WO2011142646A2 - 인유두종바이러스 검출 및 유전형 확인 방법 - Google Patents

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WO2011142646A2
WO2011142646A2 PCT/KR2011/003608 KR2011003608W WO2011142646A2 WO 2011142646 A2 WO2011142646 A2 WO 2011142646A2 KR 2011003608 W KR2011003608 W KR 2011003608W WO 2011142646 A2 WO2011142646 A2 WO 2011142646A2
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primer
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안웅식
배수미
김윤선
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주식회사 진진바이오
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/708—Specific hybridization probes for papilloma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the present invention amplifies a single strand of L1 gene of human papillomavirus without a separate labeling PCR process, and hybridizes a probe specific to each genotype capable of distinguishing the genotype of the L1 gene from the amplified L1 gene single strand, thereby detecting sensitivity. Relates to high human papillomavirus detection and genotyping methods.
  • the present invention also relates to a method for providing information for diagnosing HPV infection and infecting genotypes using the above method, and a screening method for treating cervical cancer.
  • Cervical cancer which occurs worldwide annually, is the second most common cancer among women worldwide, affecting about half a million people each year, and among women, the third leading cause of cancer deaths after breast and lung cancer.
  • Human papilloma virus infections are found in more than 99% of cervical cancers, including more than 100 of these, 30-40 of which cause mucosal tissue infections, most of which are papilloma types. Viral infections usually heal within six months to two years, but persistent infection with carcinogenic HPV can lead to cervical cancer. Cervical cancer is closely related to sexual contact, and HPV infection is known to be related to cervical tumor development. To date, about 100 human papillomavirus genotypes have been reported. Among them, about 30 human papillomaviruses can cause disease in humans, which are largely high risk (16, 18, 31, 33, 35, etc.) and low risk ( 6, 11, 42, 43, 44, etc.).
  • Pap smear a Pap smear
  • colposcopy can diagnose up to 70% of human papillomavirus infections, it requires a trained specialist and expensive equipment and has the disadvantage of not being able to classify genotypes of human papillomaviruses.
  • PCR-RFLP using a restriction enzyme after amplifying the L1 region of the human papillomavirus gene by PCR has a simple and easy result, but has a disadvantage in that the restriction enzyme cannot be analyzed if the restriction enzyme is not recognized.
  • PCR amplification may vary depending on the HPV genotype, which may be a problem in the accuracy of the test.
  • Commercially available hybrid capture kits (Digene, USA) can be identified without PCR amplification, but they can be classified into high-risk and low-risk groups and cannot distinguish between high-risk types 16 and 18 and other high-risk groups.
  • the recently developed human papillomavirus genotyping kit (Micromedlab, Korea) using the microchip technology is a two-dimensional method that reacts on a slide, and it is cumbersome to undergo three steps after the hybridization reaction.
  • the kit has a limitation in that the signal value required for detection is very low so that it can be detected in reality. Also, if more than one virus is infected, a low signal may not recognize a low concentration of the virus.
  • the inventors of the present invention (application number: 10-2006-0020684) has a disadvantage in that it takes too long time to go through a separate PCR labeling process.
  • the inventors have used L1 using a primer labeled with a first marker, which is common to two or more genotypes of the L1 gene of a sample, and a second primer labeled with a second marker recognized by an exonuclease.
  • PCR amplification of the gene and digestion of only the B-fluorescent-labeled strands with enzymes that recognize the B-fluorophore yielding highly-labeled strands with high sensitivity quickly with only one PCR without a separate labeling PCR process It was confirmed that it can be done.
  • the present invention is confirmed by not only detection of human papillomavirus, but also the identification of various genotypes of human papillomavirus with high sensitivity. Completed.
  • An object of the present invention is to provide a human papillomavirus detection and genotyping method contained in the sample to be analyzed.
  • Another object of the present invention is to provide an information providing method for diagnosing human papillomavirus infection and infecting genotype.
  • Another object of the present invention is to provide a method for amplifying a single strand of L1 gene of human papillomavirus.
  • the present invention provides a high-accuracy, simple and highly sensitive detection method capable of early diagnosis of human papillomaviruses present in trace amounts before the propagation of human papillomaviruses.
  • Figure 1 shows a schematic diagram of the PCR process and the template activation (Template activation) process.
  • Figure 2 is a chart confirming the detection of HPV using the present invention CaSki and HeLa cell line known to be infected HPV negative cell line C33A and HPV 16 type and HPV 18 type.
  • Figure 3 is an electrophoresis picture showing the PCR product performed at 50 °C.
  • Figure 4 is an electrophoresis picture showing the PCR product performed at 53 °C.
  • Figure 5 is an electrophoresis picture showing the PCR product performed by setting at 55 °C.
  • Figure 6 is an electrophoresis picture showing the PCR product performed at 57 °C.
  • Figure 7 is an electrophoresis picture showing the PCR product performed by varying the concentration of the primer.
  • 11 is a chart showing MFI values measured when the hybridization temperature is 40 ° C.
  • FIG. 13 is a chart showing MFI values measured when the hybridization time is 2 hours.
  • FIG. 15 is a chart showing MFI values measured when 10 ⁇ l of PCR product was used.
  • FIG. 16 is a chart showing MFI values measured when 20 ⁇ l of PCR product was used.
  • 17 is a chart showing MFI values measured when 50 ⁇ l of PCR product was used.
  • the present invention provides a method for labeling the first marker, which is commonly specific to two or more genotypes of human papillomavirus (HPV) L1 gene, from a sample to be analyzed.
  • HPV human papillomavirus
  • a human papillomavirus detection and genotyping method characterized in that it comprises a third step of identifying the genotype.
  • the present invention can quickly determine the presence or genotype of the L1 gene of human papillomavirus in a sample to be analyzed quickly through a single PCR without a labeling PCR process.
  • steps 1) and 2) by obtaining only a single strand of the L1 gene labeled with the first marker to increase the signal value required for detection, the accuracy and sensitivity of genotyping of human papillomaviruses having various genotypes Can increase.
  • Step 1) is amplification of the L1 gene of human papillomavirus by PCR using a set of forward and reverse primers specific for the L1 gene from the sample DNA, in which the L1 gene is amplified exponentially.
  • the primer set is labeled with a first marker and a second marker, respectively.
  • the term "first marker" is intended to label a gene with a first marker by PCR using a first primer labeled with a first marker as the first primer marker.
  • the first marker is not limited as long as it can be used for gene labeling without interfering with the hybridization of the probe with the gene product, and may use various materials known in the art. In a specific embodiment of the present invention, biotin is used, but is not limited thereto.
  • Primers labeled with the first marker in the forward or reverse direction are used for amplification into strands labeled with the first marker. If the hybridizing probe is an antisense strand, the first primer is labeled on the forward primer to amplify the sense strand. If the hybridizing probe is a sense strand, the first marker is labeled on the reverse primer to amplify the antisense strand. Let's do it.
  • the term "second marker" is intended to label a gene with a second marker by PCR using a second primer labeled with a second marker as a second primer marker.
  • the second marker may label genes other than the first marker, but may be various materials known in the art without being limited as long as they can be recognized by exonuclease. In a specific embodiment of the present invention used phosphate, but is not limited thereto.
  • Primers labeled with a second marker in the forward or reverse direction are used for amplification with the strand labeled with the second marker. If the hybridizing probe is an antisense strand, amplify the antisense strand by labeling the second marker on the reverse primer. If the hybridizing probe is a sense strand, the antisense strand is labeled with the first marker on the forward primer. Let's do it.
  • primer refers to a nucleic acid sequence having a short free 3 ′ hydroxyl group, which may form complementary templates and base pairs and is a starting point for copying a template. By short nucleic acid sequence is meant to function. Primers can initiate DNA synthesis in the presence of four different nucleoside triphosphates and reagents for polymerization (ie, DNA polymerase or reverse transcriptase) at appropriate buffers and temperatures. In the present invention, PCR amplification is performed using the sense and antisense primers of the marker polynucleotide of the present invention to diagnose the exposure of electromagnetic waves through the generation of a desired product.
  • the first primer provided by the present invention is a primer that is common to two or more genotypes of the HPV L1 gene.
  • the second primer is a primer labeled with a second marker recognized by an exonuclease, and may be common to two or more genotypes of the L1 gene, but is not limited thereto.
  • a first primer of SEQ ID NO: 1 labeled with biotin and a second primer of SEQ ID NO: 2 labeled with phosphate were used.
  • Primers of the invention can be chemically synthesized using phosphoramidite solid support methods, or other well known methods. Such nucleic acid sequences can also be modified using many means known in the art. Non-limiting examples of such modifications include methylation, capping, substitution with one or more homologs of natural nucleotides, and modifications between nucleotides, eg, uncharged linkages such as methyl phosphonate, phosphoester, phosphoro Amidate, carbamate, etc.) or charged linkers (eg, phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.).
  • the PCR of step 1) denaturation, binding, synthesis reaction time and temperature, the number of cycles and the like can be adjusted.
  • an optimal PCR condition was established.
  • the PCR was performed by setting the annealing temperature to 50, 53, 55, or 57 ° C., and then, the biotin-labeled single strand was obtained, reacted with the probe, and the signal value was measured.
  • the PCR products were more specific in all types compared to the results at other temperatures when performed under 53 °C annealing conditions, and HPV 11, 40, 51 when the reaction temperature was raised to 57 °C.
  • PCR products of 58, 70 and 70 were not identified. Therefore, it was found that the appropriate PCR annealing temperature is 53 °C (Figs. 3 to 6).
  • the annealing temperature is preferably set to 52 to 55 °C.
  • PCR amplification of step 1) is preferably performed using dCTP labeled with a first marker.
  • the concentration of the primer used in PCR amplification of the present invention is preferably 0.02 to 0.03 ⁇ M.
  • Step 2) is to leave only a single strand of L1 gene labeled with the first marker in the HPV amplified L1 gene in step 1), wherein the L1 gene labeled with the second marker in this step is determined by exonuclease. Decompose That is, since only the strands complementary to the probe are amplified by the template activation of the exponentially amplified gene product through the PCR reaction of step 1), the hybridization efficiency between the probe and the gene product Is increased, and there is an effect that the detection signal is increased.
  • the exonuclease is not limited as long as it recognizes the second marker and the second marker can decompose the labeled gene, and various enzymes known in the art may be used, and the second marker may be used in specific embodiments of the present invention.
  • Phosphate was used and exonuclease that recognizes the phosphate and degrades the phosphate-labeled genes used lambda exonuclease.
  • the time and temperature at which the template activation reaction occurs in step 2) can be controlled.
  • the present invention when the human papillomavirus gene in the sample of the present invention is processed into a single-stranded L1 gene labeled with the first marker, it is possible to save time about 4 hours than the conventional labeling PCR process separately. It was confirmed. In addition, only a single strand of the L1 gene labeled with the first marker can be obtained, increasing the signal for detection of human papillomavirus (FIG. 8). Accordingly, the present invention provides a method for detecting HPV genotypes that can detect human papillomavirus very quickly and has high accuracy and reliability and simple high sensitivity.
  • Step 3) is a step of performing a hybridization reaction of a single-stranded L1 gene product labeled with the first marker prepared by the method of steps 1) and 2 with a probe for detecting HPV.
  • probe refers to a nucleic acid fragment such as RNA or DNA, which is short to several bases to hundreds of bases, which is capable of specific binding with mRNA. You can check the presence. Probes may be made in the form of oligonucleotide probes, single stranded DNA probes, double stranded DNA probes, RNA probes, and the like. Probes of the present invention may be prepared in consideration of each type of HPV L1 gene sequence, and hybridization reactions with samples using the probe include all probes of any sequence as long as the HPV can be specifically detected.
  • the probe provided in the present invention preferably uses two or more probes specific to each genotype capable of distinguishing two or more genotypes of the L1 gene, and is preferably provided in the form of a bead array bound to the beads.
  • the kind of beads to be combined with the probe is not particularly limited and the preparation of the bead array is in accordance with general methods known in the art.
  • the two or more probes used in step 3) may be the same site or different sites in the L1 gene.
  • step 3 a single strand of L1 gene product labeled with the first marker is hybridized with two or more L1 genotype detection probes to be distinguished by L1 genotype, and then, the L1 gene product is specific to the first marker.
  • the human papillomavirus detection and genotyping may be performed by binding to and reacting the binder to which the fluorescent substance is attached and measuring the fluorescence value.
  • an optimal temperature for hybridizing a single-stranded L1 gene product and a probe labeled with the first marker was set.
  • the fluorescence value (MFI, mean fluorescence intensity) was measured by setting the hybridization temperature to 30, 37 or 40 ° C for HPV 11, 16, 18, 51, 58, 70, Caski or C33A.
  • MFI mean fluorescence intensity
  • the HPV MFI value detected at Caski was detected at HPV 18 in addition to HPV 16.
  • the overall background signal was reduced, but GAPDH of C33A and Caski, the standards, did not exceed the cut off value. 9 to 11).
  • the temperature at the time of hybridization with the probe of step 3) is preferably 35 to 38 ° C.
  • the PCR product for hybridization in step 3 is preferably 10 to 30 ⁇ l.
  • step 3 a single-stranded L1 gene product labeled with the first marker is hybridized with two or more L1 genotype detection probes to be distinguished by L1 genotype, and then specifically bound to the first marker. Fluorescence is confirmed by treating the binder to which the fluorescent substance is attached. Treatment of a specific binding agent with the first marker to which the fluorescent substance is attached binds specifically to the first marker, so that the L1 gene present in the sample can be measured by fluorescence.
  • the specific binding agent to the first marker to which the fluorescent substance is attached may be used in a variety of materials known in the art, and may be used without limitation as long as it has a specific binding force with the first marker and attaches the fluorescent material. .
  • streptavidin was used as a specific binding agent of biotin as a first marker and a first marker to which a fluorescent substance was attached, but is not limited thereto.
  • Fluorescent materials may include, but are not particularly limited to, fluorescein, isothiocyanate, rhodamine, phycoerythrin, phycocyanin, allophycocyanin, o-phthalaldehyde, fluorescamine, and the like. In a specific embodiment of the present invention, phycoerythrin was used.
  • the present invention when the human papillomavirus gene in the sample of the present invention is processed into a single-stranded L1 gene labeled with a first marker, the signal value is about 10 times stronger than the direct fluorescent labeling of a conventional double-stranded PCR product. It was confirmed experimentally that it can be obtained. Accordingly, the present invention provides a high-accuracy, simple and highly sensitive detection method capable of early diagnosis of human papillomaviruses present in trace amounts before the propagation of human papillomaviruses.
  • the present invention is compared with the known method. Virus detection sensitivity and accuracy was found to be significantly higher (Fig. 19).
  • the present invention provides a method for the detection of 1) a first primer labeled by a first marker, an exonuclease, which is common to two or more genotypes of the human papillomavirus (HPV) L1 gene.
  • the L1 gene using a second primer labeled with a second marker, a third primer labeled with a first marker specific for the GAPDH gene, and a fourth primer labeled with a second marker recognized by the exonuclease;
  • GAPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) is a gene located at human chromosome No. 12 and is an enzyme that is involved in glycolysis, an essential metabolic process in cells. Therefore, in the present invention, the GAPDH gene was used as an internal control.
  • GADPH primers are designed to specifically amplify the GADPH gene, which is always expressed as an endogenous gene in a sample.
  • a primer set having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 was used.
  • SEQ ID NO: 3 is the reverse primer labeled with the first marker and
  • SEQ ID NO: 4 is the forward primer labeled with the second marker.
  • a GAPDH gene detection probe for detecting a GADPH gene is simultaneously hybridized with the probe for detecting the L1 gene. This process can immediately determine whether the PCR reaction is successful in the beads array analyzer can significantly reduce the number of undetected cases due to PCR amplification failure.
  • the present invention provides a method for preparing a protein comprising 1) a first primer labeled with a first marker, and an exonuclease, which are commonly specific to two or more genotypes of the human papillomavirus (HPV) L1 gene.
  • the present invention relates to a method for providing information for the diagnosis of human papillomavirus infection and the infected genotype.
  • the diagnosis time is significantly reduced because the gene is detected by one PCR process, and only the first marker can obtain only a single strand of the labeled L1 gene and hybridize with the probe.
  • the presence of human papillomavirus infection and the infected genotype can be diagnosed.
  • the present invention provides a method of treating cancer, comprising the steps of: 1) administering a candidate therapeutic agent to a subject infected with HPV; And 2) separating the DNA from the subject, and detecting the genotype of the human papillomavirus by the method described above.
  • the therapeutic agent for cervical cancer can be screened by administering a candidate therapeutic agent and confirming that human papillomavirus is detected. Since the screening method can detect human papillomavirus with high sensitivity or confirm genotype, it is possible to screen an accurate cervical cancer therapeutic agent in a short time.
  • Such candidate therapeutics include any molecule such as proteins, oligopeptides, small organic molecules, polysaccharides, polynucleotides and a wide variety of compounds. Such candidates also include both natural and synthetic materials.
  • the individual used in the present invention means an entire mammal including a dog, cow, horse, rabbit, mouse, rat, chicken or human, but the mammal of the present invention is not limited to the above examples.
  • the present invention provides a method for the preparation of 1) a first marker labeled with a first marker, and an exonuclease, which are commonly specific to two or more genotypes of the human papillomavirus (HPV) L1 gene.
  • the second step of obtaining a single-stranded L1 gene product labeled relates to a method for amplifying a single-stranded L1 gene of human papillomavirus.
  • Human papillomavirus (HPV) gene was amplified by PCR using 5 ⁇ g of DNA extracted in Example 1 as a template, using biotin-labeled dCTP, and modified HPV primer set or GAPDH primer set.
  • the base sequence of each primer set used at this time is as follows, the forward primer (Forward primer) was labeled with phosphate at 5 'and the reverse primer was labeled with biotin at 5'.
  • HPV forward 5'phosphate-GCMCAGGGWCATAAYAATGG 3 '(SEQ ID NO: 1)
  • HPV reverse 5'biotin-CGTCCMARRGGAWACTGATC 3 '(SEQ ID NO: 2)
  • GAPDH forward 5'phosphate-GGGCAGCCCCTTCATACCCTCA 3 '(SEQ ID NO: 3)
  • GAPDH reverse 5'biotin-CCCAAGGGAGCCACACCATCCT 3 '(SEQ ID NO: 4)
  • PCR conditions are as follows.
  • the PCR product obtained in Example 2 was treated with lambda exonuclease, reacted at 37 ° C. for 30 minutes, heated at 80 ° C. for 15 minutes, and the PCR product labeled with phosphate at 5 ′ was obtained from the PCR product. By digestion, PCR products labeled with biotin at 5 'were selected from the obtained PCR products.
  • Probe or each HPV genotype designed to bind the GAPDH gene to the 5 'biotin-labeled PCR product selected in Example 3 , 51, 52, 53, 55, 56, 58, 59, 66, 68 and 70) was added to the probe-bound beads and Hybrisol ® and reacted for 5 minutes at 95 °C and 30 minutes at 37 °C.
  • the bead has a unique MFI value of each bead, as a MFI value of each bead can determine which genotype HPV can be detected by the probe bound to each bead, probes designed to recognize each HPV genotype
  • the combined beads were votexed before use, and Hybrisol ® was used after incubation at 60 ° C for 5 minutes.
  • the reaction product of Example 4 was added to Luminex 100, using two lasers, one detecting the MFI value of the beads, and one detecting the value of PE.
  • a sample in which the MFI value and the PE value of the beads were detected at the same time was selected to identify which HPV genotypes the sample exhibited.
  • GAPDH and HPV16 were simultaneously detected or that both GAPDH and HPV18 were simultaneously detected in the HPV-infected sample (FIG. 2).
  • Figure 2 is a chart confirming the detection of HPV using the present invention CaSki and HeLa cell line known to be infected HPV negative cell line C33A and HPV 16 type and HPV 18 type. As shown in Figure 2, using the method of the present invention, it can be seen that whether the HPV is infected by performing a single PCR, it is possible to determine the genotype of the infected HPV.
  • FIG. 3 is an electrophoretic picture showing the PCR product performed at 50 °C
  • Figure 4 is an electrophoretic picture showing the PCR product performed at 53 °C
  • Figure 5 is a PCR product performed at 55 °C
  • Figure 6 is an electrophoretic picture showing the PCR product performed by setting at 57 °C.
  • FIG. 7 is an electrophoresis picture showing the PCR product performed by varying the concentration of the primer. As shown in Figure 7, it was found that the appropriate primer concentration is 0.025 ⁇ M.
  • Example 1-4 except setting the hybridization temperature to 30, 37 or 40 ° C for HPV 11, 16, 18, 51, 58, 70, Caski or C33A to set the optimum temperature for hybridization Hybridization was performed under the same conditions as, and the MFI values measured as a result were compared (FIGS. 9 to 11).
  • FIG. 9 shows the MFI value measured when the hybridization temperature is 30 ° C
  • FIG. 10 shows the MFI value measured when the hybridization temperature is 37 ° C
  • FIG. 11 shows the MFI value measured when the hybridization temperature is 40 ° C. .
  • FIGS. 9 shows the MFI value measured when the hybridization temperature is 30 ° C
  • FIG. 10 shows the MFI value measured when the hybridization temperature is 37 ° C
  • FIG. 11 shows the MFI value measured when the hybridization temperature is 40 ° C. .
  • the number of COOH (carboxyl groups) per bead is known to be 1 ⁇ 10 6 , and when binding probes to beads, about 1 ⁇ 10 6 beads are attached at one time. Therefore, in theory, the number of possible reactions is 1 x 10 12 . It is known to insert about 10 times more probe than reactor to react with all carboxyl groups at once in all beads. It is recommended to use 0.04-0.1 nmole of probe per 1 X 10 6 beads. Doing. Therefore, in order to determine the degree of reaction according to the probe concentration in HPV 6, 11, 16, or 18, the probe was connected to the beads using 0.04, 0.1, and 0.2 nmole concentration probes, respectively. The values were compared (Table 2).
  • each probe of 0.1 nmole on 21 beads (GAPDH, HPV 6, 11, 16, 18). , 31, 33, 35, 39, 40, 42, 51, 52, 53, 55, 56, 58, 59, 66, 68 or 70) to determine the MFI value.
  • a suitable phosphor for the Luminex Analyzer eight different phosphors (R-PE, Alexa 532, Cy3, Cryptofluor Tangerine, Alexa 546, Bodipy-TMR-X, PBXL-1 or Cryptofluor Orange) were used. MFI values were compared (FIG. 18). 18 is a graph showing changes in relative MFI values according to fluorescent materials. As shown in Figure 18, it was confirmed that Straptoavidin PE shows the best value.
  • HPV type detection method disclosed in the Korean registered patent (1) the first PCR amplification of the L1 gene using a primer set specific to the L1 gene of human papillomavirus from the sample to be analyzed; (2) second PCR amplification of the first amplified L1 gene product into a single strand of L1 gene labeled biotin using a primer; (3) hybridization of the single-stranded L1 gene product labeled with the second amplified biotin with a human papillomavirus type detection probe.
  • the PCR process of labeling to amplify a single strand of L1 gene was additionally involved, which took about 3 hours longer.
  • 10 X PCR buffer was adjusted to 50ul using distilled water. PCR conditions were set to 95 °C 5 minutes, 94 °C 1 minutes, 53 °C 1 minutes, 72 °C 1 minutes 40 cycles, 72 °C 7 minutes. After the PCR, 2ul (10 units) of lambda exonuclease, 10ul of 5X buffer, and 3ul of DW were added to 40ul of the PCR solution, and reacted at 37 ° C for 30 minutes to form a single strand. After the reaction was completed, the reaction was carried out at 80 ° C. for 10 minutes to deactivate the enzyme.
  • Hybrizol 20ul of Hybrizol, 20ul of single strand PCR solution, 0.5ul of bead mixture solution (2,500ea / type, total 60,000ea) were mixed and hybridization reaction was performed at 37 ° C for 2 hours. After the hybridization reaction, the washing solution was washed using 1 and 2, and 0.2 ⁇ l of SAPE solution (1 mg / ml) was added thereto, followed by reaction for 10 minutes. After the reaction, the solution was washed once with Wash 2 and analyzed using Luminex equipment.
  • the sensitivity was 92.94%, the specificity was 99.65%, and the accuracy was 96.03%.
  • the sensitivity was measured to be 82.65%, specificity 99.31%, and accuracy 90.30% (FIG. 19).
  • the present invention can detect HPV and identify genotype at the same time with high sensitivity and accuracy within a short time.

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Abstract

본 발명은 별도의 labeling PCR 과정 없이 인유두종바이러스의 L1 유전자 단일 가닥을 증폭하고, 증폭된 L1 유전자 단일가닥과 인유두종바이러스 검출용 프로브와 교잡반응을 통해, 검출의 민감도가 높은 인유두종바이러스 검출 및 유전형 확인 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 인유두종바이러스가 증식되기 전에 미량 존재하는 인유듀종바이러스까지 조기 진단할 수 있는 정확도와 신뢰도가 높고 간단한 고감도의 검출할 수 있다.

Description

인유두종바이러스 검출 및 유전형 확인 방법
본 발명은 별도의 labeling PCR 과정 없이 인유두종바이러스의 L1 유전자 단일 가닥을 증폭하고, 증폭된 L1 유전자 단일가닥에 L1 유전자의 유전형을 구별할 수 있는 각 유전형에 특이적인 프로브를 교잡반응하여, 검출의 민감도가 높은 인유두종바이러스 검출 및 유전형 확인 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 방법을 이용하여 인유두종바이러스 감염 여부 및 감염된 유전형의 진단을 위한 정보제공방법 및 자궁경부암 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
전세계적으로 매 2분마다 한 명의 여성이 자궁경부암으로 사망한다. 세계적으로 매년 발생하고 있는 자궁경부암은 전세계 여성에게 2번째로 빈번히 발생하는 암이며, 해마다 약 50만 명에게 발병하며 특히 여성에게는 유방암과 폐암에 이어 세 번째로 주된 암 사망의 원인이다. 자궁경부암의 99% 이상에서 인유두종바이러스(Human papilloma virus, 인유두종바이러스) 감염이 발견되는데, 이러한 인유두종바이러스는 100종이 넘으며 그 중 30～40 종은 점막조직(mucosal tissue) 감염을 유발하며 대부분의 인유두종바이러스 감염은 보통 6개월에서 2년 내에 자연 치유되지만 발암성 인유두종바이러스에 지속적으로 감염되면 자궁경부암으로 발전할 수 있다. 자궁경부암은 성접촉과 밀접한 관계가 있으며, 인유두종바이러스의 감염이 자궁경부 종양 발생에 관계가 있다고 알려져 있다. 현재까지 약 100여종의 인유두종바이러스 유전자형이 보고되어 있는데 이 중에서 사람에게 질병을 유발시킬 수 있는 인유두종바이러스는 약 30여 종이며 이를 크게 고위험군(16, 18, 31, 33, 35 등)과 저위험군(6, 11, 42, 43, 44 등)으로 분류하고 있다.
현재 가장 흔히 시행되는 검진법은 자궁세포진 검사(PAP smear)로서 검사자의 숙련도에 의존하여 검사의 정확도가 떨어지는 단점이 있다. 질확대경을 시행하면 인유두종바이러스의 감염을 70%까지 진단할 수 있으나, 수련된 전문가와 고가의 장비가 필요하며 인유두종바이러스의 유전자형을 분류할 수 없는 단점이 있다. 인유두종바이러스 유전자의 L1 부위를 PCR로 증폭한 후에 제한효소를 사용하는 PCR-RFLP는 간단하고 쉽게 결과를 얻을 수 있는 장점이 있으나 사용하는 제한 효소가 변이부분을 인식하지 못하면 분석하지 못하는 단점이 있다. 또한 인유두종바이러스 유전자형에 따라서 PCR 증폭의 효율이 달라 검사의 정확도에 문제가 될 수 있다. 상품화되어 있는 하이브리드 캡쳐 키트(Digene, USA)는 PCR 증폭 과정 없이 확인 가능하나 고 위험군과 저 위험군으로 분류 가능할 뿐 자궁경부암과 상관관계가 높은 16, 18 형과 다른 고위험군을 구별할 수 없다는 단점이 있다. 최근에 개발된 마이크로칩 기술을 이용한 인유두종바이러스 유전자형 분석키트(바이오메드랩, 한국)는 슬라이드상에서 반응하는 2차원적인 방법으로 교잡반응 후에 3차에 걸쳐서 세척과정을 거쳐야 하는 번거로움이 있다. 또한, 이와 비슷한 방법으로 서스펜션 어레이를 이용한 방법의 인유두종바이러스 검출 키트가 개발되어 있으나, 이 키트의 경우, 검출에 필요한 시그널 값이 매우 낮아 현실적으로 검출을 하기에는 그 한계가 있었다. 또한 두 개 이상의 바이러스가 감염되었을 경우 낮은 시그널은 낮은 농도의 감염 바이러스를 인식하지 못할 수도 있다. 또한, 본원 발명자들의 특허 발명(출원번호:10-2006-0020684)은 별도의 PCR labeling 과정을 거치므로 PCR에 소요되는 시간이 너무 오래 걸린다는 단점이 있었다.
이에, 본 발명자들은 시료의 L1 유전자의 2종 이상 유전형에 공통적으로 특이적인, 제1표지자가 표지된 프라이머, 및 엑소뉴클레아제에 의해 인식되는 제2표지자가 표지된 제2프라이머를 사용하여 L1 유전자를 PCR 증폭하고, B 형광물질을 인식하는 효소를 넣어 B 형광물질이 표지된 가닥만 분해함으로써 별도의 labeling PCR 과정을 거치지 않고 1회의 PCR만으로 신속하게 형광물질이 표지된 가닥을 높은 민감도로 수득할 수 있음을 확인하였다. 또한, L1 유전자의 2종 이상 유전형을 구별할 수 있는 각 유전형에 특이적인 프로브를 사용하여, 인유두종바이러스의 검출 뿐만 아니라, 높은 민감도로 인유두종바이러스의 다양한 유전형을 구별할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 분석하고자 하는 시료에 포함된 인유두종바이러스 검출 및 유전형 확인 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 인유두종바이러스 감염 여부 및 감염된 유전형의 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 자궁경부암 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 인유두종바이러스의 L1 유전자 단일 가닥을 증폭하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따르면 별도의 labeling PCR 과정을 거치지 않고 1회의 PCR만으로 신속하게 형광물질이 표지된 가닥을 수득할 수 있어 인유두종바이러스 등 검출하고자 하는 병원균을 신속하게 검출할 수 있으며, 기존의 이중가닥의 PCR 산물에 직접 형광 표지를 하는 것보다 10배 정도 강한 시그날 값을 얻을 수 있다. 또한, 자궁경부암과 상관관계가 높은 16, 18 형과 다른 고위험군을 구별할 수 있다. 따라서, 본 발명은 인유두종바이러스가 증식되기 전에 미량 존재하는 인유듀종바이러스까지 조기 진단할 수 있는 정확도와 신뢰도가 높고 간단한 고감도의 검출 방법을 제공한다.
도 1은 PCR 과정과 템플레이트 활성화(Template activation) 과정을 모식도로 나타낸 것이다.
도 2는 HPV negative 세포주 C33A와 HPV 16 type과 HPV 18 type이 감염된 것으로 알려진 CaSki와 HeLa 세포주에서 본 발명을 이용하여 HPV 검출 여부를 확인한 도표이다.
도 3은 50℃로 설정하여 수행한 PCR 산물을 나타내는 전기영동사진이다.
도 4는 53℃로 설정하여 수행한 PCR 산물을 나타내는 전기영동사진이다.
도 5는 55℃로 설정하여 수행한 PCR 산물을 나타내는 전기영동사진이다.
도 6은 57℃로 설정하여 수행한 PCR 산물을 나타내는 전기영동사진이다.
도 7은 프라이머의 농도를 달리하여 수행한 PCR 산물을 나타내는 전기영동사진이다.
도 8은 람다 엑소뉴클라제 처리 전, 후 각각의 MFI값을 나타내는 도표이다.
도 9는 hybridization 온도가 30℃인 경우 측정된 MFI 값을 나타내는 도표이다.
도 10은 hybridization 온도가 37℃인 경우 측정된 MFI 값을 나타내는 도표이다.
도 11은 hybridization 온도가 40℃인 경우 측정된 MFI 값을 나타내는 도표이다.
도 12는 hybridization 시간이 1시간인 경우 측정된 MFI 값을 나타내는 도표이다.
도 13은 hybridization 시간이 2시간인 경우 측정된 MFI 값을 나타내는 도표이다.
도 14는 hybridization 시간이 3시간인 경우 측정된 MFI 값을 나타내는 도표이다.
도 15는 PCR 산물을 10㎕로 사용한 경우 측정된 MFI 값을 나타내는 도표이다.
도 16은 PCR 산물을 20㎕로 사용한 경우 측정된 MFI 값을 나타내는 도표이다.
도 17은 PCR 산물을 50㎕로 사용한 경우 측정된 MFI 값을 나타내는 도표이다.
도 18은 형광물질에 따른 상대적 MFI값의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 19는 본 발명을 이용하여 HPV 검출 및 유전형 확인의 민감도, 특이성 및 정확도를 나타낸 것이다. 또한, 이를 기존의 HPV 유전형 검출방법과 비교한 결과를 함께 나타낸 것이다.
상기 기술한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 일 양태로 본 발명은 1) 분석하고자 하는 시료로부터, 인유두종바이러스(HPV) L1 유전자의 2종 이상 유전형에 공통적으로 특이적인, 제1표지자가 표지된 제1프라이머, 및 엑소뉴클레아제에 의해 인식되는 제2표지자가 표지된 제2프라이머를 사용하여 L1 유전자를 PCR 증폭하는 제1단계; 2) 제1단계에서 증폭된 이중 가닥의 L1 유전자 산물에 상기 제2표지자를 인식하는 엑소뉴클레아제를 가하여 반응시켜서, 제2표지자가 표지된 단일 가닥의 L1 유전자 산물을 분해하여 제1표지자가 표지된 단일 가닥의 L1 유전자 산물을 수득하는 제2단계; 및 3) 제2단계에서 수득된, 제1표지자가 표지된 단일 가닥의 L1 유전자 산물을 L1 유전자의 2종 이상 유전형을 구별할 수 있는 각 유전형에 특이적인 프로브를 2종 이상 사용하여 L1 유전자의 유전형을 확인하는 제3단계를 포함하는 것이 특징인, 인유두종바이러스 검출 및 유전형 확인 방법을 제공한다.
본 발명은 Labeling PCR 과정 없이 1회의 PCR을 통하여 신속하게, 분석을 원하는 시료에서 인유두종바이러스의 L1 유전자의 존재 또는 유전형을 확인할 수 있다. 또한, 상기 1) 및 2) 단계의 과정을 통해, 제1표지자가 표지된 L1 유전자의 단일가닥만을 수득하여 검출에 필요한 시그널 값을 높임으로서, 다양한 유전형을 가진 인유두종바이러스의 유전형 검출의 정확도 및 민감도를 높일 수 있다.
단계 1)은 시료 DNA로부터 L1 유전자에 특이적인 정방향 및 역방향의 프라이머 세트를 사용하는 PCR 방법으로 인유두종바이러스의 L1 유전자를 증폭시키는 단계로, 이 단계에서 L1 유전자는 지수적으로(exponential) 증폭된다. 이때, 상기 프라이머 세트는 각각 제1표지자와 제2표지자로 표지한다.
본 발명에서 용어, "제1표지자"는 제1프라이머 표지 물질로써 제1표지자로 표지된 제1프라이머를 사용해 PCR하여 유전자를 제1표지자로 표지하기 위한 것이다. 제1표지자는 프로브와 유전자 산물과의 교잡을 방해하지 않고 유전자 표지를 위해 사용할 수 있는 것이라면 한정되지 않고 당업계에 공지된 다양한 물질을 사용할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 비오틴을 사용하였으나 이에 제한되지 않는다. 제1표지자로 표지된 가닥으로의 증폭을 위하여 정방향 또는 역방향의 제1표지자로 표지된 프라이머를 사용한다. 교잡반응을 하는 프로브가 안티센스 가닥일 경우 정방향의 프라이머에 제1표지자를 표지하여 센스 가닥을 증폭시키고, 교잡반응을 하는 프로브가 센스 가닥일 경우 역방향의 프라이머에 제1표지자를 표지하여 안티센스 가닥을 증폭시키도록 한다.
본 발명에서 용어, "제2표지자"는 제2프라이머 표지 물질로써 제2표지자로 표지된 제2프라이머를 사용해 PCR하여 유전자를 제2표지자로 표지하기 위한 것이다. 제2표지자는 제1표지자 외 유전자를 표지할 수 있되, 엑소뉴클라제에 의해 인식될 수 있는 물질이라면 한정되지 않고 당업계에 공지된 다양한 물질을 사용할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 포스페이트를 사용하였으나 이에 제한되지 않는다. 제2표지자로 표지된 가닥으로의 증폭을 위하여 정방향 또는 역방향의 제2표지자로 표지된 프라이머를 사용한다. 교잡반응을 하는 프로브가 안티센스 가닥일 경우 역방향의 프라이머에 제2표지자를 표지하여 안티센스 가닥을 증폭시키고, 교잡반응을 하는 프로브가 센스 가닥일 경우 정방향의 프라이머에 제1표지자를 표지하여 센스 가닥을 증폭시키도록 한다.
본 발명에서 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3` hydroxyl group)을 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형의 복사를 위한 시작지점으로는 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다. 본 발명에서는 상기 본 발명 마커 폴리뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 전자파 노출 여부를 진단할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다. 본 발명에서 제공하는 제1프라이머는 인유두종바이러스(HPV) L1 유전자의 2종 이상 유전형에 공통적으로 특이적인 프라이머이다. 제2프라이머는 엑소뉴클레아제에 의해 인식되는 제2표지자가 표지된 프라이머로서, L1 유전자의 2종 이상 유전형에 공통적으로 특이적일 수도 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 구체적인 실시예서는 비오틴으로 표지된 서열번호 1의 제1프라이머와 포스페이트로 표지된 서열번호 2의 제2프라이머를 사용하였다.
본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등) 로의 변형이 있다.
또한, 단계 1)의 PCR에서 변성, 결합, 합성 반응이 일어나는 시간과 온도, 사이클 횟수 등은 조절될 수 있다. 본 발명은 인유두종바이러스 L1 유전자의 검출의 민감도를 높이기 위하여, 최적의 PCR 조건을 확립하였다. 본 발명의 일 실시예에서는 어닐링(annealing) 온도를 50, 53, 55 또는 57℃로 설정하여 PCR을 수행한 후, 비오틴으로 표지된 단일가닥을 수득하여 이를 프로브와 반응시키고 시그널 값을 측정하였다. 그 결과, 53℃ 어닐링조건에서 수행했을 때 다른 온도에서 수행한 결과와 비교하여 모든 타입에서 좀 더 특이적인 PCR 산물을 관찰할 수 있었으며, 반응온도를 57℃로 올렸을 경우에는 HPV 11, 40, 51, 58 및 70의 PCR 산물이 확인되지 않았다. 따라서, 적정한 PCR 어닐링 온도는 53℃임을 알 수 있었다(도 3 내지 6).
상기 실시예를 바탕으로, 본 발명의 PCR 증폭 시, 어닐링 온도는 52 내지 55℃로 설정하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서는 프라이머의 농도를 각각 0.0125, 0.025, 0.05 또는 0.1μM으로 사용하여 PCR 한 후, 그 결과를 전기영동으로 확인하였다. 그 결과, 0.025μM일 때 가장 반응이 잘된 것으로 확인되었고 0.1일때는 PCR 반응이 잘되지 않았고 0.0125μM일때는 HPV 51 타입에서 밴드가 확인되지 않았다.
또한, 1)단계의 PCR 증폭은 제1표지자로 표지된 dCTP를 이용하여 수행되는 것이 바람직하다.
상기 실시예를 바탕으로, 본 발명의 PCR 증폭 시 사용되는 프라이머의 농도는 0.02 내지 0.03μM가 바람직하다.
단계 2)는, 단계 1)에서 증폭된 인유두종바이러스 L1 유전자 중 제1표지자로 표지된 단일 가닥의 L1 유전자만 남기는 단계로, 이 단계에서 제2표지자로 표지된 L1 유전자는 엑소뉴클라제에 의해 분해된다. 즉, 단계 1)의 PCR 반응을 통하여 지수적 증폭된 유전자 산물이 단계 2)의 템플레이트 활성화(Template activation) 과정을 통하여 프로브에 상보적인 가닥만이 증폭되어 존재하므로, 프로브와 유전자 산물과의 교잡 효율이 증가되며, 검출 신호가 증가되는 효과가 있다.
상기 엑소뉴클라제는 제2표지자를 인식하고 제2표지자가 표지된 유전자를 분해할 수 있으면 한정되지 않고 당업계에 공지된 다양한 효소를 사용할 수 있으며, 본 발명의 구체적인 실시예에서 제2표지자는 포스페이트를 사용하였으며 상기 포스페이트를 인식하고 포스페이트로 표지된 유전자를 분해하는 엑소뉴클라제는 람다 엑소뉴클라제를 사용하였다.
단계 2)의 템플레이트 활성화(Template activation) 반응이 일어나는 시간과 온도 등은 조절될 수 있다.
상기 발명은 본 발명의 시료 중 인유두종바이러스 유전자를 제1표지자로 표지된 단일가닥의 L1 유전자로 가공할 경우, 기존의 labeling PCR 과정을 별도로 거치는 것보다 약 4시간 정도 시간을 절약할 수 있음을 실험적으로 확인하였다. 또한, 제1표지자로 표지된 L1 유전자의 단일가닥만을 수득할 수 있어서, 인유두종바이러스의 검출을 위한 시그널이 증가된다(도 8). 따라서, 본 발명은 매우 신속하게 인유두종바이러스를 검출할 수 있으면서 정확도와 신뢰도가 높고 간단한 고감도의 검출 또는 HPV 유전형을 확인하는 방법을 제공한다.
단계 3)은 단계 1)과 2)의 방법으로 준비한 제1표지자로 표지된 단일 가닥의 L1 유전자 산물을 인유두종바이러스 검출용 프로브와 교잡(hybridization) 반응을 수행하는 단계이다.
본 발명에서 용어, "프로브" 란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 표지(Labelling)되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인 할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오티드 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명의 프로브는 타입별 인유두종바이러스 L1 유전자 서열을 고려하여 제조하면 되고 상기 프로브를 사용하여 시료와 교잡 반응시, 인유두종바이러스를 특이적으로 검출할 수 있으면 어떤 서열의 프로브라도 모두 포함된다.
본 발명에서 제공하는 프로브는 L1 유전자의 2종 이상 유전형을 구별할 수 있는 각 유전형에 특이적인 프로브를 2종 이상 사용하는 것이 바람직하며, 비드에 결합된 비드어레이 형태로 제공되는 것이 바람직하다. 프로브와 결합되는 비드의 종류는 특별히 제한되지 않으며 비드 어레이의 제조는 당 분야에 공지된 일반적인 방법에 따른다.
상기 단계 3)에서 사용하는 2종 이상 프로브들은 서로 L1 유전자 중 동일 부위 또는 상이한 부위인 것일 수 있다.
상기 제3)단계는 제1표지자가 표지된 단일 가닥의 L1 유전자 산물을 L1 유전자 유전형 검출형 프로브 2종 이상과 교잡(hybridization) 반응시켜 L1 유전자 유전형 별로 구별시킨 후, 상기 제1표지자와 특이적으로 결합하고 형광물질이 부착된 결합제를 반응시키고, 형광값을 측정하여 인유두종바이러스 검출 및 유전형 확인할 수 있다.
단계 3)에서 HPV L1 유전자의 검출 감도를 높이기 위한 방법으로, 본 발명의 일 실시예에서는 제1표지자로 표지된 단일 가닥의 L1 유전자 산물과 프로브를 교잡(hybridization)하기 위한 최적온도를 설정하였다. HPV 11, 16, 18, 51, 58, 70, Caski 또는 C33A를 대상으로 하여 교잡 온도를 30, 37 또는 40℃로 설정하여 형광값(MFI, mean fluorescence intensity)을 측정하였다. 30℃ 에서는 Caski에서 검출된 HPV MFI 값이 HPV 16번 이외에도 HPV 18에서도 검출되었고, 40℃에서는 전체적인 background signal이 감소되었지만 표준물질인 C33A와 Caski의 GAPDH 가 cut off 값을 넘기지 못해 검출되지 않았다(도 9 내지 11).
상기 실시예를 바탕으로 상기 3)단계의 프로브와 교잡 시 온도는 35 내지 38℃가 바람직하다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서는 교잡을 위한 최적 PCR 산물 용량을 설정하기 위해, HPV 11, 16, 18, 51, 58, 70, Caski 또는 C33A를 대상으로 하여 PCR 산물을 10, 20 또는 50㎕로 설정하여 프로브와 교잡시켰다. 그 결과, 50㎕를 사용한 결과는 HPV의 MFI값이 다소 낮아지는 경향을 보였다(도 15 내지 17).
상기 실시예를 바탕으로 상기 3) 단계에서 교잡을 위한 PCR 산물은 10 내지 30㎕인 것이 바람직하다.
단계 3)에서는 제1표지자가 표지된 단일 가닥의 L1 유전자 산물을 L1 유전자 유전형 검출형 프로브 2종 이상과 교잡(hybridization) 반응시켜 L1 유전자 유전형 별로 구별시킨 후, 제1표지자와 특이적으로 결합하고 형광물질이 부착된 결합제를 처리하여 형광으로 확인하는 단계이다. 형광물질이 부착된 제1표지자와의 특이적 결합제를 처리하면 이것이 제1표지자와 특이적으로 결합하므로 시료 중 존재하는 L1 유전자를 형광으로 측정가능하다.
형광물질이 부착된 제1표지자와의 특이적 결합제는 당업계에 공지된 다양한 물질이 사용될 수 있으며 제1표지자와 특이적 결합력을 가지며 형광물질의 부착이 가능하면 어떤 물질이라도 한정되지 않고 사용할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 각각 제1표지자로 비오틴을 형광물질이 부착된 제1표지자와의 특이적 결합제로 스트렙타비딘을 사용하였으며 이에 제한되지 않는다.
형광물질은 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등을 예시할 수 있으나 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 피코에리트린을 사용하였다.
상기 발명은 본 발명의 시료 중 인유두종바이러스 유전자를 제1표지자로 표지된 단일가닥의 L1 유전자로 가공할 경우, 기존의 이중가닥의 PCR 산물에 직접 형광 표지를 하는 것보다 10배 정도 강한 시그날 값을 얻을 수 있음을 실험적으로 확인하였다. 따라서, 본 발명은 인유두종바이러스가 증식되기 전에 미량 존재하는 인유듀종바이러스까지 조기 진단할 수 있는 정확도와 신뢰도가 높고 간단한 고감도의 검출 방법을 제공한다.
또한, 본 발명을 본 발명자에 의해 고안된 대한민국 등록특허(10-0702415)에 개시된 인유두종바이러스 타입을 검출하는 방법과 L1 유전자의 검출 민감도, 특이성 및 정확도를 비교해 본 결과, 본 발명이 공지된 방법에 비해 바이러스 검출 민감도와 정확도가 현저히 높음을 확인할 수 있었다(도 19).
다른 양태로 본 발명은 1) 분석하고자 하는 시료로부터, 인유두종바이러스(HPV) L1 유전자의 2종 이상 유전형에 공통적으로 특이적인, 제1표지자가 표지된 제1프라이머, 엑소뉴클레아제에 의해 인식되는 제2표지자가 표지된 제2프라이머, GAPDH 유전자에 특이적인, 제1표지자가 표지된 제3프라이머, 및 엑소뉴클레아제에 의해 인식되는 제2표지자가 표지된 제4프라이머를 사용하여 L1 유전자 및 GAPDH 유전자를 PCR 증폭하는 제1단계; 2) 제1단계에서 증폭된 이중 가닥의 유전자 산물에 상기 제2표지자를 인식하는 엑소뉴클레아제를 가하여 반응시켜서, 제2표지자가 표지된 단일 가닥의 유전자 산물을 분해하여 제1표지자가 표지된 단일 가닥의 유전자 산물을 수득하는 단계; 및 3) 제2단계에서 수득된, 제1표지자가 표지된 단일 가닥의 L1 유전자 산물을 L1 유전자의 2종 이상 유전형을 구별할 수 있는 각 유전형에 특이적인 프로브를 2종 이상 사용하고, GAPDH 유전자에 특이적인 프로브를 사용하여 L1 유전자의 유전형을 확인하는 제3단계를 포함하는 것이 특징인, 인유두종바이러스 검출 및 유전형 확인 방법을 제공한다.
이미 기술한 내용과 반복되는 사항은 반복을 피하기 위하여 생략한다.
GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)는 human chromosome 12번에 위치하는 유전자로서 세포에서 필수적인 대사과정인 glycolysis에 관여하는 효소이며, 세포내에서 항상 발현되면서 그 발현량이 잘 변하지 않는 유전자이다. 따라서 본 발명에서는 GAPDH유전자를 내부 대조군(internal control)로 사용하였으다.
GADPH 프라이머는 시료 내의 내재 유전자로서 항상 발현되는 GADPH 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있도록 고안된 것이다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열을 가지는 프라이머 세트를 사용하였다. 서열번호 3은 제1표지자가 표지된 역방향 프라이머이고 서열번호 4는 제2표지자가 표지된 정방향 프라이머이다.
GADPH 유전자를 검출하기 위한 GAPDH 유전자 검출용 프로브는 상기 L1 유전자 검출용 프로브와 동시에 교잡시킨다. 이 과정을 통해 PCR 반응이 성공적으로 일어나는지 여부를 비즈 어레이 분석기 내에서 곧바로 확인할 수 있으므로 PCR 증폭 실패에 따른 불검출 경우의 수를 대폭 낮출 수 있다.
또 다른 양태로서 본 발명은 1) 분석하고자 하는 시료로부터, 인유두종바이러스(HPV) L1 유전자의 2종 이상 유전형에 공통적으로 특이적인, 제1표지자가 표지된 제1프라이머, 및 엑소뉴클레아제에 의해 인식되는 제2표지자가 표지된 제2프라이머를 사용하여 L1 유전자를 PCR 증폭하는 제1단계; 2) 제1단계에서 증폭된 이중 가닥의 L1 유전자 산물에 상기 제2표지자를 인식하는 엑소뉴클레아제를 가하여 반응시켜서, 제2표지자가 표지된 단일 가닥의 L1 유전자 산물을 분해하여 제1표지자가 표지된 단일 가닥의 L1 유전자 산물을 수득하는 제2단계; 및 3) 제2단계에서 수득된, 제1표지자가 표지된 단일 가닥의 L1 유전자 산물을 L1 유전자의 2종 이상 유전형을 구별할 수 있는 각 유전형에 특이적인 프로브를 2종 이상 사용하여 L1 유전자의 유전형을 확인하는 제3단계를 포함하는 것이 특징인, 인유두종바이러스 감염 여부 및 감염된 유전형의 진단을 위한 정보제공방법에 관한 것이다.
이미 기술한 내용과 반복되는 사항은 반복을 피하기 위하여 생략한다.
상기 방법으로 인유두종바이러스를 진단하게 되면, 한번의 PCR 과정으로 유전자를 검출하기 때문에 진단 시간이 현저히 감소되고, 제1표지자만이 표지된 L1 유전자의 단일가닥만을 수득하여 프로브와 교잡할 수 있으므로 고감도로 인유두종바이러스 감염 여부 및 감염된 유전형을 진단할 수 있다.
또 다른 양태로서 본 발명은 1) 인유두종바이러스가 감염된 개체에 후보 치료 물질을 투여하는 단계; 및 2) 상기 개체로부터 DNA을 분리하여 상기 설명한 방법으로 인유두종바이러스의 검출 및 유전형을 확인하는 단계를 포함하는, 자궁경부암 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
후보 치료 물질을 투여하고, 인유두종바이러스가 검출 여부를 확인함으로써 자궁 경부암의 치료제를 스크리닝할 수 있다. 상기 스크리닝 방법은 고감도로 인유두종바이러스를 검출하거나 유전자형의 확인이 가능하므로, 빠른 시간 내에 정확한 자궁 경부암 치료제를 스크리닝 할 수 있다.
상기 후보 치료물질은 단백질, 올리고펩티드, 소형 유기 분자, 다당류, 폴리뉴클레오타이드 및 광범위한 화합물 등의 임의 분자를 포함한다. 이러한 후보 물질은 또한 천연 물질 뿐 아니라 합성 물질을 모두 포함한다.
본 발명에서 사용되는 개체는 개, 소, 말, 토끼, 마우스, 래트, 닭 또는 인간을 포함한 포유류 전체를 의미하나, 상기 예에 의해 본 발명의 포유류가 한정되는 것은 아니다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 1) 분석하고자 하는 시료로부터, 인유두종바이러스(HPV) L1 유전자의 2종 이상 유전형에 공통적으로 특이적인, 제1표지자가 표지된 제1프라이머, 및 엑소뉴클레아제에 의해 인식되는 제2표지자가 표지된 제2프라이머를 사용하여 L1 유전자를 PCR 증폭하는 제1단계; 및 2) 제1단계에서 증폭된 이중 가닥의 L1 유전자 산물에 상기 제2표지자를 인식하는 엑소뉴클레아제를 가하여 반응시켜서, 제2표지자가 표지된 단일 가닥의 L1 유전자 산물을 분해하여 제1표지자가 표지된 단일 가닥의 L1 유전자 산물을 수득하는 제2단계;를 포함하는, 인유두종바이러스의 L1 유전자 단일 가닥을 증폭하는 방법에 관한 것이다.
상기 유전자의 단일 가닥 증폭방법은 별도의 labeling PCR 과정 없이 제1표지자가 표지된 유전자의 단일가닥을 수득할 수 있으므로, PCR에 소요되는 시간이 단축된다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1: 한번의 PCR을 수행하여 HPV의 감염여부 및 유전형을 확인하는 방법
실시예 1-1: 시료에서 DNA 추출
시료의 DNA를 분리하기 위해, 브러쉬로 질 내벽을 긁어서 세포시료를 수득하고, 상기 세포시료에 lysis solution 400 ㎕ 및 Proteinase K(20mg/㎖) 10 ㎕를 가하여, 58℃에서 2시간 동안 반응시킨 다음, 95℃로 15분간 가열하여 세포용해물을 수득하였다. 상기 세포용해물에 포함된 DNA를 공지된 방법으로 추출하였다.
실시예 1-2: DNA에서 인유두종바이러스(HPV) 유전자의 증폭
상기 실시예 1에서 추출한 DNA 5 ㎍을 주형(Template)으로 하고, 비오틴으로 표지된 dCTP를 사용하며, modified HPV 프라이머 세트 또는 GAPDH 프라이머 세트를 이용한 PCR을 수행하여 인유두종바이러스(HPV) 유전자를 증폭시켰다. 이때 사용한 각 프라이머 세트의 염기서열은 하기와 같고, 정방향 프라이머(Forward primer)는 5'에 포스페이트로 표지하고 역방향 프라이머는 5'에 비오틴으로 표지하였다.
Modified HPV 프라이머 세트:
HPV forward: 5’phosphate-GCMCAGGGWCATAAYAATGG 3’(서열번호 1)
HPV reverse: 5’biotin-CGTCCMARRGGAWACTGATC 3’(서열번호 2)
Modified GAPDH 프라이머 세트:
GAPDH forward: 5’phosphate-GGGCAGCCCCTTCATACCCTCA 3’(서열번호 3)
GAPDH reverse: 5’biotin-CCCAAGGGAGCCACACCATCCT 3’(서열번호 4)
아울러, PCR 조건은 하기와 같다.
표 1 PCR 조건
Cycles Time Temp
Denaturation/Activation 1 5min 95℃
DenaturationAnnealingElongation 40 1min1min1min 94℃55℃72℃
Final Extension 1 7min 72℃
Cooling 1 ∞ 4℃
실시예 1-3: PCR 산물의 선별
상기 실시예 2에서 수득한 PCR 산물에 람다 엑소뉴클라제를 처리하여 37℃에서 30분간 반응시키고, 80℃로 15분간 가열하여, 상기 수득한 PCR 산물 중에서 5'에 포스페이트로 표지한 PCR 산물을 분해함으로써, 상기 수득한 PCR 산물에서 5'에 비오틴으로 표지한 PCR 산물을 선별하였다.
실시예 1-4: 비오틴으로 표지한 PCR 산물과 비드가 결합된 프로브의 반응
상기 실시예 3에서 선별한 5'에 비오틴으로 표지한 PCR 산물에 GAPDH 유전자와 결합하도록 고안된 프로브 또는 각각의 HPV 유전형(HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 51, 52, 53, 55, 56, 58, 59, 66, 68 및 70)을 인식하도록 고안된 프로브가 결합된 비드와 Hybrisol®을 가하고, 95℃에서 5분 및 37℃에서 30분간 반응시켰다. 이때, 상기 비드는 각각의 고유한 MFI값을 가지고 있어, 각 비드의 MFI값으로서 각 비드에 결합된 프로브가 어떠한 유전형의 HPV를 검출할 수 있는지 확인할 수 있고, 각각의 HPV 유전형을 인식하도록 고안된 프로브가 결합된 비드는 사용전에 votexing하며, Hybrisol®은 60℃에서 5분간 인큐베이션 한 후 사용하였다.
이어 상기 각 반응물을 96-웰 플레이트의 각 웰에 넣고, 여과하여 액상성분을 제거한 다음, 3회 세척하였다. 그런 다음, 상기 각 웰에 피코에리트린(PE)으로 표지된 스트렙타비딘을 가하고, 10분간 250rpm으로 혼합하였다.
실시예 1-5: 시그널 검출
상기 실시예 4의 반응산물을 Luminex 100에 가하고, 2개의 레이져를 이용하여 한 개는 비드의 MFI값을 검출하고, 한 개는 PE의 값을 검출하였다. 상기 Luminex 100으로 검출한 각 반응산물 중에서 비드의 MFI값과 PE 값이 동시에 검출된 시료를 선발하여 상기 시료가 어떠한 HPV 유전형을 나타내는지 확인하였다. 그 결과, HPV가 감염되지 않은 시료에서는 GAPDH만이 검출되었고, HPV가 감염된 시료에서는 GAPDH와 HPV16이 동시에 검출되거나 또는 GAPDH와 HPV18이 동시에 검출됨을 확인하였다(도 2). 도 2는 HPV negative 세포주 C33A와 HPV 16 type과 HPV 18 type이 감염된 것으로 알려진 CaSki와 HeLa 세포주에서 본 발명을 이용하여 HPV 검출 여부를 확인한 도표이다. 도 2에서 보듯이, 본 발명의 방법을 이용하면, 한번의 PCR을 수행하여 HPV가 감염되었는지의 여부와, 감염된 HPV의 유전형을 확인할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 2: 최적조건의 확립
실시예 2-1: PCR 어닐링 온도의 최적화
HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 51, 52, 53, 55, 56, 58, 59, 66, 68 및 70의 유전자를 주형으로 사용하고, 어닐링 온도를 50, 53, 55 또는 57℃로 설정하는 것을 제외하고는 실시예 1-2와 동일한 조건으로 PCR을 수행하고, 그 결과를 전기영동으로 확인하였다(도 3 내지 도 6). 도 3은 50℃로 설정하여 수행한 PCR 산물을 나타내는 전기영동사진이고, 도 4는 53℃로 설정하여 수행한 PCR 산물을 나타내는 전기영동사진이며, 도 5는 55℃로 설정하여 수행한 PCR 산물을 나타내는 전기영동사진이고, 도 6은 57℃로 설정하여 수행한 PCR 산물을 나타내는 전기영동사진이다. 도 3 내지 도 6에서 보듯이, PCR을 53℃ 어닐링조건에서 수행했을 때 다른 온도에서 수행한 결과와 비교하여 모든 타입에서 좀 더 특이적인 PCR 산물을 관찰할 수 있었으며, 반응온도를 57℃로 올렸을 경우에는 HPV 11, 40, 51, 58 및 70의 PCR 산물이 확인되지 않았다. 따라서, 적정한 PCR 어닐링 온도는 53℃임을 알 수 있었다.
실시예 2-2: PCR 프라이머 농도의 최적화
HPV 11, 16, 18, 51, 58, 70, Caski 및 C33A의 유전자를 주형으로 사용하고, 프라이머의 농도를 각각 0.0125, 0.025, 0.05 또는 0.1μM으로 사용하는 것을 제외하고는, 실시예 1-2와 동일한 조건으로 PCR을 수행하고, 그 결과를 전기영동으로 확인하였다(도 7). 도 7은 프라이머의 농도를 달리하여 수행한 PCR 산물을 나타내는 전기영동사진이다. 도 7에서 보듯이, 적정한 프라이머 농도는 0.025μM임을 알 수 있었다.
실시예 2-3: 엑소뉴클레아제 처리 전후에 따른 MFI 값 비교
람다 엑소뉴클라제를 처리하여 포스페이트가 표지된 L1 유전자의 단일가닥을 분해하는 과정이 인유두종바이러스 검출 및 유전형 확인에 미치는 영향을 알아보고자, 음성 샘플(Negative sample)로 C33A, HPV 양성 샘플(positive sample)로 Caski를 표준물질로 사용하여 실험하였다. 람다 엑소뉴클라제는를 PCR 산물 40㎕에 넣어 주어 반응시켰고, 반응물을 인유두종바이러스 L1 유전자의 유전형에 특이적인 프로브와 교잡반응시켜 MFI값을 측정하였다. 람다 엑소뉴클라제 처리 전 후를 비교 하였을 때, 처리 하지 않을 경우 Caski 에서 검출되지 않았고, 처리한 경우에는 Caski에서 검출된 HPV의 MFI값이 높게 나오는 것을 확인하였다(도 8).
실시예 2-4: hybridization 온도조건의 최적화
hybridization을 위한 최적온도를 설정하기 위해 HPV 11, 16, 18, 51, 58, 70, Caski 또는 C33A를 대상으로 하여 hybridization 온도를 30, 37 또는 40℃로 설정하는 것을 제외하고는 실시예 1-4와 동일한 조건으로 hybridization을 수행하고, 그 결과로서 측정된 MFI 값을 비교하였다(도 9 내지 도 11). 도 9는 hybridization 온도가 30℃인 경우 측정된 MFI 값을 나타내고, 도 10은 hybridization 온도가 37℃인 경우 측정된 MFI 값을 나타내며, 도 11은 hybridization 온도가 40℃인 경우 측정된 MFI 값을 나타낸다. 도 9 내지 도 11에서 보듯이, 모든 결과에서 검출된 HPV 의 MFI 값은 비슷하였지만, 30℃ 에서는 Caski에서 검출된 HPV MFI 값이 HPV 16번 이외에도 HPV 18에서도 검출되었고, 40℃에서는 전체적인 background signal이 감소되었지만 표준물질인 C33A와 Caski의 GAPDH 가 cut off 값을 넘기지 못해 검출되지 않았으므로, 37℃가 적합한 것으로 결정하였다.
실시예 2-5: hybridization 시간조건의 최적화
hybridization을 위한 최적시간을 설정하기 위해 HPV 11, 16, 18, 51, 58, 70, Caski 또는 C33A를 대상으로 하여 hybridization 시간을 37℃에서 1, 2 또는 3시간으로 설정하는 것을 제외하고는 실시예 1-4와 동일한 조건으로 hybridization을 수행하고, 그 결과로서 측정된 MFI 값을 비교하였다(도 12 내지 도 14). 도 12는 hybridization 시간이 1시간인 경우 측정된 MFI 값을 나타내고, 도 13는 hybridization 시간이 2시간인 경우 측정된 MFI 값을 나타내며, 도 14은 hybridization 시간이 3시간인 경우 측정된 MFI 값을 나타낸다. 도 12 내지 도 14에서 보듯이, 모든 결과에서 검출된 HPV 의 MFI 값은 비슷하여 2시간으로 결정하였다.
실시예 2-6: hybridization PCR 산물 용량의 최적화
hybridization을 위한 최적 PCR 산물 용량을 설정하기 위해, HPV 11, 16, 18, 51, 58, 70, Caski 또는 C33A를 대상으로 하여 PCR 산물을 10, 20 또는 50㎕로 설정하는 것을 제외하고는 실시예 1-4와 동일한 조건으로 hybridization을 수행하고, 그 결과로서 측정된 MFI 값을 비교하였다(도 15 내지 도 17). 도 15는 PCR 산물을 10㎕로 사용한 경우 측정된 MFI 값을 나타내고, 도 16은 PCR 산물을 20㎕로 사용한 경우 측정된 MFI 값을 나타내며, 도 17은 PCR 산물을 50㎕로 사용한 경우 측정된 MFI 값을 나타낸다. 도 15 내지 도 17에서 보듯이, PCR 산물을 10㎕와 20㎕를 사용하였을 때는 HPV의 MFI값이 비슷하였지만, 50㎕를 사용한 결과는 HPV의 MFI값이 다소 낮아지는 경향을 보여 20㎕를 사용하는 것이 적합하다고 판단하여 20㎕의 PCR 산물을 이용하여 교잡반응 하는 것으로 결정하였다.
실시예 2-7: hybridization 프로브 농도의 최적화
비드에 결합하는 하는 프로브의 농도를 결정하기 위해 다음의 가설을 이용하여 실험을 수행하였다. 이론상 비드 한 개당 COOH(카르복실기)의 수는 1 X 106개라고 알려져 있으며, 비드에 프로브를 결합시킬 경우에는 약 1 X 106개의 비드를 한 번에 붙인다. 따라서 이론상 반응이 가능한 COOH 의 수는 1 x 1012 개다. 한 번에 모든 비드에 모든 카르복실기에 해당하는 반응기와 반응하기 위해서 반응기의 약 10배 정도 과량의 프로브를 넣어주면 된다고 알려져 있으며, 1 X 106개의 비드당 0.04 - 0.1nmole의 프로브를 사용하는 것을 권장하고 있다. 이에, HPV 6, 11, 16 또는 18을 대상으로 하여 프로브 농도에 따른 반응 정도를 알아보기 위해 4종의 비드에 0.04, 0.1, 0.2nmole 농도의 프로브를 사용하여 비드에 각각 연결 한 후 Luminex 로 MFI 값을 비교하였다(표 2).
표 2 프로브의 농도에 따른 MFI 값의 변화
nmole HPV 6 HPV 11 HPV 16 HPV 18
0.04 4030.5 4317.5 3970 5020
0.1 4355 4365 4061 5106
0.2 4345 4585 4160 5088
buffer 32 38.5 46 41
상기 표 2에서 보듯이, 프로브 농도에 따른 MFI 값의 변화가 없었으므로, 낮은 농도인 0.04nm에서도 높은 MFI 값이 나온 것은 충분한 양의 프로브가 들어간 것으로 예측되었고, 프로브 농도가 높아져도 MFI값이 일정하게 나오는 것으로부터 과량의 프로브가 hybridization을 방해하지는 않음을 확인할 수 있었다.
이에, 1 X 106개의 비드에 프로브를 결합할 경우, 0.1 nmole의 프로브를 사용하기로 하고, 이를 확인하기 위하여 21종의 비드에 0.1nmole의 각 프로브(GAPDH, HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 51, 52, 53, 55, 56, 58, 59, 66, 68 또는 70)를 결합시켜서 MFI값을 측정하였다.
표 3 0.1 nmole의 프로브가 결합된 비드의 MFI 값
Bead MFI Bead MFI Bead MFI
GAPDH 4145 HPV 35 4867 HPV 55 4676
HPV 6 4466 HPV 39 4602 HPV 56 5292
HPV 11 4974 HPV 40 4861 HPV 58 5301
HPV 16 5313 HPV 42 5196 HPV 59 4627
HPV 18 5323 HPV 51 4757 HPV 66 4574
HPV 31 4154 HPV 52 5117 HPV 68 4591
HPV 33 5017 HPV 53 5104 HPV 70 4397
표 3에서 보듯이, 모든 비드에서 MFI 값이 3,000이상으로 나타남을 확인할 수 있었으므로, 1 X 106개의 비드에 프로브를 결합하기 위하여는 0.1nmole의 프로브를 사용함이 바람직함을 알 수 있었다.
실시예 2-8: 형광물질의 최적화
Luminex Analyzer에 적당한 형광물질을 선택하기 위해, 8종의 서로다른 형광물질(R-PE, Alexa 532, Cy3, Cryptofluor Tangerine, Alexa 546, Bodipy-TMR-X, PBXL-1 또는 Cryptofluor Orange)을 사용하여 MFI값을 비교하였다(도 18). 도 18은 형광물질에 따른 상대적 MFI값의 변화를 나타내는 그래프이다. 도 18에서 보듯이, Straptoavidin PE가 가장 우수한 값을 나타냄을 확인할 수 있었다.
실시예 3: 인유두종바이러스의 검출 민감도 측정
상기 실시예 1 및 2에서 설명한 방법으로, 시료로부터 DNA를 분리하여 HPV 검출 및 HPV 유전형을 확인하였다. 본 발명의 HPV 검출방법의 민감도, 특이성 및 정확도를 측정하였으며, 이를 한국등록특허(10-0708415)에서 개시된 HPV 타입의 검출방법과 비교하였다.
한국등록특허에서 개시된 HPV 타입의 검출방법은 (1) 분석하고자 하는 시료로부터 인유두종바이러스의 L1 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 사용하여 L1 유전자를 1차 PCR 증폭하는 단계; (2) 상기 1차 증폭된 L1 유전자 산물을 프라이머를 사용하여 비오틴으로 라벨된 단일 가닥의 L1 유전자로 2차 PCR 증폭하는 단계; (3) 상기 2차 증폭된 비오틴으로 라벨된 단일 가닥의 L1 유전자 산물을 인유두종바이러스 타입 검출용 프로브와 교잡 반응하는 단계를 포함하여 수행하였다. 즉, 단일 가닥의 L1 유전자를 증폭하기 위해 labeling 하는 PCR 과정이 추가로 포함됨으로써 시간을 3시간 가량 더 소요되었다.
임상 시료는 가톨릭대학교 IRB 승인을 받아 수집하였다. 정상과 환자의 자궁경부탈락세포를 cervical brush로 수집한 후 원심분리하여 세포만 수집하였다. 수집된 세포는 genomic DNA 추출 키트를 사용하여 추출하였다. 추출된 genomic DNA는 정량하지 않고 5ul를 본 실험에 사용하였다. DNA 5ul를 사용하고, 12종의 PGMY09Biotin 프라이머 각각 0.025uM, 5종의 PGMY 11-Phosphate 프라이머 0.025uM, GAPDHBiotin 리버스 프라이머 0.025uM, GAPDH-Phosphate 포워드 프라이머 0.025uM, HMB01 0.05 uM과 dCTPs 30uM, Biotin-dCTP 10uM, Taq pol. 1.5 U, 10 X PCR buffer 5ul를 섞은 후 증류수를 이용하여 50ul로 맞췄다. PCR 조건은 95℃ 5분 실시 후, 94℃ 1분, 53℃ 1분, 72℃ 1분 40 cycle, 72℃ 7분으로 설정하였다. PCR 실시 후 PCR 용액 40ul에 람다 엑소뉴클레아제 2ul (10 Unit), 10X buffer 5ul, DW 3ul를 첨가하여 37℃에서 30분간 반응하여 단일 가닥을 형성하였다. 반응 종료 후 80℃에서 10분간 반응시켜 효소를 비활성화시켰다. Hybrizol 20ul, 단일 가닥 PCR 용액 20ul, Bead 혼합액 0.5ul (2,500ea/type, total 60,000ea)를 섞어 37℃에서 2시간 동안 교잡반응을 실시하였다. 교잡반응 후 세척액 1과 2를 사용하여 세척하고 SAPE 용액(1mg/ml) 0.2ul를 넣어준 후 10분간 반응시켰다. 반응 종료 후 세척액 2를 이용하여 한번 세척하고 Luminex 장비를 이용하여 분석을 실시하였다.
그 결과, 본 발명의 방법으로 HPV 검출 및 유전형을 확인한 경우 민감도가 92.94%, 특이성이 99.65%, 정확도가 96.03%로 측정되었다. 반면, 공지된 방법으로 HPV 타입을 검출한 경우, 민감도가 82.65%, 특이성이 99.31%, 정확도가 90.30%로 측정되었다(도 19).
상기 결과를 통해 본 발명은 짧은 시간 안에, 높은 민감도와 정확도로 HPV를 검출하고 동시에 유전형을 확인할 수 있음을 알 수 있었다.

Claims (22)

1) 분석하고자 하는 시료로부터, 인유두종바이러스(HPV) L1 유전자의 2종 이상 유전형에 공통적으로 특이적인, 제1표지자가 표지된 제1프라이머, 및 엑소뉴클레아제에 의해 인식되는 제2표지자가 표지된 제2프라이머를 사용하여 L1 유전자를 PCR 증폭하는 제1단계;
2) 제1단계에서 증폭된 이중 가닥의 L1 유전자 산물에 상기 제2표지자를 인식하는 엑소뉴클레아제를 가하여 반응시켜서, 제2표지자가 표지된 단일 가닥의 L1 유전자 산물을 분해하여 제1표지자가 표지된 단일 가닥의 L1 유전자 산물을 수득하는 제2단계;
3) 제2단계에서 수득된, 제1표지자가 표지된 단일 가닥의 L1 유전자 산물을 L1 유전자의 2종 이상 유전형을 구별할 수 있는 각 유전형에 특이적인 프로브를 2종 이상 사용하여 L1 유전자의 유전형을 확인하는 제3단계를 포함하는 것이 특징인,
인유두종바이러스 검출 및 유전형 확인 방법.
제1항에 있어서, 제2프라이머도 인유두종바이러스(HPV) L1 유전자의 2종 이상 유전형에 공통적으로 특이적인 것이 특징인 인유두종바이러스 검출 및 유전형 확인 방법.
제1항에 있어서, 제3단계에서 사용하는 2종 이상 프로브들은 서로 L1 유전자 중 동일 부위 또는 상이한 부위인 것이 특징인 인유두종바이러스 검출 및 유전형 확인 방법.
제1항에 있어서, 제3단계는, 제1표지자가 표지된 단일 가닥의 L1 유전자 산물을 L1 유전자 유전형 검출형 프로브 2종 이상과 교잡(hybridization) 반응시켜 L1 유전자 유전형 별로 구별시킨 후,
상기 제1표지자와 특이적으로 결합하고 형광물질이 부착된 결합제를 반응시키고,
형광값을 측정하는 것이 특징인 인유두종바이러스 검출 및 유전형 확인 방법.
제1항에 있어서, 상기 제1표지자는 비오틴인 것을 특징으로 하는 인유두종바이러스 검출 및 유전형 확인 방법.
제1항에 있어서, 상기 제2표지자는 포스페이트인 것을 특징으로 하는 인유두종바이러스 검출 및 유전형 확인 방법.
제1항에 있어서, 상기 제2표지자를 인식하는 엑소뉴클라제는 람다 엑소뉴클라제인 것을 특징으로 하는 인유두종바이러스 검출 및 유전형 확인 방법.
제1항에 있어서, 상기 제1프라이머는 서열번호 1의 염기서열을 가지고 상기 제2프라이머는 서열번호 2의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 인유두종바이러스 검출 및 유전형 확인 방법.
제1항에 있어서, 제1단계의 PCR 증폭은 상기 제1표지자로 표지된 dCTP, dATP, dGTP, dTTP 또는 이들의 혼합물을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 인유두종바이러스 검출 및 유전형 확인 방법.
제1항에 있어서, 상기 프로브가 비드에 결합된 형태인 것을 특징으로 하는 인유두종바이러스 검출 및 유전형 확인 방법.
제4항에 있어서, 제3단계의 결합제는 스트렙타비딘인 것을 특징으로 하는 인유두종바이러스 검출 및 유전형 확인 방법.
제4항에 있어서, 제3단계의 형광물질은 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드 또는 플루오레스카민인 것을 특징으로 하는 인유두종바이러스 검출 및 유전형 확인 방법.
제1항에 있어서, 제1단계의 PCR 증폭 시, 어닐링(annealing) 온도를 52 내지 55℃로 설정하는 것을 특징으로 하는 인유두종바이러스 검출 및 유전형 확인 방법.
제1항에 있어서, 제1단계의 프라이머 농도는 0.02 내지 0.03μM인 것을 특징으로 하는 인유두종바이러스 검출 및 유전형 확인 방법.
제4항에 있어서, 제3단계에서 프로브와 교잡 시 온도는 35 내지 38℃인 것을 특징으로 하는 인유두종바이러스 검출 및 유전형 확인 방법.
제4항에 있어서, 제3단계에서 교잡을 위한 L1 유전자 산물은 10 내지 30㎕인 것을 특징으로 하는 인유두종바이러스 검출 및 유전형 확인 방법.
1) 분석하고자 하는 시료로부터, 인유두종바이러스(HPV) L1 유전자의 2종 이상 유전형에 공통적으로 특이적인, 제1표지자가 표지된 제1프라이머, 엑소뉴클레아제에 의해 인식되는 제2표지자가 표지된 제2프라이머, GAPDH 유전자에 특이적인, 제1표지자가 표지된 제3프라이머, 및 엑소뉴클레아제에 의해 인식되는 제2표지자가 표지된 제4프라이머를 사용하여 L1 유전자 및 GAPDH 유전자를 PCR 증폭하는 제1단계;
2) 제1단계에서 증폭된 이중 가닥의 유전자 산물에 상기 제2표지자를 인식하는 엑소뉴클레아제를 가하여 반응시켜서, 제2표지자가 표지된 단일 가닥의 유전자 산물을 분해하여 제1표지자가 표지된 단일 가닥의 유전자 산물을 수득하는 단계;
3) 제2단계에서 수득된, 제1표지자가 표지된 단일 가닥의 L1 유전자 산물을 L1 유전자의 2종 이상 유전형을 구별할 수 있는 각 유전형에 특이적인 프로브를 2종 이상 사용하고, GAPDH 유전자에 특이적인 프로브를 사용하여 L1 유전자의 유전형을 확인하는 제3단계를 포함하는 것이 특징인,
인유두종바이러스 검출 및 유전형 확인 방법.
제17항에 있어서, 상기 제1표지자는 비오틴이고, 제2표지자는 포스페이트이고, 제2표지자를 인식하는 엑소뉴클라제는 람다 엑소뉴클라제인 것을 특징으로 하는 인유두종바이러스 검출 및 유전형 확인 방법.
제17항에 있어서, 상기 제1프라이머는 서열번호 1의 염기서열, 상기 제2프라이머는 서열번호 2의 염기서열, 상기 제3프라이머는 서열번호 3의 염기서열, 상기 제4프라이머는 서열번호 4의 염기서열인 것을 특징으로 하는 인유두종바이러스 검출 및 유전형 확인 방법.
1) 분석하고자 하는 시료로부터, 인유두종바이러스(HPV) L1 유전자의 2종 이상 유전형에 공통적으로 특이적인, 제1표지자가 표지된 제1프라이머, 및 엑소뉴클레아제에 의해 인식되는 제2표지자가 표지된 제2프라이머를 사용하여 L1 유전자를 PCR 증폭하는 제1단계;
2) 제1단계에서 증폭된 이중 가닥의 L1 유전자 산물에 상기 제2표지자를 인식하는 엑소뉴클레아제를 가하여 반응시켜서, 제2표지자가 표지된 단일 가닥의 L1 유전자 산물을 분해하여 제1표지자가 표지된 단일 가닥의 L1 유전자 산물을 수득하는 제2단계;
3) 제2단계에서 수득된, 제1표지자가 표지된 단일 가닥의 L1 유전자 산물을 L1 유전자의 2종 이상 유전형을 구별할 수 있는 각 유전형에 특이적인 프로브를 2종 이상 사용하여 L1 유전자의 유전형을 확인하는 제3단계를 포함하는 것이 특징인,
인유두종바이러스 감염 여부 및 감염된 유전형의 진단을 위한 정보제공방법.
1) 인유두종바이러스가 감염된 개체에 후보 치료 물질을 투여하는 단계; 및
2) 상기 개체로부터 DNA을 분리하여 상기 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 방법으로 인유두종바이러스 검출 및 유전형을 확인하는 단계를 포함하는, 자궁경부암 치료제의 스크리닝 방법.
1) 분석하고자 하는 시료로부터, 인유두종바이러스(HPV) L1 유전자의 2종 이상 유전형에 공통적으로 특이적인, 제1표지자가 표지된 제1프라이머, 및 엑소뉴클레아제에 의해 인식되는 제2표지자가 표지된 제2프라이머를 사용하여 L1 유전자를 PCR 증폭하는 제1단계;
2) 제1단계에서 증폭된 이중 가닥의 L1 유전자 산물에 상기 제2표지자를 인식하는 엑소뉴클레아제를 가하여 반응시켜서, 제2표지자가 표지된 단일 가닥의 L1 유전자 산물을 분해하여 제1표지자가 표지된 단일 가닥의 L1 유전자 산물을 수득하는 제2단계;를 포함하는, 인유두종바이러스의 L1 유전자 단일 가닥을 증폭하는 방법.
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