KR20180007432A - Hpv 지노타이핑 다중분석 루미넥스 키트 및 이를 이용한 인유두종 바이러스의 유전자 검출 방법 - Google Patents

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Abstract

본원 발명은 자궁경부암의 주원인인 인유두종 바이러스의 핵산과 특이적으로 결합하는 프로브 21종을 4.5um의 폴리스틸렌 비드에 각 HPV L1 유전자의 타입에 대해 특이적으로 고안된 HPV 특이적인 프로브와 결합시켜 바이오틴으로 표지된 HPV L1 PCR 산물과 교잡반응시킨 후, streptavidin-PE와 반응시켜 Luminex 장비를 이용하여 자궁경부암과 관련된 인유두종 바이러스 유전자형을 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 HPV 지노타이핑 다중분석 루미넥스 키트 및 그 방법에 관한 것이다.

Description

HPV 지노타이핑 다중분석 루미넥스 키트 및 이를 이용한 인유두종 바이러스의 유전자 검출 방법 {Multianalytical HPV Genotyping Luminex kit and HPV gene Detection Method Thereof}
본 발명은 자궁경부암과 관련된 인유두종 바이러스(HPV)유전자형을 신속하고 정확한 검출방법 및 HPV 지노타이핑 다중분석 루미넥스 키트에 관한 것으로 더욱 상세하게는, 자궁경부암의 주원인인 인유두종 바이러스의 핵산과 특이적으로 결합하는 프로브 21종을 4.5um의 폴리스틸렌 비드에 각 HPV L1 유전자의 타입에 대해 특이적으로 고안된 HPV 특이적인 프로브와 결합시켜 바이오틴으로 표지된 HPV L1 PCR 산물과 교잡반응시킨 후, streptavidin-PE와 반응시켜 Luminex 장비를 이용하여 자궁경부암과 관련된 인유두종 바이러스 유전자형을 신속 정확한 검출 방법 및HPV 지노타이핑 다중분석 루미넥스 키트에 관한 것이다.
2007년에 발표된 국립암센터 암발생 통계자료에 의하면 자궁경부암은 여성에게서 암 발생률 4위로, 여성암의 9.5%에 해당되고 있다. 그러나 자궁경부암은 조기 진단시 완치 및 예방이 가능하므로, 자궁경부암의 주원인으로 알려진 인유두종바이러스의 감염여부와 타입을 명확히 알아내는 것은 첫 번째로 자궁경부 형성이상 및 자궁경부암을 검진할 수 있으며, 둘째, 저등급 자궁경부 형성이상을 가진 여성의 추적검사, 마지막으로 원추절제술과 같은 보존적 수술 (conservative surgical treatment)후 추적 검사로 활용할 수 있다는 점에서 무엇보다 중요하다. 현재 자궁경부암을 조기에 발견하는데 가장 많이 사용되고 있는 선별검사는 자궁경부 세포검사(PAP smear)로 자궁경부에서 채취한 세포를 염색한 후 해부병리의사 또는 세포전문기사(cytology)가 검사하여 암세포를 찾아내는 방법이다. 이 방법은 간편하고 경제적이어 현재 국내에서만 연간 백만 건 정도가 시행되며 이를 통하여 조기 진단이 가능해지고 자궁경부암에 의한 사망률을 크게 감소시키는데 기여하였다. 그러나 기존의 세포검사와 면역조직 화학염색법에 의한 자궁경부암 선별 검사법은 암 유발 요인인 고위험 인유두종바이러스 감염을 알 수 없다는 한계가 있다.
인유두종바이러스는 사람의 편평상피를 침범하는 직경 55 nm 크기의 약 8 Kb의 genome을 가진 double strand circular DNA 바이러스로 자궁경부암의 95 % 이상에서 발견된다. 현재까지 약 120 종의 인유두종바이러스 아형이 알려져 있으며, 이중 40개 이상의 아형이 자궁경부암과 관련되는 것으로 보고되고 있다. 인유두종바이러스 아형은 지역에 따라 각기 다른 분포를 보이며 감염 후, 발생까지의 기간도 아형에 따라 3-15년까지 다양하다. 인유두종 바이러스의 감염은 침윤성 자궁경부암이나 그의 전구병변의 발생에 필수 단계이며, 자궁경부암 환자의 95%에서 검출이 되는 것으로 알려져 있다. 또한 현재 자궁경부에 병변은 없지만 HPV에 감염되어 있는 경우 향후 자궁경부상피 내 병변이 발생할 위험이 증가한다. 이러한 HPV 와 자궁암과의 인과관계는 이미 많은 문헌을 통하여 입증되었다. 인유두종 바이러스는 현재까지 118종에 달하는 유전형이 생물학적 특성, 계통 발생적 지위, 그리고 암 유발 가능성에 의하여 분류되어 있는데, 이중 약 40종이 생식기 감염과 관련이 있는 것으로 알려져 있다.이중 암이나 전암성 병변의 발생과 관련이 있는 인유두종 바이러스는 고위험군 (HPV-16,-18, -31, -33, -35, -39, -45, -51, -52, -56,-58, -59, -66, -68, -69)으로 분류하고, 주로 양성 종양의 일종인 유두종을 일으키는 인유두종 바이러스는 저위험군 (HPV-6, -11, -34, -40, -42, -43, -44) 으로 분류하고 있다
이러한 인유두종바이러스를 검출하는 방법으로는 중합효소연쇄반응법 (PCR), In situ hybridization, Hybrid Capture II, 그리고 HPV DNA chip 등이 임상검사나 연구 목적으로 이용되고 있다. 이중 PCR은 높은 민감도를 가지고 있으나 다양한 HPV 아형을 진단하기 위해서는 적절한 primer를 여러 번에 걸쳐 사용해야 하므로, 대량의 검체를 처리해야 하는 임상적 목적으로 사용하기에는 현재까지는 한계가 있었다. In situ hybridization은 조직병변을 유지하면서 세포내의 특정 핵산을 인식하는 방법으로 높은 특이도를 가지고 있으나 민감도가 떨어지는 단점이 있다. HC-II assay는 검사방법이 kit로 되어 있어 외래에서 채취한 검체를 쉽게 진단할 수 있는 장점이 있어 널리 사용되고 있다. 또한 적절한 민감도와 특이도를 갖고 있어 자궁경부암의 선별검사로서 임상적유용성이 크며, FDA에 의해 공인되었지만, 이 검사 또한 감염된 각각의 HPV 아형을 구분할 수 없다는 단점이 있다.
루미넥스 xMAP 기술은 유세포분석기, 마이크로 비드, 레이저, 디지털 시그널 프로세싱과 전통적인 화학분야가 결합된 매우 독창적인 기술로서 96-well plate의 각각의 well에서 100가지의 생물학적 분석체를 동시에 분석할 수 있는 다중분석기술이다. xMAP 기술은 다양한 생물학적 분석을 빠르고, 정확하게 그리고 비용면에서도 효과적으로 수행 할 수 있다. 뿐만 아니라 다중 분석을 통해 비슷한 다른 방법과 비교하여 시험에 들어가는 시간과 비용을 절감할 수 있다. 이외에도 용액상에서 반응을 유도하므로 빠른 반응을 유도할 수 있으므로 고형의 어레이에 비해 재현성이 높다는 다양한 장점을 가지고 있다.
루미넥스사의 x-MAP 기술의 장점을 정리하면 다음과 같다.
첫째, 속도/고속 탐색기술로 각각의 마이크로 비드는 하나의 테스트를 의미하므로 동시에 하나의 시료에서 100가지 시험이 가능하다.
둘째, 적용분야의 다양성으로 마이크로 비드는 유전자 발현, SNP, 점돌연변이등 핵산 반응을 비롯하여, 항체 항원 반응, 리간드-리셉터 반응 등의 다양한 단백질 상호작용 테스트에도 적용이 가능하다.
셋째, 유연성으로 루미넥스사의 x-MAP 기술은 소비자의 요구에 따라 혹은 정기적인 업데이트에 따라 특이적이 프로브를 결함시켜 기존의 제품에 추가하는 것이 가능하다.
넷째, 정확성으로 루미넥스사의 x-MAP 기술은 생물학적 상호작용은 실시간으로 분석하고, 정확하게 정량하는 것이 가능하다.
다섯째, 재현성으로 하나의 lot에서 다량의 마이크로 비드가 생산되므로 재현성이 높다.
여섯째, 루미넥스 기술은 두 종류의 laser detector를 사용하여 실시간으로 신호전달을 진행시킴으로 100개의 다른 색깔군의 폴리스티렌 비드를 구별하여 정량할 수 있다. Luminex 시스템에서는 담체로서 직경 5.6μμm의 polystyrene계 마이크로비드를 사용하여 여러 가지 농도에 편성한 2색의 형광 색소로 염색해, 각 형광 색소의 함유량을 식별 코드로서 이용하고 있다. 적색 레이저와 APD센서로 비드의 직경과 색을 측정하고, 녹색 레이저와 광전자증배관에서 샘플의 결합 양을 측정한다.
일곱째, 루미넥스사의 x-MAP 기술은 단백질 발현 프로파일링, 유전자 발현 프로파일링, 자가 면역 질환, 유전질환, 감염성 질환, HLA 타이핑 등에 적용할 수 있다.
본 발명자는 고속측정 및 정확한 분석이 가능한 서스펜션 어레이를 개발하였으며 이의 특징은 한 튜브(Tube)안에서 교잡반응이 일어나는 3차원적 방법으로 반응 후 Luminex 시스템에서 동시에 532nm과 633nm파장을 측정함으로써 형광 값을 얻게 된다. 633nm 파장에서 측정된 형광 값은 마이크로스피어 비드를 식별하며, 532nm 파장에서 측정된 형광값은 각 프로브와 반응한 PCR 산물이 Streptavidin-Phycoerythrin와 결합한 값을 나타낸다. 따라서 서스펜션 어레이는 고속측정이 가능하며, 1회 측정으로 100-300개의 마이크로스피어 비드의 형광값의 최대빈도를 확인하기 때문에 정확한 분석이 가능하다. 따라서 정확한 인유두종바이러스의 검출 및 유전형 구분 검사를 통하여 분자생물학적으로 자궁경부암의 조기 진단 및 치료 뿐 아니라 예방 및 관리에 있어서도 큰 역할을 할 것으로 기대된다.
지금까지 신속하고 정확하게 인유두종바이러스의 유전자형을 검출할 수 있는 키트와 이를 이용한 검출방법은 개시된 바 없다.
본 발명의 목적은 상기와 같은 점들을 감안하여 Luminex 장비를 이용하여 자궁경부암과 관련된 인유두종 바이러스 유전자형을 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 HPV 지오타이핑 다중분석 루미넥스 키트 및 이를 이용한 검출방법을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 상기 목적은 자궁경부암의 주원인인 인유두종 바이러스의 핵산과 특이적으로 결합하는 프로브 21종을 4.5um의 폴리스틸렌 비드에 각 HPV L1 유전자의 타입에 대해 특이적으로 고안된 HPV 특이적인 프로브와 결합시켜 바이오틴으로 표지된 HPV L1 PCR 산물과 교잡반응시킨 후, streptavidin-PE와 반응시켜 Luminex 장비를 이용하여 자궁경부암과 관련된 인유두종 바이러스 유전자형을 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 HPV 지오타이핑 다중분석 루미넥스 키트를 제공함으로써 달성하였다.
본 발명에서 용어, "시료"는 인유두종바이러스에 감염되거나 또는 감염이 의심되는 개체의 시료를 말한다. 상기의 시료는 인유두종바이러스 유전자를 포함하는 전혈, 혈장, 타액, 뇨, 객담, 림프액, 뇌척수액 및 세포간액과 같은 시료 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, "인유두종바이러스"는 파포바 바이러스(papova virus) 계열에 속하는 DNA 바이러스로서 72개의 외각 단위단백질체(capsomer)로 이루어진 20면체이며 7,900 개의 염기서열이 이중 원형 DNA로 이루어져 있다. HPV는 게놈(genome)을 구성하고 있는 염기서열의 유사성에 따라 120 여종의 다른 아형으로 나누어진다. 이들 120 여종의 아형 중 30여 종이 하부 생식기에 감염되는 것으로 알려져 있으며, 자궁경부 상피내 종양과 자궁경부암을 유발하는 위험 정도에 따라 HPV-16, HPV-18, HPV-26, HPV-30, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-52, HPV-53, HPV-56, HPV-57, HPV-58, HPV-59, HPV-67, HPV-68, HPV-73, HPV-74 등의 고 위험군(high risk type)과 HPV-2a, HPV-3, HPV-6, HPV-10, HPV-11, HPV-32, HPV-34, HPV-40, HPV-42, HPV-43, HPV-44. HPV-54, HPV-55, HPV-61, HPV-69, HPV-70등의 저위험군(low risk type)으로 나누어진다.
HPV의 게놈 구조는 크게 초기전사부위 E (early gene region)와 후기전사부위 L (late gene region), 그리고 발현되지 않는 부위인 LCR (long control region)으로 나누어지며, HPV의 게놈 구조는 발병의 양상과 위험 정도, 예후에 커다란 영향을 끼친다. 특히 초기전사부위 중 E6와 E7 유전자는 HPV가 감염 세포의 게놈 내로 들어가 머물러 있는 동안 발현(expression)되어 발암에 가장 중요한 역할을 한다. 즉, HPV-16, -18 등의 고 위험군에 속하는 HPV의 E6와 E7 유전자는 종양억제유전자(tumor suppressor gene)인 p53과 rb(retinoblastoma) 유전자에서 발현되는 단백질들과 각각 결합하여 이들 단백질들을 불활성화시키며, 그 결과 세포주기(cell cycle)의 조절과 세포사멸(apoptosis) 기전이 저해됨으로써 자궁경부의 정상세포가 암세포로 변형된다. 이에 반해 HPV-6, HPV-11 등의 저위험군에 속하는 HPV의 경우 종양억제 유전자들에서 발현되는 단백질들을 불활성화시키는 능력이 떨어지므로 자궁경부암을 유발하기 어렵다.
본 발명에서 용어, "프라이머"는 상보적인 주형과 염기쌍을 형성할 수 있고, 주형가닥 복제를 위한 15개에서 30개의 염기로 구성된 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)이다. 프라이머는 보통 합성하지만 자연적으로 생성된 폴리뉴클레오티드(polynucletide)에서 이용할 수도 있다. 프라이머의 서열은 반드시 주형의 서열과 정확히 같을 필요는 없으며, 충분히 상보적이어서 주형과 혼성화될 수 있으면 된다. 바람직하게 본 발명의 프라이머는 인유두종바이러스의 L1 유전자 증폭용 프라이머, SP5+/6+, GP6+ 또는 SPF2일 수 있고, 더욱 바람직하게는 인유두종바이러스 L1 유전자에 특이적인 제1프라이머 및 엑소뉴클레아제에 의해 인식되는 표지자가 표지된 제2프라이머일 수 있으며, 공지된 방법에 의해 당업자가 용이하게 디자인할 수 있다.
용어, "엑소뉴클레아제"는 핵산 즉, DNA 또는 RNA(ribonucleic acid)를 절단하는 효소로서, 말단을 절단하는 뉴클레아제이다.
본 발명에서 용어, "탐침"은 DNA 또는 RNA의 핵산과 특이적으로 상보적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 HPV 타입별로 표지되어 있어서 특정 타입의 HPV의 존재 유무를 확인할 수 있다. 탐침은 올리고뉴클레오티드 탐침, 단일가닥 DNA(single stranded DNA) 탐침, 이중가닥 DNA(double stranded DNA) 탐침, RNA 탐침 등의 형태로 제작될 수 있으나, 바람직하게는 단일가닥 탐침을 사용할 수 있다. 본 발명에서는 포스페이트 표지된 프라이머를 이용하여 시료내 HPV L1 유전자를 증폭하고 엑소뉴클레아제로 포스페이트 표지된 핵산 가닥을 분해하여 최종적으로 HPV L1 유전자에 해당하는 단일 가닥 핵산만을 증폭시켰으므로 단일가닥 탐침과의 혼성화 반응시 반응 효율이 높다. 이중 가닥 핵산의 경우, 고온 조건에서의 변성(denaturation) 단계를 거쳐야하고, 일단 변성시킨 후에도, 이중 가닥끼리의 상보적 재결합과 탐침과의 결합 사이에 경쟁이 발생하므로 혼성화 반응 효율이 낮아지는 문제가 있다.
본 발명은 HPV 지노타이핑(genotyping) 다중분석 키트를 제공하는 효과가 있으며, HPV 양성으로 판정된 945명의 임상 시료를 이용하여 염기서열 분석을 실시한 결과 96.40%의 일치율을 보임으로써 신속하고도 정확한 검출효과를 제공하느 sgy과가 있고(표 14), 아울러 비드를 이용한 다중 HPV 검출법은 101 - 10 3copy의 아주 작은 수의 HPV 감염도 검출 할 수 있는 민감도와 (표 15), 10 6copy의 고농도의 HPV DNA를 사용했을 때도 각각의 아형간의 교차반응성이 전혀 없는 것으로 나타나 (표 16) 신속성, 정확도와 민감도 그리고 특이도가 뛰어난 비드를 이용한 HPV 다중 검출방법을 제공하는 임상적으로 유용한 효과가 있을 뿐만 아니라 향후 각각의 HPV 아형과 자궁경부암이나 전암병변의 연관성에 관한 연구 등에 획기적인 도움을 줄 수 있는 뛰어난 효과가 있다.
이하, 본 발명의 내용에 대하여 구체적인 구성을 실시예를 들어 상세히 설명한다.
도1은 본 발명에 따라 증폭된 HPV와 GAPDH PCR 산물을 확인하기 위한 전기영동 실험결과를 나타내는 사진도이다.
이하 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 않는다.
실시예 1-1. 유전자증폭( PCR )의 실시
하기 표1 에 기재된 반응 조건 및 하기 표2의 반응시간에 따라 PCR을 진행하여 유전자를 증폭하였다.
구성 부피(㎕)
DNA 5
프라이머 혼합(Primer mix) 12.5
PCR 완충액 (PCR buffer) (10x) 5
dNTP(A,G,T) mix 0.1
dCTP(1mM) 0.5
Biotin dCTP (1mM) 0.25
Taq polymerase 0.3
D.W. 26.35
합계 50
Cyles (싸이클) Time (시간) Temperature (온도,°C)
Denaturation/Activation 1 5min 94
denaturation
annealing
elongation		 40

 1min 94
2min 53
30sec 72
final extension 1 5min 72
cooling ∞ 4

실시예 1-2. 엠플리케이션 프리믹스의 제조
PGMY 11 (A-E)의 프라이머 5종 과 PGMY 09 (F-R) 12종, GAPDH 프라이머를 각각 0.05 μM, HMB01 1종을 0.1 μM 와 0.08 mM dNTP 혼합액, Tris HCl (pH 9.0), 4 mM MgCl2, (NH4)2SO4이 포함된 Premix (2x) 2.5ml 양으로 제조하였고 이 때 하기 표3과 같은 프라이머 염기서열을 사용하였다.
프라이머 서열 (5'-3') 서열번호
PGMY11-A 5' Phosphate GCA CAG GGA CAT AAC AAT GG 서열번호 1
PGMY11-B 5' Phosphate GCG CAG GGC CAC AAT AAT GG 서열번호 2
PGMY11-C 5' Phosphate GCA CAG GGA CAT AAT AAT GG 서열번호 3
PGMY11-D 5' Phosphate GCC CAG GGC CAC AAC AAT GG 서열번호 4
PGMY11-E 5' Phosphate GCT CAG GGT TTA AAC AAT GG 서열번호 5
PGMY09-F 5' Biotin CGT CCC AAA GGA AAC TGA TC 서열번호 6
PGMY09-G 5' Biotin CGA CCT AAA GGA AAC TGA TC 서열번호 7
PGMY09-H 5' Biotin CGT CCA AAA GGA AAC TGA TC 서열번호 8
PGMY09-I 5' Biotin G CCA AGG GGA AAC TGA TC 서열번호 9
PGMY09-J 5' Biotin CGT CCC AAA GGA TAC TGA TC 서열번호 10
PGMY09-K 5' Biotin CGT CCA AGG GGA TAC TGA TC 서열번호 11
PGMY09-L 5' Biotin CGA CCT AAA GGG AAT TGA TC 서열번호 12
PGMY09-M 5' Biotin CGA CCT AGT GGA AAT TGA TC 서열번호 13
PGMY09-N 5' Biotin CGA CCA AGG GGA TAT TGA TC 서열번호 14
PGMY09-P 5' Biotin G CCC AAC GGA AAC TGA TC 서열번호 15
PGMY09-Q 5' Biotin CGA CCC AAG GGA AAC TGG TC 서열번호 16
PGMY09-R 5' Biotin CGT CCT AAA GGA AAC TGG TC 서열번호 17
HMB01 프라이머 5'GCG ACC CAA TGC AAA TTG GT 서열번호 18
GAPDH 프라이머 Forward 5'Phosphate ATCCCTGAGCTGAACGGGAA 서열번호 19
GAPDH 프라이머 Reverse 5'Biotin GTGGGTGTCGCTGTTGAAGT 서열번호 20

실시예 1-3. 유전자 증폭을 위한 주형의 활성화 ( PCR template activation )
하기 표4과 같은 조건의 구성액을 PCR 산물에 10㎕ 첨가한 후 37˚C 에서 30분간 인큐베이션한 후 80˚C 에서 10분동안 활성 효소 반응(Activator enzyme activation)을 시켜주었다.
구성 부피(㎕)
활성효소(Activator enzyme) 1
활성완충액 (Activator buffer) 5
증류수 (D.W.) 4
합계 10
실시예 1-4. PCR 결과
도면 1의 전기영동결과의 사진은 상기 프라이머를 이용하여 증폭된 HPV와 GAPDH PCR 산물을 확인하기 위해 50㎕의 PCR산물 5㎕를 1.5% 아가로스 젤에 전기영동한 결과를 나타내었다. 이로써 GAPDH(213bp)와 HPV L1(450bp)의 존재 유무를 확인하였다. 전기영동은 125volt로 약 25분간 수행하며 표준 전기영동 물질로는 100bp ladder를 이용하였다.
실시예 2. 혼성화 ( Hybridisation )
상기 PCR 산물에 60˚C 에서 5분동안 인큐베이션 한 혼합 완충액 (Hybridisation buffer)및 미리 votexing한 bead 혼합물을 더하여 하기 표5와 같은 반응 조건 및 표6와 같은 반응시간에 따라 Hybridisation과 washing을 진행하였다.
구체적으로, biotin-dCTP 표지산물에 bead 1㎕와 hybrisol 20㎕를 잘 섞어준 후 47˚C 에서 30분간 인큐베이션하였다.
구성 부피(㎕)
PCR 산물 (PCR products) 10
혼합 완충액 (Hybridisation buffer) 20
비드 (Bead) 1
Time(시간) Temperature(온도,°C)
혼성화 (Hybridisation) 30분 47
실시예 3. 워싱 ( Washing )
1) 96 홈 플레이트(well plate)의 각 홈(well)에 워싱완충액 Ⅰ을 150㎕ 넣어준 후 여과하고
2) 반응이 끝난 비드 표지산물 혼합물을 96 홈 플레이트에 넣어준 후 여과한후,
3) 각 홈에 워싱완충액 Ⅰ을 150㎕ 넣어준 후 여과하고
4) 각 홈에 워싱완충액 Ⅱ을 150㎕ 넣어준 후 여과하였다.
실시예 4. 염색 ( Staining )
염색을 위하여 스트렙타아비딘 PE(Streptavidin PE)는 워싱완충액 Ⅱ에 200ng/ml의 농도로 준비하고(표7), 준비된 SAPE를 잘 섞어 준 후 각 well에 95㎕씩 넣어서 10분간 250rpm 에서 교반해주었다(표8).
상기 염색 과정이 끝단 다음 여과한 후 워싱완충액 Ⅱ를 100㎕ 첨가하여 분석하였다.
구성 부피(㎕)
Washing buffer Ⅱ 100
SAPE 0.2
shaking time(시간,분) temperature (온도,°C)
250rpm 10 실온
실시예 5. 분석 ( Reading )
본 발명에 따른 키트는 Luminex 200, Luminex 100, Bioplex200 장비로 분석이 가능하며, 소프트웨어는 IS2.1(Luminex corp.), xPonent 3.1 (Luminex corp.), Master Plex CT(MiraiBio), Bioplex Manager 5.0(Bio-Rad)를 장비로 사용하며, biotin-dCTP 표지산물과 Beads 혼합물의 교잡 반응 전에 장비를 켜놓고, laser warming과 calibration을 한 후 샘플 reading 및 샘플의 MFI(Median Fluorescence Intensity,중앙 형광강도)값을 확인하였다.
실시예 6. 결과 측정 및 판정
상기 실시예에 따라 반응 종료 후 Luminex 장비를 이용하여 각 HPV 타입별 비드에 결합된 Streptoavidin PE값을 측정하고 각각의 HPV 타입에서 MFI값이 80 이상으로 검출된 경우 양성으로 판정하였다.
구체적인 판정방법은 하기와 같다.
실시예 6-1. HPV 판정방법
HPV 각각의 타입 중 하나라도 MFI값이 80 이상이 나왔을 경우 양성으로, MFI값이 80이하인 경우 음성으로 판정하였다. 전기영동상에서 HPV L1 PCR 산물을 확인할 수 없으면서 GAPDH의 MFI값이 80 이상으로 나오거나, 전기영동상에서 GAPDH PCR 산물을 확인한 경우 HPV 음성으로 판정한다. HPV와 GAPDH의 MFI 값이 80 이하로 나오면서, 전기영동에서 어떠한 PCR 산물도 확인할 수 없는 경우 판정 불가로 판정하였다.
실시예 6-2. 정도관리
HPV 지노타이핑 다중분석 검사시에는 한번 검사할 때마다 양성대조 시료 (HPV 16 양성 세포주)와 음성대조 시료(HPV 음성세포주)를 동시에 검사해야하고, 양성 대조 시료의 MFI값은 HPV 16과 GAPDH 특이 프로브가 결합된 비드에서만 80 이상으로 나오고, 나머지 타입의 비드에서는 모두 80 미만으로 나와야 한다. 음성대조 시료의 MFI 값은 GAPDH 특이 프로브가 결합된 비드에섭만 80 이상으로 나오고 나머지 타입의 비드에서는 모두 80 미만으로 나와야 한다. 양성 대조 시료와 음성대조 시료에서 16번 타입과 GAPDH외에 다른 타입의 HPV의 MFI값이 80 이상으로 나오는 경우 실험을 반복하여 수행하였다.
실험예 1. 컷오프 농도 설정 실험
음성대조군 (C33A genomic DNA) 200ng을 용법 용량항에 따라 19회 반복시험하였고 컷오프 농도 설정 기준은 Average + 3SD 방법으로 산출하여 가장 높은 수치의 컷오프 수치와 가까운 값으로 설정하였다. 컷오프 농도 설정실험의 결과는 표9와 같다.
Type HPV
6 		HPV
11 		HPV
16 		HPV
18 		HPV
31 		HPV
33 		HPV
34		 HPV
35		 HPV
39		 HPV
40 		HPV
45 		HPV
51 		HPV
52 		HPV
53 		HPV
54 		HPV
55 		HPV
56 		HPV
58 		HPV
59		 HPV
66		 HPV
68 		HPV
70
1 16 5 24 9 1 2.5 0 30 2 2 0 3 3 2.5 2 3 4 3 4.5 6 4 10
2 3 5 19 7 2 2.5 3 3 2 4 3 1 4 5 2 1 4.5 2 1 3.5 4 12.5
3 33 3 7.5 3 0 2 2.5 22 3 3 1.5 0 4 2 2.5 1 4 4 3 7 4 6
4 19 6 2 8 3 1 0 2 2 2 3 4 3 3 1.5 3 4 4 4 5 8 8
5 4 3 4 6 3 3 2 11 3 1.5 2 2 4 3 0 2 5.5 1.5 5 4.5 2 6
6 20 2 3 3 3 3 0.5 1 2 1 2 3 4 2 3 4.5 3.5 4 1.5 5.5 4 8
7 50 5.5 21.5 5 2 2 1 70 2 6 2.5 2 3 2 4 3 1 2 3 4 1 10
8 59 4 6 9 1 2 1.5 26 2 3 0 1 3 2 2 2 4 3 3 5 4 8
9 9 4 10 4 4 2 1.5 7 0 1 3 3 4.5 2 0 2 3 3 1.5 5 3 9
10 16 1 14.5 4 1 2 1 4 3.5 1 2 1 3 3 3 3 4 2 2 4 4 8
11 18.5 5 31 4.5 3 3 3 1.5 2 2.5 1 2 2 2 2 0.5 3.5 3 2 5 3 8
12 11 1 16.5 3 1 3 0 1 1 2 2 1 1 3 2 1 3 2 3 3 3 6
13 2 5 54 8 2 2 2 3 2 1.5 5 1.5 3.5 3 2 3 5.5 1 2.5 5 3 6
14 17 7 21 7.5 3 3 2 27 3 3 26 8 1 3 0 1 2 3 3 6 4.5 8
15 4 4.5 37.5 14 4 2 3 3 3 1 1.5 2 5 3 3 2 4 1 4 3 0 7
16 23 5 62 9 1 3 1 2 3 2 1 1 3 1.5 2 3 2 2.5 3.5 8 1 9
17 10 3 16 7 1 1 2 3 2 5 1 2 3 2.5 2 2 4 3 3 3 6 6
18 3 5 1 80 3 3 3 2 0 2 3 2.5 2 6 3 1 5 1 1.5 3 16 8.5
19 7 1 16 67 3 1.5 0 1 3 4 3 2 0 2.5 3.5 1 9 2.5 0 2 2 6.5
Average 17.1 3.9 19.3 13.6 2.2 2.3 1.5 11.6 2.1 2.5 3.3 2.2 2.9 2.8 2.1 2.1 4.0 2.5 2.7 4.6 4.0 7.9
STD 15.6 1.8 16.9 21.4 1.2 0.7 1.1 17.3 1.0 1.4 5.6 1.7 1.3 1.1 1.1 1.1 1.7 1.0 1.3 1.5 3.4 1.7
cut-off 63.8 9.2 69.9 77.8 5.7 4.3 4.8 63.5 5.0 6.7 20.2 7.3 6.8 6.0 5.4 5.3 9.0 5.4 6.5 9.2 14.3 13.1
실험예 2. 간섭 교차 반응 실험
실험예 2-1. 28종 박테리아 교차반응
28종류의 박테리아, Candida albicans, Trichomonas vaginalis, Escherichia coli, Staphylococcus Saprophyticus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus pyogenes, Clostridium perfringens, Bacillus subtilis , Enterobacter cloacae, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas hydrophila, Neisseria gonorrhoeae, Clostridium sordellii, Gardnerella vaginalis, Proteus mirabilis, Bacteroides spp., Bifidobacterium spp, Fusobacterium spp., Corynebacterium accolens, Clamidia trachomatis, Klebsiella pneumonia, Bacteroides fragilis, Lactobacillus acidophilus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus agalactiae, Enterococcus spp., Klebsiella spp., Proteus spp., 및 대조군인 C33A, Caski의 2μg의 gDNA 를 준비하여 용법 및 용량에 따라 시험한 결과 하기 표10과 같은 교차 반응을 얻었다.
Figure pat00001
실험예 2-2. 5종 바이러스 교차반응
5종류의 바이러스 Adenovirus, Cytomegalovirus, Epstein Barr virus, Herpes simplex virus 1, Herpes simplex virus 2의 2μg의 gDNA 를 준비하여 용법 및 용량에 따라 시험한 결과 하기 표11과 같은 교차 반응을 얻었다.
Figure pat00002
실험예 2-3. HPV 타입 플라스미드 교차반응
GAPDH, HPV 06, HPV11 등 HPV 22종의 플라스미드를 각각 5X105 카피/5㎕를 준비하여 용법용량항에 따라 시험한 결과 하기 표12와 같은 결과를 보였다.
Figure pat00003
실험예 2-4. HPV 22종 의외의 타입 HPV42 , HPV 43, HPV 44, HPV 67과의 플라스미드 교차반응
22종 이외의 HPV 타입 (HPV42,43,44,67)의 플라스미드를 각 5X105 카피/5㎕를 준비하여 용법용량항에 따라 시험하여 하기 표13과 같은 결과를 보였다.
Figure pat00004
실험예 3. 비드를 이용한 HPV 아형 검출법과 염기서열 분석법과의 일치율 (%)
진진바이오 HPV 지오타이핑(genotyping) 다중분석 키트를 이용하여, HPV 양성으로 판정된 945명의 임상 시료를 이용하여 염기서열 분석을 실시한 결과 96.40%의 일치율을 보였다는 사실은 매우 고무적이며, 임상적으로 충분히 이용 가능한 정확도를 나타내었다.
HPV 타입 일치율 (%)
HPV 6 90.0
HPV 11 100.0
HPV 16 99.2
HPV 18 96.6
HPV 31 98.5
HPV 33 96.3
HPV 35 96.7
HPV 39 90.7
HPV 40 94.4
HPV 42 100.0
HPV 51 87.1
HPV 52 100.0
HPV 53 100.0
HPV 55 100.0
HPV 56 98.3
HPV 58 99.2
HPV 59 91.7
HPV 66 97.5
HPV 68 100.0
HPV 70 100.0
실험예 4. HPV 아형별 최소 검출 한계 측정 (민감도)
비드를 이용한 다중 HPV 검출법은 하기 표15와 같이 101 - 10 3copy의 아주 작은 수의 HPV 감염도 검출 할 수 있는 민감도를 가지고 있었다.
6 11 16 18 31 33 35 39 40 42 51 52 53 55 56 58 59 66 68 70
음성 대조군 33 37 42 5 28 3 7 7 53 4 5 21 30 9 9 22 24 35 31 19
5x100 5 64 54 32 30 14 58 34 258 258 38 65 57 35 10 28 30 28 8 28
5x101 26 79 169 71 59 90 115 44 410 590 78 100 37 33 22 37 35 18 19 58
5x102 405 690 882 352 308 557 488 246 1467 1499 360 284 229 98 72 62 139 49 198 84
5x103 2487 4654 3875 3427 2123 2457 3785 2254 13964 11498 2276 1067 3035 1048 825 310 742 162 1949 697
5x104 6538 7713 9256 9292 5534 5233 10294 2254 18118 15036 9164 2849 4116 3468 4325 948 3790 504 4093 5356
5x105 8531 7528 10731 11459 6296 5407 13069 3890 18407 16112 12096 1964 7416 10008 4879 1525 5775 956 5133 7824
5x106 10243 8481 11896 11074 5760 7346 11831 4256 17640 16372 11604 3425 6569 7793 5987 2105 6821 1713 5987 7545
실험예 5. HPV 아형별 교차 반응성 측정
10 6copy의 고농도의 HPV DNA를 사용했을 때 하기 표 16과 같이 각 아형간의 교차반응성이 전혀 없는 것으로 나타났다.
Figure pat00005

Claims (2)

  1. 인유두종바이러스(HPV)의 핵산과 특이적으로 결합하는 probe들을 선택하는 단계와;
    폴리스틸렌 비드에 상기 HPV와 probe들을 결합시켜 비오틴으로 표지된 HPV L1 PCR 산물과 교잡반응시키는 단계와;
    Streptavidin-PE와 반응시켜 Luminex 장비를 이용하여 자궁경부암과 관련된 HPV 유전자 type을 분석하는 단계로 이루어진 것이 특징인 인유두종 바이러스 유전자형의 검출 방법
  2. 제1항의 방법을 실시할 수 있도록 제조된 HPV 지노타이핑 다중분석 루미넥스 키트
KR1020160088412A 2016-07-13 2016-07-13 Hpv 지노타이핑 다중분석 루미넥스 키트 및 이를 이용한 인유두종 바이러스의 유전자 검출 방법 KR20180007432A (ko)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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