WO2016072662A1 - 인유두종바이러스의 유전자형 검출을 위한 ρνα 프로브, 키트 및 방법 - Google Patents

인유두종바이러스의 유전자형 검출을 위한 ρνα 프로브, 키트 및 방법 Download PDF

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최보라
강재현
최재진
김성기
박두산
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Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting HPV genotype using a PNA detection probe including a fluorescence and a quencher, and more particularly, can specifically bind to a human papillomavirus (HPV) DNA genotype.
  • the present invention relates to a method for detecting multiple HPV genotypes in real time using one or more detection probes, a melting curve analysis method, and an HPV genotyping kit through melting curve analysis.
  • HPV Human Papillomavirus
  • HPV is closely related to the symptoms of warts and various malignancies that infect human and mammalian right upper epithelial cells, and in fact, almost all cervical cancers are caused by HPV. Howley PM. Virology , 1996, 2: 2045-2109.
  • Cervical cancer is a malignant tumor of the cervix, which accounts for 95% of all uterine cancers, and is the second most common cancer among women in the world after breast cancer (Korea Disease Control Center, 2004). Cervical cancer usually develops after HPV infection in cervical epithelial basal cells, followed by prolonged prognostic stages such as low squamous intraepithelial lesions (LSIL), high squamous intraepithelial lesions (HSIL), and intraepithelial cancer. You will progress to cancer. Since the development of cervical cancer takes a long time and occurs in stages, early diagnosis of precancerous stage lesions, which is an intermediate stage of the onset, can be treated before cancer is completely developed, thereby preventing cervical cancer. Therefore, providing a method for effectively detecting HPV causing cervical cancer is very important for the diagnosis, prevention and treatment of diseases.
  • LSIL low squamous intraepithelial lesions
  • HSIL high squamous intraepithelial lesions
  • the genotype is determined by the difference in the open reading frame of the E6, E7, and L1 genes of the HPV genome sequences. To date, more than 120 different genotypes have been found. Among these genotypes, HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, belonging to the high-risk group are divided into high-risk and low-risk types according to the risk of causing cervical cancer.
  • HPV 6, 11, 26, 34, 40, 42, 44, 47, 53, 66, 69, and potential high risk HPV 26, belonging to Types 56, 58, 59, 68 and the low-risk group Types 73 and 82 are closely associated with progression to cervical cancer (Comparison of Seegene Anyplex II HPV 28 with the PGMY-CHUV Assay for Human papillomavirus Genotyping, C. Estrade et al ., J Clin Microbiol, 2014, 52 (2): 607].
  • HPV genotype thus infected is an important influence factor for the future progression of cancer, it is important to accurately identify the presence of HPV in the sample and the HPV genotype present in the sample, which is important for the prognosis and diagnosis of cervical cancer patients.
  • the presence and genotyping method of HPV can be largely divided into a method using a Pap smear (Papanicolaou smear or pap smear) method, direct identification of HPV DNA and amplification of HPV DNA.
  • Pap smear has been used as a diagnostic for HPV since the 1940s as a standard test for the primary screening of cervical cancer and progenitor lesions.
  • this method has a disadvantage in that the accuracy of the test results is lowered depending on the skill of the tester, and it is still reported to have a high false negative rate of 30 to 40% (Ledger WJ et al ., Am J Obstet Gynecol). , 2000, 182: 860-865].
  • Direct identification of HPV DNA includes liquid hybridization (Hybrid Capture by Digene Diagnostics, Silver Spring, MD), Southern blots and dot blots using HPV type-specific probes. (dot blot), filter in situ hybridization (FISH), and others (Detection of high-risk HPV type by the hybrid Capture 2 test, George et al., J Clin Microbiol, 2001, 65: 155-162].
  • these methods do not amplify the DNA of HPV, which makes the test less sensitive.
  • Methods of using amplification of HPV DNA include type-specific polymerase chain reaction (PCR), general primer PCR (general primer PCR), and the like.
  • PCR type-specific polymerase chain reaction
  • general primer PCR general primer PCR
  • Dot blot hybridization, microtiter plate hybridization, or line of amplified HPV DNA A method of a line probe assay, etc. (Evaluation of a Modified Reverse Line Blot Assay for Detection and Typing of Human Papillomavirus, Feray et al., 2005, Am J clin Pathol . 123: 896-899). Genotype detection is generally performed through.
  • HPV genotyping kits using DNA microarray (DNA chip) technology (Korean Patent Nos. 2006-0015669 and 2004-0078506) fix DNA probes specific for various genotypes of HPV on glass slides.
  • DNA chip DNA microarray
  • the reaction resulting from hybridization with the product amplified by PCR can be analyzed simultaneously.
  • the HPV DNA chip is able to quickly detect various genotypes of HPV within a short time and is widely used for diagnosis of HPV commercially.
  • bead microarray-type HPV diagnostics have been developed. This method immobilizes HPV genotype-specific probes to beads to hybridize with target nucleic acids in a tube, and detects HPV genotypes by selecting beads of probes hybridized with target nucleic acids. Compared to the general DNA chip for immobilizing probes on slides, etc., a large amount of samples can be processed within a short time, and the high specificity can detect the genotype of HPV, and it is very inexpensive and commercially very useful (Facile , comprehensive, High-Throughput Genotyping of Human Genital Papillomaviruses using spectrally addressable Liquid Bead Microarrays, Jan Wallace et al., 2005, J.
  • DNA / DNA hybridization reactions between specific genotypes of DNA and immobilized DNA probes are often identified using optical methods, often using phosphors that fluoresce at specific wavelengths. In addition, other known methods such as electrochemical methods can be used.
  • the DNA chip or the bead array has a low stability because the immobilized DNA probe itself has very low biological and chemical stability with respect to nucleases. (See Korean Patent Publication No. 2006-0091708).
  • PNA peptide nucleic acids
  • PNA which acts like DNA or RNA and has excellent hybridization and stability, is recognized as a high replacement material to compensate for the current shortcomings of DNA, and is analyzed or diagnosed using PNA oligomer instead of DNA oligomer.
  • Many studies have been conducted on methods (Korean Patent Nos. 91708 and 12544, and Peptide nucleic acids on microarrays and other biosensors, Brandt O et al., 2004, Trends in Biotechnology , 22, 617-622 ], [Detection of target DNA using fluorescent cationic polymer and peptide nucleic acid probes on solid support, Fredric R Raymond et al., 2005, BMC technology , 5, 1-5]).
  • the present inventors have been granted a patent application No. 10-2007-0022201 for a PNA chip and a method for diagnosing HPV genotype using a PNA probe having excellent hybridization binding ability and stability.
  • the PNA chip has the advantage of accurately detecting the HPV genotype with high sensitivity and specificity, but the user's convenience and the reaction time are long, and the demand for detecting the HPV genotype only by real-time polymerase chain reaction has been increased.
  • the real-time PCR method is a method of observing an increase in PCR amplification products in real time every cycle of PCR, and is a technique for analyzing and detecting fluorescence reacting with PCR amplification products. This method does not require additional electrophoresis, has excellent accuracy and sensitivity, and has high reproducibility, compared to the conventional PCR method after finishing the final step and confirming PCR amplification products after electrophoresis by staining on gel.
  • DNA probes used for this melting curve analysis include MGB Taqman probe, molecular beacon (MB), and binary probe. While these methods have the advantage of distinguishing single nucleotide sequences, the short length of the DNA probe is about 20 to 40 mer, which means that single nucleotide sequences that are adjacent to each other are difficult to detect in one reaction.
  • the present inventors have made a PNA probe that can specifically bind to each genotype of HPV using the PNA having the above-described advantages, to solve the problems of the prior art as described above, the HPV genotype detection PNA probe 20 high risk groups (high risk 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 69, 70, 73 and 82) and low risk 2 Eighteen species (types 30, 32, 34, 40, 42, 43, 44, 54, etc.) that contain all probes capable of detecting species (low risk groups 6 and 11).
  • high risk groups high risk 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 69, 70, 73 and 82
  • low risk 2 Eighteen species types 30, 32, 34, 40, 42, 43, 44, 54, etc.
  • probes capable of detecting HPV genotypes (types 55, 61, 62, 67, 74, 81, 83, 84, 87 and 90).
  • HPV positive probes were constructed to hybridize to consensus regions of each genotype of HPV to confirm HPV infection.
  • PNA can be used as a probe of real-time PCR technology that detects single nucleotide sequence mutations because it has superior thermal and biological stability, and ability to recognize and bind target DNA.
  • the real-time PCR method uses a fluorescent material to detect the target DNA in the sample, there is a problem that a probe having two different wavelengths of fluorescent material is required to detect several genotypes. This is a big limitation in performing multiplex detection, and in the present invention, this problem can be solved through the melting curve analysis of the fluorescent probe.
  • the present invention provides a PNA probe combined with a reporter and quencher for detecting each genotype of 22 HPV species. Also provided are PNA probes incorporating reporters and quenchers for detecting genotypes other than 22 HPV species.
  • the present invention provides a melting curve analysis method using a PNA probe combined with a reporter and a quencher to detect HPV genotype.
  • the present invention provides a kit for detecting HPV genotype comprising the HPV PNA probe.
  • the PNA probe used in the melting curve analysis method for detecting the HPV genotype may be a general PNA probe or may include negatively charged molecules, and when using a PNA probe containing negative charges, the melting curve resolution is increased so that multiple genotypes in one reaction tube may be used. It is easy to analyze at once.
  • the PNA probe may include a fluorescent material.
  • the fluorescent material may be a reporter and a quencher, and may be an intercalating fluorescent material.
  • HPV detection method enables simultaneous analysis of real-time amplification curves and melting curves for 20 high-risk and low-risk groups of HPV, and enables accurate genotype determination of HPV simultaneously and simultaneously.
  • HPV genotypes can be detected and HPV infections can be identified.
  • each genotype can be detected with high specificity and sensitivity, it can be very useful for HPV genotyping.
  • 1) is a schematic diagram of multiple detection probes and HPV type specific primer mixtures for identification of HPV genotypes.
  • 1) 2) is a schematic diagram of a primer mixture using SYBR green or fluorescent PNA detection probes to distinguish between HPV infection and other types.
  • 1, 3) shows 22 types of HPV genotypes (6, 11, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68) , HPV genotype 18 (types 30, 32, 34, 40, 42, 43, 44, 54, 55, 61, 62, 67, 74, 81, 83, 84, 87) And a primer complex using a fluorescent PNA probe for type 90).
  • Figure 2 is a data confirming the detection sensitivity and melting peak (melting peak) of the HPV genotype using a fluorescent PNA detection probe and primer mixture.
  • the detection sensitivity and specificity of HPV genotypes were confirmed using the HPV fluorescent PNA probe mixture and HPV type specific primer mixture to be detected. It was confirmed that each genotype was specifically distinguished using the Tm value of the fluorescent substance labeled on the detection probe.
  • Figure 3 confirmed that the HPV genotype using the fluorescent PNA detection probe and primer mixture is distinguished using the fluorescent material and Tm value.
  • Each fluorescent material (FAM, HEX, ROX, CY5) was labeled with HPV genotype 11 PNA was confirmed that the genotype is classified by Tm.
  • Each of the PNA mixtures labeled with the fluorescent substance FAM can distinguish 33, 11, and 58 types, and confirmed Tm of 47.0 ° C, 58.5 ° C, and 66.0 ° C.
  • each of the PNA mixture labeled with the fluorescent substance HEX can be distinguished 16, 73 type and confirmed the probe Tm of 48.0 °C, 63 °C.
  • Each PNA mixture labeled with the fluorescent substance ROX can distinguish 45, 18, and 69 types, and confirmed Tm of 47.5 ° C, 59.5 ° C, and 69.0 ° C.
  • Each PNA mixture labeled with fluorescent substance CY5 can distinguish between 26, 6, and 52 types, and Tm was detected at 44.0 ° C, 53.0 ° C, and 62.5 ° C, respectively.
  • FIG. 4 shows the presence or absence of HPV infection through Ct (cycle threshold) graph analysis generated by performing a real-time PCR reaction using SYBR green fluorescence to determine whether HPV is infected, and HPV gene through analysis of melting peak. It was confirmed that the specificity of the amplification can be verified. In addition, the fluorescent probe detection system for determining the presence or absence of HPV also confirmed the presence and specificity of HPV DNA infection through analysis of the Ct graph and melting peak.
  • HPV genotype detection was possible through Ct graph analysis generated by real-time PCR reaction using fluorescent PNA probe.
  • the present invention relates to a method for simultaneously detecting HPV genotypes using HPV genotype detection probes combined with a reporter and quenching.
  • the detection probe may be selected from the group consisting of oligonucleotides, peptide nucleic acids (PNAs) and locked nucleic acids (LNAs) as all nucleic acids and nucleic acid analogs that complementarily bind to HPV specific genotypes. have. Since the polymerase for PCR generally has nuclease activity, which may cause damage to the probe, it is preferable to use synthetic nucleic acid such as PNA that is stable to nuclease. In addition, since the detection probe serves to selectively detect a target target nucleic acid gene, it is possible to use a probe for detecting a nucleic acid known in the art.
  • PNAs peptide nucleic acids
  • LNAs locked nucleic acids
  • a PNA probe is preferably used, and the PNA probe is artificial synthetic DNA, which can specifically bind to target HPV DNA or RNA, and is stable to nucleases, so that it is possible to analyze a melting curve based on a probe. Do.
  • a detection probe binds a specific functional group such as a side chain of a natural amino acid and a synthetic amino acid to an alpha, beta, gamma, or linker position of the probe's N-terminal, C-terminal, or probe (synthetic nucleic acid) backbone.
  • the amino acid may be characterized as having no charge, or having a negative charge or a positive charge, but is not limited thereto.
  • a probe conformational change and charge assigning method known in the art may be used. Can be.
  • the HPV genotype detection PNA probe of the present invention includes 20 high risk groups (high risk groups 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 69, 70, Types 73 and 82) and two low-risk types (low-risk type 6 and 11) probes are included, and 18 others (types 30, 32, 34, 40) that occur frequently in Koreans. And probes capable of detecting HPV genotypes (types 42, 43, 44, 54, 55, 61, 62, 67, 74, 81, 83, 84, 87 and 90).
  • the PNA detection probe consists of any one of SEQ ID NOs: 1 to 65 and 114 to 121 and 148 to 185, and 6, 11, 16, 18, 26, 30, 31, 32 , 33, 34, 35, 39, 40, 42, 43, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 59, 61, 62, 66, 67, 68, 69, 70, 73 HPV genotypes selected from the group consisting of, 74, 81, 82, 83, 84, 87 and 90 can be detected.
  • the HPV genotype detection PNA probe of the present invention may be a general PNA probe or may include negatively charged molecules, and when using a negatively charged PNA probe, the melting curve resolution is increased to facilitate analysis of several genotypes in one reaction tube at a time. .
  • the PNA probe comprising the negatively charged molecule according to the present invention may comprise one or more negatively charged molecules selected from the group of all acids of the phosphoric acid, carboxylic acid, sulfonic acid, nitric acid, boric acid series.
  • the negatively charged molecule can be bound to the N-terminal, C-terminal or alpha, beta or gamma position of the PNA backbone of the PNA probe, and at least one negatively charged molecule can bind to the base of the probe continuously and intermittently.
  • the PNA probe according to the present invention can be applied to various HPV genotype detection techniques due to the narrow half width at half maximum of the melting curve graph.
  • the resolution of the melting curve is high, the melting curves are distinguished from each other according to the nucleotide sequences of each HPV genotype.
  • genotypes can be easily determined without separate analysis such as sequencing analysis according to each HPV genotype. have.
  • the detection probe of the present invention may combine a reporter and a quencher capable of quenching the reporter fluorescence at both ends, and may include an intercalating fluorescent material.
  • the 'reporter' refers to a material that absorbs and emits light having a specific wavelength and emits fluorescence.
  • the reporter refers to a material that can be labeled with a probe to confirm whether hybridization between the target nucleic acid and the probe is performed, and fluorescein ), Fluorescein chlorotriazinyl, rhodamine green, rhodamine red, rhodamine red, tetramethylrhodamine, FITC, Oregon green, Alexa Fluoro ( At least one selected from the group consisting of Alexa Fluor, FAM, JOE, ROX, HEX, Texas Red, TET, TRITC, TAMRA, Cyanine-based dyes, and thiadicarbocyanine dyes Can be.
  • the reporter may be one or more selected from the group consisting of FAM (6-carboxyfluorescein), Texas red, JOE, TAMRA, CY5 and CY3.
  • the 'quencher' refers to a material that absorbs the light generated by the reporter and decreases the fluorescence intensity.Daccyl, TAMRA, Eclipse, DDQ, QSY, Blackberry Quencher, Black Hole Quinture (Black Hole Quencher), Qxl, Iowa black (Iowa black) FQ, Iowa black may be one or more selected from the group consisting of RQ and IRDye QC-1.
  • the quencher is preferably used TAMRA (6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 or Dabsyl, but is not limited thereto, and the quencher may be used in consideration of the fluorescence intensity because the range is reduced.
  • the PNA probe including the negatively charged molecule, reporter and quencher is hybridized with the target DNA and then a fluorescence signal is generated and rapidly melts with the target DNA at the proper melting temperature of the probe by the negative charge effect as the temperature increases.
  • the fluorescent signal is quenched, and the PNA probe including the negative charge increases the resolution of the melting curve because dissociation with the target DNA is faster than that of the PNA probe without the negative charge.
  • the HPV genotype of the target DNA can be analyzed through high resolution melting curve analysis obtained from the fluorescence signal according to the temperature change.
  • the 'intercalating fluorescent material' is acridine homodimer and derivatives thereof, Acridine Orange and derivatives thereof, 7-aminoactinomycin D (7-aminoactinomycin D, 7-AAD) and derivatives thereof, Actinomycin D and derivatives thereof, ACMA (9-amino-6-chloro-2-methoxyacridine) and derivatives thereof, DAPI and derivatives thereof , Dihydroethidium and derivatives thereof, ethidium bromide and derivatives thereof, ethidium homodimer-1 (EthD-1) and derivatives thereof, ethidium homodimer-2 (EthD-2) and Derivatives thereof, Ethidium monoazide and derivatives thereof, Hexidium iodide and derivatives thereof, bisbenzimide (Hoechst 33258) and derivatives thereof, Hoechst 33342 And derivatives thereof, hoechst 34580 (Hoechst 34580) and its derivatives, hydroxystil
  • the probe coupled with the negatively charged molecule and the intercalating fluorescent material is hybridized with the target DNA and then generates a fluorescent signal.
  • the negatively charged effect rapidly melts the target DNA at the proper melting temperature of the probe, thereby extinguishing the signal.
  • the HPV genotype can be analyzed through a high resolution melting curve analysis obtained according to the temperature of the fluorescent signal.
  • the target HPV genotyping method according to the present invention may include analyzing the melting curve of the intercalating fluorescent material obtained by using the fluorescent signal detection without direct binding to the probe.
  • the conventional amplification curve analysis method using a real-time PCR to detect a plurality of HPV genotypes simultaneously uses a fluorescent material in detecting a target nucleic acid in a sample, so the number of targets to detect two or more target nucleic acids
  • the simultaneous multiple HPV genotyping detection method of the present invention can simultaneously perform amplification curve and melting curve analysis using a detection probe. It is possible to detect multiple HPV genotypes using a substance.
  • the simultaneous multiple HPV genotype detection method using the probe of the present invention is not limited to the simultaneous analysis of the amplification curve and the melting curve, it is possible to separately analyze or sequentially analyze the amplification curve and the melting curve, if necessary, amplification Target nucleic acids can be detected only by curve analysis or melting curve analysis. In particular, when quantitative analysis is not required, the presence or absence of target nucleic acid or genotype can be distinguished by omitting amplification curve analysis and performing only melting curve analysis.
  • Simultaneous multiple HPV genotype detection method of the present invention specifically, (a) mixing the hybridization detection probes and primers in the sample sample containing the target nucleic acid to obtain a real-time amplification curve; (b) obtaining a melting curve between the amplification product and the detection probe while changing the temperature after the amplification process; And (c) analyzing the obtained real-time amplification curve and the melting curve separately or sequentially or simultaneously.
  • the detection probe of step (a) can be variously adjusted according to the HPV genotype to be detected.
  • the step of obtaining the amplification curve or the melting curve was performed through a real-time PCR (polymerase chain reaction), the analysis of the amplification curve may be characterized by measuring by measuring the cycle threshold (Ct) value. If the target nucleic acid is present in the sample or the amount of the target nucleic acid contained in the sample is large, the number of cycles reaching the threshold is reduced and the Ct value is measured to confirm the presence or absence of the target nucleic acid, and the amount of the initial target nucleic acid can also be measured. have.
  • Ct cycle threshold
  • melting curve analysis is generally the last process after the real-time PCR process is completed, the fluorescence while increasing the temperature of 0.5 to 1 °C per second to 95 °C after dropping the temperature of the sample to about 30 to 55 °C
  • the detection probe and the target nucleic acid one strand of the target nucleic acid capable of complementarily binding to the detection probe
  • the fluorescence is quenched and the fluorescent signal drops abruptly. peak) to confirm the presence or absence of the target nucleic acid.
  • Simultaneous multiple HPV detection method of the present invention can be characterized in that it can be detected in a nucleic acid sample sample of 10 1 copy or less.
  • Kits of the present invention may optionally include reagents necessary to conduct target amplification PCR reactions (eg, PCR reactions) such as buffers, DNA polymerase cofactors and deoxyribonucleotide-5-triphosphates.
  • reagents necessary to conduct target amplification PCR reactions eg, PCR reactions
  • the kits of the present invention may also include various polynucleotide molecules, reverse transcriptases, various buffers and reagents, and antibodies that inhibit DNA polymerase activity.
  • kits of the present invention are manufactured in a separate package or compartment containing the aforementioned components.
  • the PNA probe used in the present invention was intended to detect various targets by labeling fluorescence on a detection probe and a general PNA probe that gave structural changes through conformational change and charge.
  • PNA probes were synthesized as shown in Table 1.
  • Fluorescent PNA probe for HPV genotyping detection uses a nucleotide sequence specific to the HPV genotype to be detected by combining the side chains of D-glutamic acid and L-glutamic acid with negative charges at the gamma position of the unmodified probe and the PNA probe backbone. It was.
  • numeric markers in the PNA sequences in Table 1 are those in which some of the PNA sequences are modified with D-glutamine and L-glutamine. See Table 2.
  • Each HPV genotype probe was designed in consideration of nucleotide sequences and Tm values that are highly specific for each genotype in the HPV L1 region, and in the case of overlapping Tm values for genotypes in one tube by changing the fluorescent material that labels the PNA probe. We attempted to distinguish different genotypes at the same time. In addition, to adjust the Tm value of the fluorescent PNA, we tried to control the Tm value of the fluorescent probe by changing the conformational structure, the number of mers, and the position of each probe.
  • PNA probes were synthesized by solid phase synthesis from PNA monomers protected with benzothiazolesulfonyl (Bts) groups and functionalized resins according to the method described in Korean Patent No. 464261 (Lee et al. , Org. Lett., 9: 3291, 2007).
  • PNA can be synthesized using known 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc: 9-flourenylmethloxycarbonyl) or t-Boc (t-butoxycarbonyl) synthesis (Kim L. et al., J. Org). Chem., 59: 5767, 1994; Stephen A. et al., Tetrahedron, 51: 6179, 1995), reporter materials and quenching materials were labeled on PNA probes according to methods well known in the art.
  • the PNA probe prepared in Table 1 was manufactured by itself, and various oligomers used for the PCR reaction were used by Bionics (Korea) for synthesis as shown in Table 3.
  • a primer specific for the genotype to be detected is designed to detect the sensitivity of HPV genotype according to mixing between primer and fluorescent PNA probe. Specificity was analyzed.
  • the PNA fluorescent probes of SEQ ID NOs: 33 to 65 of Table 1 were mixed with the primers of SEQ ID NOs: 66, 67, and 90 to 111 of Table 3, respectively, at an appropriate ratio.
  • the Tm value of each fluorescent probe was confirmed by Melt measurement, and the detection sensitivity and specificity after the PCR reaction of HPV genotype was selected by selecting 11 kinds of probe combinations that do not overlap the fluorescence signal and Tm value. Analyzed.
  • DNA used as the target nucleic acid was used for HPV genotype 22 to verify the combination specificity and sensitivity of the probe and primer, each of the 22 HPV genotype DNA was prepared in 10 10 to 10 0 copies to prepare the target nucleic acid.
  • each PNA fluorescent probe of SEQ ID NOs: 1 to 32 of Table 1 was 0.15 ⁇ M and SEQ ID NOs: 66, 67 primers of Table 3, respectively 0.15 The primers were mixed by mixing the primers of ⁇ M and SEQ ID Nos.
  • PCR cycle was performed for 50 minutes 2 minutes, 95 °C 15 minutes, followed by 45 cycles of 95 °C 15 seconds, 55 °C 45 seconds, 72 °C 15 seconds, the fluorescence of the PNA probe was measured at 55 °C. Thereafter, the mixture was maintained at 95 ° C. for 5 minutes, lowered to 35 ° C., and then hybridized with the PNA probe and the PCR reaction product for 5 minutes. Then, the fluorescent signal was detected by increasing the temperature by 0.5 ° C. from 35 ° C. to 80 ° C. Analysis of the melting curve was performed.
  • each PNA fluorescent probe of SEQ ID NOS: 33 to 65 of Table 1 was prepared using 0.15 ⁇ M and SEQ ID NOs: 66, 67 of Table 3, respectively.
  • the primers of 0.15 ⁇ M and SEQ ID NOs: 90-111 were mixed to 1.2 ⁇ M, respectively, and PCR amplification solution (Engineics, Korea) and each prepared target nucleic acid were added, and a real-time PCR (Real-time PCR machine, CFX96TM Real- The reaction was performed using a time PCR System, Biorad, USA. PCR cycle was performed for 50 minutes 2 minutes, 95 °C 15 minutes, followed by 45 cycles of 95 °C 15 seconds, 55 °C 45 seconds, 72 °C 15 seconds, the fluorescence of the PNA probe was measured at 55 °C. Thereafter, the mixture was maintained at 95 ° C.
  • the fluorescent signal was detected by increasing the temperature by 0.5 ° C. from 35 ° C. to 80 ° C. Analysis of the melting curve was performed.
  • each prepared target nucleic acid, and the reaction was performed using a real-time gene amplifier (Real-time PCR machine, CFX96TM Real-time PCR System, Biorad, USA).
  • PCR cycle was performed for 50 minutes 2 minutes, 95 °C 15 minutes, followed by 45 cycles of 95 °C 15 seconds, 55 °C 45 seconds, 72 °C 15 seconds, the fluorescence of the PNA probe was measured at 55 °C. Thereafter, the mixture was maintained at 95 ° C. for 5 minutes, lowered to 35 ° C., and then hybridized with the PNA probe and the PCR reaction product for 5 minutes. Then, the fluorescent signal was detected by increasing the temperature by 0.5 ° C. from 35 ° C. to 80 ° C. Analysis of the melting curve was performed.
  • the nucleotide sequences of the forward primers MY11, 12 and reverse primers GP6 and PGMY09 are known.
  • SYBR green fluorescence detection system and the design of a fluorescent probe in the base sequence region that can detect a variety of HPV genotypes as shown in Table 4 it was confirmed through the PCR reaction whether the detection of various HPV genotypes.
  • the SYBR green detection system using the SEQ ID NOs 66, 67, 112 and 113 primers had 22 genotypes (6, 11, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 18 HPV genotypes (types 30, 32, 34, 40, 42, 43, 44, 54, 55, 61, 62, 67, 74, other than 58, 59, 66, 68, 69, 70, 73, and 82); 81, 83, 84, 87 and 90) was confirmed that the detection through the Ct value after the PCR reaction (Fig. 4). In addition, it was confirmed that the detection of various genotypes of HPV using the probe detection system 114 to 121 fluorescent probe mixture.
  • 18 HPV genotypes (types 30, 32, 34, 40, 42, 43, 44, 54, 55, 61, 62, 67, 74, 81, 83, 84 not detectable in the primer and probe mixture systems presented above)
  • Type 87 and 90 detectable primer system Forward primer MY11, using a specific reverse primer that can amplify 12 and 18 HPV genotypes, and a fluorescent probe at the base sequence region capable of detecting 18 HPV genotypes
  • the design as shown in Table 5 and Table 6 confirmed the possibility of detecting 18 HPV genotypes by PCR reaction.
  • the present invention can be applied to a human papillomavirus (HPV) genotype detection method.
  • HPV human papillomavirus
  • the present invention relates to a detection probe capable of specifically binding to the DNA of HPV genotype, a detection kit comprising the same and a method for detecting HPV genotype using the same.
  • the present invention can accurately detect genotypes of 22 types of HPV found in the cervix, diagnose multiple infections of one or more HPV genotypes, and detect the presence or absence of 22 types of other HPV genotypes, HPV genotypes can be detected with high sensitivity and specificity.

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Abstract

본 발명은 PNA 검출 프로브를 이용한 HPV 유전자형 검출방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 인유두종바이러스 (Human Papillomavirus: 이하 'HPV'라 함) DNA와 유전자형 특이적으로 결합할 수 있는 검출 프로브, 이를 포함하는 검출 키트 및 이를 이용한 HPV 유전자형 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명은 자궁경부에서 발견되는 22종의 HPV의 유전형을 정확하게 검출할 수 있으며, 하나 이상의 HPV 유전자형의 복합감염도 진단할 수 있으며, 22종 외 다른 HPV의 유전자형의 유무에 대한 검출이 가능하며, HPV 유전자형을 높은 민감도와 특이도로 검출할 수 있다.

Description

인유두종바이러스의 유전자형 검출을 위한 ΡΝΑ 프로브, 키트 및 방법
본 발명은 형광자와 소광자가 포함된 PNA 검출 프로브를 이용한 HPV 유전자형의 검출방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 인유두종바이러스 (Human Papillomavirus: 이하 “HPV“ 라 함) DNA와 유전자형 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 검출 프로브(detection probe)를 이용하여 동시에 다중 HPV 유전자형을 실시간으로 검출하는 방법 및 융해곡선 분석방법, 융해곡선 분석을 통한 HPV 유전형 분석 키트에 관한 것이다.
인유두종바이러스(Human Papillomavirus: 이하 'HPV'라 함)는 8kb의 원형의 이중나선 바이러스로서, 유전자는 E1, E2, E4, E5, E6, E7, L1 및 L2로 구성되어 있다. HPV는 사람뿐 아니라 포유동물의 우상피 세포에 감염되어 사마귀와 여러 가지 악성종양을 일으키는 증상과 밀접한 관계가 있고, 실제로 자궁경부암(cervical cancer)의 거의 대부분이 HPV에 의해 발병하는 것으로 확인되고 있다(문헌 [Howley PM. Virology, 1996, 2:2045-2109]).
자궁경부암은 자궁경부에서 발생하는 악성종양으로 전체 자궁암 발생빈도의 95%를 차지하고 있으며, 전세계의 여성 암 가운데 유방암 다음으로 발생 빈도가 높다(대한민국 질병관리센터, 2004). 자궁경부암은 일반적으로 HPV가 자궁경부 상피기저세포에 감염된 후 저급 상피 이형성증(low squamous intraepithelial lesion, LSIL), 고급 상피 이형성증(high squamous intraepithelial lesion, HSIL) 및 상피내암 등의 오랜 전구 단계를 거쳐 최종 침윤암으로 진전하게 된다. 이러한 자궁경부암의 발병에는 장기간이 소요되고 단계적으로 발생하기 때문에, 발병 중간 단계인 전암 단계 병변을 조기에 효과적으로 진단하면 암으로 완전히 발생되기 전에 치료가 가능하여 자궁경부암을 예방할 수 있다. 따라서 자궁경부암을 야기하는 HPV를 효과적으로 검출하는 방법을 제공하는 것은 질병의 진단, 예방 및 치료를 위해 매우 중요하다.
HPV 게놈 염기서열 중 E6, E7 및 L1 유전자의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)의 차이에 따라 유전자형이 결정되는데, 현재까지 120종 이상의 다른 유전자형이 발견되었다. 이들 유전자형 중에서 자궁경부암을 유발할 수 있는 위험에 따라 고위험형과 저위험형으로 나뉘는 바, 고위험군(high-risk group)에 속하는 HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68형과 저위험군(low-risk group)에 속하는 HPV 6, 11, 26, 34, 40, 42, 44, 47, 53, 66, 69형, 및 잠재적인 고위험군 HPV 26, 73, 82형 등이 자궁경부암으로의 진행과 밀접한 관련이 있다(문헌 [Comparison of Seegene Anyplex II HPV 28 with the PGMY-CHUV Assay for Human papillomavirus Genotyping , C. Estrade et al., J Clin Microbiol, 2014, 52(2): 607]). 이와 같이 감염된 HPV 유전자형의 종류는 암의 향후 진행에 중요한 영향 인자이므로, 샘플 내에서 HPV의 존재여부 및 존재하는 HPV 유전자형을 정확하게 동정하는 것은 자궁경부암 환자의 예후 및 진단에 중요한 의미를 갖는다.
HPV의 존재 및 유전자형 확인 방법은 크게 세포진 검사(Papanicolaou smear 또는 pap smear)법, HPV DNA의 직접 확인법 및 HPV DNA의 증폭을 이용하는 방법으로 나눌 수 있다. 세포진 검사법은 자궁경부암과 전구 병변의 일차 선별을 위해, 자궁경부 세포진의 세포학적 형태에 근거하여 1940년대부터 표준 검사법으로 시행되어 지금까지 HPV의 진단법으로 이용되고 있다. 그러나 이 방법은 검사자의 숙련도에 의존되어 검사결과의 정확도가 떨어지는 단점이 있어, 여전히 30~40%에 달하는 높은 위 음성율을 나타내는 것으로 보고되고 있다(문헌 [Ledger WJ et al., Am J Obstet Gynecol, 2000, 182: 860-865]).
HPV DNA의 직접 확인법으로는 리퀴드 하이브리디제이션(liquid hybridization, Hybrid Capture by Digene Diagnostics, Silver Spring, MD), HPV 타입-특이적 프로브(type-specific probe)를 이용한 서던 블랏(southern blot) 및 도트 블랏(dot blot), 필터 인 시튜 하이브리디제이션(filter in situ hybridization, FISH) 등이 있다(문헌 [Detection of high-risk HPV type by the hybrid Capture 2 test, George et al., J Clin Microbiol, 2001, 65:155-162]). 그러나 이들 방법은 HPV의 DNA를 증폭하지 않기 때문에 검사의 민감도가 떨어지는 단점이 있다.
HPV DNA의 증폭을 이용하는 방법으로는 타입-특이적 PCR(type-specific polymerase chain reaction), 제너럴-프라이머 PCR(general primer PCR) 등이 있으며, 특히 제너럴 프라이머 PCR(general primer set)을 이용하여(문헌 [Leen-Jan et al., J Clin Microbiol, 2006, 3292-3298]) 증폭된 HPV DNA를 도트 블랏 하이브리디제이션(dot blot hybridization), 마이크로타이터 플레이트 하이브리디제이션(microtiter plate hybridization), 또는 라인 프로브 어세이(line probe assay) 등(문헌 [Evaluation of a Modified Reverse Line Blot Assay for Detection and Typing of Human Papillomavirus, Feray et al., 2005, Am J clin Pathol. 123:896-899])의 방법을 통해 유전자형을 검색하는 방법이 일반적으로 수행되고 있다. 그러나 이들 방법은 복잡한 절차를 거쳐야 하며, 많은 검체를 처리하고 분석하는데 있어 많은 시간과 노동력이 소비될 뿐만 아니라 검출 감도와 데이터 해석 상의 문제점을 내포하고 있다(문헌 [Gravitt PE et al., J Clin Microbiol, 1998, 36:3020-3027]).
최근에 개발된 DNA 마이크로어레이(DNA chip) 기술을 이용한 HPV 유전자형 분석키트(한국공개특허 제2006-0015669호 및 제2004-0078506호)들은 유리 슬라이드 상에 HPV의 다양한 유전자형에 특이적인 DNA 프로브를 고정하고, PCR로 증폭된 산물과 혼성화하여 나타나는 반응을 동시에 분석할 수 있다. 상기 HPV DNA 칩은 단시간 내에 HPV의 다양한 유전자형을 신속하게 검출할 수 있어 상업적으로 HPV 진단을 위해 많이 이용되고 있다.
나아가, 최근에는 비드 마이크로어레이(bead microarray) 방식의 HPV 진단법이 개발되었다. 이 방법은 HPV 유전자형 특이적 프로브를 비드(beads)에 고정화시켜 한 튜브 내에서 표적핵산과 혼성화 반응시키는 것으로서, 표적핵산과 혼성화 반응한 프로브의 비드를 선별하는 방법에 의해 HPV 유전형을 검출하므로, 유리 슬라이드 등에 프로브를 고정화시키는 일반적인 DNA 칩에 비해 단시간 내에 다량의 샘플을 처리할 수 있고, 높은 특이도로 HPV의 유전자형을 검출할 수 있을 뿐 아니라, 비용이 매우 저렴하여 상업적으로 매우 유용하다(문헌 [Facile, comprehensive, High-Throughput Genotyping of Human Genital Papillomaviruses using spectrally addressable Liquid Bead Microarrays, Jan Wallace et al., 2005, J. Mol. Diagn, 7: 72-80] 및 [Bead-based multiplex genotyping of Human Papillomaviruses, Markus et al., 2006, J. Clin. Microbiol, 44: 504-512]). 특정 유전자형의 DNA와 고정된 DNA 프로브 사이에 DNA/DNA 혼성화 반응이 일어났는지는 흔히 특정한 파장의 형광을 내는 형광체를 이용하는 광학적 방법을 주로 사용하여 확인한다. 이 밖에도 전기화학적 방법 등 알려져 있는 다른 방법을 사용할 수도 있다. 그러나 상기한 DNA 칩이나 비드 어레이는 고정된 DNA 프로브 자체가 핵산분해효소(nuclease) 등에 대한 생물학적 및 화학적 안정성이 매우 낮은 관계로 안정성이 낮아 보존 기간에 따라 DNA가 변질되거나 반응력이 떨어질 수 있는 문제점이 있다(한국공개특허 제2006-0091708호 참조).
상기한 바와 같은 DNA 자체의 불안정성을 해결하기 위해서, 다양한 DNA 유사체들(analogues)이 개발되고 있으며, 그 중 PNA(peptide nucleic acids)는 1991년 넬슨(Nielsen)에 의해 개발되었다. PNA는 DNA의 포스포다이에스터(phosphodiester) 결합이 펩타이드 결합(peptide bond)으로 대체되어 있으며, DNA와 같은 아데닌, 티민, 구아닌과 시토신을 가지고 있어 염기 특이적으로 DNA나 RNA와 혼성화 반응을 일으킬 수 있다. 특히, 펩타이드 결합 형태로 변화된 기본골격(backbone)의 구조적 차이는 DNA나 RNA의 포스페이트 골격의 음이온성 성질을 중성 성질로 바꾸었다. 이러한 음이온성 성질의 중성화로 인한 음이온들 간의 정전기적 반발력의 제거는 혼성화 반응 시 그 결합력이 높아지는 직접적 원인이 된다. 그 결과, 혼성화 반응속도가 빠를 뿐만 아니라 특이도도 매우 높아 S/N 비율(signal to noise ratio)이 향상되는 장점이 있다. 또한 핵산분해효소와 같은 생분해효소 등이 인지하지 못하여 DNA나 RNA보다 안정성이 매우 높다(문헌 [Peptide nucleic acid, PNA, sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide, P.E. Nielsen et al., 1991, Science, 254, 1497-1500]).
이와 같이 DNA나 RNA와 같은 역할을 하면서 혼성화 결합력과 안정성이 우수한 PNA는 현재 DNA의 단점을 보완할 수 있는 대체물질로서 높은 잠재력을 인정받아, DNA 올리고머를 대신하여 PNA 올리고머를 이용하여 분석 또는 진단하는 방법에 대한 많은 연구가 진행되고 있다(한국등록특허 제91708호 및 제12544호, 및 문헌 [Peptide nucleic acids on microarrays and other biosensors, Brandt O et al., 2004, Trends in Biotechnology, 22, 617-622], [Detection of target DNA using fluorescent cationic polymer and peptide nucleic acid probes on solid support, Fredric R Raymond et al., 2005, BMC technology, 5, 1-5]).
그 일례로 본 발명자들은 이러한 혼성화 결합력과 안정성이 우수한 PNA 프로브를 이용하여 HPV 유전자형을 진단할 수 있는 PNA 칩 및 방법에 대해 특허출원으로 출원번호 제 10-2007-0022201를 부여 받은바 있다. 그러나 PNA 칩은 높은 민감도 및 특이도로 HPV 유전형을 정확하게 검출할 수 있는 장점이 있지만 사용자의 편리성 및 반응시간 등이 길어 실시간 중합효소 연쇄반응으로만 HPV 유전자형을 검출하고자 하는 요구가 증대되어 왔다.
이러한 문제점을 해결하기 위해서는 복수의 시료를 적은 노동력으로 빠른 시간 내에 정확하게 분석할 수 있는 실험 방법이 필요하다. 현재 개발된 기술 중 이러한 조건에 가장 부합되는 것은 실시간 PCR(RT-PCR)이라고 할 수 있다. 실시간 PCR 방법은 PCR 증폭산물의 증가를 PCR의 매 주기마다 실시간으로 관찰하는 방법으로, PCR 증폭산물과 반응하는 형광물질의 검출과 정량으로 해석하는 기술이다. 이 방법은 기존의 PCR법이 최종 단계를 마치고 겔 상에서 염색하여 전기영동 후 PCR 증폭산물을 확인하는 것에 비해, 전기영동의 추가 작업이 필요 없고 정확도 및 민감도가 뛰어나며, 재현성이 높다. 또한 자동화가 가능하고, 결과를 수치화할 수 있으며, EtBr(Ethidium Bromide)과 같은 염색제에 의한 오염 및 자외선 조사에 대해 생물학적 안전성이 뛰어나고, 자동으로 특이 유전자의 증폭 유무를 확인할 수 있는 진단방법으로, 검출하고자 하는 DNA와 RNA의 정확한 정량이 가능하다(문헌 [Real-time PCR in virology, Mackay I.M., Arden K.E. and Nitsche A., 2002, Nucleic Acids Res. 30(6): 1292-1305]).
그러나 위와 같은 실시간 PCR 방법은 형광물질을 다르게 설계하여 16, 18 형의 유전형의 검출만 가능하며, 형광자체로만 유전형을 검출하기 때문에 하나의 튜브에서 4개의 유전형만 구별이 가능하다. 이에, 하나의 튜브(tube)에서 다양한 유전자 변이를 검출하고자 하는 노력들이 지속적으로 이루어지고 있으며, DNA 프로브를 이용한 융해곡선 분석법이 이용되고 있다. 이러한 융해곡선 분석을 위해 사용되는 DNA프로브는 MGB 태크만(Taqman) 프로브, 분자비컨(molecular beacon, MB), 양면(binary) 프로브가 있다. 이 방법들은 단일염기서열변이 구별능을 나타낸다는 장점이 있는 반면, DNA 프로브의 최소 길이가 20~40mer 정도로 길어서 서로 인접하게 존재하는 단일염기서열변이는 하나의 반응으로 검출하기 어렵다는 단점이 있다(문헌 [Hidefumi Sasaki et al., 2005, Clin Cancer Res. 11: 2924-2929], [Manna Zhang et al., 2002, HEPATOLOGY 36: 3]).
본 발명자들은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여, 상기한 장점을 갖는 PNA를 이용하여 HPV의 각각의 유전자형에 특이적으로 결합할 수 있는 PNA 프로브를 제작하였으며, 본 HPV 유전자형 검출PNA 프로브는 고위험군 20종(고위험군 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 69, 70, 73 및 82형) 및 저위험군 2종(저위험군 6 및 11형)을 검출할 수 있는 프로브를 모두 포함하고 있으며, 한국인에게서 높은 빈도로 발생되는 그 외 18종(유형 30, 32, 34, 40, 42, 43, 44, 54, 55, 61, 62, 67, 74, 81, 83, 84, 87 및 90형)의 HPV 유전형을 검출할 수 있는 프로브도 포함되어 있다. 또한 HPV 감염여부를 확인하기 위해 HPV의 각각의 유전자형의 컨센서스(consensus) 지역에 혼성화할 수 있는 HPV 양성(positive) 프로브를 제작하였다.
이들 PNA 프로브를 이용하여 실시간 증폭반응 중합효소 반응 키트를 제작하였으며, 또한 HPV의 증폭 민감도를 증가시킬 수 있는 HPV 컨센서스 프라이머 조합을 이용하여 각각의 유전자형을 높은 특이도 및 민감도로 검출할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서 본 발명의 목적은 HPV 유전자형을 높은 특이도 및 민감도로 정확하게 검출할 수 있는, 생물학적 효소에 안정한 PNA 프로브를 제공하기 위한 것이다. 본 발명의 다른 목적은 상기 프로브를 포함하는 HPV 유전자형의 검출키트를 제공하기 위한 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 검출키트를 이용한 HPV 유전자형의 검출방법을 제공하기 위한 것이다.
PNA는 DNA보다 열 및 생물학적 안정성과 타겟 DNA에 대한 인식능력 및 결합 능력이 뛰어나서 단일염기서열변이를 검출하는 실시간 PCR 기술의 프로브로 사용할 수 있다. 그러나 실시간 PCR 방법은 시료 내 타겟 DNA를 검출함에 있어 형광물질을 사용하기 때문에, 여러 유전자형을 검출하기 위해서는 두 개의 서로 다른 파장의 형광물질을 가진 프로브가 필요한 문제가 있다. 이는 다중 검출(multiplex detection)을 함에 있어 커다란 제한사항으로 작용하며, 본 발명에서는 형광 프로브의 융해곡선 분석을 통하여 이러한 문제를 해결할 수 있다.
본 발명은 HPV 22종의 각각의 유전자형을 검출하기 위한 리포터 및 소광자가 결합된 PNA 프로브를 제공한다. 또한 HPV 22종 외의 다른 유전자형을 검출하기 위한 리포터 및 소광자가 결합된 PNA 프로브를 제공한다.
본 발명은 HPV 유전형을 검출하기 위한 리포터 및 소광자가 결합된 PNA 프로브를 이용하는 융해곡선 분석 방법을 제공한다.
본 발명은 상기 HPV PNA 프로브를 포함하는 HPV 유전자형 검출용 키트를 제공한다.
상기 HPV 유전자형 검출을 위한 융해곡선 분석방법에 이용되는 PNA 프로브는 일반적인 PNA 프로브이거나 음전하 분자를 포함할 수 있으며, 음전하가 포함된 PNA 프로브를 이용하는 경우 융해곡선 해상도가 증가하여 하나의 반응 튜브에서 여러 유전형을 한번에 분석하기에 용이하다.
또한, 상기 PNA 프로브는 형광물질을 포함할 수 있다. 형광물질은 리포터 및 소광자일 수 있으며, 인터컬레이팅(intercalating) 형광물질일 수 있다.
본 발명에 따른 HPV 검출방법을 이용하면 HPV의 고위험군 20종과 저위험군 2종에 대해서 실시간 증폭곡선과 융해곡선의 동시 분석이 가능해 동시 다중적으로 HPV의 정확한 유전형 판별이 가능하다. 또한 유전형 판별이 가능한 22종외에 다른 HPV 유전형의 검출 및 HPV 감염유무의 확인이 가능하다. 또한 각각의 유전자형을 높은 특이도 및 민감도로 검출할 수 있으므로, HPV 유전형 판별에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
도 1의 1)은 HPV 유전자형의 확인을 위한 다중 검출 프로브 및 HPV 유형 특이적 프라이머 혼합체의 모식도이다. 도 1의 2)는 HPV 의 감염 유무 및 다른 유형을 구별하기 위한 SYBR green 또는 형광 PNA 검출 프로브를 이용한 프라이머 혼합체의 모식도이다. 도 1의 3)은 유전형 판별이 가능한 HPV 유전형 22종(6, 11, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 69, 70, 73 및 82형) 외 HPV 유전형 18종(유형 30, 32, 34, 40, 42, 43, 44, 54, 55, 61, 62, 67, 74, 81, 83, 84, 87 및 90형)을 구별하기 위한 형광 PNA 프로브를 이용한 프라이머 복합체의 모식도이다.
도 2는 형광 PNA 검출 프로브 및 프라이머 혼합체를 이용하여 HPV 유전자형의 검출 민감도 및 멜팅 피크(melting peak)를 확인한 데이터이다. 검출하고자 하는 HPV 형광 PNA 프로브 혼합체 및 HPV 유형 특이적인 프라이머 혼합체를 이용하여 HPV 유전자형의 검출 민감도 및 특이성을 확인한 결과 각 유형별 형광 프로브의 멜팅 피크의 분석을 통해 HPV DNA에서 1copy 물질까지의 검출이 가능하였으며 검출 프로브에 표지된 형광 물질의 Tm값을 이용하여 각각의 유전자형이 특이적으로 구별됨을 확인하였다.
도 3은 형광 PNA 검출 프로브 및 프라이머 혼합체를 이용하여 HPV 유전자형을 형광물질 및 Tm 값을 이용하여 구분됨을 확인하였다. 각각의 형광물질(FAM, HEX, ROX, CY5)을 HPV 유전자형 11종 PNA에 표지하여 유전자형을 Tm에 따라 구분됨을 확인하였다. 형광물질 FAM이 표지된 각각의 PNA 혼합체는 33, 11, 58 형을 구분할 수 있으며 47.0℃, 58.5℃, 66.0℃의 Tm을 확인하였다. 또한 형광물질 HEX가 표지된 각각의 PNA 혼합체는 16, 73 형을 구분할 수 있으며 48.0℃, 63℃의 프로브 Tm을 확인하였다. 형광물질 ROX가 표지된 각각의 PNA 혼합체는 45, 18, 69형을 구분할 수 있으며 47.5℃, 59.5℃, 69.0℃의 Tm을 확인하였다. 형광물질 CY5가 표지된 각각의 PNA 혼합체는 26, 6, 52형을 구분할 수 있으며 Tm은 각각 44.0℃, 53.0℃, 62.5℃에서 검출됨을 확인하였다.
도 4는 HPV 의 감염 유무를 결정하기 위해 SYBR green 형광을 이용하여 Real-time PCR 반응을 수행하여 발생되는 Ct(cycle threshold) 그래프 분석을 통해 HPV 감염 유무를 구분하였으며 멜팅 피크의 분석을 통해 HPV 유전자 증폭의 특이성 검증이 가능함을 확인하였다. 또한 HPV 의 감염 유무를 결정을 위한 형광 프로브 검출 시스템 또한 Ct 그래프 및 멜팅 피크의 분석을 통해 HPV DNA의 감염 유무 및 특이성 검증이 가능함을 확인하였다.
도 5는 HPV 유전형 18종(유형 30, 32, 34, 40, 42, 43, 44, 54, 55, 61, 62, 67, 74, 81, 83, 84, 87 및 90형)을 검출하기 위한 형광 PNA 프로브를 이용하여 Real-time PCR 반응을 수행하여 발생되는 Ct 그래프 분석을 통해 HPV 유전형 검출이 가능함을 확인하였다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 리포터(reporter) 및 소광자(quenching)가 결합된 HPV 유전자형 검출 프로브를 이용하여 동시에 HPV 유전형을 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 검출 프로브는 HPV 특이적 유전형에 상보적으로 결합하는 모든 핵산 및 핵산 유사체로 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide), PNA(peptide nucleic acids) 및 LNA(Locked nucleic acid)로 이루어진 군에서 각각 선택될 수 있다. PCR을 위한 중합효소에 일반적으로 뉴클레아제(nuclease) 활성이 있어 프로브의 손상이 생길 가능성도 있으므로, 뉴클레아제에 안정한 PNA와 같은 합성핵산을 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 검출 프로브는 목적 표적핵산 유전자를 선택적으로 검출하는 역할을 하므로, 당업계에 알려진 핵산 검출을 위한 프로브의 사용이 가능하다. 본 발명에서 검출 프로브가 PNA 이외의 다른 핵산 유사체일 경우에도 표적핵산 검출이 가능한지 확인하기 위해 MGB-taqman 검출 프로브를 사용하여 분석을 수행하였으며, 그 결과 서로 다른 가닥에서 돌연변이 검출용 MGB-taqman 프로브와 야생형 클램핑 PNA 프로브 시스템이 작동하는 것을 실시간 증폭곡선 분석으로 확인할 수 있다.
본 발명에서는 바람직하게 PNA 프로브를 사용하였으며, PNA 프로브는 인공합성 DNA로 타겟 HPV DNA 또는 RNA와 특이적으로 결합이 가능하고, 뉴클레아제에 대해 안정하기 때문에 프로브를 기반으로 한 융해곡선 분석이 가능하다.
또한, 본 발명에 있어서, 검출 프로브는 프로브의 N 말단, C 말단 또는 프로브(합성핵산) 골격의 알파, 베타, 감마 또는 링커(linker) 위치에 천연 아미노산의 및 합성 아미노산의 곁사슬 등 특정 작용기를 결합시켜 입체구조적 변화를 줄 수 있으며, 상기 아미노산은 전하를 가지고 있지 않거나, 음전하 또는 양전하를 가지는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정된 것은 아니며, 당업계에 공지된 프로브 입체구조 변화 및 전하 부여 방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 HPV 유전자형 검출 PNA 프로브는 고위험군 20종(고위험군 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 69, 70, 73 및 82형) 및 저위험군 2종 (저위험군 6 및 11형)을 검출할 수 있는 프로브를 모두 포함하고 있으며, 한국인에게서 높은 빈도로 발생되는 그 외 18종(유형 30, 32, 34, 40, 42, 43, 44, 54, 55, 61, 62, 67, 74, 81, 83, 84, 87 및 90형)의 HPV 유전형을 검출할 수 있는 프로브도 포함한다. 본 발명의 일실시예에서, PNA 검출 프로브가 서열번호 1 내지 65 및 114 내지 121 및 148 내지 185 중 어느 하나의 염기서열로 이루어지며, 6, 11, 16, 18, 26, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 39, 40, 42, 43, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 59, 61, 62, 66, 67, 68, 69, 70, 73, 74, 81, 82, 83, 84, 87 및 90형으로 구성된 군으로부터 선택되는 HPV 유전자형을 검출할 수 있다.
본 발명의 HPV 유전자형 검출 PNA 프로브는 일반적인 PNA 프로브이거나 음전하 분자를 포함할 수 있으며, 음전하가 포함된 PNA 프로브를 이용하는 경우 융해곡선 해상도가 증가하여 하나의 반응 튜브에서 여러 유전형을 한번에 분석하기에 용이하다.
본 발명에 따른 음전하 분자를 포함하는 PNA 프로브는 인산, 카르복실산, 설폰산, 질산, 붕산 계열의 모든 산의 군으로부터 선택되는 하나 이상의 음전하 분자를 포함할 수 있다. 음전하 분자는 PNA 프로브의 N 말단, C 말단 또는 PNA 골격의 알파, 베타 또는 감마 위치에 결합될 수 있으며, 최소 하나 이상의 음전하 분자가 연속적, 간헐적으로 프로브의 염기에 결합할 수 있다.
본 발명에 따른 PNA 프로브는 융해곡선 그래프의 피크 반 진폭 너비(half width at half maximum)가 좁은 특징으로 인하여 다양한 HPV 유전자형 검출 기술에 적용할 수 있다. 또한, 융해곡선의 해상도가 높기 때문에 각각의 HPV 유전자형의 염기서열에 따라 융해곡선이 서로 구분되며, 이로 인하여 각각의 HPV 유전자형에 따라 시퀀싱(sequencing) 분석과 같은 별도의 분석이 없어도 간편하게 유전자형을 알아낼 수 있다.
본 발명의 상기 검출 프로브는 양 말단에 리포터(reporter)와 리포터 형광을 소광(quenching)할 수 있는 소광자(quencher)가 결합할 수 있으며, 인터컬레이팅(intercalating) 형광 물질을 포함할 수 있다.
상기 '리포터(reporter)'는 특정 파장의 빛을 흡수, 방출하여 형광을 발하는 물질로서, 프로브에 표지하여 표적핵산과 프로브 사이의 혼성화가 이루어졌는지 확인할 수 있는 물질을 의미하여, 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC, 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오로(Alexa Fluor), FAM, JOE, ROX, HEX, 텍사스 레드(Texas Red), TET, TRITC, TAMRA, 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 염료로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다. 바람직하게는, 상기 리포터가 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, JOE, TAMRA, CY5 및 CY3 로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
상기 '소광자(quencher)'는 리포터가 발생시킨 빛을 흡수하여 형광세기를 감소시키는 물질을 의미하며, 답실(Dabcyl), TAMRA, Eclipse, DDQ, QSY, 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 블랙홀 퀸처(Black Hole Quencher), Qxl, 아이오와 블랙(Iowa black) FQ, 아이오와 블랙 RQ 및 IRDye QC-1 로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 또는 Dabsyl을 사용하는 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니며, 소광자는 종류에 따라 형광세기를 감소하는 범위가 다르므로 이를 고려하여 사용할 수 있다.
일실시예에서, 상기 음전하 분자, 리포터 및 소광자가 포함된 PNA 프로브는 타겟 DNA와 혼성화된 후 형광 신호가 발생되며, 온도가 올라감에 따라 음전하 효과에 의해 프로브의 적정 융해 온도에서 타겟 DNA와 빠르게 융해되어 형광 신호가 소광되며, 상기 음전하가 포함된 PNA 프로브는 음전하가 없는 PNA 프로브와 비교하여 타켓 DNA와의 해리가 빨라 융해곡선의 해상도를 증가시킨다. 이러한 온도 변화에 따른 상기 형광 신호로부터 얻어진 고해상도의 융해곡선 분석을 통하여 타켓 DNA의 HPV 유전자형을 분석할 수 있다.
상기 '인터컬레이팅(intercalating) 형광 물질'은 아크리딘 호모다이머(Acridine homodimer) 및 이의 유도체, 아크리딘 오렌지(Acridine Orange) 및 이의 유도체, 7-아미노액티노마이신 D(7-aminoactinomycin D, 7-AAD) 및 이의 유도체, 액티노마이신 D(Actinomycin D) 및 이의 유도체, 에이씨엠에이(ACMA, 9-amino-6-chloro-2-methoxyacridine) 및 이의 유도체, 디에이피아이(DAPI) 및 이의 유도체, 디하이드로에티듐(Dihydroethidium) 및 이의 유도체, 에티듐 브로마이드(Ethidium bromide) 및 이의 유도체, 에티듐 호모다이머-1(EthD-1) 및 이의 유도체, 에티듐 호모다이머-2(EthD-2) 및 이의 유도체, 에티듐 모노아자이드(Ethidium monoazide) 및 이의 유도체, 헥시디움 아이오다이드(Hexidium iodide) 및 이의 유도체, 비스벤지마이드(bisbenzimide, Hoechst 33258) 및 이의 유도체, 호에크스트 33342(Hoechst 33342) 및 이의 유도체, 호에크스트 34580(Hoechst 34580) 및 이의 유도체, 하이드로옥시스티바미딘(hydroxystilbamidine) 및 이의 유도체, 엘디에스 751(LDS 751) 및 이의 유도체, 프로피디움 아이오다이드(Propidium Iodide, PI) 및 이의 유도체, 및 사이다이스(Cy-dyes) 유도체로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
일실시예에서, 음전하 분자와 인터컬레이팅 형광물질이 결합된 프로브는 타겟 DNA와 혼성화 된 후 형광 신호가 발생되며, 음전하 효과에 의해 프로브의 적정 융해 온도에서 타겟 DNA와 빠르게 융해되어 신호가 소광되며, 상기 형광 신호의 온도에 따라 얻어진 고 해상도의 융해곡선 분석을 통하여 HPV 유전자형을 분석할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 타겟 HPV 유전자형 분석방법은 인터컬레이팅 형광 물질이 프로브에 직접적인 결합 없이 형광 신호 검출을 이용하여 얻어진 융해곡선을 분석하는 것을 포함할 수 있다.
일반적으로, 복수의 HPV 유전자형을 동시적으로 검출하기 위해 종래의 실시간 PCR을 이용한 증폭곡선 분석 방법은 시료 내 표적핵산을 검출함에 있어서 형광물질을 사용하기 때문에 두 가지 이상 표적핵산을 검출하기 위해서는 타겟 수만큼의 형광물질을 가진 프로브가 필요한 문제가 있어 다중 검출이 제한적이었지만, 본 발명의 동시 다중적 HPV 유전형 검출방법은 검출 프로브를 이용하여 증폭곡선 및 융해곡선 분석을 동시에 수행할 수 있으므로, 하나의 형광물질을 이용하여 다중 HPV 유전형 검출이 가능한 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 프로프를 이용한 동시 다중적 HPV 유전형 검출방법은 증폭곡선 및 융해곡선의 동시 분석에 한정된 것이 아닌, 증폭곡선과 융해곡선을 별도로 분석하거나 순차적으로 분석할 수 있으며, 필요에 따라 증폭곡선 분석 또는 융해곡선 분석만 수행하여 표적핵산을 검출할 수 있다. 특히, 정량분석이 필요 없는 경우에는 증폭곡선 분석을 생략하고 융해곡선 분석만 수행하여도 표적핵산의 유무 또는 유전자형을 구별할 수 있다.
본 발명의 동시 다중적 HPV 유전형 검출방법은 구체적으로, (a) 표적핵산이 포함되어 있는 검체 시료에 검출 프로브 및 프라이머를 혼합하여 혼성화시켜 실시간 증폭곡선을 얻는 단계; (b) 상기 증폭과정 이후 온도를 변화시키면서 증폭산물과 검출 프로브간의 융해곡선을 얻는 단계; 및 (c) 상기 얻어지는 실시간 증폭곡선 및 융해곡선을 별도로 분석하거나 순차적 또는 동시에 분석하는 단계를 포함한다.
상기 (a) 단계의 검출 프로브는 검출하고자 하는 HPV 유전자형에 따라 다양하게 조절이 가능하다. 본 발명에서 상기 증폭곡선 또는 융해곡선을 수득하는 단계는 실시간 PCR(polymerase chain reaction)을 통해 수행하였으며, 증폭곡선의 분석은 Ct(cycle threshold)값을 측정하여 분석하는 것을 특징으로 할 수 있다. 시료 내에 표적핵산이 존재하거나 시료에 포함된 표적핵산의 양이 많으면, threshold에 도달하는 cycle 수가 적어지게 되어 Ct값이 적게 측정되므로 표적핵산의 유무를 확인할 수 있으며, 초기 표적핵산의 양도 측정할 수 있다.
또한, 융해곡선(melting curve) 분석은 일반적으로 실시간 PCR의 과정이 끝난 후에 마지막으로 진행되는 과정으로, 샘플의 온도를 30 내지 55℃ 정도로 떨어트린 후에 95℃까지 초당 0.5 내지 1℃씩 증가시키면서 형광의 시그널 크기를 측정하며, 온도가 올라감에 따라 검출 프로브와 표적핵산(검출 프로브와 상보적으로 결합 가능한 표적핵산의 한쪽 가닥)이 분리되면 형광이 소광되어 형광시그널이 갑자기 떨어지게 되므로, 멜팅 피크(melting peak)를 통해 표적핵산의 유무를 확인할 수 있다.
본 발명의 동시 다중적 HPV 검출방법은 101 copy 이하의 핵산 샘플시료에서 검출할 수 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 방법으로 HPV 유전형 16, 18, 52형의 107 내지 100 copy 농도별 실시간 증폭곡선 및 융해곡선을 분석한 결과, 도 2 내지 5에 나타난 바와 같이, 100 copy 의 HPV 유전자형을 검출할 수 있을 뿐 아니라 동시 다중적으로 검출 가능한 것을 확인하였다.
본 발명의 키트는 버퍼, DNA 중합효소 조인자 및 데옥시리보뉴클레오타이드-5-트리포스페이트와 같은 타겟 증폭 PCR 반응(예컨대, PCR 반응)을 실시하는데 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 키트는 또한 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 역전사효소, 다양한 버퍼 및 시약, 및 DNA 중합효소 활성을 억제하는 항체를 포함할 수 있다.
또한, 키트는 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적양은, 본 명세서에 개시사항을 습득한 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 키트는 앞서 언급된 구성성분들을 포함하는 별도의 포장 또는 컴파트먼트(compartment)로 제작된다.
[실시예]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
[검출 프로브와 DNA 올리고머의 분석]
[실시예1]
HPV 검출에 사용된 PNA 프로브 및 타겟 DNA 올리고머 예시
1-1 : PNA 프로브 제작
본 발명에서 이용한 PNA 프로브는 입체구조 변화 및 전하부여를 통한 구조적 변화를 준 검출 프로브(detection probe) 및 일반적인 PNA 프로브에 형광을 표지하여 다양한 타겟을 검출하고자 하였다. PNA 올리고머를 이용하여 다양한 HPV 유전자형의 검출 및 특이성을 확인하기 위해, 표 1과 같이 PNA 프로브를 합성하였다. HPV 유전형 검출을 위한 형광 PNA 프로브는 변형되지 않는 프로브 및 PNA 프로브 골격의 감마 위치에 음전하를 가지는 D-글루탐산 및 L-글루탐산의 곁사슬을 결합하여 검출하고자 하는 HPV 유전형에 특이적인 염기서열의 프로브를 사용하였다.
[표 1]
본 발명에서 사용한 PNA 프로브의 서열
Figure PCTKR2015011478-appb-I000001
(표 1의 PNA 서열 중에서 숫자 표식은 PNA 서열 일부를 D-글루타민과 L-글루타민으로 변형시킨 것임. 표 2 참조)
각각의 HPV 유전자형 프로브는 HPV L1 지역에서 유전자형 별로 특이성이 높은 염기서열 및 Tm값을 고려하여 디자인 하였으며, 유전자형 별로 Tm값이 중복되는 경우에는 PNA프로브에 표지하는 형광 물질의 변경을 통해 한 개의 튜브에서 다양한 유전자형을 동시에 구분하고자 하였다. 또한 형광 PNA의 Tm값 조절을 위해 각 프로브에 입체 구조의 변경, mer 수 변경 및 위치 조절을 통해 형광 프로브의 Tm값을 조절하고자 하였다.
[표 2]
PNA 서열 변형
Figure PCTKR2015011478-appb-I000002
PNA 프로브는 한국등록특허 제 464261호에 기재된 방법에 따라 PNA 올리고머를 벤조티아졸설포닐(Bts: Benzothiazolesulfonyl)기로 보호된 PNA 단량체와 기능화된 레진으로부터 고체상 합성법(solid phase synthesis)으로 합성하였다 (Lee et al., Org. Lett., 9:3291, 2007). 이 방법 이외에도 알려진 9-플루오레닐메톨시카르보닐 (Fmoc: 9-flourenylmethloxycarbonyl) 또는 t-Boc(t-butoxycarbonyl) 합성법을 사용하여 PNA를 합성할 수 있으며(Kim L. et al., J. Org. Chem., 59:5767, 1994; Stephen A. et al., Tetrahedron, 51:6179, 1995), 리포터 물질 및 소광 물질은 당업계에 널리 공지된 방법에 따라 PNA 프로브에 표지하였다.
1-2 : DNA 올리고머 제작
상기 표 1에서 제작한 PNA 프로브는 자체 제작하였으며, PCR 반응에 사용하는 다양한 올리고머는 표 3과 같이 ㈜바이오닉스(한국)에 합성을 의뢰하여 사용하였다. 특히 HPV 검출 민감도의 향상 및 실시간 PCR 반응을 통한 HPV 유전자형의 다중 감염 유무를 확인하기 위하여, 검출하고자 하는 유전자형에 대립 특이적인 프라이머를 디자인하여 프라이머 및 형광 PNA 프로브간 혼합에 따른 HPV 유전형의 검출 민감도 및 특이성을 분석하였다.
[표 3]
PNA 프로브 특성 분석을 위한 DNA 올리고머 서열
Figure PCTKR2015011478-appb-I000003
1개의 반응 튜브에서 HPV 11종의 유전자형 구분을 위하여 표 1의 서열번호 1 내지 32의 PNA 형광 프로브를 각각 표 3의 서열번호 66 내지 89 의 프라이머와 적정 비율로 혼합하여 실시간 PCR 반응을 수행 후 Melt 측정을 통해 각각의 형광 프로브의 Tm 값을 확인 하였으며, 형광 신호 및 Tm값이 중복되지 않는 11종의 프로브의 조합을 선별하였다. 이렇게 선정된 11종의 프로브 조합을 이용하여 PCR 반응 후 HPV 유전자형의 검출 민감도 및 특이도를 분석하였다. 또한 다른 1개의 반응 튜브에서 11종의 HPV 유전자형의 구분을 위하여 표 1의 서열번호 33 내지 65의 PNA 형광 프로브를 각각 표 3의 서열번호 66, 67 및 90 내지 111의 프라이머와 적정 비율로 혼합하여 실시간 PCR 반응을 수행 후 Melt 측정을 통해 각각의 형광 프로브의 Tm값을 확인하였으며, 형광 신호 및 Tm값이 중복되지 않는 11종의 프로브 조합을 선별하여 HPV 유전형의 PCR 반응 후의 검출 민감도 및 특이도를 분석하였다.
[실시예2]
PNA 프로브 혼합체와 DNA 올리고머에 따른 반응 분석
2-1 표적핵산의 준비
표적핵산으로 사용된 DNA는 프로브 및 프라이머의 조합 특이성 및 민감도 검증을 위해서 HPV 유전자형 22종을 이용하였으며, 각각의 22종 HPV 유전자형 DNA는 1010 내지 100 카피로 준비하여 표적핵산을 준비하였다.
2-2 PNA 프로브 혼합체와 다양한 프라이머의 반응분석
1) 실시예 1-1에서 제조한 타겟 특이적인 PNA 형광 프로브와 실시예 1-2에서 제조한 타겟 특이적인 프라이머 종류에 따른 11종의 HPV (6, 11, 16, 18, 26, 33, 45, 52, 58, 69, 73) 유전자형의 검출 민감도 및 특이성 확인을 위해, 상기 표 1의 서열번호 1 내지 32의 각각의 PNA 형광 프로브를 0.15μM와 표 3의 서열번호 66, 67 프라이머를 각각 0.15μM, 서열번호 68 내지 89 각각의 프라이머를 1.2μM로 혼합하여 PCR 증폭용액(엔지노믹스, 한국)과 각각의 준비된 표적핵산을 첨가하였으며, 실시간 유전자 증폭기(Real-time PCR machine, CFX96TM Real-time PCR System, 바이오라드, 미국)를 이용하여 반응을 수행하였다. PCR 사이클은 50℃ 2분, 95℃ 15분 동안 반응 후, 95℃ 15초, 55℃ 45초, 72℃ 15초 반응 과정을 45 cycle 수행하였으며, PNA 프로브의 형광은 55℃에서 측정하였다. 이 후 95℃에서 5분 동안 유지 후, 35℃까지 낮춘 뒤에 5분 동안 PNA 프로브와 PCR 반응산물을 혼성화시킨 후, 35℃부터 80℃까지 0.5℃씩 온도를 증가하면서 형광신호를 측정하여 검출된 융해곡선의 분석을 수행하였다.
2) 또한 실시예 1-1에서 제조한 타겟 특이적인 PNA 형광 프로브와 실시예 1-2에서 제조한 타겟 특이적인 프라이머 종류에 따른 11종의 HPV (31, 35, 39, 51, 53, 56, 59, 66, 68, 70, 82) 유전자형의 검출 민감도 및 특이성 확인을 위해, 상기 표 1의 서열번호 33 내지 65의 각각의 PNA 형광 프로브를 0.15μM와 표 3의 서열번호 66, 67 프라이머를 각각 0.15μM, 서열번호 90 내지 111 각각의 프라이머를 각각 1.2μM로 혼합하여 PCR 증폭용액(엔지노믹스, 한국)과 각각의 준비된 표적핵산을 첨가하였으며, 실시간 유전자 증폭기(Real-time PCR machine, CFX96TM Real-time PCR System, 바이오라드, 미국)를 이용하여 반응을 수행하였다. PCR 사이클은 50℃ 2분, 95℃ 15분 동안 반응 후, 95℃ 15초, 55℃ 45초, 72℃ 15초 반응 과정을 45 cycle 수행하였으며, PNA 프로브의 형광은 55℃에서 측정하였다. 이 후 95℃에서 5분 동안 유지 후, 35℃까지 낮춘 뒤에 5분 동안 PNA 프로브와 PCR 반응산물을 혼성화 시킨 후, 35℃부터 80℃까지 0.5℃씩 온도를 증가하면서 형광신호를 측정하여 검출된 융해곡선의 분석을 수행하였다.
2-3 선별된 PNA 프로브 혼합체와 프라이머의 특이성 및 반응분석
실시예 2-2의 1)에서 확인된 타겟 특이적인 프로브 11종의 HPV (6, 11, 16, 18, 26, 33, 45, 52, 58, 69, 73) 유전자형의 검출 민감도 및 특이성 확인을 위해, 상기 표 1의 서열번호 1 내지 32의 각각의 PNA 형광 프로브 중 서열번호 3, 6, 9, 12, 15, 20, 23, 26, 29, 32 프로브 혼합체와 표 3의 서열번호 66, 67 프라이머를 각각 0.15μM, 서열번호 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89 프라이머를 각각 1.2μM로 혼합하여 PCR 증폭용액(엔지노믹스, 한국)과 각각의 준비된 표적핵산을 첨가하였다(도 3).
또한 실시예 2-2의 2)에서 확인된 타겟 특이적인 프라이머 종류 및 11종의 HPV (31, 35, 39, 51, 53, 56, 59, 66, 68, 70, 82) 유전자형의 검출 민감도 및 특이성 확인을 위해, 상기 표 1의 서열번호 33 내지 65의 각각의 PNA 형광 프로브 중 서열번호 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 65 프로브 혼합체와 표 3의 서열번호 66, 67 프라이머를 각각 1.2μM, 서열번호 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111 프라이머를 각각 1.2μM로 혼합하여 PCR 증폭 용액(엔지노믹스, 한국)과 각각의 준비된 표적핵산을 첨가하였으며, 실시간 유전자 증폭기(Real-time PCR machine, CFX96TM Real-time PCR System, 바이오라드, 미국)를 이용하여 반응을 수행하였다. PCR 사이클은 50℃ 2분, 95℃ 15분 동안 반응 후, 95℃ 15초, 55℃ 45초, 72℃ 15초 반응 과정을 45 cycle 수행하였으며, PNA 프로브의 형광은 55℃에서 측정하였다. 이 후 95℃에서 5분 동안 유지 후, 35℃까지 낮춘 뒤에 5분 동안 PNA 프로브와 PCR 반응산물을 혼성화 시킨 후, 35℃부터 80℃까지 0.5℃씩 온도를 증가하면서 형광신호를 측정하여 검출된 융해곡선의 분석을 수행하였다.
그 결과, HPV 유전형에 특이적인 형광 PNA 프로브 혼합체 및 프라이머의 혼합체를 이용한 PCR 반응에서 HPV 유전자형의 검출 특이성이 높으며 우수한 민감도로 HPV 유전형의 구분이 가능함을 확인하였다.
2-4 HPV 유전형의 검출을 확인하기 위한 프라이머 및 형광시스템
위에서 제시한 프라이머 및 프로브 혼합체 시스템에서 검출할 수 없는 다른 HPV 유전자형들의 검출을 위해서 현재까지 잘 알려진 HPV 유전형 검출이 가능한 프라이머 시스템 Forward 프라이머 MY11, 12와 역방향 프라이머(Reverse Primer) GP6 및 PGMY09의 염기서열 위치를 이용하여 SYBR green 형광 검출 시스템을 이용한 검출 및 다양한 HPV 유전형들의 검출이 가능한 염기서열 부위에 형광 프로브를 표 4와 같이 디자인하여 다양한 HPV 유전형 검출의 가능 여부를 PCR 반응을 통하여 확인하였다.
[표 4]
HPV의 유전형 검출을 위한 프라이머 및 프로브 시스템
Figure PCTKR2015011478-appb-I000004
결과 서열번호 66, 67, 112 및 113 프라이머를 이용한 SYBR green 검출 시스템은 유전자형 22종(6, 11, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 69, 70, 73 및 82형) 외 HPV 유전형 18종(유형 30, 32, 34, 40, 42, 43, 44, 54, 55, 61, 62, 67, 74, 81, 83, 84, 87 및 90형) 모두 PCR 반응 후 Ct값을 통한 검출이 가능함을 확인하였다(도 4). 또한 프로브 검출 시스템 114 내지 121 형광 프로브 혼합체를 이용하여 HPV의 다양한 유전자형의 검출이 가능함을 확인하였다. SYBR green을 이용한 검출 시스템에서는 샘플의 양성, 음성 및 위양성의 경우 Tm값의 분석을 통해 특이성의 분석이 가능하였으며, 프로브 혼합체를 이용한 검출 시스템에서는 프라이머로 증폭된 HPV PCR 반응 산물과 특이적인 형광 PNA 프로브가 결합하여 양성, 음성 샘플을 특이성 있게 구분할 수 있었다.
2-5 HPV 유전형의 검출을 위한 프라이머 및 형광프로브 시스템
위에서 제시한 프라이머 및 프로브 혼합체 시스템에서 검출할 수 없는 18종 HPV 유전형(유형 30, 32, 34, 40, 42, 43, 44, 54, 55, 61, 62, 67, 74, 81, 83, 84, 87 및 90형) 검출이 가능한 프라이머 시스템 Forward 프라이머 MY11, 12와 18종 HPV 유전형을 각각 증폭시킬 수 있는 특이적 Reverse 프라이머를 이용한 검출 및 18종 HPV 유전형들의 검출이 가능한 염기서열 부위에 형광 프로브를 표 5 및 표 6과 같이 디자인하여 18종 HPV 유전형 검출의 가능 여부를 PCR 반응을 통하여 확인하였다.
[표 5]
Figure PCTKR2015011478-appb-I000005
[표 6]
Figure PCTKR2015011478-appb-I000006
결과 서열번호 66, 67 및 122 내지 147 프라이머와 프로브 검출 시스템 148 내지 185 형광 프로브 혼합체를 이용한 검출 시스템은 HPV 유전자형 18종 모두 PCR 반응 후 Ct값을 통한 검출이 가능함을 확인하였다(도 5). 형광 프로브 혼합체를 이용한 검출 시스템에서는 프라이머로 증폭된 HPV PCR 반응 산물과 특이적인 형광 PNA 프로브가 결합하여 양성, 음성 샘플을 특이성 있게 구분할 수 있었다.
본 발명은 인유두종바이러스(Human Papillomavirus, HPV) 유전자형 검출방법에 적용할 수 있다. 구체적으로, 본 발명은 HPV의 DNA와 유전자형 특이적으로 결합할 수 있는 검출 프로브, 이를 포함하는 검출 키트 및 이를 이용한 HPV 유전자형 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명은 자궁경부에서 발견되는 22종의 HPV의 유전형을 정확하게 검출할 수 있으며, 하나 이상의 HPV 유전자형의 복합감염도 진단할 수 있으며, 22종 외 다른 HPV의 유전자형의 유무에 대한 검출이 가능하며, HPV 유전자형을 높은 민감도와 특이도로 검출할 수 있다.

Claims (10)

  1. 서열번호 1 내지 65 및 114 내지 121 및 148 내지 185 중 어느 하나의 염기서열로 이루어지는 PNA(Peptide Nucleic Acid) 프로브를 포함하는 프로브 혼합체로서,
    상기 PNA 프로브가 리포터 및 소광자와 결합되고, 인유두종바이러스(Human Papillomavirus; HPV) DNA와 유전자형 특이적으로 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 프로브 혼합체.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 PNA 프로브가 6, 11, 16, 18, 26, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 39, 40, 42, 43, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 59, 61, 62, 66, 67, 68, 69, 70, 73, 74, 81, 82, 83, 84, 87 및 90형으로 구성된 군으로부터 선택되는 HPV 유전자형을 검출하는 프로브 혼합체.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 PNA 프로브는 구조적 변형을 위해 아미노산, 아미노산의 곁사슬 또는 음전하 분자가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 프로브 혼합체.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 아미노산, 아미노산의 곁사슬 또는 음전하 분자가 프로브의 N 말단 또는 C 말단 위치에 결합되는 것을 특징으로 하는 프로브 혼합체.
  5. 제 3 항에 있어서, 상기 아미노산, 아미노산의 곁사슬 또는 음전하 분자가 프로브 골격의 알파, 베타 또는 감마 위치에 결합되는 것을 특징으로 하는 프로브 혼합체.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 리포터(reporter)가 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC, 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오로(Alexa Fluor), FAM, JOE, ROX, HEX, 텍사스 레드(Texas Red), CY5, CY3, TET, TRITC, TAMRA, 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 염료로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 형광물질임을 특징으로 하는 프로브 혼합체.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 소광자(quencher)가 답실(Dabcyl), TAMRA, Eclipse, DDQ, QSY, 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 블랙홀 퀸처(Black Hole Quencher), Qxl, 아이오와 블랙(Iowa black) FQ, 아이오와 블랙 RQ 및 IRDye QC-1 로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상임을 특징으로 하는 프로브 혼합체.
  8. 표적핵산을 실시간으로 검출하기 위한 하나 이상의 검출 프로브(detection probe) 를 이용한 HPV 유전형 검출 방법으로서,
    상기 검출 프로브가 서열번호 1 내지 65 및 114 내지 121 및 148 내지 185 중 어느 하나의 염기서열로 이루어지고, 리포터 및 소광자가 결합되며, HPV 의 DNA 와 유전자형 특이적으로 결합할 수 있는 PNA 검출 프로브인 것을 특징으로 하는, HPV 유전형 검출 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, (a) 표적핵산이 포함되어 있는 검체 시료에 검출 프로브 및 프라이머를 혼합하여 혼성화시켜 실시간 증폭곡선을 얻는 단계; (b) 상기 증폭과정 이후 온도를 변화시키면서 증폭산물과 검출 프로브간의 융해곡선을 얻는 단계; 및 (c) 상기 얻어지는 실시간 증폭곡선 및 융해곡선을 별도로 분석하거나 순차적 또는 동시에 분석하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 HPV 유전형 검출 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 증폭은 실시간 PCR(polymerase chain reaction)을 통해 수행하는 것을 특징으로 하는 HPV 유전형 검출 방법.
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