WO2018066910A1 - 메틸화 dna 다중 검출방법 - Google Patents

메틸화 dna 다중 검출방법 Download PDF

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target dna
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안성환
오태정
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Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting the methylation of a target DNA multiplely and to a composition for the detection of methylation of a target DNA, and more particularly complementary to the target specific sequence and target DNA capable of complementarily binding to the target DNA
  • Oligonucleotides comprising artificial primers that do not bind to each other are prepared and used as primary primers to linearly amplify the target DNA (Linear Target Enrichment, hereinafter, LTE), and complementarily bind to the linearly amplified target DNA.
  • LTE Linear Target Enrichment
  • the present invention relates to a method for detecting the presence or absence of methylation of a target DNA by amplifying using another oligonucleotide and a universal primer, and using a probe capable of detecting the presence or absence of an amplification product.
  • the genomic DNA of mammalian cells contains a fifth base in addition to A, C, G, and T, which is 5-methylcytosine (5-mC) having a methyl group attached to the fifth carbon of the cytosine ring.
  • 5-mC always comes only to C of CG dinucleotide (5'-mCG-3 '), and this CG is often referred to as CpG.
  • Most of C of CpG is methylated because a methyl group is attached.
  • This methylation of CpG inhibits the expression of repetitive sequences in the genome, such as alu or transposon, and is the site where extragenic changes occur most frequently in mammalian cells.
  • CpG sites There are exceptionally dense CpGs, which are called CpG sites (CpG islands).
  • the CpG site is 0.2-3kb in length, the distribution percentage of C and G bases is over 50%, and the distribution percentage of CpG is indicated to be highly concentrated at 3.75% or more.
  • About 45,000 CpG sites appear in the entire human genome, particularly in promoter regions that control gene expression. Indeed, the promoters of housekeeping genes, which make up about half of human genes, show CpG sites (Cross, S. et al., Curr. Opin. Gene Develop., 5: 309, 1995).
  • Abnormal DNA methylation occurs mainly at the 5 'regulatory region of the gene and is known to reduce the expression of the gene.
  • the 5 'expression control region of the gene includes a promoter, an enhancer, and a 5' untranslated region.
  • the methylation analysis method of the gene is usually carried out by detecting a control gene irrelevant to methylation by PCR in order to confirm the adequacy of the PCR and the presence of input DNA, and in parallel to the methylation detection PCR for the target DNA.
  • the methylation analysis method using real-time PCR is i) methylation-specific primer that can be hybridized with methylated target DNA using PCR methylation and independent primers as primers for real-time PCR and PCR amplification products
  • a method of using a detection probe ii) using a methylation specific primer of a target DNA as a primer for real-time PCR, and in the PCR amplification product, a detection probe that contains a methylation and a non-dependent sequence and can hybridize with the sequence.
  • both of these methods use non-enriched DNA directly as templates and essentially use two forward and reverse primers to amplify the target DNA simultaneously. Accordingly, there is a problem that two more primers are needed at a time each time the target to be amplified in one tube (single reactor) increases.
  • primers for multiplex PCR will allow different primers to have similar hybridization properties in a single tube. Annealing temperatures and primer concentrations can be calculated to some extent or empirically used. Since nonspecific hybridization increases with each additional primer pair, the reaction conditions must be modified for each additional primer pair. In addition, depletion of primer pairs may result in artifacts. Weighardt et al. (PCR Meth App, 1993, 3: 77) described the use of oligonucleotides tagged 5 ′ for PCR reactions. However, the main feature of this amplification method includes annealing each primer and separating the primer extension reaction, which is not suitable for the actual multiplex PCR concept. Therefore, creating perfect conditions for multiplex PCR is a very difficult and expensive process. Therefore, it is necessary to develop a multiplex PCR method capable of simultaneously amplifying multiple targets to the same degree regardless of various characteristics of different primers.
  • the inventors of the present application have intensively attempted to solve the above problems and develop a method for detecting methylated target DNA having high detection limit and accuracy, and thus, by using oligonucleotides having universal primers bound thereto, the target DNA is oriented in one direction.
  • methylated DNA can be detected with a high degree of sensitivity and accuracy as desired, and the present invention was completed.
  • An object of the present invention is to provide a method for multiplexing methylated DNA using universal primers.
  • An object of the present invention is to provide a composition for detecting methylated DNA multiplexing including a universal primer.
  • An object of the present invention to provide a kit for detecting methylated DNA multiplex comprising the composition.
  • the present invention provides a method for detecting methylated DNA, comprising the steps of: (a) Target DNA with one or more reagents that modify the methylated and unmethylated DNA sites differently; Processing a sample that contains; (b) preparing an oligonucleotide comprising a target specific sequence designed to complementarily bind to the target DNA sequence treated with the reagent and a universal primer that does not complementarily bind to the target DNA; (c) linear amplification in one direction using the oligonucleotide prepared in step (b) as a primer as a template of the target DNA treated with the reagent in step (a); (d) amplifying the target DNA using oligonucleotides and universal primers capable of complementarily binding to linearly amplified DNA in step (c); And (e) detecting methylation of the target DNA using a probe capable of complementarily hybridizing to the target DNA sequence amplified in step (d).
  • the present invention also includes one or more reagents for modifying methylated and unmethylated DNA differently from the sample comprising the target DNA; Oligonucleotides comprising a target specific sequence capable of complementarily binding to a target DNA sequence treated with the reagent and a universal primer that does not hybridize to the target DNA; Oligonucleotides and universal primers capable of complementarily binding to the linearly amplified DNA; And a probe capable of complementarily hybridizing to the amplified target DNA sequence.
  • the present invention also provides a kit for detecting methylated DNA comprising the composition.
  • FIG. 1 is a conceptual diagram schematically illustrating the target methylated DNA multiplex detection method of the present invention.
  • Figure 2 shows the result of comparing the detection sensitivity for the methylated DNA detected by the method of the present invention and the general method.
  • Figure 3 illustrates the process of designing primers and probes for the target DNA used in the method of the present invention.
  • Figure 4 shows the result of comparing the detection sensitivity to the methylated DNA detected by the method of the present invention and the general method using a primer and a probe for the target DNA.
  • the invention relates to a method of detecting methylated DNA comprising the steps of: (a) a target DNA is included with one or more reagents that modify the methylated and unmethylated DNA sites differently; Processing the sample; (b) preparing an oligonucleotide comprising a target specific sequence designed to complementarily bind to the target DNA sequence treated with the reagent and a universal primer that does not complementarily bind to the target DNA; (c) linear amplification in one direction using the oligonucleotide prepared in step (b) as a primer as a template of the target DNA treated with the reagent in step (a); (d) amplifying the target DNA using oligonucleotides and universal primers capable of complementarily binding to linearly amplified DNA in step (c); And (e) detecting methylation of the target DNA using a probe capable of complementarily hybridizing to the target DNA sequence amplified in step (d).
  • an internal control gene using a target specific sequence capable of complementarily binding to a target DNA and a universal primer that does not complementarily bind to a target DNA bound to the target specific sequence and Linearly amplify the target DNA first, and then perform real-time PCR using oligonucleotides that can complementarily bind to the target DNA and complementary hybridization to the target DNA sequence, and probes and universal primers. Methylated DNA was analyzed. As a result, it was confirmed that the method of the present invention can detect methylated DNA with higher sensitivity and accuracy than the conventional method.
  • step (a) is a step of treating the sample containing the target DNA with one or more reagents that modify the methylated DNA site and the unmethylated DNA site differently.
  • Methods of the present invention means that the methyl group attached to the fifth carbon of the cytosine (cytocine) base ring is modified to 5-methylcytosine (5-mC), 5-methylcytosine is always C only of CG dinucleotide (5'-mCG-3 '), this CG is often referred to as CpG.
  • This methylation of CpG inhibits the expression of repeating sequences in the genome, such as alu and transposon, and is the site where extragenic changes occur most frequently in mammalian cells.
  • CpG islands there are exceptionally dense ones, which are called CpG islands.
  • CpG islands are 0.2-3kb in length, and the distribution percentage of C and G bases is over 50%, and the distribution percentage of CpG is concentrated to 3.75% or more.
  • About 45,000 CpG islands appear in the entire human genome, particularly in promoter regions that regulate gene expression. Indeed, CpG islands appear in the promoters of housekeeping genes, which make up about half of human genes.
  • the presence of CpG methylation in the target DNA can be indicative of disease, for example measuring the CpG methylation of any one of a promoter, 5 ′ untranslated region and intron of the target DNA.
  • CpG-containing genes are typically DNA.
  • the method of the present invention may apply for example a sample containing DNA or RNA comprising DNA and mRNA, wherein the DNA or RNA may be single stranded or double stranded, or DNA-RNA hybrids may be used. It may be characterized by the contained sample.
  • Nucleic acid mixtures may also be used.
  • the term "multiple" includes both cases where there are a plurality of specific nucleic acid sequence sites to be detected in a gene and a case where a plurality of target DNAs are included in one tube (single reactor).
  • the specific nucleic acid sequence to be detected may be a fraction of a large molecule, and from the outset the specific sequence may exist in the form of isolated molecules that make up the entire nucleic acid sequence.
  • the nucleic acid sequence need not be nucleic acid present in pure form, and the nucleic acid may be a small fraction in a complex mixture, such as containing whole human DNA.
  • the present invention is to detect the methylation of a plurality of target DNA in a sample in a single reactor, the sample may include a plurality of multiple target DNA, the target DNA is abnormally methylated and expressed as well as the control gene When inhibited, any gene that affects the development or progression of cancer can be used without limitation.
  • the sample may be derived from the human body, for example, liver cancer, glioblastoma, ovarian cancer, colon cancer, head and neck cancer, bladder cancer, kidney cell cancer, gastric cancer, breast cancer, metastatic cancer, prostate Cancer, pancreatic cancer or lung cancer patients may be derived, and the sample may use solid or liquid tissue, cells, feces, urine, blood, serum or plasma.
  • One or more reagents for differently modifying the methylated DNA and the unmethylated DNA can be used without limitation so long as it can distinguish between the unmethylated cytosine base and the methylated cytosine base, for example bisulfite, hydride. Rosen sulfite, disulfite, and combinations thereof, but is not limited thereto.
  • the cytosine base methylated by the reagent is not converted, and the unmethylated cytosine base may be converted to a base other than uracil or cytosine.
  • step (b) is to prepare an oligonucleotide comprising a target specific sequence designed to complementarily bind to the target DNA sequence treated with the reagent and a universal primer that does not complementarily bind to the target DNA. Step.
  • a pair of forward and reverse primers should be used at the same time as the number of targets to be detected, whereas the method of the present invention uses a target DNA by a universal primer in a real-time PCR process for detecting multiple multiplexed DNAs simultaneously.
  • Only one target specific sequence (reverse primer) capable of complementarily binding to the sequence may be used, and only oligonucleotides (forward primer) capable of complementarily binding linearly amplified DNA are used as the number of targets to be detected.
  • forward primer oligonucleotides
  • only a small number of primers may be used to simultaneously detect methylation of several targets, thereby reducing the complexity of PCR and variation in PCR efficiency.
  • the target specific sequence is a sequence capable of complementarily binding to the target DNA, and a sequence capable of complementarily binding to a methylation site of the target DNA, as well as a sequence capable of complementarily binding to an unmethylated site of the target DNA. Sequences can also be used optionally.
  • the target specific sequence may comprise one or more CpG dinucleotides, for example.
  • the target specific sequence is, for example, a sequence having at least 50% homology with at least one sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 5, 9, 14, 17, 21, and 26, for example, At least 55%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90% homology.
  • the universal primer is either a target specific sequence (reverse primer) capable of complementarily binding to a target DNA sequence or an oligonucleotide (forward primer) capable of complementarily binding linearly amplified DNA, or a reverse primer and It can be used in conjunction with both forward primers.
  • the universal primer may be used without limitation as long as the base sequence does not complementarily bind to the amplifiable target DNA irrespective of the target DNA, but may include, for example, a base sequence not present in the human genome.
  • the universal primer is a sequence having at least 50% homology with the sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7, for example, 55% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more Sequences with homology may be included.
  • the universal sequence may include a sequence such as T7, SP6, M13, but is not limited thereto.
  • the universal sequence may be at least one selected from the group consisting of, for example, SEQ ID NO: 35 to SEQ ID NO: 41.
  • the universal sequence is for example the T7 sequence of 5'-TAATACGACTCACTATAGG-3 '(SEQ ID NO: 35), the SP6 sequence of 5'-TATTTAGGTGACACTATAG-3' (SEQ ID NO: 36), or 5'-GTAAAACGACGGCCAG-3 '(SEQ ID NO: 37: -20F), 5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3 '(SEQ ID NO: 38: -40F), 5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3' (SEQ ID NO: 39: -47F), 5'-GAAACAGCTATGACCATG-3 '(SEQ ID NO: 40: R) or the M13 sequence of 5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3 '(SEQ ID NO: 41 -48R).
  • the present invention includes the step of amplifying linearly (asymmetric) in one direction using a target DNA treated with a reagent in step (a) as a template using the oligonucleotide prepared in step (b) as a primer. .
  • the bisulfite-treated DNA was not directly used in the real-time PCR process, but the linearly amplified DNA was used, thereby providing excellent detection rate and detection sensitivity (FIGS. 2 and 4).
  • methylated target DNA is linearly amplified in one direction, and enrichment occurs through this.
  • an oligonucleotide comprising a structure in which a universal primer is bound to the 5 'end of a target specific sequence is used as a primer, and a linear for enriching the methylated target DNA through unidirectional PCR Amplification can be performed.
  • the linear amplification means that the amplification products are produced linearly with respect to the number of amplification cycles including double strand denaturation, primers and annealing and nucleic acid synthesis, and the amplification products are exponential with respect to the number of amplification cycles. It is distinguished from the chain reaction (PCR) produced.
  • PCR chain reaction
  • the present invention then includes the steps of (d) amplifying the target DNA using oligonucleotides and universal primers capable of complementarily binding to linearly amplified DNA in step (c).
  • the step (d) may include detecting the methylation of the target DNA using a self-reporting function or using an energy transfer labeled primer.
  • self-reporting is also sometimes referred to as an “energy transfer label” and can be used interchangeably herein.
  • a universal primer having a self-reporting function may be mixed with an energy transfer labeled primer.
  • Self-reporting or energy transfer labeling function does not fluoresce by self-quenching at a stage where amplification does not occur, but self-quenching or self probing (self-quenching) that releases quenching when amplification occurs -probing)
  • self-quenching or self probing self-quenching that releases quenching when amplification occurs -probing
  • a material having a self-reporting function or a material having an energy transfer labeling function may include, but is not limited to, a TaqMan probe, a fluorophore, or a molecular beacon.
  • the oligonucleotide (forward primer) capable of complementarily binding to the linearly amplified DNA is a sequence capable of complementarily binding and amplifying the target DNA produced in step (c), for example, one or more CpG dinucleotides.
  • the oligonucleotide is at least 50% phase with at least one sequence selected from the group consisting of, for example, SEQ ID NOs: 1, 4, 8, 10-13, 15, 16, 18-20, 22-25, 27 and 28 Sequences that are homologous, eg, sequences having at least 55%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90% homology.
  • the present invention includes the step (e) of detecting the methylation of the target DNA using a probe capable of complementarily hybridizing to the target DNA sequence amplified in step (d).
  • the methylation detection is performed by PCR, methylation specific PCR, real time methylation specific PCR, PCR using methylated DNA specific binding protein, methylated DNA specific binding antibody. It can be carried out by a method selected from the group consisting of PCR, quantitative PCR, gene chip, sequencing, sequencing by synthesis and sequencing by ligation used.
  • Methylation specific PCR When detected by the methylation specific PCR, bisulfite treatment results in cytosine at the 5'-CpG'-3 site as it is methylated, and remains unmethylated. If so, it turns into uracil. Therefore, a primer corresponding to the site where the 5'-CpG-3 'nucleotide sequence exists can be prepared for the converted nucleotide sequence after bisulfite treatment. When PCR is carried out using a primer, the PCR product is made from the primer corresponding to the methylated nucleotide sequence, and methylation can be confirmed by agarose gel electrophoresis.
  • the methylation detection probe may be a TaqMan, a Molecular Beacon, a probe having a self-reporting function or an energy transfer labeling function, but is not limited thereto.
  • the real time methylation specific PCR is a conversion of the methylation specific PCR method to a real time measurement method.
  • the PCR primers are designed and real-time PCR is performed using these primers.
  • there are two methods of detection using a TaqMan probe complementary to the amplified base sequence and two methods of detection using Sybergreen.
  • real-time methylation specific PCR can selectively quantitate only methylated DNA.
  • a standard curve may be prepared using an in vitro methylated DNA sample, and for standardization, a gene without a 5'-CpG-3 'sequence in the base sequence may be amplified with a negative control to quantitatively analyze the degree of methylation.
  • PCR or quantitative PCR and DNA chip using methylated DNA-specific binding protein mixes DNA with a protein that specifically binds to methylated DNA, Since the protein is specifically bound to methylated DNA, only methylated DNA can be selectively isolated.
  • methylation can also be determined by quantitative PCR.
  • Methods for labeling DNA separated by methylated DNA-specific binding proteins can be labeled with a fluorescent dye and hybridized to DNA chips having complementary probes to measure methylation. Can be.
  • Another method of detecting nucleic acids containing methylated CpG comprises contacting a sample containing nucleic acid with an agent that modifies non-methylated cytosine and a CpG-specific oligonucleotide Amplifying the CpG-containing nucleic acid of the sample using a primer.
  • the oligonucleotide primer may be characterized by detecting the methylated nucleic acid by distinguishing the modified methylated and unmethylated nucleic acid.
  • the amplification step is optional and desirable but not necessary.
  • the method relies on a PCR reaction that distinguishes between modified (eg, chemically modified) methylated and unmethylated DNA.
  • Bisulfite sequencing method Another method of detecting nucleic acid containing methylated CpG comprises contacting a sample containing nucleic acid with an agent that modifies unmethylated cytosine and a methylation independent oligonucleotide primer. Amplifying the CpG-containing nucleic acid in the sample.
  • the oligonucleotide primer may be characterized by amplifying the nucleic acid without distinguishing the modified methylated and unmethylated nucleic acid.
  • the amplified products have been described in connection with bisulfite sequencing for the detection of methylated nucleic acids by sequencing by the Sanger method using sequencing primers or by the next generation sequencing method.
  • next generation sequencing method may be characterized by sequencing by synthesis and sequencing by ligation.
  • the distinctive feature of this method is that instead of creating bacterial clones, a single DNA fragment is spatially separated, amplified in situ, and sequenced. In this case, since several hundreds of thousands of fragments are read at the same time, it is also called a massively parallel sequencing method.
  • a sequencing by synthesis method and a method of obtaining a signal by attaching mono or dinucleotides sequentially includes pyro sequencing, ion torrent, and Solexa methods.
  • NGS equipment based on sequencing by synthesis includes Roche's 454 platform, Illumina's HiSeq platform, Life Technology's Ion PGM platform, and finally PacBio platform on Pacific BioSciences. have. 454 and Ion PGM use emersion PCR as a clonal amplification method, and HiSeq uses bridge amplification.
  • the sequencing by synthesis method reads a sequence by detecting phosphate, hydrogen ions, or pre-attached fluorescence generated when DNA is synthesized by sequentially attaching one nucleotide.
  • 454 uses a pyroseqeuncing method using phosphoric acid
  • Ion PGM uses hydrogen ion detection.
  • Sequencing by ligation is a sequencing technique that uses DNA ligase to identify nucleotides at specific positions in the DNA sequence. Unlike most sequencing techniques that use polymerases, they do not use polymerases and take advantage of the feature that DNA ligase does not ligation mismatch sequences. This is the case with SOLiD systems. In this technique, two bases are read at intervals, which are repeated five times independently through a primer reset, so that each base is read twice twice to increase accuracy.
  • dinucleotide primers corresponding to the corresponding sequencing are sequentially ligated, and the combination of these ligations is analyzed and finally The base sequence of the DNA is completed.
  • next generation sequencing method may be characterized by a sequencing by synthesis or a sequencing by ligation method.
  • methylated DNA specific binding protein is not limited to MBD2bt
  • the antibody is not limited to 5'-methyl-cytosine antibody.
  • the primer used in the present invention when the reagent, for example, bisulfite, is treated according to step (a), the cytosine at the 5'-CpG'-3 site remains methylated as it is, When methylated, it turns into uracil. Therefore, a primer corresponding to a site where a 5'-CpG-3 'nucleotide sequence exists can be prepared for a reagent, for example, a base sequence converted after bisulfite treatment.
  • the primers can be constructed to have "alternatively" complementarities with each strand of the locus to be amplified in the target DNA. This means that the primers have sufficient complementarity to hybridize with the corresponding nucleic acid strands under the conditions for carrying out the polymerization.
  • step (d) the product amplified by the oligonucleotide and the universal primer capable of complementarily binding to the linearly amplified DNA is detected by methylation using a probe capable of hybridizing with the target DNA, and the probe is subjected to the target.
  • Anything that can be detected by hybridization with DNA can be used without limitation, but may include, for example, one or more CpG dinucleotides.
  • the probe may be, for example, a sequence having at least 50% homology with at least one sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3, 6, 29, 30, 31-34, eg, at least 55%, at least 60% , At least 70%, at least 80%, at least 90% homology.
  • the probe may be characterized in that the reporter (quencher) or the reporter (quencher) is coupled to the sock end, the reporter is FAM (6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX (2 ', 4 ', 5', 7'-tetrachloro-6-carboxy-4, 7-dichlorofluorescein), JOE, CY3 and CY5 may be one or more selected from the group consisting of, the quencher TAMRA (6- carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 and Dabcyl can be characterized in that at least one selected from the group consisting of.
  • the present invention provides a kit comprising one or more reagents for modifying methylated and unmethylated DNA differently from a sample comprising a target DNA;
  • Oligonucleotides comprising a target specific sequence capable of complementarily binding to a target DNA sequence treated with the reagent and a universal primer that does not hybridize to the target DNA; Oligonucleotides and universal primers capable of complementarily binding to the linearly amplified DNA; And a probe capable of complementarily hybridizing to the amplified target DNA sequence.
  • the composition according to the present invention comprises a target specific sequence and a target capable of complementarily binding to a target DNA sequence that amplifies the target DNA treated with one or more reagent treatments and reagents that modify the methylated and unmethylated DNA differently. Detecting methylated DNA using oligonucleotides, universal primers and probes capable of linear amplification and complementary binding to linearly amplified DNA using oligonucleotides comprising universal primers that do not hybridize to DNA, and Since it overlaps with the described configuration, the description applies equally.
  • the present invention relates to a kit for detecting methylation of a target DNA containing the composition.
  • the kit comprises a compartmentalized carrier means for holding a sample, a container comprising a reagent, a container comprising a primer capable of amplifying a target DNA 5′-CpG-3 ′ and for detecting the amplification product. It may include a container containing a probe.
  • the carrier means is suitable for containing one or more containers, such as bottles, tubes, each container containing independent components used in the method of the invention.
  • containers such as bottles, tubes
  • each container containing independent components used in the method of the invention.
  • one of ordinary skill in the art can readily dispense the required formulation in the container.
  • Example 1 Derivation of detection limit using cell line-derived methylated DNA
  • Human colon cancer cell lines HCT116, SW480 and HT-29 cell lines were purchased from Korea Cell Line Bank (Seoul, Korea), RPMI 1640 medium containing 10% fetal bovine serum (JBI, Seoul, South Korea), penicillin and streptomycin (JBI, Seoul, South Korea) and 37 °C, incubated in a 5% carbon dioxide incubator.
  • Genomic DNA was extracted using a QiaAmp DNA Mini kit (Qiagen, Hilden, Germany), and sodium bisulfite was treated using an EZ DNA Methylation-Gold kit (ZYMO Research, Irvine, USA).
  • bisulfite was treated at 65 ° C. for 2.5 hours, then left at room temperature for 20 minutes to perform sulfonation desulfonation, followed by binding to a Zymo-Spin IC column (Zymo Research, Irvine, USA). After extraction, the mixture was extracted with 10 ⁇ l of distilled water and stored at 20 ° C.
  • HCT116 cell line-derived methylated DNA was dispensed in 200-10 pg units, followed by Illustra GenomiPhi V2 DNA Amplification Kit (GE Healthcare, Cleveland, USA) was mixed with 20 ng of non-methylated human leukocyte genomic DNA (BioChain Insititute Inc., Hayward, CA) and amplified stepwise.
  • the oligonucleotide comprising the universal primer of SEQ ID NO: 7 bound to the SDC2 specific sequence of SEQ ID NO: 2 and the oligonucleotide comprising the universal primer of SEQ ID NO: 7 linked to the COL2A1 specific sequence of SEQ ID NO: 95 5 minutes; Linear amplification at 95 ° C.15 sec., 60 ° C.
  • Each sequence of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 5 is SDC2 And a COL2A1 target specific sequence corresponding to the remaining sequence except for the universal sequence of SEQ ID NO: 7, wherein the oligonucleotide comprises a universal primer which does not hybridize to the target specific sequence and the target DNA.
  • the conventional method shows a detection rate of 100% in 200 pg of DNA, but a detection rate of 37.5% in 20 pg and 0% in 10 pg, while the method of the present invention shows a detection rate of 100% up to 200 pg-20 pg, It was confirmed that the detection rate of 33.3% even in 10pg (Fig. 2 and Table 2).
  • LTE Linear amplification
  • R methylation target specific sequence
  • FIG. 3 The methylation target specific sequence
  • FIG. 3 The methylation target specific sequence (R) designed in Table 3, with the bisulfite-treated genomic DNA as a template (FIG. 3).
  • LTE reaction was performed using a Rotor-Gene Q PCR instrument (Qiagen) for a total of 20 ⁇ l PCR reaction solution (template DNA, 10 ⁇ l; 5X AptaTaq DNA Master (Roche Diagnostics), 4 ⁇ l; COL2A1 target specific sequence, 1 ⁇ l (1 pmole); SDC2 Target specific sequence, 1 ⁇ l (1 pmole); 4 ⁇ l of DW) was prepared, and PCR conditions were performed 35 times with 95 ° C. for 5 minutes, followed by 15 seconds at 95 ° C., and 1 minute at 60 ° C.
  • Qiagen Rotor-Gene Q PCR instrument
  • qMSP was used Rotor-Gene Q PCR equipment (Qiagen). 40 ⁇ l total PCR reaction solution (20 ⁇ l primary LTE product; 8 ⁇ l 5X AptaTaq DNA Master (Roche Diagnostics); 1 ⁇ l PCR primer capable of complementarily binding to DNA (10 pmole); complementary to SDC2 1 ⁇ l (10 pmole) oligonucleotide; 1 ⁇ l (5 pmole) oligonucleotide capable of complementary binding to COL2A1 ; 1 ⁇ l (10 pmole) universal primer (SEQ ID NO: 7); SDC2 TaqMan probe, 1 ⁇ l ( 5 pmole); COL2A1 TaqMan probe, 1 ⁇ l (2.5 pmole); DW 6 ⁇ l) were prepared and PCR conditions were 95 ° C.
  • F1 to F17 correspond to oligonucleotides capable of complementarily binding to linearly amplified target DNA
  • the detection sensitivity of the LTE-qMSP method and the qMSP method of set 6 was compared by the method described in Example 1.
  • the conventional method shows a detection rate of 100% in 200 pg of DNA, but a detection rate of 37.5% in 20 pg and 0% in 10 pg, while the method of the present invention shows a detection rate of 100% up to 200 pg-20 pg, It was confirmed that the detection rate of 33.3% also in 10pg (Fig. 4a and Table 4).
  • the detection sensitivity of the LTE-qMSP and qMSP methods of set 17 was compared by the method described in Example 1.
  • the qMSP method showed 100% detection rate in 200 pg of DNA, but 45.0% in 20 pg and 0% in 10 pg, while the method of the present invention showed 100% detection rate up to 200 pg-100 pg, and 20 pg. It was confirmed that the detection rate of 91.7% and also in the 10pg 29.2% (Fig. 4b and Table 5).
  • Example 2 The degree of methylation of each sample in Table 3 was measured by Ct values, and the sensitivity and specificity of each primer and probe set were calculated through ROC curve analysis (MedCalc program, Belgium) (Table 6).
  • SDC2 gene methylation test using fecal DNA from normal and colorectal cancer patients showed 76% (19/25) to 88.0% (22/25) sensitivity and 88.0% (3/25) specificity to colorectal cancer diagnosis. It was confirmed to be excellent at 100% (0/25). Therefore, the use of SDC2 gene methylation was confirmed to be highly useful for diagnosing colon cancer.
  • the method for detecting methylated DNA according to the present invention uses a universal primer, in spite of various kinds of genes included in a sample, it is possible to efficiently amplify multiple target DNA even if only one primer is additionally used.
  • the complexity is reduced in the PCR (real-time PCR) used for the methylation detection by linear amplification and the variation in PCR efficiency can be reduced, the detection sensitivity is excellent and useful.
  • the methylated target DNA can be enriched with higher specificity in the linear amplification of the target DNA (LTE step).

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Abstract

본 발명은 타겟 DNA의 메틸화를 다중으로 검출하는 방법 및 타겟 DNA의 메틸화 검출을 위한 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 타겟 DNA와 상보적으로 결합할 수 있는 타겟 특이적 서열 및 타겟 DNA에 상보적으로 결합하지 않는 유니버셜 프라이머를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 제작하여, 이를 프라이머로 사용함으로써 타겟 DNA를 선형 증폭하고, 선형 증폭된 타겟 DNA를 선형 증폭된 DNA에 상보적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드, 유니버셜 프라이머 및 프로브를 이용하여 증폭함으로써, 타겟 DNA의 메틸화를 검출하는 방법에 관한 것이다.

Description

메틸화 DNA 다중 검출방법
본 발명은 타겟 DNA의 메틸화를 다중으로 검출하는 방법 및 타겟 DNA의 메틸화 검출을 위한 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 타겟 DNA와 상보적으로 결합할 수 있는 타겟 특이적 서열 및 타겟 DNA에 상보적으로 결합하지 않는 인공적인 프라이머를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 제작하여, 이를 1차 프라이머로 사용함으로써 타겟 DNA를 선형 증폭 (Linear Target Enrichment: 이하, LTE)하고, 선형 증폭된 타겟 DNA에 상보적으로 결합할 수 있는 또 다른 올리고뉴클레오타이드, 유니버셜 프라이머를 이용하여 증폭하고, 증폭산물의 유무를 검출할 수 있는 프로브를 이용함으로써, 타겟 DNA의 메틸화 유무를 검출하는 방법에 관한 것이다.
포유류 세포의 게놈 DNA에는 A, C, G, T 외에 5번째 염기가 존재하며, 이는 시토신 환의 5번째 탄소에 메틸기가 붙은 5-메틸시토신(5-mC)이다. 5-mC는 항상 CG 다이뉴클레오타이드의 C에만 오며(5'-mCG-3'), 이러한 CG를 흔히 CpG라고 표시한다. CpG의 C는 대부분이 메틸기가 붙어서 메틸화되어 있다. 이러한 CpG의 메틸화는 알루(alu)나 전이인자(transposon)와 같이 게놈내에 반복되는 염기서열(repetitive sequence)이 발현되지 못하도록 억제하며, 포유류 세포에서 유전자 외 변화가 가장 흔히 나타나는 부위이다. 이러한 CpG의 5-mC는 자연히 탈아미노화(deamination)되어 T로 바뀌며, 이에 따라 포유류 게놈내 CpG는 정상적으로 나타나야 할 빈도(1/4 × 1/4 = 6.25%)보다 훨씬 낮은 1%의 빈도만을 나타낸다.
CpG 중에 예외적으로 밀집되어 나타나는 것들이 있으며, 이를 CpG 부위 (CpG 섬)라고 한다. CpG 부위는 길이가 0.2~3kb이고, C 및 G염기의 분포백분율이 50%를 넘으며, CpG의 분포백분율이 3.75%이상으로 높게 집중되어 나타나는 부위를 가리킨다. CpG 부위는 전체 인체 유전체에 약 45,000개가 나타나며, 특히 유전자의 발현을 조절하는 프로모터 부위에 집중되어 나타난다. 실제로 인체 유전자 중 약 절반을 차지하는 중요 유전자(housekeeping genes)의 프로모터에는 CpG 부위가 나타난다 (Cross, S. et al., Curr. Opin. Gene Develop., 5:309, 1995). 비정상적인 DNA 메틸화는 주로 해당 유전자의 5' 발현조절 부위 (5' regulatory region)에서 일어나 해당 유전자의 발현을 감소시키는 것으로 알려져 있다.
여기서 유전자의 5' 발현조절부위는 프로모터 (promoter), 인헨서 (enhancer) 그리고 5’ 비번역 영역 (5' untranslated region) 등이 해당된다. 이에 실제 혈액이나 객담, 침, 대변, 소변 등에서 종양관련 유전자의 프로모터 메틸화를 조사하여 각종 암 진료에 사용하려는 시도가 최근 활발하게 이루어지고 있다.
세포사멸 (apoptosis) 또는 세포괴사 (necrosis) 등의 과정에 의해 유출된 DNA들이 혈액 내로 흘러나와 혈청 (serum)이나 혈장 (plasma)내에 종양세포 유리 (cell-free tumor) DNA에도 메틸화된 DNA 조각이 함께 존재한다고 잘 알려져 있으며 이러한 비정상적 DNA 메틸화 존재를 암을 진단하는 타겟으로 활용하고 있다.
한편, 통상 유전자의 메틸화 분석방법은 PCR의 적정성과 인풋 DNA의 존재유무를 확인하기 위하여 메틸화와 상관없는 대조군 유전자를 PCR로 검출하고, 이와 병행하여 타겟 DNA에 대한 메틸화 검출 PCR을 실시함으로써 수행된다.
특히, 실시간 PCR을 통한 메틸화 분석 방법은 i) 실시간 PCR을 위한 프라이머로 타겟 DNA의 메틸화와 비의존적 (independent) 프라이머를 사용하고, PCR 증폭산물 검출시 메틸화된 타겟 DNA와 혼성화할 수 있는 메틸화 특이적 검출 프로브를 사용하는 방법, ii) 실시간 PCR을 위한 프라이머로 타겟 DNA의 메틸화 특이적 프라이머를 사용하고, PCR 증폭 산물 내에는 메틸화와 비의존적 서열을 포함하며, 이 서열과 혼성화할 수 있는 검출 프로브를 사용하는 방법 및 iii) 실시간 PCR을 위한 프라이머로 타겟 DNA의 메틸화 특이적 프라이머를 사용하고, PCR 증폭산물 검출시 메틸화된 타겟 DNA와 혼성화할 수 있는 메틸화 특이적 검출 프로브를 사용하는 방법을 고려할 수 있다.
그러나, 이들 방법은 모두 풍부화되지 않은 DNA를 직접 주형으로 사용하고, 타겟 DNA를 증폭하기 위한 정방향과 역방향 프라이머 2개를 필수적으로 동시에 사용한다. 이에 따라, 하나의 튜브 (단일 반응기)에서 증폭해야 하는 타겟이 증가할 때마다 한 번에 2개의 프라이머가 더 필요하다는 문제점이 있다.
다중 PCR을 위한 프라이머의 설계는 단일 튜브에서 서로 다른 프라이머들이 유사한 혼성화 특성을 가질 수 있도록 설계하게 된다. 어닐링 (annealing) 온도와 프라이머 농도를 어느 정도 까지는 계산하여 사용할 수 도 있고 경험적으로 사용할 수도 있다. 프라이머쌍이 추가될 때 마다 비특이적 혼성화가 증가하기 때문에 각 프라이머쌍이 추가될 때 마다 반응조건을 변형시켜야만 한다. 또한, 프라이머쌍의 고갈 등으로 가공의 결과 (artifact)가 발생할 수 있다. Weighardt 등 (PCR Meth App, 1993, 3: 77)은 5’에 태그된 올리고뉴크레오타이드를 PCR 반응에 사용하는 것으로 기술한 바 있다. 그러나 이러한 증폭방법의 주요 특징은 각 프라이머의 어닐링과 프라이머 연장 반응을 분리하는 단계를 포함하고 있어 실제 다중 PCR 개념에는 적합하지 않다. 따라서 다중 PCR을 위한 완벽한 조건을 만드는 것은 매우 어려운 일이며, 비용이 많이 들어가는 과정이다. 따라서 서로 다른 프라이머들의 다양한 특성에 상관없이 동일조건에서 여러 개의 타겟을 동시에 동일한 정도로 증폭할 수 있는 다중 PCR 방법의 개발이 필요하다.
이러한 기술적 배경하에서, 본 출원의 발명자들은 상기 문제점들을 해결하고 높은 검출한도와 정확도를 가지는 메틸화 타겟 DNA의 검출방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 유니버셜 프라이머가 결합된 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 타겟 DNA를 한쪽 방향으로 (asymmetric) 선형 증폭하고, 풍부화된 이들 타겟 DNA를 주형으로 사용하여 타겟 DNA를 검출하며, 타겟 특이적 올리고뉴클레오타이드에 유니버셜 프라이머를 연결하는 경우 종래와 달리 다중 타겟 DNA 검출시 하나의 프라이머만을 추가하여도 목적하는 정도의 높은 민감도와 정확도로 메틸화 DNA를 검출할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 유니버셜 프라이머를 이용하여 메틸화 DNA를 다중으로 (multiple) 검출하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 목적은 유니버셜 프라이머를 포함하는 메틸화 DNA 다중 검출용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 목적은 상기 조성물을 포함하는 메틸화 DNA 다중 검출용 키트를 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 메틸화 DNA를 검출하는 방법을 제공한다: (a) 메틸화된 DNA 부위와 비메틸화된 DNA 부위를 서로 다르게 변형시키는 하나 이상의 시약으로 타겟 DNA가 포함되어 있는 샘플을 처리하는 단계; (b) 상기 시약으로 처리된 타겟 DNA 서열에 상보적으로 결합할 수 있도록 디자인된 타겟 특이적 서열 및 타겟 DNA에 상보적으로 결합하지 않는 유니버셜 프라이머를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 제작하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 제작된 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 사용하여 상기 (a) 단계에서 시약으로 처리된 타겟 DNA를 주형으로 하여 한쪽 방향으로 (asymmetric) 선형 증폭하는 단계; (d) 상기 (c) 단계에서 선형 증폭된 DNA에 상보적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 및 유니버셜 프라이머를 사용하여 타겟 DNA를 증폭하는 단계; 및 (e) 상기 (d) 단계에서 증폭된 타겟 DNA 서열에 상보적으로 혼성화 할 수 있는 프로브를 이용하여 타겟 DNA의 메틸화를 검출하는 단계.
본 발명은 또한, 타겟 DNA를 포함하는 샘플에 처리되는 메틸화된 DNA와 비메틸화된 DNA를 서로 다르게 변형시키는 하나 이상의 시약; 상기 시약으로 처리된 타겟 DNA 서열에 상보적으로 결합할 수 있는 타겟 특이적 서열 및 타겟 DNA에 혼성화 하지 않는 유니버셜 프라이머를 포함하는 올리고뉴클레오타이드; 상기 선형 증폭된 DNA에 상보적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 및 유니버셜 프라이머; 및 상기 증폭된 타겟 DNA 서열에 상보적으로 혼성화 할 수 있는 프로브를 포함하는 메틸화 DNA 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 조성물을 포함하는 메틸화 DNA 검출용 키트를 제공한다.
도 1은 본 발명의 타겟 메틸화 DNA 다중검출방법을 도식화한 개념도이다.
도 2는 본 발명의 방법과 일반적인 방법으로 검출한 메틸화 DNA에 대한 검출 민감도를 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 방법 사용되는 타겟 DNA에 대한 프라이머 및 프로브를 설계하는 과정을 도식화한 것이다.
도 4는 타겟 DNA에 대한 프라이머 및 프로브를 이용하여 본 발명의 방법과 일반적인 방법으로 검출한 메틸화 DNA에 대한 검출 민감도를 비교한 결과를 나타낸 것이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
일 관점에서, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 메틸화 DNA를 검출하는 방법에 관한 것이다: (a) 메틸화된 DNA 부위와 비메틸화된 DNA 부위를 서로 다르게 변형시키는 하나 이상의 시약으로 타겟 DNA가 포함되어 있는 샘플을 처리하는 단계; (b) 상기 시약으로 처리된 타겟 DNA 서열에 상보적으로 결합할 수 있도록 디자인된 타겟 특이적 서열 및 타겟 DNA에 상보적으로 결합하지 않는 유니버셜 프라이머를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 제작하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 제작된 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 사용하여 상기 (a) 단계에서 시약으로 처리된 타겟 DNA를 주형으로 하여 한쪽 방향으로 (asymmetric) 선형 증폭하는 단계; (d) 상기 (c) 단계에서 선형 증폭된 DNA에 상보적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 및 유니버셜 프라이머를 사용하여 타겟 DNA를 증폭하는 단계; 및 (e) 상기 (d) 단계에서 증폭된 타겟 DNA 서열에 상보적으로 혼성화 할 수 있는 프로브를 이용하여 타겟 DNA의 메틸화를 검출하는 단계.
본 발명에서는 높은 민감도로 메틸화 DNA를 검출하여 질병을 조기 진단할 수 있는 방법을 개발하여 그 성능을 확인하고자 하였다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 타겟 DNA와 상보적으로 결합할 수 있는 타겟 특이적 서열 및 상기 타겟 특이적 서열에 결합된 타겟 DNA에 상보적으로 결합하지 않는 유니버셜 프라이머를 이용하여 내부 컨트롤 유전자와 타겟 DNA를 1차적으로 선형 증폭한 다음, 타겟 DNA와 상보적인 서열에 상보적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드, 타겟 DNA 서열에 상보적으로 혼성화 할 수 있는 프로브 및 유니버셜 프라이머를 이용하여 실시간 PCR을 통하여 메틸화 DNA를 분석하였다. 그 결과, 본 발명의 방법이 기존 방법에 비해 높은 민감도와 정확도를 가지고, 메틸화 DNA를 검출할 수 있음을 확인하였다.
구체적으로, 정상인 유래 대변 DNA와 각 단계별 대장암 환자 유래 대변 DNA에 바이설파이트(bisulfite)를 처리하여 비메틸화된 시토신은 유라실로 모두 변화시킨 다음, 메틸화된 SDC2(타겟 DNA) 또는 COL2A1(내부 컨트롤)에 각각 특이적으로 결합하고, 유니버셜 프라이머가 융합된 타겟 DNA와 상보적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 선형 증폭한 뒤, 각 타겟 DNA와 혼성화 할 수 있는 특이적 프로브, 타겟 DNA와 상보적인 서열에 상보적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 및 유니버셜 프라이머를 이용하여 실시간 PCR을 수행하였다(도 1). 그 결과, 유니버셜 프라이머를 포함하지 않은 프라이머를 사용한 기존의 qMSP(quantitative methylation specific PCR)에 비하여 높은 민감도와 정확도로 메틸화 DNA를 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다 (도 2 및 도 4).
본 발명에서 단계 (a)는 메틸화된 DNA 부위와 비메틸화된 DNA 부위를 서로 다르게 변형시키는 하나 이상의 시약으로 타겟 DNA가 포함되어 있는 샘플을 처리하는 단계이다.
본 발명의 "메틸화"는 사이토신(cytocine) 염기환의 5번째 탄소에 메틸기가 붙어 5-메틸사이토신(5-mC)으로 변형된 것을 의미하며, 5-메틸사이토신은 항상 CG 다이뉴클레오타이드의 C에만 오며(5'-mCG-3'), 이러한 CG를 흔히 CpG라고 표시한다. 이러한 CpG의 메틸화는 알루(alu)나 전이인자(transposon)와 같이 게놈내에 반복되는 염기서열이 발현되지 못하도록 억제하며, 포유류 세포에서 유전자외 변화가 가장 흔히 나타나는 부위이다. 이러한 CpG의 5-mC는 자연히 탈아미노화되어 T로 바뀌며, 이에 따라 포유류 게놈내 CpG는 정상적으로 나타나야 할 빈도 (1/4 × 1/4 = 6.25%)보다 훨씬 낮은 1%의 빈도만을 나타낸다.
CpG 중에 예외적으로 밀집되어 나타나는 것들이 있으며, 이를 CpG 섬이라고 한다. CpG 섬은 길이가 0.2~3kb이고, C 및 G염기의 분포백분율이 50%를 넘으며, CpG의 분포백분율이 3.75%이상으로 높게 집중되어 나타나는 부위를 가리킨다. CpG 섬은 전체 인체 유전체에 약 45,000개가 나타나며, 특히 유전자의 발현을 조절하는 프로모터 부위에 집중되어 나타난다. 실제로 인체 유전자 중 약 절반을 차지하는 중요 유전자(housekeeping genes)의 프로모터에는 CpG 섬이 나타난다.
상기 타겟 DNA 중 CpG 메틸화의 존재가 질병의 지표일 수 있으며, 예를 들어 타겟 DNA의 프로모터, 5' 비번역 영역 및 인트론 중 어느 한 부위의 CpG 메틸화를 측정할 수 있다.
CpG-함유 유전자는 통상적으로 DNA이다. 그러나, 본 발명의 방법은 예를 들면, DNA 또는 DNA와 mRNA를 포함하는 RNA를 함유하는 시료를 적용할 수 있고, 여기서 DNA 또는 RNA는 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있으며, 또는 DNA-RNA 하이브리드를 함유한 시료인 것을 특징으로 할 수 있다.
핵산 혼합물 또한 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 “다중”은 일종의 유전자 내 검출될 특이적인 핵산 서열 부위가 복수개인 경우와 하나의 튜브 (단일 반응기) 내 복수의 타겟 DNA를 포함하는 경우를 모두 포함하는 것이다. 검출될 특이적인 핵산 서열은 큰 분자의 분획일 수 있고, 처음부터 특이 서열이 전체 핵산 서열을 구성하는 분리된 분자 형태로 존재할 수 있다. 상기 핵산 서열은 순수한 형태로 존재하는 핵산일 필요는 없으며, 핵산은 전체 인간 DNA가 포함되어 있는 것과 같이 복잡한 혼합물 내의 적은 분획일 수도 있다.
구체적으로, 본 발명은 단일 반응기 내 샘플 중 복수의 타겟 DNA의 메틸화를 검출하기 위한 것으로, 상기 샘플은 복수의 다중 타겟 DNA를 포함할 수 있으며, 타겟 DNA는 대조군 유전자 뿐 아니라, 비정상적으로 메틸화되어 발현이 억제될 억제될 경우, 암의 발생 또는 진행에 영향을 주는 유전자라면 제한없이 이용 가능하다.
본 발명에 있어서, 상기 샘플은 인체로부터 유래한 것을 특징으로 할 수 있고, 예를 들어 간암, 교세포종, 난소암, 대장암, 두경부암, 방광암, 신장세포암, 위암, 유방암, 전이암, 전립선암, 췌장암 또는 폐암 환자 유래일 수 있으며, 상기 샘플은 고체 또는 액체 조직, 세포, 대변, 소변, 혈액, 혈청 또는 플라즈마를 사용할 수 있다.
상기 메틸화된 DNA와 비메틸화된 DNA를 서로 다르게 변형시키는 하나 이상의 시약은 비메틸화된 사이토신 염기와 메틸화된 사이토신 염기를 구별할 수 있는 것이면 제한없이 사용 가능하나, 예를 들어 바이설파이트, 하이드로젠 설파이트, 다이설파이트 및 이들의 조합일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 구체적으로, 상기 시약에 의하여 메틸화된 사이토신 염기는 변환되지 않고, 비메틸화된 사이토신 염기는 우라실 또는 사이토신 이외의 염기로 변환될 수 있다.
본 발명에서 단계 (b)는 상기 시약으로 처리된 타겟 DNA 서열에 상보적으로 결합할 수 있도록 디자인된 타겟 특이적 서열 및 타겟 DNA에 상보적으로 결합하지 않는 유니버셜 프라이머를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 제작하는 단계이다.
일반 다중 PCR은 검출하고자 하는 타겟 (target) 숫자만큼 정방향 및 역방향 프라이머를 쌍으로 만들어서 동시에 사용해야 하는데 비해, 본 발명의 방법은 여러 개의 다중 메틸화 DNA를 동시에 검출하는 실시간 PCR 과정에서 유니버셜 프라이머에 의해 타겟 DNA 서열에 상보적으로 결합할 수 있는 타겟 특이적 서열 (역방향 프라이머)을 1개만 사용해도 되고, 선형 증폭된 DNA에 상보적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 (정방향 프라이머)만 검출하고자 하는 타겟 숫자만큼 사용하게 됨으로써, 여러 타겟의 메틸화를 동시에 검출하고자 할 때 작은 수의 프라이머만을 사용해도 되기 때문에 PCR의 복잡성 및 PCR 효율의 편차가 감소된다.
상기 타겟 특이적 서열은 타겟 DNA와 상보적으로 결합할 수 있는 서열로, 타겟 DNA의 메틸화 부위에 상보적으로 결합할 수 있는 서열 뿐 아니라, 타겟 DNA의 비메틸화 부위에 상보적으로 결합할 수 있는 서열 역시 선택적으로 사용될 수 있다.
상기 타겟 특이적 서열은 예를 들어, 하나 이상의 CpG 다이뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 타겟 특이적 서열은 예를 들어, 서열번호 2, 5, 9, 14, 17, 21 및 26으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 서열과 50% 이상의 상동성을 가지는 서열, 예를 들어, 55% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상의 상동성을 가지는 서열을 포함할 수 있다.
상기 유니버셜 프라이머는 타겟 DNA 서열에 상보적으로 결합할 수 있는 타겟 특이적 서열 (역방향 프라이머) 또는 선형 증폭된 DNA에 상보적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 (정방향 프라이머) 중 어느 하나, 또는 역방향 프라이머 및 정방향 프라이머 둘 다에 연결되어 사용될 수 있다.
상기 유니버셜 프라이머는 타겟 DNA와 상관없이 증폭 가능한 타겟 DNA에 상보적으로 결합하지 않는 염기서열이면 제한없이 이용 가능하나, 예를 들어 인간 유전체에 존재하지 않는 염기서열을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 유니버셜 프라이머는 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 서열과 50% 이상의 상동성을 가지는 서열, 예를 들어, 55% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상의 상동성을 가지는 서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 유니버셜 서열은 T7, SP6, M13 등의 서열을 포함할 수 있으며, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 상기 유니버셜 서열은 예를 들어 서열번호 35 내지 서열번호 41로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 상기 유니버셜 서열은 예를 들어 5'-TAATACGACTCACTATAGG-3' (서열번호 35)의 T7 서열, 5'-TATTTAGGTGACACTATAG-3’ (서열번호 36)의 SP6 서열, 또는 5'-GTAAAACGACGGCCAG-3'(서열번호 37: -20F), 5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3'(서열번호 38: -40F), 5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3' (서열번호 39: -47F), 5'-GAAACAGCTATGACCATG-3' (서열번호 40: R) 또는 5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3' (서열번호 41: -48R)의 M13 서열일 수 있다.
본 발명은 (c) 상기 (b) 단계에서 제작된 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 사용하여 상기 (a) 단계에서 시약으로 처리된 타겟 DNA를 주형으로 하여 한쪽 방향으로 (asymmetric) 선형 증폭하는 단계를 포함한다.
상기 (c) 단계를 통해 실시간 PCR 과정에서 바이설파이트 처리된 DNA를 바로 사용하지 않고, 선형 증폭된 DNA를 사용하였기 때문에 검출률 및 검출 민감도가 탁월하다(도 2, 도 4).
본 발명에서는 메틸화된 타겟 DNA만을 일방으로 선형 증폭하며, 이를 통해 풍부화 (enrichment)가 일어난다. 하나의 실시예에서, 타겟 특이적 서열의 5’말단에 유니버셜 프라이머가 결합된 구조를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 사용하고, 단일방향 PCR (unidirectional PCR)을 통해 메틸화된 타겟 DNA를 풍부화하기 위한 선형 증폭을 수행할 수 있다.
상기 선형 증폭은 이중가닥의 변형(denaturation), 프라이머와 어닐링 및 핵산 합성을 포함하는 증폭 싸이클의 수에 대하여 증폭 산물이 선형적으로 생산됨을 의미하고, 증폭 싸이클 수에 대하여 증폭 산물을 대수적 (exponential)으로 생산하는 연쇄 반응 (PCR)과 구별된다.
본 발명은 다음으로, (d) 상기 (c) 단계에서 선형 증폭된 DNA에 상보적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 및 유니버셜 프라이머를 사용하여 타겟 DNA를 증폭하는 단계를 포함한다.
경우에 따라서, 상기 (d) 단계에서 자가 리포팅 (self-reporting) 기능을 가지거나 또는 에너지 전이 표지된 프라이머 (energy transfer labeled primer)를 사용하여 타겟 DNA의 메틸화를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 “자가 리포팅”은 종종 “에너지 전이 표지 (energy transfer label)”로도 명명되며, 본 명세서에서 혼용하여 사용될 수 있다. 본 명세서에서 자가 리포팅 (self-reporting) 기능을 지닌 유니버셜 프라이머는 에너지 전이 표지 프라이머 (energy transfer labeled primer)와 혼용될 수 있다.
자가 리포팅 (self-reporting) 기능 또는 에너지 전이 표지 기능은 증폭이 일어나지 않는 단계에서는 자가 퀜칭 (self-quenching)에 의해 형광을 발하지 않지만 증폭이 일어나면 퀜칭이 해제되어 형광을 발하는 자가 퀜칭 또는 자가 프로빙 (self-probing)할 수 있도록 하는 것을 의미한다 (Nazarenko IA et al., Nulceic Acid Res, 1997, 25(12):2516-2521; Whitcombe D et al., Nat Biotechnol, 1999, 17(8):804-807; Myakishev MV et al., Genome Res, 2001, 11:163-169; Nazarenko IA et al., Nucleic Acid Res, 2002, 30(9):2089-2195; Bengra C et al., Clin Chem, 2002, 48(12):2131-2140; Murray JL et al., J Mol Diag, 2014, 16(6):627-638; Gao L et al., Mol Cell Probes, 2015, 29(6):438-441). 자가 리포팅 기능을 가지는 물질 또는 에너지 전이 표지 기능을 가지는 물질로는 택맨 (TaqMan) 프로브, 플루오로포어 (fluorophore) 또는 분자 비콘 (Molecular beacon) 등이 해당될 수 있으며, 이에 제한되지는 않는다.
하나의 실시예에서, 상기 선형 증폭된 DNA에 상보적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 (정방향 프라이머)는 단계 (c)에서 제작된 타겟 DNA와 상보적으로 결합하여 증폭할 수 있는 서열로, 예를 들어 하나 이상의 CpG 다이뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 올리고뉴클레오타이드는 예를 들어 서열번호 1, 4, 8, 10-13, 15, 16, 18-20, 22-25, 27 및 28로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 서열과 50% 이상의 상동성을 가지는 서열, 예를 들어, 55% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상의 상동성을 가지는 서열을 포함할 수 있다.
상기 유니버셜 프라이머에 대한 설명은 앞서 언급된 단계 (b)에서와 동일하게 적용된다.
본 발명은 상기 (d) 단계에서 증폭된 타겟 DNA 서열에 상보적으로 혼성화 할 수 있는 프로브를 이용하여 타겟 DNA의 메틸화를 검출하는 (e) 단계를 포함한다.
하나의 실시예에서, 상기 메틸화 검출은 PCR, 메틸화 특이 PCR (methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이 PCR (real time methylation specific PCR), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 메틸화 DNA 특이적 결합 항체를 이용한 PCR, 정량 PCR, 유전자 칩, 시퀀싱, 시퀀싱 바이 신세시스 및 시퀀싱 바이 라이게이션으로 구성된 군에서 선택되는 방법에 의하여 수행될 수 있다.
(1) 메틸화 특이 PCR (methylation specific PCR): 상기 메틸화 특이 PCR로 검출하는 경우, 바이설파이트를 처리하면 5'-CpG'-3 부위의 시토신이 메틸화된 경우에는 그대로 시토신으로 남아 있고, 비메틸화된 경우에는 우라실로 변하게 된다. 따라서, 바이설파이트 처리 후 변환된 염기서열을 대상으로 5'-CpG-3' 염기서열이 존재하는 부위에 해당하는 프라이머를 제작할 수 있다. 프라이머를 이용하여 PCR을 하면 메틸화된 경우에는 메틸화된 염기서열에 해당되는 프라이머를 사용한 것에서 PCR 산물이 만들어지게 되고, 아가로즈겔 전기영동방법으로 메틸화 여부를 확인할 수 있다. 여기서, 상기 메틸화 검출 프로브는 TaqMan, Molecular Beacon, 자가 리포팅 (self-reporting) 기능을 가지거나 또는 에너지 전이 표지 기능을 가지는 프로브일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
(2) 실시간 메틸화 특이 PCR (real time methylation specific PCR): 상기 실시간 메틸화 특이 PCR은 메틸화 특이 PCR 방법을 실시간 측정방법으로 전환한 것으로, 지노믹 DNA에 바이설파이트를 처리한 후, 메틸화된 경우에 해당하는 PCR 프라이머를 디자인하고, 이들 프라이머를 이용하여 실시간 PCR을 수행하는 것이다. 이때, 증폭된 염기서열과 상보적인 TaqMan 프로브를 이용하여 검출하는 방법과 Sybergreen을 이용하여 검출하는 두 가지 방법이 있다. 따라서, 실시간 메틸화 특이 PCR은 메틸화된 DNA만을 선택적으로 정량 분석할 수 있다. 이때, in vitro 메틸화 DNA 샘플을 이용하여 표준곡선을 작성하고, 표준화를 위하여 염기 서열 내에 5'-CpG-3' 서열이 없는 유전자를 음성 대조군으로 함께 증폭하여 메틸화 정도를 정량 분석할 수 있다.
(3) 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR 또는 정량 PCR 및 DNA 칩: 상기 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR 또는 DNA 칩 방법은 메틸화 DNA에만 특이적으로 결합하는 단백질을 DNA와 섞어주게 되면, 메틸화 DNA에만 특이적으로 단백질이 결합하기 때문에 메틸화 DNA만을 선택적으로 분리할 수 있다.
또한, 정량 PCR 방법으로도 메틸화 여부를 측정할 수 있으며, 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질로 분리한 메틸화 DNA는 형광 염료로 표지하여 상보적인 프로브가 집적된 DNA칩에 하이브리디제이션시킴으로써 메틸화 여부를 측정할 수 있다.
(4) 차별적 메틸화의 검출-바이설파이트 시퀀싱 방법: 메틸화 CpG를 함유한 핵산을 검출하는 다른 방법은 핵산을 함유한 시료를 비메틸화 시토신을 변형시키는 제제와 접촉시키는 단계 및 CpG-특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 시료의 CpG-함유 핵산을 증폭시키는 단계를 포함한다. 여기서, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머는 변형된 메틸화 및 비메틸화 핵산을 구별하여 메틸화 핵산을 검출하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 증폭 단계는 선택적이고, 바람직하지만 필수적인 것은 아니다. 상기 방법은 변형된(예를 들면, 화학적으로 변형된) 메틸화 및 비메틸화 DNA를 구별하는 PCR 반응에 의존하는 것이다.
(5) 바이설파이트 시퀀싱 방법: 메틸화 CpG를 함유한 핵산을 검출하는 다른 방법은 핵산을 함유한 시료를 비메틸화 시토신을 변형시키는 제제와 접촉시키는 단계 및 메틸화-비의존적 (Methylation independent) 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 시료의 CpG-함유 핵산을 증폭시키는 단계를 포함한다. 여기서, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머는 변형된 메틸화 및 비메틸화 핵산을 구별하지 않고 핵산을 증폭하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 증폭된 산물을 시퀀싱 프라이머를 이용하여 Sanger 방법으로 시퀀싱하거나 차세대 시퀀싱 (next generation sequencing) 방법으로 메틸화 핵산의 검출을 위한 바이설파이트 (bisulfite) 시퀀싱과 연관하여 기재되어 있다.
(6) 여기서 차세대 시퀀싱 방법은 Sequencing by synthesis와 Sequencing by ligation 방법으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이 방법의 특징은 bacterial clone을 만드는 대신 단일 DNA 단편을 공간적으로 분리하여 in situ로 증폭하고 (clonal amplification), 시퀀싱을 해낸다는 것이다. 이때, 수십 만개의 단편을 동시에 읽어내기 때문에 매시브 페러럴 시퀀싱(massively parallel sequencing) 방법으로 불리기도 한다.
기본적으로는 시퀀싱 바이 신세시스(sequencing by synthesis) 방법이며, 모노 혹은 디뉴클레오티드를 순차적으로 붙여가면서 시그널을 얻는 방법을 사용하는데 파이로시퀀싱, ion torrent, Solexa 방법들이 여기에 해당한다.
시퀀싱 바이 신세시스에 기반하는 NGS 장비로는 로슈(Roche)사의 454 플랫폼, 일루미나(Illumina)사의 HiSeq 플랫폼, 라이프테크놀로지(Life Technology)사의 Ion PGM 플랫폼, 마지막으로 퍼시픽바이오사이언스(Pacific BioSciences)상의 PacBio 플랫폼이 있다. 454와 Ion PGM은 클로날증폭(clonal amplification)방법으로 emersion PCR을 사용하며, HiSeq은 브릿지 증폭(Bridge amplification)을 사용한다. 시퀀싱 바이 신세시스 방법은 한 개의 뉴클레오티드를 순차적으로 붙여가며 DNA를 합성시켜 나갈 때 발생되는 인산(phosphate), 수소이온, 혹은 미리 붙여 놓은 형광을 검출하여 서열을 읽어 나간다. 서열을 검출하는 방법에 있어, 454는 인산을 이용하는 파이로시퀀싱(pyroseqeuncing) 방법을 사용하며, Ion PGM은 수소이온 검출을 이용한다. HiSeq과 PacBio는 형광을 검출하여 서열을 해독한다.
시퀀싱 바이 라이게이션(Sequencing by ligation)은 DNA ligase를 이용하는 시퀀싱 기술로 DNA 염기서열에 존재하는 특정위치의 뉴클레오티드를 확인하는 기술이다. 대부분의 시퀀싱 기술이 중합효소를 사용하는 것과 달리 중합효소를 사용하지 않으며 DNA ligase가 미스매치 서열을 ligation하지 않는 특징을 이용한다. SOLiD 시스템이 여기에 해당한다. 이 기법에서는 간격을 두면서 두 개씩 염기를 읽는데, 프라이머 리셋(primer reset)을 통해 독립적으로 다섯 번을 반복하기 때문에, 최종적으로는 각 염기를 두 번씩 중복하여 읽어서 정확도를 높인다.
시퀀싱 바이 라이게이션(Sequencing by ligation)의 경우, 16개 조합으로 만들어진 디뉴클레오티드 프라이머 셋트 중, 해당 염기서열에 대응되는 디뉴클레오티드 프라이머가 순차적으로 라이게이션되며, 이 라이게이션들의 조합을 최종적으로 분석하여 해당 DNA의 염기서열이 완성된다.
여기서 차세대 시퀀싱 방법은 시퀀싱 바이 신테시스 (Sequencing by synthesis) 또는 시퀀싱 바이 라이게이션 (Sequencing by ligation) 방법으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다. 여기서 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질은 MBD2bt에 제한되지 않으며, 항체는 5'-메틸-시토신 (5'-methyl-cytosine) 항체로 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 프라이머와 관련하여, 상기 단계 (a)에 따라 시약 예를 들어, 바이설파이트를 처리하면 5'-CpG'-3 부위의 시토신이 메틸화된 경우에는 그대로 시토신으로 남아 있고, 비메틸화된 경우에는 우라실로 변하게 된다. 따라서, 시약 예를 들어, 바이설파이트 처리 후 변환된 염기서열을 대상으로 5'-CpG-3' 염기서열이 존재하는 부위에 해당하는 프라이머를 제작할 수 있다.
상기 프라이머는 타겟 DNA 중 증폭될 로커스의 각 가닥과 "대체적으로" 상보성을 가지도록 제작될 수 있다. 이는 중합반응을 수행하는 조건에서 프라이머가 대응하는 핵산 가닥과 하이브리다이제이션 되기에 충분한 상보성을 가지는 것을 의미한다.
상기 단계 (d)에서 선형 증폭된 DNA에 상보적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 및 유니버셜 프라이머에 의해 증폭된 산물은 타겟 DNA와 혼성화할 수 있는 프로브를 사용하여 메틸화 여부를 검출하고, 상기 프로브는 타겟 DNA와 혼성화하여 메틸화 검출할 수 있는 것이라면 제한없이 사용 가능하나, 예를 들어 하나 이상의 CpG 다이뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 올리고뉴클레오타이드 또는 유니버셜 프라이머에 자가 리포팅 (self-reporting) 기능을 가진 형광물질 또는 에너지 전이 표지 프라이머를 이용하여 검출하는 방법이 있다.
구체적으로, 상기 프로브는 예를 들어 서열번호 3, 6, 29, 30, 31-34로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 서열과 50% 이상의 상동성을 가지는 서열 예를 들어, 55% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상의 상동성을 가지는 서열을 포함할 수 있다.
경우에 따라서, 상기 프로브는 양말단에 리포터(reporter) 또는 소광자(quencher)가 결합되어 있는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2', 4', 5', 7'-tetrachloro-6-carboxy-4, 7-dichlorofluorescein), JOE, CY3 및 CY5로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl으로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 타겟 DNA를 포함하는 샘플에 처리되는 메틸화된 DNA와 비메틸화된 DNA를 서로 다르게 변형시키는 하나 이상의 시약;
상기 시약으로 처리된 타겟 DNA 서열에 상보적으로 결합할 수 있는 타겟 특이적 서열 및 타겟 DNA에 혼성화 하지 않는 유니버셜 프라이머를 포함하는 올리고뉴클레오타이드; 상기 선형 증폭된 DNA에 상보적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 및 유니버셜 프라이머; 및 상기 증폭된 타겟 DNA 서열에 상보적으로 혼성화 할 수 있는 프로브를 포함하는 메틸화 DNA 검출용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 조성물은 메틸화된 DNA와 비메틸화된 DNA를 서로 다르게 변형시키는 하나 이상의 시약 처리 및 시약으로 처리된 타겟 DNA를 증폭하는 타겟 DNA 서열에 상보적으로 결합할 수 있는 타겟 특이적 서열 및 타겟 DNA에 혼성화 하지 않는 유니버셜 프라이머를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 선형 증폭 및 선형 증폭된 DNA에 상보적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드, 유니버셜 프라이머 및 프로브를 사용하여 메틸화 DNA를 검출하는 것을 포함하며, 앞서 설명된 구성과 중첩되므로, 이에 대한 설명은 동일하게 적용된다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 조성물을 포함하는 타겟 DNA의 메틸화 검출용 키트에 관한 것이다.
하나의 실시예에서, 상기 키트는 샘플을 담는 구획된 캐리어 수단, 시약을 포함하는 용기, 타겟 DNA 5'-CpG-3'를 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 용기 및 상기 증폭 산물을 검출하기 위한 프로브를 포함하는 용기를 포함할 수 있다.
상기 캐리어 수단은 병, 튜브와 같은 하나 이상의 용기를 함유하기에 적합하고, 각 용기는 본 발명의 방법에 사용되는 독립적 구성요소들을 함유한다. 본 발명의 명세서에서, 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자는 용기 중의 필요한 제제를 손쉽게 분배할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 세포주 유래 메틸화 DNA를 이용한 검출한계 도출
인간 대장암 세포주인 HCT116, SW480 및 HT-29 세포주는 한국 세포주 은행(서울, 한국)에서 구입하였고, 10% 우태아혈청 (JBI, Seoul, South Korea), 페니실린 및 스트렙토마이신이 포함된 RPMI 1640 배지(JBI, Seoul, South Korea)와 37℃, 5% 이산화탄소 배양기에서 배양하였다.
QiaAmp DNA Mini kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 지노믹 DNA를 추출하였고, EZ DNA Methylation-Gold kit(ZYMO Research, Irvine, USA)를 이용하여 소듐 바이설파이트 (sodium bisulfite)를 처리하였다. 요약하자면, 바이설파이트를 65℃에서 2.5시간 동안 처리한 다음, 20분간 상온에 방치하여 술폰화 탈반응 (desulfonation)을 수행한 다음, Zymo-Spin IC 컬럼 (Zymo Research, Irvine, USA)에 결합시킨 뒤, 10μl의 증류수로 추출하여 20℃에 보관하였다.
본 발명의 방법에 대한 검출한계를 도출하고, LTE 과정을 포함하지 않은 meSDC2-qMSP 분석법과 비교하기 위하여, HCT116 세포주 유래 메틸화 DNA를 200-10pg 단위로 분주한 다음, Illustra GenomiPhi V2 DNA Amplification Kit (GE Healthcare, Cleveland, USA)를 이용하여 증폭한 비메틸화 인간 백혈구 지노믹 DNA(BioChain Insititute Inc., Hayward, CA)로 20ng과 혼합하여 단계적으로 희석하였다.
이후, 서열번호 2의 SDC2 특이적 서열과 결합된 서열번호 7의 유니버셜 프라이머를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 및 서열번호 5의 COL2A1 특이적 서열과 결합된 서열번호 7의 유니버셜 프라이머를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 이용하여 95℃ 5분; 95℃15초, 60℃ 1분, 35 사이클로 선형 증폭한 다음, 서열번호 3의 프로브; 서열번호 1의 선형 증폭된 DNA에 상보적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드; 서열번호 6의 프로브; 서열번호 4의 선형 증폭된 DNA에 상보적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드; 및 서열번호 7의 유니버셜 프라이머를 이용하여 95℃ 5분; 95℃ 15초, 60℃ 1분, 40 사이클로 실시간 PCR을 수행하였다 (24회 반복 실험) (표 1 및 도 1). 이후 Ct(cycle threshold) 값을 Rotor Gene Q 소프트웨어로 분석하였다.
Figure PCTKR2017010907-appb-T000001
Figure PCTKR2017010907-appb-I000001
밑줄: CpG 다이뉴클레오타이드. 기울임체: 유니버셜 프라이머
I: inosine nucleotide
* 서열번호 2 및 서열번호 5의 서열 각각은 SDC2 및 COL2A1 타겟 특이적 서열로 서열번호 7의 유니버셜 서열을 제외한 나머지 서열에 해당하며, 타겟 특이적 서열 및 타겟 DNA에 혼성화 하지 않는 유니버셜 프라이머를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 사용함.
그 결과, 기존의 방법은 200pg의 DNA에서는 100% 검출률을 나타내나, 20pg에서는 37.5% 및 10pg에서는 0%의 검출률을 나타내는 반면, 본 발명의 방법은 200pg-20pg 까지는 모두 100%의 검출률을 나타내고, 10pg에서도 33.3%의 검출률을 나타내는 것을 확인하였다(도 2 및 표 2).
Figure PCTKR2017010907-appb-T000002
실시예 2: LTE-qMSP와 qMSP 비교
SDC2 유전자의 대장암 진단능력을 평가하기 위하여 SDC2 유전자의 CpG섬 전체를 대변할 수 있는 18 세트의 메틸화 특이적 검출 프라이머 및 프로브를 설계하고 (표 3), LTE-qMSP를 수행하였다. 이를 위하여 정상인 25명 및 대장암 환자 25명의 대변으로부터 게놈 DNA를 분리 (QIAamp DNA Stool Mini kit, Qiagen)하고 상기 게놈 DNA에 EZ DNA methylation-Gold kit (Zymo Research, USA)를 이용하여 바이설파이트를 처리한 다음, 멸균 증류수 10 ㎕로 용출하여 LTE-qMSP (Linear Target Enrichment-Methylation-specific real time PCR)에 사용하였다. 바이설파이트로 처리된 게놈 DNA를 주형으로 하여 표 3에서 설계한 메틸화 타겟 특이적 서열 (R)를 사용하여 한쪽 방향으로 선형 증폭 (LTE)을 수행하였다 (도 3). LTE 반응은 Rotor-Gene Q PCR 장비 (Qiagen)를 사용하여 총 20 ㎕ PCR 반응 용액 (주형 DNA, 10 ㎕; 5X AptaTaq DNA Master (Roche Diagnostics), 4 ㎕; COL2A1 타겟 특이적 서열, 1 ㎕ (1 pmole); SDC2 타겟 특이적 서열, 1 ㎕ (1 pmole); D.W. 4 ㎕)을 준비하고 PCR 조건은 95℃, 5분 처리한 후 95℃에서 15초, 60℃에서 1분으로 총 35회 수행하였다.
qMSP는 Rotor-Gene Q PCR 장비 (Qiagen)를 이용하였다. 총 40 ㎕ PCR 반응 용액 (1차 LTE 산물 20 ㎕; 5X AptaTaq DNA Master (Roche Diagnostics) 8 ㎕; DNA에 상보적으로 결합할 수 있는 PCR 프라이머 1 ㎕ (10 pmole); SDC2에 상보적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 1 ㎕ (10 pmole); COL2A1에 상보적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 1 ㎕ (5 pmole); 유니버셜 프라이머 (서열번호 7) 1 ㎕ (10 pmole); SDC2 TaqMan 프로브, 1 ㎕ (5 pmole); COL2A1 TaqMan 프로브, 1 ㎕ (2.5 pmole); D.W. 6 ㎕)을 준비하고 PCR 조건은 95℃, 5분 처리한 후 95℃에서 15초, 적절한 어닐링 온도 (58℃~61℃)에서 1분으로 총 40회 수행하였다. PCR 산물의 증폭여부는 cycle threshold (Ct) 값을 측정하여 확인하였다. 메틸화 및 비메틸화 대조 DNA는 EpiTect PCR 대조 DNA 세트 (Qiagen, cat. no. 59695)를 사용하여 샘플 DNA와 함께 시험하였다. 내부 대조 유전자로는 COL2A1 유전자 (Kristensen et al., 2008)를 사용하였다.
Figure PCTKR2017010907-appb-T000003
Figure PCTKR2017010907-appb-I000002
Figure PCTKR2017010907-appb-I000003
Figure PCTKR2017010907-appb-I000004
* 기울임체: 유니버설 서열 (서열번호 7)
* R1 내지 R6의 서열은 타겟 특이적 서열로 서열번호 7의 유니버셜 서열을 제외한 나머지 서열에 해당함.
* F1 내지 F17은 선형 증폭된 타겟 DNA에 상보적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드에 해당함
A. 세트 6에 대한 LTE-qMSP와 qMSP 비교 결과
실시예 1에 기술된 방법으로 세트 6의 LTE-qMSP 방법과 qMSP 방법의 검출 민감도를 비교하였다. 그 결과, 기존의 방법은 200pg의 DNA에서는 100% 검출률을 나타내나, 20pg에서는 37.5% 및 10pg에서는 0%의 검출률을 나타내는 반면, 본 발명의 방법은 200pg-20pg 까지는 모두 100%의 검출률을 나타내고, 10pg에서도 33.3%의 검출률을 나타내는 것을 확인하였다 (도 4a 및 표 4).
Figure PCTKR2017010907-appb-T000004
B. 세트 17 LTE-qMSP와 qMSP 비교 결과
실시예 1에 기술된 방법으로 세트 17의 LTE-qMSP 방법과 qMSP 방법의 검출민감도를 비교하였다. 그 결과, qMSP 방법은 200pg의 DNA에서는 100% 검출률을 나타내나, 20pg에서는 45.0% 및 10pg에서는 0%의 검출률을 나타내는 반면, 본 발명의 방법은 200pg-100pg 까지는 모두 100%의 검출률을 나타내고, 20pg에서 91.7% 그리고 10pg에서도 29.2%의 검출률을 나타내는 것을 확인하였다(도 4b 및 표 5).
Figure PCTKR2017010907-appb-T000005
실시예 3: 대변에서 LTE-qMSP를 이용한 SDC2 유전자 대장암 진단능력 평가
실시예 2 표 3의 각 샘플의 메틸화 정도는 Ct 값으로 측정하였으며, ROC curve 분석 (MedCalc 프로그램, 벨기에)을 통하여 각 프라이머 및 프로브 세트의 민감도 및 특이도를 계산하였다 (표 6).
정상인 및 대장암 환자의 대변 DNA를 이용한 SDC2 유전자 메틸화 검증결과, 대장암 진단에 대한 민감도는 76% (19/25) ~ 88.0% (22/25) 그리고 특이도는 88.0% (3/25) ~ 100% (0/25)로 우수함을 확인하였다. 따라서, SDC2 유전자 메틸화를 이용하여 대장암 진단의 유용성이 높음을 확인하였다.
Figure PCTKR2017010907-appb-T000006
LTE-qMSP 방법의 메틸화 다중 검출 능력을 재확인하기 위하여 상기 Set 1과 Set 12를 조합하여 하나의 튜브에서 대변 DNA를 이용한 대장암 진단능력을 평가하였다.
Figure PCTKR2017010907-appb-T000007
Set 1과 Set 12를 조합하여 임상 검증을 수행한 결과, 민감도는 88% 그리고 특이도는 92%로 매우 우수하였다. 따라서 하나의 튜브에서 여러 개의 메틸화 표적을 동시에 증폭하는 LTE-qMSP 방법을 이용한 메틸화 검출이 가능함을 재확인 하였다.
본 발명에 따른 메틸화 DNA를 검출하는 방법은 유니버셜 프라이머를 사용하기 때문에, 샘플에 포함된 다양한 종류의 유전자에도 불구하고, 하나의 프라이머만을 추가로 사용하더라도 다중 타겟 DNA의 효율적 증폭이 가능하다. 또한, 선형 증폭에 의해 메틸화 검출시 사용되는 PCR (실시간 PCR)에서 복잡성이 감소하고, PCR 효율의 편차를 줄일 수 있으므로, 검출 민감도가 탁월하여 유용하다. 또한, 타겟 DNA를 선형 증폭하는 단계 (LTE 단계)에서 메틸화된 타겟 DNA를 보다 높은 특이도로 풍부화 (enrichment)할 수 있는 장점이 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (30)

  1. 다음의 단계를 포함하는 DNA 메틸화 상태를 검출하는 방법:
    (a) 메틸화된 DNA 부위와 비메틸화된 DNA 부위를 서로 다르게 변형시키는 하나 이상의 시약으로 타겟 DNA가 포함되어 있는 샘플을 처리하는 단계;
    (b) 상기 시약으로 처리된 타겟 DNA 서열에 상보적으로 결합할 수 있도록 디자인된 타겟 특이적 서열 및 타겟 DNA에 상보적으로 결합하지 않는 유니버셜 프라이머를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 제작하는 단계;
    (c) 상기 (b) 단계에서 제작된 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 사용하여 상기 (a) 단계에서 시약으로 처리된 타겟 DNA를 주형으로 하여 한쪽 방향으로 (asymmetric) 선형 증폭하는 단계;
    (d) 상기 (c) 단계에서 선형 증폭된 DNA에 상보적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 및 유니버셜 프라이머를 사용하여 타겟 DNA를 증폭하는 단계; 및
    (e) 상기 (d) 단계에서 증폭된 타겟 DNA 서열에 상보적으로 혼성화 할 수 있는 프로브를 이용하여 타겟 DNA의 메틸화를 검출하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 시약은 바이설파이트, 하이드로젠 설파이트, 다이설파이트 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 시약 처리에 의해 적어도 하나의 사이토신 염기가 우라실 또는 사이토신과 상이한 염기로 변환되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 단일 반응기 내 샘플 중 복수의 타겟 DNA의 메틸화를 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 유니버셜 프라이머는 서열번호 7, 35 내지 41로 구성된 군에서 선택된 염기서열로 표시되는 하나 이상의 서열과 50% 이상의 상동성을 가지는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 타겟 특이적 서열은 타겟 DNA의 메틸화 부위 및/또는 비메틸화 부위에 상보적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 타겟 특이적 서열은 하나 이상의 CpG 다이뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 타겟 특이적 서열은 서열번호 2, 5, 9, 14, 17, 21 및 26으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 서열과 50% 이상의 상동성을 가지는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 메틸화 검출은 PCR, 메틸화 특이 PCR (methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이 PCR (real time methylation specific PCR), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 메틸화 DNA 특이적 결합 항체를 이용한 PCR, 정량 PCR, 유전자 칩, 시퀀싱, 시퀀싱 바이 신세시스 및 시퀀싱 바이 라이게이션으로 구성된 군에서 선택되는 방법에 의하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 단계 (d)의 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 CpG 다이뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 단계 (d)의 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 1, 4, 8, 10-13, 15, 16, 18-20, 22-25, 27 및 28로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 서열과 50% 이상의 상동성을 가지는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 단계 (e)의 프로브는 하나 이상의 CpG 다이뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 단계 (e)의 프로브는 서열번호 3, 6, 29, 30, 31-34로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 서열과 50% 이상의 상동성을 가지는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 단계 (e)의 프로브는 리포터(reporter) 또는 소광자(quencher)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드 및 유니버셜 프라이머는 자가 리포팅 (self reporting) 기능을 가지거나, 에너지 전이 표지된 (energy transfer label) 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), JOE, CY3 및 CY5로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제14항에 있어서,
    상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl으로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 타겟 유전자는 SDC2인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 타겟 DNA를 포함하는 샘플에 처리되는 메틸화된 DNA와 비메틸화된 DNA를 서로 다르게 변형시키는 하나 이상의 시약;
    상기 시약으로 처리된 타겟 DNA 서열에 상보적으로 결합할 수 있는 타겟 특이적 서열 및 타겟 DNA에 혼성화 하지 않는 유니버셜 프라이머를 포함하는 올리고뉴클레오타이드;
    선형 증폭된 DNA에 상보적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 및 유니버셜 프라이머; 및
    증폭된 타겟 DNA 서열에 상보적으로 혼성화 할 수 있는 프로브를 포함하는 메틸화 DNA 검출용 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 시약은 바이설파이트, 하이드로젠 설파이트, 다이설파이트 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 조성물.
  21. 제19항에 있어서, 단일 반응기 내 샘플 중 복수의 타겟 DNA의 메틸화를 검출하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  22. 제19항에 있어서, 상기 유니버셜 프라이머는 서열번호 7, 35 내지 41로 구성된 군에서 선택된 염기서열로 표시되는 하나 이상의 서열과 50% 이상의 상동성을 가지는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  23. 제19항에 있어서, 상기 타겟 특이적 서열은 타겟 DNA의 메틸화 부위 및/또는 비메틸화 부위에 상보적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  24. 제19항에 있어서, 상기 타겟 특이적 서열은 하나 이상의 CpG 다이뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  25. 제19항에 있어서, 상기 타겟 특이적 서열은 서열번호 2, 5, 9, 14, 17, 21 및 26로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 서열과 50% 이상의 상동성을 가지는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  26. 제19항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 CpG 다이뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  27. 제19항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 1, 4, 8, 10-13, 15, 16, 18-20, 22-25, 27 및 28로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 서열과 50% 이상의 상동성을 가지는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  28. 제19항에 있어서, 상기 프로브는 하나 이상의 CpG 다이뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  29. 제19항에 있어서, 상기 프로브는 서열번호 3, 6, 29, 30, 31-34로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 서열과 50% 이상의 상동성을 가지는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  30. 제19항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 메틸화 DNA 검출용 키트.
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