J. Virol. 63: 4898-4903, 1989; Jacobs et al., J. Clin. Microbiol. 33: 901-905, 1995).
  • PCR-RFLP using a restriction enzyme after amplifying the L1 region of the HPV gene by PCR has a simple and easy result. However, if the restriction enzyme used does not recognize the mutant part, it cannot be analyzed. In addition, the efficiency of PCR amplification varies depending on the HPV genotype, which may be a problem in the accuracy of the test.
  • Commercially available hybrid capture kits (Digene, USA) can be identified without PCR amplification, but they can be classified into high-risk and low-risk groups and cannot distinguish between high-risk types 16 and 18 and other high-risk groups. (Clavel et al., J. Clin. Pathol. 51: 737-740, 1998).
  • Recently developed HPV genotyping kit using microchip technology is a two-dimensional method of reacting on a slide, which has to be washed three times after hybridization.
  • the HPV detection kit of the method using a suspension array has been developed in a similar manner, but in this case, the signal value required for the detection is very low, so there was a limit to the detection. Also, if more than one virus is infected, a low signal may not recognize a low concentration of the virus. Therefore, there is a need for the development of a highly sensitive HPV type detection method capable of detecting a small amount of HPV present in a sample to accurately diagnose its type.
  • a probe having a nucleic acid sequence capable of specifically detecting the HPV type was prepared from the L1 gene region having severe variation between HPV types, and the L1 gene of HPV in the sample was labeled with a phosphate recognized by an exonuclease.
  • PCR amplification using the prepared primers since the phosphate-labeled strand can be selectively digested and single stranded, when detected by reacting with the prepared HPV type detection probe, the signal is 10 times stronger than conventional methods. It was confirmed that can be obtained, and completed the method of detecting the HPV type with high sensitivity.
  • the present invention uses (1) a first primer specific for L1 gene of human papillomavirus (HPV) and a second primer labeled with a marker specific for L1 gene of human papillomavirus (HPV) and recognized by exonuclease.
  • the present invention relates to an HPV L1 gene specific first primer, a HPV L1 gene specific second primer labeled with an exonuclease, and a marker recognized by HPV L1 gene specific exonuclease.
  • the present invention provides a kit for detecting a human papillomavirus type comprising a second primer, a probe for detecting a human papillomavirus type, an exonuclease, and a reaction buffer.
  • Human papillomaviruses can be detected accurately and sensitively by type using a human papillomavirus type detection probe and a human papillomavirus type detection method and kit provided by the present invention.
  • the present invention provides a high-accuracy, reliable and simple detection method capable of early diagnosis of human papillomaviruses present in trace amounts before the propagation of human papillomaviruses.
  • the present invention provides a kit comprising (1) a first primer specific for the L1 gene of human papillomavirus (HPV) and a marker that is specific for the L1 gene of human papillomavirus (HPV) and that is recognized by an exonuclease.
  • a first primer specific for the L1 gene of human papillomavirus (HPV) and a marker that is specific for the L1 gene of human papillomavirus (HPV) and that is recognized by an exonuclease First PCR amplifying the L1 gene from the sample to be analyzed using a two primer; (2) adding a exonuclease that recognizes the marker to the first amplified L1 gene product to decompose the nucleic acid strand extended from the second primer labeled with the marker, thereby to obtain a single strand of the single strand extended from the first primer.
  • Step (1) is a first PCR of the L1 gene using a second primer labeled with a first primer specific for the L1 gene of human papillomavirus (HPV) and a marker recognized by an exonuclease from the sample to be analyzed. It is about amplifying step.
  • HPV human papillomavirus
  • sample refers to a sample of an individual infected with or suspected of having an HPV virus.
  • the sample may include, but is not limited to, samples such as whole blood, plasma, saliva, urine, sputum, lymph, cerebrospinal fluid, and intercellular fluid containing the HPV gene.
  • human papilloma virus is a DNA virus belonging to the papova virus family, a icosahedron consisting of 72 outer envelope protein (capsomer) and 7,900 nucleotide sequences are composed of double circular DNA.
  • HPV is divided into 120 different subtypes depending on the similarity of the sequences that make up the genome. About 30 of these 120 subtypes are known to infect the lower genital organs, and HPV-16, HPV-18, HPV-26, HPV-30, and HPV- depending on the risk of developing cervical epithelial tumors and cervical cancer.
  • HPV human immunodeficiency virus
  • E early transcription region
  • L late gene region
  • LCR non-expressed region
  • E6 and E7 genes in the early transcription region are expressed while HPV enters and remains in the genome of infected cells and plays the most important role in carcinogenesis.
  • EV and E7 genes of HPV belonging to high-risk groups such as HPV-16 and -18 bind to proteins expressed in tumor suppressor genes p53 and rb (retinoblastoma) genes, respectively.
  • HPV which belongs to low risk groups such as HPV-6 and HPV-11, has a poor ability to inactivate proteins expressed in tumor suppressor genes, making it difficult to cause cervical cancer.
  • L1 gene is a part occupying most of the genes of human papillomavirus, the sequence is preserved in most human papillomavirus, and there is a variation between HPV types. It occupies most of the capsid protein of HPV, is expressed in epithelial cells that differentiate later in HPV infection, and is also the site of highest antigenicity.
  • the term "primer” is a single strand of oligonucleotide consisting of 15 to 30 bases for template strand replication, which can form complementary templates and base pairs. Primers are commonly synthesized but can also be used on naturally occurring polynucletide.
  • the sequence of the primer does not necessarily have to be exactly the same as the sequence of the template, but only if it is sufficiently complementary to hybridize with the template.
  • the primer of the present invention may be a primer for amplifying the L1 gene of human papillomavirus, SP5 + / 6 +, GP6 +, or SPF2, and more preferably, recognized by a first primer and an exonuclease specific for the human papillomavirus L1 gene.
  • the marker may be a labeled second primer and can be easily designed by those skilled in the art by known methods.
  • forward and reverse primers designed to amplify all types of HPV L1 genes may be used regardless of HPV types, or a plurality of primer mixtures that specifically bind to L1 gene sites may be used according to HPV types. .
  • MY09 / 11 may be used as a primer that binds to the L1 gene region
  • PGMY09 / 11 may be used as a plurality of primer mixtures that specifically bind to the L1 gene region according to the HPV type. It is not limited. It is also possible to use SP5 + / 6 +. In the embodiment of the present invention was used a primer mixture consisting of SEQ ID NOs: 1 to 17 in Table 1.
  • the second primer uses a primer labeled with a marker recognized by the exonuclease.
  • the marker recognized by the exonuclease may be phosphate.
  • the second primer may be a forward primer or a reverse primer. If the probe to hybridize is an antisense strand, amplify the sense strand using a labeled or unlabeled forward primer that is recognized by an exonuclease, and if the probe to hybridize is a sense strand, the exo
  • the marker recognized by the nuclease is used to amplify the antisense strand using a labeled or unlabeled reverse primer.
  • a primer selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 12 was used as the 5 'terminal phosphate labeled second primer.
  • Step (2) is performed by adding an exonuclease that recognizes the marker to the first amplified L1 gene product to decompose the nucleic acid strand extending from the labeled second primer to extend from the first primer. To obtain a single stranded L1 gene product.
  • Nucleic acid strand degradation in the present invention can be carried out using exonuclease.
  • exonuclease refers to an enzyme that cleaves a nucleic acid, ie, DNA or RNA (ribonucleic acid), and is a nuclease that cleaves a terminus.
  • the 5 'end is phosphate by using the ⁇ -exonuclease in that the phosphate group has a high affinity for the ⁇ -exonuclease in the nucleic acid strand extending from the 5' end of the phosphate-labeled primer.
  • the extended nucleic acid strand was removed from the labeled second primer.
  • Strands amplified by phosphate labeled primers at the 5 'end have the advantage of having a ⁇ -exonuclease affinity about 20 times higher than strands amplified by phosphate unlabeled primers.
  • Step (3) is a second PCR amplification of the L1 gene into a single strand using a second primer whose template is a single strand extending from the obtained first primer and whose label is not recognized by the exonuclease. It is about the steps to do.
  • the nucleic acid strand removed and left by ⁇ -exonuclease in step 2 is used as a template, and a phosphate-free second primer is used. It is a step to perform a PCR reaction. Since the single-strand template from which the complementary strand is removed by ⁇ -exonuclease is used, it is characterized by high efficiency of hybridization with the primer.
  • the primer may be used without limitation as long as it is an oligonucleotide including a nucleotide sequence specific to the L1 gene, and may use a second primer that is not phosphate labeled.
  • a primer selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 12 was used as the second primer.
  • Single strands of nucleic acid were labeled with biotin by performing PCR in the presence of dNTP labeled with biotin.
  • Step (4) relates to the step of hybridizing the amplified and labeled single-stranded nucleic acid with a probe for detecting the HPV type.
  • the term “probe” refers to a nucleic acid fragment such as RNA or DNA, which corresponds to a few bases to several hundred bases, which can specifically form a complementary bond with a nucleic acid of DNA or RNA. Labeled to confirm the presence of certain types of HPV.
  • the probe may be made in the form of an oligonucleotide probe, a single stranded DNA probe, a double stranded DNA probe, an RNA probe, or the like, but preferably, a single stranded probe may be used.
  • phosphate-labeled primers were used to amplify the HPV L1 gene in the sample and digested the phosphate-labeled nucleic acid strand with exonuclease, thereby amplifying only the single-stranded nucleic acid corresponding to the HPV L1 gene.
  • the reaction efficiency is high in the hybridization reaction.
  • double-stranded nucleic acid it has to undergo a denaturation step at a high temperature condition, and even after it is denatured, competition between complementary recombination between the double-strands and the probe and the probe occurs, resulting in low hybridization efficiency. have.
  • the presence or absence of hybridization with the probe can be used to diagnose human papillomavirus infection, and the selection and hybridization conditions of the appropriate probe can be modified based on what is known in the art.
  • the probe of the present invention can be used without limitation as long as it is an oligonucleotide including a sequence capable of specific detection of HPV L1 gene sequence, and cross-reacts with other types of HPV in consideration of HPV L1 gene sequence by type. Can be made to be free.
  • it may be selected from the group consisting of SEQ ID NO: 18 to SEQ ID NO: 43, more preferably may be a type 16 detection probe represented by SEQ ID NO: 18 and a type 18 detection probe represented by SEQ ID NO: 19.
  • GAPDH Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase
  • GAPDH is a gene located on human chromosome 12 and is an enzyme involved in glycolysis, an essential metabolic process in cells.
  • the GAPDH gene detection probe for detecting the GADPH gene is hybridized with the L1 gene detection probe. Through this process, it is possible to immediately check whether the PCR reaction is successful in the beads array analyzer, thereby greatly reducing the number of undetected cases due to PCR amplification failure.
  • Primers or probes of the present invention can be chemically synthesized using the phosphor amidite solid support method, or other well known methods. Such nucleic acid sequences can also be modified using many means known in the art. Non-limiting examples of such modifications include methylation, capping, substitution with one or more homologs of natural nucleotides, and modifications between nucleotides, eg, uncharged linkages such as methyl phosphonate, phosphoester, phosphoro Amidate, carbamate, and the like) or charged linkers (eg, phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.).
  • each probe provided in the present invention can be modified as follows.
  • each probe was prepared with 15 thymine (dTTP) groups and a (CH2) 6 chain and an amine group.
  • the nucleic acid sequence of the probe can be variously modified in the art.
  • the probe may be provided in the form of a bead array coupled to the beads.
  • the type of beads is not particularly limited and is in accordance with general methods known in the art.
  • Step (5) relates to a method for detecting a human papillomavirus type, comprising the step of identifying a human papillomavirus type by measuring a signal from the hybridization reactant.
  • Labeling with various forms of detection markers known in the art for the identification of single-stranded L1 gene can be further performed, and available detection markers include Cy3, Cy5, Fluoresce Phosphorus isothiocyanate (FITC), tetramethyltamine isothiocyanate (RITC), Alexa, 4,4, -difluoro-4-boro-3a, 4a-diaza-s-indacene (BODIPY), or Texas Red, but is not limited to such.
  • the PCR reaction was performed in the presence of biotin-labeled dNTP to label the nucleic acid strand with biotin, and then the signal was measured using the detection marker bound streptavidin.
  • the reaction degree between the probe and the HPV L1 gene amplification product in the sample can be confirmed by the intensity of fluorescence by treating the fluorescent material coupled with streptavidin, which is specific for biotin and biotin.
  • streptavidin which is specific for biotin and biotin.
  • Human papillomavirus type detection method using the human papillomavirus L1 gene amplified using biotin-labeled dNTP using the phosphate-labeled primer of the 5 'terminal of the present invention can detect various human papillomavirus types with high sensitivity, and especially high risk group. Human papillomavirus types 16 and 18 belonging to can be detected with high sensitivity.
  • another aspect of the present invention provides an HPV L1 gene specific first primer, a second primer labeled HPV L1 gene specific and a marker recognized by exonuclease, HPV L1 gene specific and recognized by exonuclease
  • a kit for detecting a human papilloma virus type comprising a second primer, a human papillomavirus type detection probe, an exonuclease, and a reaction buffer.
  • first primer and “second primer” are as described above.
  • the term "probe for detecting the type of papilloma type" is as described above.
  • the kit of the present invention can diagnose mRNA or DNA levels of HPV and diagnose a specific type of HPV infection and suspect individuals.
  • the kit of the present invention does not label the HPV L1 gene specific first primer for measuring the level of the nucleic acid, the second primer labeled with the marker recognized by the exonuclease, the marker recognized by the exonuclease.
  • the primer may be used without limitation as long as it is an oligonucleotide including a nucleotide sequence that can specifically bind to L1 gene.
  • it may be selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 17, or may be composed of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 17.
  • the probe may be easily prepared by those skilled in the art as long as it can specifically bind to the HPV gene region, preferably, a probe selected from the group consisting of SEQ ID NO: 18 to SEQ ID NO: 43, and more preferably. May be a type 16 detection probe represented by SEQ ID NO: 18 or a type 18 detection probe represented by SEQ ID NO: 19.
  • the human papillomavirus type detection kit may be a kit including essential elements necessary for performing RT-PCR.
  • RT-PCR kits include test tubes or other appropriate containers, reaction buffers, deoxynucleotides (dNTPs), enzymes such as Taq-polymerase and reverse transcriptase, DNase, RNase inhibitors, DEPC, in addition to individual primer pairs specific for the L1 gene.
  • dNTPs deoxynucleotides
  • enzymes such as Taq-polymerase and reverse transcriptase
  • DNase RNase inhibitors
  • DEPC reverse transcriptase
  • Kits can include positive and negative controls.
  • the kit of the present invention may be a kit including essential elements necessary for performing the microarray chip.
  • the microarray chip kit may include a substrate to which a cDNA corresponding to a gene or a fragment thereof is attached with a probe, and the substrate may include a cDNA corresponding to a quantitative control gene or a fragment thereof.
  • the microarray chip of the present invention may be a human papillomavirus type detection kit in which an oligonucleotide or a complementary strand molecule corresponding to the gene or fragment thereof of the human papillomavirus is integrated.
  • the oligonucleotide or complementary strand molecule thereof may comprise 18 to 30 nucleic acids of the HPV L1 gene, and preferably 20 to 25 nucleic acids.
  • the microarray chip of the present invention can be easily manufactured by a manufacturing method commonly used in the art. In order to fabricate a microarray chip, a micropipetting method or a pin-shaped spotter using a piezoelectric method is used to immobilize probe DNA molecules on a DNA chip substrate. It is preferable to use the method used, but is not limited thereto.
  • the substrate of the microarray chip is preferably coated with an active group selected from the group consisting of amino-silane, poly-L-lysine, and aldehyde, but is not limited thereto. . In addition, the substrate is preferably selected from the group consisting of slide glass, plastic, metal, silicon, nylon membrane and nitrocellulose membrane, but is not limited thereto.
  • the kit of the present invention may be a kit containing essential elements necessary for performing the bead array.
  • the bead array kit may include microbeads comprising a nucleic acid corresponding to a gene or a fragment thereof as a probe and include microbeads comprising a nucleic acid corresponding to a quantitative control gene or a fragment thereof.
  • Bead array kits of the present invention can be easily prepared according to methods commonly prepared in the art.
  • the micro beads are polystyrene, polymethyl methacrylate, latex, silica, polyvinyl toluene, styrenevinyl toluene, styrene butyl butadiene It may be selected from the group consisting of styrene-butadien.
  • the size of the micro beads is not limited, and the surface of the beads may be both unmodified and modified with a carboxyl group, but is not limited thereto.
  • the kit of the present invention may further perform the step of labeling various types of detection markers known in the art for the identification of the single-stranded L1 gene, and usable detection markers include Cy3, Cy5 ( Cy5), fluorescein isothiocyanate (FITC), tetramethyltamine isothiocyanate (RITC), Alexa, 4,4, -difluoro-4-boro-3a, 4a-diaza -s-indasen (BODIPY), or Texas Red, but is not limited to such.
  • the kit may further include components necessary for carrying out PCR in the presence of biotin-labeled dNTP.
  • the microarray chip may use a 36 k Human V4.0 OpArray oligo microarray (Operon, Germany) or Whole human genome oligo microarray (Agilent, USA), but is not limited thereto.
  • the bead array included in the assay kit includes 20-27 mer oligonucleotide probes containing 15 thymine (dTTP), 6 CH2 chains and amine groups at the 5 'end, including the L1 gene region of HPV. It is fixed at.
  • bead arrays were prepared by attaching the probes to the beads using the prepared beads (xMAP carboxylated microspheres; Luminex Corp. Austin, TX).
  • the probe was prepared by melting the probe at 100 uM, respectively, using the probe prepared in Example 1-1.
  • Example 2-1 For HPV detection and genotyping, 5 ul of DNA prepared in Example 2-1 was used as a template, and the HPV primer set 0.4 uM, 0.1 mM dNTP mix, 7.5 mM Tris HCl (pH 9.0), 0.2 mM MgCl 2 , 5 mM Amplification was made with KCl, 2 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , Taq polymerase (Ultratools, Spain) 1U.
  • the base sequence of the primer used was used a primer mixture of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 17. Primers selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 1-12 were used with 5 'terminal phosphate labeling.
  • PCR reaction conditions were as follows; After 5 minutes and 1 cycle at 95 ° C., 60 cycles at 91 ° C., 60 seconds at 55 ° C., and 60 cycles at 72 ° C. were performed for 40 cycles, followed by reaction at 72 ° C. for 7 minutes.
  • 2 nd was labeled amplification products to be used for single-stranded PCR probe hybridization through the labeling reaction.
  • PCR reaction conditions were as follows; 1 cycle was performed for 5 minutes at 94 degreeC, and it reacted for 7 minutes at 72 degreeC after 35 cycles of 30 second at 94 degreeC, 60 second at 55 degreeC, 120 second at 72 degreeC.
  • the sample genes processed in Examples 2-1 to 2-4 were mixed with a hybridization buffer (50% formamide, 1x Denhardt's, 6xSSC, 0.1% SDS, 250 ug / ml salmon sperm DNA). After dissolving in a hybridized reaction with each other. After 5 minutes of reaction at 95 ° C, the reaction was carried out at 37 ° C for 60 minutes. The sample was simultaneously transferred to a 96 well filter plate like beads, and then washed three times using TE buffer. After washing, Streptavidin phycoerythrin (Sigma Aldrich, S3402) was stirred in the dark for 15 minutes using 100 ul of a solution diluted 500-fold.
  • a hybridization buffer 50% formamide, 1x Denhardt's, 6xSSC, 0.1% SDS, 250 ug / ml salmon sperm DNA.
  • Example 2-6 Signal Detection of Bead Arrays
  • Luminex 100 was numerically calculated using two lasers, one for the bead number and one for the amount of phycoerythrin reacted. A total of 26 types of beads were read and the determination of each HPV genotype was represented by the MFI value of the beads representing the HPV genotype, thereby determining the genotype of HPV.
  • the conditions performed by phosphate modification at the 5 'end of the primer were compared with those without labeling. As shown in Tables 3 and 4 below, only GAPDH was detected in HPV-negative cervical cancer cell line C33A, and HPV 16 and GAPDH, an internal control, were detected in CaSki cell line infected with HPV 16, but no other types of HPV were detected. . Therefore, the present invention shows that the specific type of HPV can be detected.
  • the phosphate-labeled condition of the 5 'region of the PGMY09 primer using HPV No. 18 plasmids compared to the phosphate-free condition the final signal was improved by 20.7, 2.1 and 1.1 times depending on the concentration of the plasmid, respectively. .

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Abstract

본 발명은 (1) 인유두종바이러스(HPV)의 L1 유전자에 특이적인 제1프라이머 및 인유두종바이러스(HPV)의 L1 유전자에 특이적이고 엑소뉴클레아제에 의해 인식되는 표지자가 표지된 제2프라이머를 사용하여, 분석하고자 하는 시료로부터 L1 유전자를 1차 PCR 증폭하는 단계; (2) 상기 1차 증폭된 L1 유전자 산물에 상기 표지자를 인식하는 엑소뉴클레아제를 가하여, 상기 표지자가 표지된 제2프라이머로부터 연장된 핵산가닥을 분해하여, 제1프라이머로부터 연장된 단일 가닥의 L1 유전자 산물을 수득하는 단계; (3) 상기 수득된 제1프라이머로부터 연장된 단일 가닥을 주형으로 하고, 엑소뉴클레아제에 의해 인식되는 표지자가 표지되지 않은 제2프라이머를 사용하여, L1 유전자를 단일가닥으로 2차 PCR 증폭하는 단계; (4) 상기 증폭된 단일가닥의 핵산을 인유두종바이러스 타입 검출용 탐침과 혼성화 반응시키는 단계; 및 (5) 상기 혼성화 반응물로부터 신호를 측정하여 인유두종바이러스 타입을 확인하는 단계를 포함하는, 인유두종바이러스 타입을 검출하는 방법 및 인유두종바이러스 타입을 검출하는 키트에 관한 것이다. 본 발명이 제공하는 인유두종바이러스 타입 검출용 탐침과 인유두종 바이러스 타입 검출 방법 및 키트를 이용하여 인유두종바이러스를 타입별로 정확하고 고감도로 검출할 수 있다. 본 발명은 인유두종바이러스가 증식되기 전에 미량 존재하는 인유듀종바이러스까지 조기 진단할 수 있는 정확도와 신뢰도가 높고 간단한 고감도의 검출 방법을 제공한다.

Description

인유두종바이러스 검출 방법 및 키트
본 발명은 (1) 인유두종바이러스(HPV)의 L1 유전자에 특이적인 제1프라이머 및 인유두종바이러스(HPV)의 L1 유전자에 특이적이고 엑소뉴클레아제에 의해 인식되는 표지자가 표지된 제2프라이머를 사용하여, 분석하고자 하는 시료로부터 L1 유전자를 1차 PCR 증폭하는 단계; (2) 상기 1차 증폭된 L1 유전자 산물에 상기 표지자를 인식하는 엑소뉴클레아제를 가하여, 상기 표지자가 표지된 제2프라이머로부터 연장된 핵산가닥을 분해하여, 제1프라이머로부터 연장된 단일 가닥의 L1 유전자 산물을 수득하는 단계; (3) 상기 수득된 제1프라이머로부터 연장된 단일 가닥을 주형으로 하고, 엑소뉴클레아제에 의해 인식되는 표지자가 표지되지 않은 제2프라이머를 사용하여, L1 유전자를 단일가닥으로 2차 PCR 증폭하는 단계; (4) 상기 증폭된 단일가닥의 핵산을 인유두종바이러스 타입 검출용 탐침과 혼성화 반응시키는 단계; 및 (5) 상기 혼성화 반응물로부터 신호를 측정하여 인유두종바이러스 타입을 확인하는 단계를 포함하는, 인유두종바이러스 타입을 검출하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 HPV L1 유전자 특이적인 제1프라이머, HPV L1 유전자 특이적이고 엑소뉴클레아제에 의해 인식되는 표지자가 표지된 제2프라이머, HPV L1 유전자 특이적이고 엑소뉴클레아제에 의해 인식되는 표지자가 표지되지 않은 제2프라이머, 인유두종바이러스 타입 검출용 탐침, 엑소뉴클레아제 및 반응 완충액을 포함하는 인유두종바이러스 타입 검출용 키트에 관한 것이다.
인유두종바이러스(human papillomavirus, HPV)는 이중나선 DNA의 게놈(genome)을 외피가 덮고 있는 구조를 가진 바이러스로 골프공 모양을 하고 있다. 상기 HPV는 2가지 관점에서 인체에 중요하다. 첫째, HPV는 인체에서 가장 흔한 성교전파성질환(sexually transmitted disease, STD)이다. 모든 성인 여성의 절반 이상이 평생에 한번 이상 HPV에 감염된다는 보고도 있다. 둘째, HPV는 인간의 상피세포에 감염이 된 후 과잉증식(hyperproliferation)을 일으킨다. 이 때의 과잉 증식은 단순한 피부의 사마귀(wart)나 외성기, 홍문 주위의 곤지름 혹은 첨규콘딜롬(condyloma accuminata)과 같은 양성종양인 경우가 대부분이다. 그러나 HPV는 발암의 원인이 될 수도 있으며, 실제 거의 모든 자궁경부암(uterine cervix cancer or cervical cancer)과 상당수의 두경부암, 그리고 다수의 홍문암(anal cancer)이 HPV에 의해 발병함이 확인되고 있다.
자궁경부암은 전 세계의 여성의 주요 사망 원인 중 하나이며, 전 세계 여성 암 가운데 유방암 다음으로 발생빈도가 높아 해마다 약 44만 건 정도가 신규로 보고되고 있다. 개발도상국에서는 가장 흔한 여성암으로 연간 약 30만 명이 자궁경부암으로 사망한다. 우리나라의 경우 최근 발병빈도가 감소하는 추세이나, 2000년도 보건복지부 암 등록 조사통계를 보면 아직도 매년 약 5,000여명의 새로운 환자들이 발생하는 것으로 보고되고 있다. 국내 여성의 경우 자궁경부암(10.6%)은 장기별 발생 빈도상 위암(15.8%)과 유방암(15.1%)에 이어 3위를 차지하고 있다. 특히 최근에는 20-30대 젊은 여성에서 HPV의 감염율이 크게 늘어 전체 성교전파성질환 환자의 32%를 차지하는 등 국민보건상 심각한 문제로 대두되고 있다(대한민국 질병관리센터, 2004).
현재까지 약 100여종의 HPV 유전자형이 보고되어 있는데 이 중에서 사람에게 질병을 유발시킬 수 있는 HPV는 약 30여 종이며 이를 크게 고위험군(16, 18, 31, 33, 35 등)과 저위험군(6, 11, 42, 43, 44 등)으로 분류하고 있다(De Villiers, J. Virol . 63:4898-4903, 1989 ; Jacobs et al ., J. Clin. Microbiol. 33:901-905, 1995).
현재 가장 흔히 시행되는 검진법은 자궁세포진 검사(PAP smear)로서 검사자의 숙련도에 의존하여 검사의 정확도가 떨어지는 단점이 있다. 질확대경을 시행하면 HPV의 감염을 70%까지 진단할 수 있으나, 수련된 전문가와 고가의 장비가 필요하며 인유두종바이러스의 유전자형을 분류할 수 없는 단점이 있다.
HPV 유전자의 L1 부위를 PCR로 증폭한 후에 제한효소를 사용하는 PCR-RFLP는 간단하고 쉽게 결과를 얻을 수 있는 장점이 있으나 사용하는 제한 효소가 변이부분을 인식하지 못하면 분석하지 못하는 단점이 있다. 또한 HPV 유전자형에 따라서 PCR 증폭의 효율이 달라 검사의 정확도에 문제가 될 수 있다. 상품화되어 있는 하이브리드 캡쳐 키트(Digene, USA)는 PCR 증폭 과정 없이 확인 가능하나 고 위험군과 저 위험군으로 분류 가능할 뿐 자궁경부암과 상관관계가 높은 16, 18 형과 다른 고위험군을 구별할 수 없다는 단점이 있다(Clavel et al. , J. Clin. Pathol. 51:737-740, 1998). 최근에 개발된 마이크로칩 기술을 이용한 HPV 유전자형 분석키트(바이오메드랩, 한국)는 슬라이드상에서 반응하는 2차원적인 방법으로 교잡반응 후에 3차에 걸쳐서 세척과정을 거쳐야 하는 번거로움이 있다.
또한, 이와 비슷한 방법으로 서스펜션 어레이를 이용한 방법의 HPV 검출 키트가 개발되어 있으나, 이 키트의 경우, 검출에 필요한 시그널 값이 매우 낮아 현실적으로 검출을 하기에는 그 한계가 있었다. 또한 두 개 이상의 바이러스가 감염되었을 경우 낮은 시그널은 낮은 농도의 감염 바이러스를 인식하지 못할 수도 있다. 따라서, 시료에 미량으로 존재하는 HPV도 검출하여 이의 타입을 정확하게 진단할 수 있는 고감도의 HPV 타입 검출 방법의 개발이 필요한 실정이다.
이런 배경하에, 본 발명자는 HPV 타입을 검출하는 탐침과 검출 방법상의 개선을 통하여 HPV 타입을 고감도로 검출하고자 하였다. 구체적으로, HPV 타입간 변이가 심한 L1 유전자 부위로부터 HPV 타입을 특이적으로 검출할 수 있는 핵산 서열을 가지는 탐침을 제조하였으며, 시료내 HPV의 L1 유전자를 엑소뉴클레아제에 의해 인식되는 포스페이트로 표지된 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하면, 포스페이트 표지된 가닥을 선택적으로 분해하여 단일가닥화할 수 있으므로, 이를 상기 제조한 HPV 타입 검출용 탐침과 반응시켜 검출할 경우, 기존의 방법에 비하여 10배 이상 강한 신호를 얻을 수 있는 것을 확인하고, 고감도로 HPV 타입을 검출하는 방법을 완성하였다.
본 발명은 (1) 인유두종바이러스(HPV)의 L1 유전자에 특이적인 제1프라이머 및 인유두종바이러스(HPV)의 L1 유전자에 특이적이고 엑소뉴클레아제에 의해 인식되는 표지자가 표지된 제2프라이머를 사용하여, 분석하고자 하는 시료로부터 L1 유전자를 1차 PCR 증폭하는 단계; (2) 상기 1차 증폭된 L1 유전자 산물에 상기 표지자를 인식하는 엑소뉴클레아제를 가하여, 상기 표지자가 표지된 제2프라이머로부터 연장된 핵산가닥을 분해하여, 제1프라이머로부터 연장된 단일 가닥의 L1 유전자 산물을 수득하는 단계; (3) 상기 수득된 제1프라이머로부터 연장된 단일 가닥을 주형으로 하고, 엑소뉴클레아제에 의해 인식되는 표지자가 표지되지 않은 제2프라이머를 사용하여, L1 유전자를 단일가닥으로 2차 PCR 증폭하는 단계; (4) 상기 증폭된 단일가닥의 핵산을 인유두종바이러스 타입 검출용 탐침과 혼성화 반응시키는 단계; 및 (5) 상기 혼성화 반응물로부터 신호를 측정하여 인유두종바이러스 타입을 확인하는 단계를 포함하는, 인유두종바이러스 타입을 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명은 HPV L1 유전자 특이적인 제1프라이머, HPV L1 유전자 특이적이고 엑소뉴클레아제에 의해 인식되는 표지자가 표지된 제2프라이머, HPV L1 유전자 특이적이고 엑소뉴클레아제에 의해 인식되는 표지자가 표지되지 않은 제2프라이머, 인유두종바이러스 타입 검출용 탐침, 엑소뉴클레아제 및 반응 완충액을 포함하는 인유두종바이러스 타입 검출용 키트를 제공한다.
본 발명이 제공하는 인유두종바이러스 타입 검출용 탐침과 인유두종 바이러스 타입 검출 방법 및 키트를 이용하여 인유두종바이러스를 타입별로 정확하고 고감도로 검출할 수 있다. 본 발명은 인유두종바이러스가 증식되기 전에 미량 존재하는 인유듀종바이러스까지 조기 진단할 수 있는 정확도와 신뢰도가 높고 간단한 고감도의 검출 방법을 제공한다.
하나의 양태로서, 본 발명은 (1) 인유두종바이러스(HPV)의 L1 유전자에 특이적인 제1프라이머 및 인유두종바이러스(HPV)의 L1 유전자에 특이적이고 엑소뉴클레아제에 의해 인식되는 표지자가 표지된 제2프라이머를 사용하여, 분석하고자 하는 시료로부터 L1 유전자를 1차 PCR 증폭하는 단계; (2) 상기 1차 증폭된 L1 유전자 산물에 상기 표지자를 인식하는 엑소뉴클레아제를 가하여, 상기 표지자가 표지된 제2프라이머로부터 연장된 핵산가닥을 분해하여, 제1프라이머로부터 연장된 단일 가닥의 L1 유전자 산물을 수득하는 단계; (3) 상기 수득된 제1프라이머로부터 연장된 단일 가닥을 주형으로 하고, 엑소뉴클레아제에 의해 인식되는 표지자가 표지되지 않은 제2프라이머를 사용하여, L1 유전자를 단일가닥으로 2차 PCR 증폭하는 단계; (4) 상기 증폭된 단일가닥의 핵산을 인유두종바이러스 타입 검출용 탐침과 혼성화 반응시키는 단계; 및 (5) 상기 혼성화 반응물로부터 신호를 측정하여 인유두종바이러스 타입을 확인하는 단계를 포함하는, 인유두종바이러스 타입을 검출하는 방법에 관한 것이다.
상기 단계 (1)은 분석하고자 하는 시료로부터 인유두종바이러스(HPV)의 L1 유전자에 특이적인 제1프라이머 및 엑소뉴클레아제에 의해 인식되는 표지자가 표지된 제2프라이머를 사용하여 L1 유전자를 1차 PCR 증폭하는 단계에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, "시료"는 인유두종바이러스에 감염되거나 또는 감염이 의심되는 개체의 시료를 말한다. 상기의 시료는 인유두종바이러스 유전자를 포함하는 전혈, 혈장, 타액, 뇨, 객담, 림프액, 뇌척수액 및 세포간액과 같은 시료 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, "인유두종바이러스"는 파포바 바이러스(papova virus) 계열에 속하는 DNA 바이러스로서 72개의 외각 단위단백질체(capsomer)로 이루어진 20면체이며 7,900 개의 염기서열이 이중 원형 DNA로 이루어져 있다. HPV는 게놈(genome)을 구성하고 있는 염기서열의 유사성에 따라 120 여종의 다른 아형으로 나누어진다. 이들 120 여종의 아형 중 30여 종이 하부 생식기에 감염되는 것으로 알려져 있으며, 자궁경부 상피내 종양과 자궁경부암을 유발하는 위험 정도에 따라 HPV-16, HPV-18, HPV-26, HPV-30, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-52, HPV-53, HPV-56, HPV-57, HPV-58, HPV-59, HPV-67, HPV-68, HPV-73, HPV-74 등의 고 위험군(high risk type)과 HPV-2a, HPV-3, HPV-6, HPV-10, HPV-11, HPV-32, HPV-34, HPV-40, HPV-42, HPV-43, HPV-44. HPV-54, HPV-55, HPV-61, HPV-69, HPV-70등의 저위험군(low risk type)으로 나누어진다.
HPV의 게놈 구조는 크게 초기전사부위 E (early gene region)와 후기전사부위 L (late gene region), 그리고 발현되지 않는 부위인 LCR (long control region)으로 나누어지며, HPV의 게놈 구조는 발병의 양상과 위험 정도, 예후에 커다란 영향을 끼친다. 특히 초기전사부위 중 E6와 E7 유전자는 HPV가 감염 세포의 게놈 내로 들어가 머물러 있는 동안 발현(expression)되어 발암에 가장 중요한 역할을 한다. 즉, HPV-16, -18 등의 고 위험군에 속하는 HPV의 E6와 E7 유전자는 종양억제유전자(tumor suppressor gene)인 p53과 rb(retinoblastoma) 유전자에서 발현되는 단백질들과 각각 결합하여 이들 단백질들을 불활성화시키며, 그 결과 세포주기(cell cycle)의 조절과 세포사멸(apoptosis) 기전이 저해됨으로써 자궁경부의 정상세포가 암세포로 변형된다. 이에 반해 HPV-6, HPV-11 등의 저위험군에 속하는 HPV의 경우 종양억제 유전자들에서 발현되는 단백질들을 불활성화시키는 능력이 떨어지므로 자궁경부암을 유발하기 어렵다.
본 발명에서 용어, "L1 유전자"는 인유두종바이러스의 유전자 중 대부분을 차지하는 부분으로, 대부분의 인유두종바이러스에서 염기서열이 보존되어 있으며, HPV 타입간 변이가 존재한다. 인유두종바이러스의 캡시드 단백질의 대부분을 차지하고, HPV 감염 후기에 분화하는 상피세포에서 발현하며, 항원성이 가장 높은 부위이기도 하다.
본 발명에서 용어, "프라이머"는 상보적인 주형과 염기쌍을 형성할 수 있고, 주형가닥 복제를 위한 15개에서 30개의 염기로 구성된 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)이다. 프라이머는 보통 합성하지만 자연적으로 생성된 폴리뉴클레오티드(polynucletide)에서 이용할 수도 있다. 프라이머의 서열은 반드시 주형의 서열과 정확히 같을 필요는 없으며, 충분히 상보적이어서 주형과 혼성화될 수 있으면 된다. 바람직하게 본 발명의 프라이머는 인유두종바이러스의 L1 유전자 증폭용 프라이머, SP5+/6+, GP6+ 또는 SPF2일 수 있고, 더욱 바람직하게는 인유두종바이러스 L1 유전자에 특이적인 제1프라이머 및 엑소뉴클레아제에 의해 인식되는 표지자가 표지된 제2프라이머일 수 있으며, 공지된 방법에 의해 당업자가 용이하게 디자인할 수 있다.
구체적으로 HPV 타입에 상관없이 모든 타입의 HPV L1 유전자를 증폭할 수 있도록 고안된 정방향 및 역방향의 프라이머를 사용할 수도 있고, HPV 타입에 따라 L1 유전자 부위에 특이적으로 결합하는 복수개의 프라이머 혼합물을 사용할 수도 있다.
HPV 타입에 상관없이 L1 유전자 부위에 결합하는 프라이머로는 MY09/11 를 사용할 수 있고, HPV 타입에 따라 L1 유전자 부위에 특이적으로 결합하는 복수개의 프라이머 혼합물로는 PGMY09/11을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, SP5+/6+를 사용할 수도 있다. 본 발명의 구체예에서는 하기 표 1의 서열번호 1 내지 17로 이루어진 프라이머 혼합물을 사용하였다.
표 1
프라이머 서열(5'-3') 서열번호
PGMY09_F CGT CCC AAA GGA AAC TGA TC 서열번호 1
PGMY09_G CGA CCT AAA GGA AAC TGA TC 서열번호 2
PGMY09_H CGT CCA AAA GGA AAC TGA TC 서열번호 3
PGMY09_Ia G CCA AGG GGA AAC TGA TC 서열번호 4
PGMY09_J CGT CCC AAA GGA TAC TGA TC 서열번호 5
PGMY09_K CGT CCA AGG GGA TAC TGA TC 서열번호 6
PGMY09_L CGA CCT AAA GGG AAT TGA TC 서열번호 7
PGMY09_M CGA CCT AGT GGA AAT TGA TC 서열번호 8
PGMY09_N CGA CCA AGG GGA TAT TGA TC 서열번호 9
PGMY09_Pa G CCC AAC GGA AAC TGA TC 서열번호 10
PGMY09_Q CGA CCC AAG GGA AAC TGG TC 서열번호 11
PGMY09_R CGT CCT AAA GGA AAC TGG TC 서열번호 12
PGMY11_A GCA CAG GGA CAT AAC AAT GG 서열번호 13
PGMY11_B GCG CAG GGC CAC AAT AAT GG 서열번호 14
PGMY11_C GCA CAG GGA CAT AAT AAT GG 서열번호 15
PGMY11_D GCC CAG GGC CAC AAC AAT GG 서열번호 16
PGMY11_E GCT CAG GGT TTA AAC AAT GG 서열번호 17
제2프라이머는 엑소뉴클레아제에 의해 인식되는 표지자가 표지된 프라이머를 사용한다. 상기 엑소뉴클레아제에 의해 인식되는 표지자는 포스페이트일 수 있다. 제2프라이머는 정방향 프라이머 또는 역방향 프라이머일 수 있다. 혼성화 반응을 하는 탐침이 안티센스 가닥일 경우 엑소뉴클레아제에 의해 인식되는 표지자가 표지된, 또는 표지되지 않은 정방향의 프라이머를 이용하여 센스 가닥을 증폭시키고, 혼성화 반응을 하는 탐침이 센스 가닥일 경우 엑소뉴클레아제에 의해 인식되는 표지자가 표지된, 또는 표지되지 않은 역방향의 프라이머를 이용하여 안티센스 가닥을 증폭시키도록 한다. 본 발명의 구체적 실시예에서는 5' 말단이 포스페이트 표지된 제2프라이머로서 서열번호 1 내지 12로 구성된 군으로부터 선택된 프라이머를 5' 말단 포스페이트 표지하여 사용하였다.
상기 단계 (2)는 상기 1차 증폭된 L1 유전자 산물에 상기 표지자를 인식하는 엑소뉴클레아제를 가하여 반응시켜서, 상기 표지자가 표지된 제2프라이머로부터 연장된 핵산가닥을 분해하여 제1프라이머로부터 연장된 단일 가닥의 L1 유전자 산물을 수득하는 단계에 관한 것이다.
본 발명에서 핵산 가닥 분해는 엑소뉴클레아제를 이용하여 수행할 수 있다. 용어, "엑소뉴클레아제"는 핵산 즉, DNA 또는 RNA(ribonucleic acid)를 절단하는 효소로서, 말단을 절단하는 뉴클레아제이다. 본 발명의 구체예에서는 5' 말단이 포스페이트 표지된 프라이머로부터 연장된 핵산가닥에서 포스페이트기가 λ-엑소뉴클레아제에 친화성이 높다는 점을 이용하여 λ-엑소뉴클레아제를 이용해 5' 말단이 포스페이트 표지된 제2프라이머로부터 연장된 핵산 가닥을 제거하였다.
5' 말단이 포스페이트 표지된 프라이머에 의해 증폭된 가닥은 포스페이트 표지되지 않은 프라이머에 의해 증폭된 가닥에 비해 20배 정도 높은 λ-엑소뉴클레아제 친화성을 갖는 장점이 있다.
상기 단계 (3)은 상기 수득된 제1프라이머로부터 연장된 단일 가닥을 주형으로 하고 엑소뉴클레아제에 의해 인식되는 표지자가 표지되지 않은 제2프라이머를 사용하여 L1 유전자를 단일가닥으로 2차 PCR 증폭하는 단계에 관한 것이다.
인유두종바이러스 타입 검출용 탐침과 혼성화시킬 핵산 단일 가닥을 표지시키기 위한 단계로서, 상기 단계 2에서 λ-엑소뉴클레아제에 의해 제거되고 남은 핵산가닥을 주형으로 하고, 포스페이트 표지되지 않은 제2프라이머를 사용하여 PCR 반응을 수행하는 단계이다. λ-엑소뉴클레아제에 의해 상보가닥이 제거된 단일가닥 주형을 사용하므로 프라이머와 혼성화되는 효율이 높은 것이 특징이다. 상기 프라이머는 L1 유전자에 특이적인 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드이면 제한없이 사용가능하며, 포스페이트 표지되지 않은 제2프라이머를 사용할 수 있다. 본 발명의 구체예에서는 제2프라이머로서 서열번호 1 내지 12 로 구성되는 군으로부터 선택되는 프라이머를 사용하였다. 비오틴으로 표지된 dNTP 존재하에 PCR을 수행함으로써 핵산 단일 가닥을 비오틴으로 표지하였다.
상기 단계 (4)는 상기 증폭되고 표지된 단일가닥 핵산을 인유두종바이러스 타입 검출용 탐침과 혼성화 반응시키는 단계에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, "탐침"은 DNA 또는 RNA의 핵산과 특이적으로 상보적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 HPV 타입별로 표지되어 있어서 특정 타입의 HPV의 존재 유무를 확인할 수 있다. 탐침은 올리고뉴클레오티드 탐침, 단일가닥 DNA(single stranded DNA) 탐침, 이중가닥 DNA(double stranded DNA) 탐침, RNA 탐침 등의 형태로 제작될 수 있으나, 바람직하게는 단일가닥 탐침을 사용할 수 있다. 본 발명에서는 포스페이트 표지된 프라이머를 이용하여 시료내 HPV L1 유전자를 증폭하고 엑소뉴클레아제로 포스페이트 표지된 핵산 가닥을 분해하여 최종적으로 HPV L1 유전자에 해당하는 단일 가닥 핵산만을 증폭시켰으므로 단일가닥 탐침과의 혼성화 반응시 반응 효율이 높다. 이중 가닥 핵산의 경우, 고온 조건에서의 변성(denaturation) 단계를 거쳐야하고, 일단 변성시킨 후에도, 이중 가닥끼리의 상보적 재결합과 탐침과의 결합 사이에 경쟁이 발생하므로 혼성화 반응 효율이 낮아지는 문제가 있다.
탐침과의 혼성화 여부를 통해 인유두종바이러스 감염 여부를 진단할 수 있고, 적당한 탐침의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다. 본 발명의 탐침은 HPV L1 유전자 서열 중 인유두종바이러스 타입의 특이적 검출이 가능한 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드이면 제한없이 사용 가능하며, 타입별 HPV L1 유전자 서열을 고려하여 다른 타입의 HPV와 교차반응이 거의 없도록 제조될 수 있다. 바람직하게는 서열번호 18 내지 서열번호 43으로 구성된 군으로부터 선택된 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 18로 표시되는 타입 16 검출용 탐침 및 서열번호 19로 표시되는 타입 18 검출용 탐침일 수 있다.
본 발명에서는 GAPDH 유전자를 내부 대조군(internal control)으로 사용하였다. GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)는 인간 염색체 12번에 위치하는 유전자로서 세포에서 필수적인 대사과정인 해당작용(glycolysis)에 관여하는 효소이며, 세포내에서 항상 발현되면서 그 발현량이 잘 변하지 않는 유전자이다. GADPH 유전자를 검출하기 위한 GAPDH 유전자 검출용 탐침은 상기 L1 유전자 검출용 탐침과 동시에 혼성화시킨다. 이 과정을 통해 PCR 반응이 성공적으로 일어나는지 여부를 비즈 어레이 분석기 내에서 곧바로 확인할 수 있으므로 PCR 증폭실패에 따른 불검출 경우의 수를 대폭 낮출 수 있다.
본 발명의 프라이머 또는 탐침은 포스포르 아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 또한, 본 발명에서 제공하는 각 탐침은 다음과 같은 변형이 가능하다. 탐침의 5' 말단쪽으로 5 내지 20개의 티민(dTTP) 서열을 포함할 수 있다. 또한, 5' 말단에 비드의 카르복실기와 공유결합할 수 있는 아민기를 가질 수 있다. 아민기는 바람직하게는 (CH2)n사슬을 통하여 연결된다. 이 때, n은 5 내지 10, 보다 바람직하게는 5 내지 7이다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는, 각 탐침은 15개의 티민(dTTP)기를 가지고 (CH2)6 사슬과 아민기를 가지도록 제조되었다. 그 외에도, 탐침의 핵산 서열은 당해 분야에 공지된 다양한 변형이 가능하다. 탐침은 비드에 결합된 비드어레이 형태로 제공될 수 있다. 비드의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 당 기술분야에 공지된 일반적 방법에 따른다.
상기 단계 (5)는 상기 혼성화 반응물로부터 신호를 측정하여 인유두종바이러스 타입을 확인하는 단계를 포함하는, 인유두종바이러스 타입을 검출하는 방법에 관한 것이다.
단일가닥 L1 유전자의 확인을 위해 당업계에 공지된 다양한 형태의 검출 표지자로 표지하는 단계를 추가로 수행할 수 있으며, 사용 가능한 검출 표지자로는 싸이3(Cy3), 싸이5(Cy5), 플루오레세인 아이소티오시안산염(FITC), 테트라메틸로다민 아이소티오시안산염(RITC), 알렉사(Alexa), 4,4,-다이플루오로-4-보로-3a,4a-다이아자-s-인다센(BODIPY), 또는 텍사스 레드(Texas Red) 등이 있으며 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 구체예에서는 비오틴 표지된 dNTP 존재하에 PCR 반응을 수행하여 핵산가닥을 비오틴으로 표지한 후, 검출 표지자 결합된 스트렙타아비딘을 이용하여 신호를 측정하였다.
단계 (3) 내지 (4)에서 상기 탐침과 시료내 HPV L1 유전자 증폭 산물과의 반응정도를 스트렙타아비딘과 결합된 형광물질을 처리하여 형광의 강도로 확인할 수 있으며, 스트렙타아비딘은 비오틴과 특이적으로 결합하므로 시료 중 존재하는 L1 유전자를 형광으로 측정가능하다.
본 발명의 5' 말단이 포스페이트 표지된 프라이머를 이용하고, 비오틴 표지된 dNTP를 사용하여 증폭된 인유두종바이러스 L1 유전자를 이용한 인유두종바이러스 타입 검출 방법은 다양한 인유두종바이러스 타입을 고감도로 검출할 수 있으며, 특히 고위험군에 속하는 인유두종바이러스 타입 16 및 타입 18에 대하여 고감도로 검출할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 태양은 HPV L1 유전자 특이적인 제1프라이머, HPV L1 유전자 특이적이고 엑소뉴클레아제에 의해 인식되는 표지자가 표지된 제2프라이머, HPV L1 유전자 특이적이고 엑소뉴클레아제에 의해 인식되는 표지자가 표지되지 않은 제2프라이머, 인유두종바이러스 타입 검출용 탐침, 엑소뉴클레아제 및 반응 완충액을 포함하는 인유두종바이러스 타입 검출용 키트를 제공한다.
본 발명에서 용어, "제1프라이머" 및 "제2프라이머"는 상기에서 설명한 바와 같다.
또한, 본 발명에서 용어, "인유두종 타입 검출용 탐침"은 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 키트는 인유두종바이러스의 mRNA 또는 DNA 수준을 확인하여 특정 타입의 인유두종바이러스 감염 여부 및 의심개체를 진단할 수 있다. 본 발명의 키트에는 상기 핵산의 수준을 측정하기 위한 HPV L1 유전자 특이적인 제1프라이머, 엑소뉴클레아제에 의해 인식되는 표지자가 표지된 제2프라이머, 엑소뉴클레아제에 의해 인식되는 표지자가 표지되지 않은 제2프라이머, 인유두종바이러스 타입 검출용 탐침, 뉴클레아제 및 반응 완충액 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다. 상기 프라이머는 L1 유전자에 특이적으로 결합 가능한 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드이면 제한없이 사용가능하며, 바람직하게는 서열번호 1 내지 서열번호 17 로 구성된 군으로부터 선택된 것이거나, 서열번호 1 내지 서열번호 17로 구성될 수 있다.
또한, 상기 탐침은 인유두종바이러스 L1 유전자 부위에 특이적으로 결합가능한 것이면 당업자에 의해 용이하게 제작될 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 18 내지 서열번호 43으로 구성된 군으로부터 선택된 탐침일 수 있고, 더욱 바람직하게는 서열번호 18로 표시되는 타입 16 검출용 탐침 또는 서열번호 19로 표시되는 타입 18검출용 탐침일 수 있다.
본 발명에서 상기 인유두종바이러스 타입 검출용 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 L1 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-중합효소 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-물(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 키트는 양성 및 음성 대조군을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 마이크로어레이 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 마이크로어레이 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 탐침으로 부착되어 있는 기판을 포함하고 기판은 정량 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 마이크로어레이 칩은 인유두종바이러스의 유전자 또는 그 단편에 해당하는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된 인유두종바이러스 타입 검출용 키트일 수 있다. 상기 올리고 뉴클레오티드 또는 이의 상보가닥 분자는 상기 HPV L1 유전자의 18 내지 30개의 핵산을 포함하고, 바람직하게는 20 내지 25개의 핵산을 포함할 수 있다. 본 발명의 마이크로어레이 칩은 당업계에서 통상적으로 사용되는 제조 방법에 의하여 용이하게 제조될 수 있다. 마이크로어레이 칩을 제작하기 위해서, 탐침 DNA 분자를 DNA 칩의 기판상에 고정화시키기 위해 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting)법 또는 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 마이크로어레이 칩의 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-Llysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 활성기가 코팅된 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막 및 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 키트는 비드어레이를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 비드어레이 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 핵산을 포함하는 마이크로 비드를 탐침으로서 포함하고 정량 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 핵산을 포함하는 마이크로 비드를 포함할 수 있다. 본 발명의 비드어레이 키트는 당업계에서 통상적으로 제조되는 방법에 따라 용이하게 제조될 수 있다. 구체적으로, 상기 마이크로 비드는 폴리스티렌(polystyrene), 폴리메틸 메타크릴레이트(polymethyl methacrylate), 라텍스(latex), 실리카(silica), 폴리비닐톨루엔(polyvinyltoluene), 스티렌비닐톨루엔 중합체(styrenevinyltoluene), 스타렌부타디엔 중합체(styrene-butadien)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 그리고, 상기 마이크로 비드의 크기에는 제한이 없으며, 비드의 표면이 개질되지 않은 것과 카르복실기로 개질된 것을 모두 사용할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 키트는 단일가닥 L1 유전자의 확인을 위해 당업계에 공지된 다양한 형태의 검출 표지자를 표지하는 단계를 추가로 수행할 수 있으며, 사용 가능한 검출 표지자로는 싸이3(Cy3), 싸이5(Cy5), 플루오레세인 아이소티오시안산염(FITC), 테트라메틸로다민 아이소티오시안산염(RITC), 알렉사(Alexa), 4,4,-다이플루오로-4-보로-3a,4a-다이아자-s-인다센(BODIPY), 또는 텍사스 레드(Texas Red) 등이 있으며 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 비오틴 표지된 dNTP 존재하에 PCR을 수행하기 위하여 필요한 구성요소를 추가로 포함하는 키트일 수 있다. 또한, 마이크로어레이 칩은 36 k Human V4.0 OpArray 올리고마이크로어레이(Operon, Germany) 또는 Whole human genome oligo microarray(Agilent, USA) 등을 사용할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1-1 : 탐침의 작제
분석키트에 포함된 비드어레이는 HPV 의 L1유전자 부위를 포함하여, 5' 말단에 15 개의 티민 (dTTP), 6개의 CH2 사슬 및 아민(amine)기를 포함하는 20-27 mer의 올리고뉴클레오타이드 탐침이 비드에 고정되어 있다.
사용한 선별용 탐침은 하기 표 2와 같다.
표 2
탐침 1 type 16 5'-(T)15-TGTGCTGCCATATCTACTTCAGA -3' (서열번호 18)
탐침 2 type 18 5'-(T)15-AGTCTCCTGTACCTGGGCAA -3' (서열번호 19)
탐침 3 type 31 5'-(T)15-GTGCTGCAATTGCAAACAGT -3' (서열번호 20)
탐침 4 type 33 5'-(T)15-TGCACACAAGTAACTAGTGACAGTACA -3' (서열번호 21)
탐침 5 type 35 5'-(T)15-CTGTGTGTTCTGCTGTGTCTTCT -3' (서열번호 22)
탐침 6 type 39 5'-(T)15-TTCCATACCTTCTACATATGATCCTTC -3'(서열번호 23)
탐침 7 type 52 5'-(T)15-GCTGAGGTTAAAAAGGAAAGCA -3' (서열번호 24)
탐침 8 type 45 5'-(T)15-CACAAAATCCTGTGCCAAGT -3' (서열번호 25)
탐침 9 type 51 5'-(T)15-ATTAGCACTGCCACTGCTGC -3' (서열번호 26)
탐침 10 type 59 5'-(T)15-TTCTGTGTGTGCTTCTACTACTTCTTC -3'(서열번호 27)
탐침 11 type 53 5'-(T)15-CCGCAACCACACAGTCTATG -3' (서열번호 28)
탐침 12 type 54 5'-(T)15-CATCCACGCAGGATAGCTTT -3' (서열번호 29)
탐침 13 type 56 5'-(T)15-CAGTTAAGTAAATATGATGCACGAAAA -3'(서열번호 30)
탐침 14 type 58 5'-(T)15-TGCACTGAAGTAACTAAGGAAGG -3' (서열번호 31)
탐침 15 type 66 5'-(T)15-AACTAAATATGATGCCCGTGAAA -3' (서열번호 32)
탐침 16 type 68 5'-(T)15-TCAGCTGTACCAAATATTTATGATCC -3' (서열번호 33)
탐침 17 type 06 5'-(T)15-GCATCCGTAACTACATCTTCCA -3' (서열번호 34)
탐침 18 type 11 5'-(T)15-TGTGCATCTGTGTCTAAATCTGC -3' (서열번호 35)
탐침 19 type 34 5'-(T)15-TCCACAAGTACAACTGCACCA -3' (서열번호 36)
탐침 20 type 40 5'-(T)15-CCCACACCAACCCCATATAA -3' (서열번호 37)
탐침 21 type 42 5'-(T)15-CCACTGCAACATCTGGTGAT -3' (서열번호 38)
탐침 22 type 43 5'-(T)15-CTGACCCTACTGTGCCCAGT -3' (서열번호 39)
탐침 23 type 44 5'-(T)15-CACTACACAGTCCCCTCCGT -3' (서열번호 40)
탐침 24 type 70 5'-(T)15-AACGGCCATACCTGCTGTAT -3' (서열번호 41)
탐침 25 type 55 5'-(T)15-GCTACAACTCAGTCTCCATC -3' (서열번호 42)
탐침 26 type 67 5'-(T)15-AGG AAA AAT CAG AGG CTA CAT A -3' (서열번호 43)
실시예 1-2 : 비드 어레이의 제작
이러한 탐침을 이용하여 각 준비된 비드(xMAP carboxylated microspheres; Luminex Corp. Austin, TX)를 이용하여 비드에 탐침을 붙이는 작업을 통해 비드어레이를 제작하였다.
1) 상기 실시예 1-1 에서 작제된 탐침을 이용하여 각각 100 uM 로 탐침을 녹여 준비하였다.
2) 각 탐침에 따라 각각 다른 번호의 비드를 준비하고, 반응하고자 하는 비드를 각 번호에 맞추어 잘 혼합한 후 각각 40 ul를 따내어 새 튜브에 옮겼다.
3) 0.1 M MES (pH 4.5) 20ul를 섞고 준비된 탐침을 2ul 덜어서 비드와 섞었다.
4) 이후 새로 만든 10 ml/ml EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide HCl, PIERCE) 용액 1ul 를 넣고 반응하였다.
5) 어두운 곳에서 약 30분간 잘 흔들어 반응시켰다.
6) 다시 새로 만든 10 ml/ml EDC 용액 1ul를 추가로 넣고, 약 20분간 더 반응하였다.
7) 이후 각 튜브에 500 ul 의 0.02% Tween-20 용액을 넣어서 잘 섞어주었다.
8) 각 튜브의 비드를 원심분리하여 상층액을 걷어주고, 다시 500ul 의 0.1% SDS 용액으로 잘 혼합하였다.
9) 각 튜브의 비드를 8번과 같이 원심분리하여 상층액을 걷어주었다.
10) 이후 150 ul 의 TE(pH 8.0) 버퍼에 녹여 잘 섞은 후, 4℃ 암실에서 보관하였다.
실시예 2: 비드 어레이를 이용한 HPV의 유전형의 분석
실시예 2-1 : 시료에서 DNA 추출
시료의 DNA를 분리하기 위해, 면봉으로 질 내벽을 긁어낸 샘플을 세포 용해 용액(lysis solution) 400 ul 에 풀어내고 이를 프로테이나아제 K(20mg/ml) 10 ul를 첨가 후, 58℃에서 1시간 반응시킨 후, 끓는 물에 15분간 반응하여 준비하였다. HPV 18번의 L1 유전자가 클로닝된 플라스미드 (5X103부터 5X105 copy)와 HPV 16번 이 감염된 CaSki 자궁경부암 세포주와 HPV 음성인 자궁경부암 세포주 C33A의 유전체 DNA(genomic DNA) 200ng 사용하였다.
실시예 2-2 : DNA 에서 HPV 유전자의 증폭
HPV 검출 및 유전형 분석을 위해, 실시예 2-1 에서 준비한 DNA 5 ul 를 주형으로 하고, HPV 프라이머 세트 0.4 uM, 0.1mM dNTP mix, 7.5mM Tris HCl(pH 9.0), 0.2mM MgCl2, 5 mM KCl, 2mM (NH4)2SO4, Taq 폴리머라아제 (Ultratools ,Spain) 1U 로 하여 증폭하였다. 이때 사용한 프라이머의 염기서열은 서열번호 1 내지 서열번호 17의 프라이머 혼합물을 사용하였다. 서열번호 1 내지 12로 구성된 군으로부터 선택된 프라이머는 5' 말단 포스페이트 표지하여 사용하였다.
PCR 반응 조건은 다음과 같았다; 95℃ 에서 5분 1 사이클 이후, 91℃ 에서 60 초, 55℃ 에서 60 초, 72℃ 에서 60초 조건으로 40 사이클 수행 후, 72℃에서 7분 반응하였다.
실시예 2-3: 인산화된 핵산 가닥의 제거
엑소뉴클레아제 6 ㎕, 완충액(10X) 1.5 ㎕, 증류수 2.5 ㎕의 조건으로 1차 PCR 산물에 10㎕ 넣어 준 후 37℃에서 30분간 인큐베이션한 후 80℃에서 15분 동안 활성화 효소 반응시켰다. 본 과정에서는 람다 엑소뉴클레아제를 이용하는데, 이 효소는 포스페이트로 표지된 이중가닥 DNA를 인지하고 포스페이트 표지된 가닥(strand)만 분해한다. 본 과정에서 람다 엑소뉴클레아제를 넣어 이것이 이중 가닥 L1 산물(Double strand L1 product)에서 포스페이트 표지된 것을 인식하여 분해시키도록 하였다.
실시예 2-4 : 2nd 단일가닥 PCR 표지 반응
본 발명에서는 2nd 단일가닥 PCR 표지 반응을 통해서 탐침 혼성화 반응에 사용할 증폭산물을 표지하였다.
표지를 위해 실시예 2-3에서 형성된 산물 5ul 를 사용하고, 서열번호 1 내지 12의 프라이머 0.5 uM, 50 uM dATP, GTP, TTP mix, 20 uM biotin-dCTP(Invitrogen), 7.5mM Tris HCl(pH 9.0), 0.2mM MgCl2, 5 mM KCl, 2mM (NH4)2SO4, Taq polymerase (Ultratools, Spain) 1U 로 하여 단일가닥 선형 증폭을 수행하였다.
PCR 반응 조건은 다음과 같았다; 94℃ 에서 5분간 1 사이클을 하고, 94℃ 에서 30초, 55℃에서 60초, 72℃ 에서 120초씩 35 사이클 후 72℃에서 7분 반응하였다.
실시예 2-5 : 비드 어레이를 이용한 혼성화반응
실시예 1 에서 제조한 혼성비드에 상기 실시예 2-1 내지 2-4에서 가공된 시료 유전자를 혼성화 버퍼(50% 포름아미드, 1x Denhardt's, 6xSSC, 0.1% SDS, 250 ug/ml 연어 정자 DNA)에 녹인 후 서로 혼성화 반응을 하여주었다. 95℃ 에서 5분간 반응 후, 37℃ 에서 60분간 반응하였다. 이에 96 웰 필터 플레이트로 시료를 비드와 같이 동시에 옮긴 후, TE 버퍼를 이용하여 3번 세척하였다. 세척 후 스트렙타비딘 피코에리트린(시그마알드리치, S3402) 을 500배 희석한 용액 100 ul를 사용하여 15분간 암실에서 교반시켜주었다.
실시예 2-6 : 비드 어레이의 시그날 검출
이렇게 준비된 혼성비드 샘플을 이용하여 Luminex 100 기계에서 웰 별로 비드를 읽는다. Luminex 100은 2개의 레이저를 이용하여 한 개는 비드 번호를 한 개는 반응된 피코에리트린의 양을 계산하여 수치로 나타내었다. 총 26종류의 비드를 읽으며 각각의 HPV 유전형의 판정은, HPV 유전형을 대표하는 비드의 MFI 값으로 대변되고, 이를 통해 HPV의 유전형을 판정하였다.
실시예 3: 실험결과
프라이머의 5' 말단에 포스페이트 표지(phosphate modification)하여 실시한 조건과 표지하지 않은 조건을 비교하였다. 하기 표 3 및 4에 나타난 바와 같이, HPV 음성인 자궁경부암 세포주 C33A 에서는 GAPDH 만 검출 되었으며, HPV 16번이 감염된 CaSki 세포주에서는 HPV 16과 내부 대조군인 GAPDH가 검출 되었으며, 다른 타입의 HPV는 검출되지 않았다. 따라서 본 발명에 의해 HPV의 특이적인 유형 검출이 가능함을 보여주고 있다. 또한, HPV 18 번의 농도별 플라스미드를 이용하여 PGMY09 프라이머의 5' 부위를 포스페이트 표지한 조건의 경우 포스페이트 표지하지 않은 조건과 비교하여, 최종 신호가 플라스미드의 농도에 따라 각각 20.7, 2.1 및 1.1배로 향상되었다. 주목할 만한 결과는 낮은 농도(5X103 copy)의 플라스미드를 사용한 경우 신호가 20배 이상 증가하는 것이다. 높은 농도의 경우도 신호 향상이 관찰되었으나, 이미 신호가 포화상태(saturation)에 가까워지면서 신호의 상승률이 낮아지는 것으로 판단된다. 본 발명의 5' 말단이 포스페이트 표지된 프라이머를 사용하는 경우 고위험군 인유두종바이러스 타입 16 및 18을 특이적이며 고감도로 검출할 수 있고, 특히 인유두종바이러스가 증식되기 전에 미량 존재하는 인유듀종바이러스까지 조기 진단할 수 있다.
표 3
GAPDH HPV 6 HPV 11 HPV 16 HPV 18 HPV 31 HPV 33 HPV 34 HPV 35 HPV 39 HPV 40 HPV 42 HPV 43
No modificated primer(MY09/11, GAPDH) 5X10^3 41 8 11 17 184 14 10 19 8 10 12 10 12
5X10^4 33 25 29 46 1,620 29 22 33 23 19 43 24 26
5X10^5 23 18 19 42 3,954 24 20 30 17 17 28 18 19
c33a 2,048 5 5 9 6 6 12 13 5 5 10 5 6
caski 131 13 12 2,686 15 15 24 24 13 9 22 13 13
5' phosphate modificated primer(MY09/11, GAPDH) 5X10^3 108 12 11 22 3,805 12 10 22 10 10 21 8 11
5X10^4 40 15 16 31 3,951 16 15 26 14 12 34 15 13
5X10^5 22 15 18 29 4,574 17 15 26 14 13 48 16 17
c33a 2,968 5 5 10 5 6 7 15 5 4 9 5 6
caski 190 13 13 6,115 14 14 20 26 12 12 24 12 13
표 4
HPV 44 HPV 45 HPV 51 HPV 52 HPV 53 HPV 54 HPV 55 HPV 56 HPV 58 HPV 59 HPV 66 HPV67 HPV68 HPV70
No modificated primer(MY09/11, GAPDH) 5X10^3 31 10 12 11 11 35 9 10 20 17 16 20 17 10
5X10^4 48 26 26 27 29 55 23 27 47 45 44 52 30 23
5X10^5 43 21 20 20 22 45 22 22 40 41 34 39 22 18
c33a 22 5 6 6 7 27 5 10 11 9 8 11 11 17
caski 33 11 14 14 13 37 13 15 25 22 18 22 19 13
5' phosphate modificated primer(MY09/11, GAPDH) 5X10^3 34 11 14 12 13 39 11 13 21 21 22 24 17 12
5X10^4 42 15 19 15 19 44 14 16 30 27 28 34 21 14
5X10^5 41 17 21 17 21 45 16 17 30 30 25 32 22 15
c33a 29 5 6 5 6 32 5 8 12 12 11 13 13 16
caski 37 16 14 14 15 39 14 16 29 27 21 29 20 13

Claims (13)

  1. (1) 인유두종바이러스(HPV)의 L1 유전자에 특이적인 제1프라이머 및 인유두종바이러스(HPV)의 L1 유전자에 특이적이고 엑소뉴클레아제에 의해 인식되는 표지자가 표지된 제2프라이머를 사용하여, 분석하고자 하는 시료로부터 L1 유전자를 1차 PCR 증폭하는 단계;
    (2) 상기 1차 증폭된 L1 유전자 산물에 상기 표지자를 인식하는 엑소뉴클레아제를 가하여, 상기 표지자가 표지된 제2프라이머로부터 연장된 핵산가닥을 분해하여, 제1프라이머로부터 연장된 단일 가닥의 L1 유전자 산물을 수득하는 단계;
    (3) 상기 수득된 제1프라이머로부터 연장된 단일 가닥을 주형으로 하고, 엑소뉴클레아제에 의해 인식되는 표지자가 표지되지 않은 제2프라이머를 사용하여, L1 유전자를 단일가닥으로 2차 PCR 증폭하는 단계;
    (4) 상기 증폭된 단일가닥의 핵산을 인유두종바이러스 타입 검출용 탐침과 혼성화 반응시키는 단계; 및
    (5) 상기 혼성화 반응물로부터 신호를 측정하여 인유두종바이러스 타입을 확인하는 단계를 포함하는, 인유두종바이러스 타입을 검출하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 서열번호 17로 구성된 군으로부터 선택된 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 서열번호 17의 혼합물인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 제2프라이머는 서열번호 1 내지 서열번호 12로 구성된 군으로부터 선택된 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 제2프라이머는 서열번호 1 내지 서열번호 12의 혼합물인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 표지자는 포스페이트인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 표지자를 인식하는 엑소뉴클라아제는 람다 엑소뉴클라아제인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 단계 (3)에서 비오틴 표지된 dNTP 존재하에 PCR을 수행하는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 단계 (4)의 인유두종바이러스 타입 검출용 탐침은 서열번호 18 내지 서열번호 43으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 단계 (4)의 인유두종바이러스 타입 검출용 탐침은 서열번호 18로 표시되는 타입 16 검출용 탐침 및 서열번호 19로 표시되는 타입 18 검출용 탐침으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 탐침이 비드에 결합된 형태인 방법.
  12. HPV L1 유전자 특이적인 제1프라이머, HPV L1 유전자 특이적이고 엑소뉴클레아제에 의해 인식되는 표지자가 표지된 제2프라이머, HPV L1 유전자 특이적이고 엑소뉴클레아제에 의해 인식되는 표지자가 표지되지 않은 제2프라이머, 인유두종바이러스 타입 검출용 탐침, 엑소뉴클레아제 및 반응 완충액을 포함하는 인유두종바이러스 타입 검출용 키트.
  13. 제12항에 있어서, 비오틴 표지된 dNTP를 추가로 포함하는 것인 키트.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR100702415B1 (ko) * 2006-03-03 2007-04-09 안웅식 올리고 핵산 탐침 비드 어레이를 이용한 인유두종바이러스검출 키트 및 방법
KR100988755B1 (ko) * 2007-12-28 2010-10-26 대한민국 네스티드 рсｒ을 이용한 ｈｐｖ ｌ1 유전자 검출방법

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113584225A (zh) * 2021-07-27 2021-11-02 赵飞 一种检测hpv病毒的引物和探针组合及其分型检测的试剂、应用
CN113584225B (zh) * 2021-07-27 2022-06-28 赵飞 一种检测hpv病毒的引物和探针组合及其分型检测的试剂、应用

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