WO2018174318A1 - 양기능성 pna 프로브를 이용한 융해곡선 분석방법, 및 이를 이용한 현미부수체 불안정성의 진단방법 및 현미부수체 불안정성 진단용 키트 - Google Patents

양기능성 pna 프로브를 이용한 융해곡선 분석방법, 및 이를 이용한 현미부수체 불안정성의 진단방법 및 현미부수체 불안정성 진단용 키트 Download PDF

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target nucleic
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microsatellite
pna
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이한우
이시석
허덕회
박희경
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주식회사 시선바이오머티리얼스
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    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to a melting curve analysis method using a bifunctional PNA probe, and to a method for diagnosing microsatellite instability and a diagnostic kit for microsatellite instability using the same, and more specifically, to a site where the same base is repeated.
  • Analysis method of the melting curve according to the structure of the fluorescent PNA probe that binds with different binding force according to the number of base mutations deleted using the fluorescent PNA probe capable of binding to, and the same base is repeated by the above analysis method
  • the present invention relates to a diagnostic method capable of quickly and accurately discriminating microsatellite instability by detecting genetic variation of microsatellite markers generated by base deletion of a site and analyzing the number of base variants.
  • Microsatellite refers to a form in which up to six short DNA sequences are arranged in sequence over the entire human gene, which are scattered with different numbers of repetitions on each chromosome.
  • Microsatellite instability is a diversity of lengths that occurs as the short tandem repeat sequence of the microsatellite increases or decreases, indicating a DNA mismatch repair gene; MMR gene is recovered through the recovery process. However, if dysfunctional repair occurs due to germline mutation or promoter methylation of DNA mismatched repair gene, the length of microsatellite changes. The occurrence of gene repair abnormalities can be diagnosed. This MSI was first discovered in patients with hereditary nonpolyposis colorectal cancer (HNPCC) syndrome, and about 90% of patients with hereditary nonpolyposis colorectal cancer have been reported to have this MSI.
  • HNPCC hereditary nonpolyposis colorectal cancer
  • MSI (+) is expressed more than 75% in endometrial cancer most frequently in patients with hereditary non-neoplastic colorectal cancer syndrome, and sporadic colorectal cancer and sporadic endometrium without family history of hereditary non-neoplastic colorectal cancer MSI has also been found in cancer.
  • various cases of MSI (+) in sporadic endometrial cancer have been reported with a frequency of about 10-40%, and 20-24% of sporadic endometrial carcinomas in Korea have recently been reported.
  • MSIs are generally divided into two types according to international standards.
  • NCI National Cancer Institute
  • MCS Microsatellite stable
  • a method for diagnosing MSI a method of diagnosing the length distribution of a product amplified by a polymerase chain reaction by capillary electrophoresis has been generally used.
  • the "Multiplex fluorescence PCR amplification and capillary electrophoresis” method extracts DNA from normal tissues and tumor tissues and amplifies the DNA by fluorescence-labeled polymerase chain reaction targeting five microsatellite markers recommended by the US National Cancer Institute. Then, the most widely known method for diagnosing MSI by analyzing fluorescence represented by fluorescently labeled DNA using capillary electrophoresis.
  • the sensitivity and specificity of the D2S123, D17S250, and D5S346 biomarkers consisting of three dinucleotides, among the five microsatellite markers recommended by the National Institute of Cancer, were identified as BAT25, which consists of two mononucleotides; There is a significant drop compared to BAT26 biomarkers.
  • the MSI test separates normal and cancerous tissues, but in the case of MSI, which has cell-to-cell heterogeneity and has a low rate of 10% or less, The diagnostic method is difficult to test.
  • Bethesda loci (BAT25, BAT26, D2S123, D17S250, By using quasi loci (BAT25, BAT26, NR21, NR24, NR27) selected through a statistical database rather than D5S346), it has higher sensitivity and accuracy than conventional Bethesda loci for MSI analysis (Buhard et al., Disease Markers , 20: 251-7, 2004; Deschoolmeester et al., J Mol Diagn, 10: 154-159, 2008) .
  • quasi loci a mononucleotide repeating marker is required. As a result, a small number of nucleotide deletion assays must be possible for the analysis of the marker.
  • PNA Protein Nucleic Acid
  • a single base mutation of a target nucleic acid and a mutation or deletion due to insertion of bases are effectively analyzed by dissolution curve analysis. Detectable techniques are in the spotlight.
  • PNA has better thermal and biological stability than DNA and its ability to recognize and bind to target DNA.
  • Fusion curve analysis using PNA probes can bind to target DNA faster and stronger than DNA probes. While it can be used to detect single nucleotide sequence mutations that exist adjacent to each other, the fusion curve analysis shows a simple distinction compared to the normal target nucleic acid by comparing the mutations caused by deletion or insertion of single nucleotide variations and bases. There is a limit to that.
  • the PNA probe may play a role of inhibiting the extension of the polymerase when the binding is maintained in the extension of the polymerase during the polymerase chain reaction process.
  • the desired single base mutation has a feature capable of preferential amplification.
  • the present inventors have a melting curve using a PNA probe in which a reporter and a quencher are coupled and a complementary binding temperature with a normal sequence is higher than the extension reaction temperature of the polymerase chain reaction.
  • MSI microsatellite instability
  • Dissolution curve analysis can be used to identify the presence of base deletions with high sensitivity.
  • Present in 5% of the check which is capable of detecting a nucleotide deletion of loci Quasi microscopic cracking body markers of low rate, and to thereby completing the present invention.
  • An object of the present invention is to use a bifunctional peptide nucleic acid (PNA) probe selected from the group consisting of a sequence represented by SEQ ID NOS: 11-23, with a reporter and a quencher
  • PNA peptide nucleic acid
  • the present invention is a reporter (reporter) and quencher (quencher) is combined, PNA (Peptide Nucleic Acid, selected from the group consisting of the sequence represented by SEQ ID NO: 11 to 23 and a sequence complementary thereto)
  • PNA Peptide Nucleic Acid, selected from the group consisting of the sequence represented by SEQ ID NO: 11 to 23 and a sequence complementary thereto
  • MSI microsatellite instability
  • the present invention also relates to a sequence represented by SEQ ID NOs: 11 to 23 in (BAT) BAT25, BAT26, NR21, NR24 or NR27, which is a microsatellite marker included in the target nucleic acid after (a) isolating the target nucleic acid from the sample sample.
  • BAT BAT25, BAT26, NR21, NR24 or NR27
  • a probe selected from the group consisting of complementary sequences to hybridize the PNA probe with the target nucleic acid
  • the present invention also relates to i) a PNA (Peptide Nucleic Acid, peptide nucleic acid) selected from the group consisting of a sequence represented by SEQ ID NOS: 11-23 and a complementary sequence to which a reporter and a quencher are bound ) Probes and ii) SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8; And a primer set selected from the group consisting of a sequence represented by SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10, a kit for diagnosing microsatellite instability (MSI) according to detection of base mutation of target nucleic acid using a melting curve analysis method to provide.
  • MSI microsatellite instability
  • the present invention also provides a PNA (Peptide Nucleic Acid) probe selected from the group consisting of a sequence represented by SEQ ID NOS: 11-23 and complementary to the reporter and quencher
  • a PNA Peptide Nucleic Acid
  • a kit for detecting a malfunction of a gene involved in DNA mismatch repair due to base mutation detection of a microsatellite target nucleic acid Provided is a kit for detecting a malfunction of a gene involved in DNA mismatch repair due to base mutation detection of a microsatellite target nucleic acid.
  • the present invention also provides a PNA (Peptide Nucleic Acid) probe selected from the group consisting of a sequence represented by SEQ ID NOS: 11-23 and complementary to the reporter and quencher It provides a kit for detecting a malfunction of a gene involved in DNA proof (proofreading) according to the base mutation detection of the microsatellite target nucleic acid using.
  • PNA Peptide Nucleic Acid
  • the present invention also provides a PNA (Peptide Nucleic Acid) probe selected from the group consisting of a sequence represented by SEQ ID NOS: 11-23 and complementary to the reporter and quencher It provides a kit for the detection of mutations according to DNA mismatch repair or DNA proofreading function abnormalities using.
  • PNA Peptide Nucleic Acid
  • FIG. 1 shows the target microsatellites (BAT25, BAT26, NR21, NR24, and NR27) and the results of existing analytical techniques.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of high sensitivity analysis of microsatellite deletions using bifunctional PNA probes.
  • Figure 3 is a schematic diagram for explaining the hybridization step for determining whether or not the base deletion of the microsatellite using a fluorescent PNA probe and the step of obtaining the melting curve.
  • Figure 4 is a schematic showing the real-time PCR reaction conditions for determining the deletion of the microsatellite.
  • FIG. 5 shows the results of analyzing the number and genotypes of base variants deleted by a single assay using MSI and MSS cell lines for five microsatellites (BAT25, BAT26, NR21, NR24, and NR27) of Quasi loci. It is shown.
  • FIG. 7 compares the results of colorectal cancer sample analysis using the highly sensitive microsatellite deletion diagnostic kit with conventional analytical techniques, showing microsatellite instability (MSI High).
  • FIG. 8 compares the results of colorectal cancer sample analysis using the high sensitivity microsatellite deletion diagnostic kit with conventional analytical techniques, and shows the microsatellite stability (MSS).
  • FIG. 9 compares the results of gastric cancer sample analysis using the high sensitivity microsatellite deletion diagnostic kit with conventional analytical techniques, and shows the microsatellite instability (MSI High).
  • MSS microsatellite stability
  • the present invention uses a PNA (Peptide Nucleic Acid) probe that combines a reporter and a quencher, and has a microsatellite instability, and enables amplification and melting curves of sensitive markers.
  • PNA Peptide Nucleic Acid
  • the present invention relates to a method for examining microsatellite instability (MSI) with high sensitivity by confirming the presence or absence of microsatellite deletion through analysis.
  • microsatellite markers (NR21, NR24, BAT26, NR27 and BAT25) of Quasi loci were selected as markers for microsatellite instability testing according to the present invention, and a fluorescent PNA probe set for determining whether the markers were deleted was One or more of SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 of NR21 and one or more of SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 of NR24, SEQ ID NO: 17 of BAT26, SEQ ID NO: 18 of SEQ ID NO: 19, And at least one of SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 and at least one of SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 of NR27.
  • a fluorescent PNA probe having bifunctionality was prepared and selected for diagnosis of microsatellite markers (see FIG. 4).
  • the bifunctional PNA probe is a fluorescence conjugated PNA probe that inhibits elongation reaction of the polymerase and maintains fluorescence analysis at the same time when maintaining complete binding with the complementary sequence.
  • the binding temperature with the microsatellite stability (normal) sequence is higher than that of the polymerase extension so that the preferred amplification is possible, and the binding force with the microsatellite marker including the deletion sequence is the polymerase extension reaction. Characterized by lower than the temperature, it was selected using the sequence of SEQ ID NO: 11 to 23 to have this characteristic.
  • the binding force (melting temperature, Tm) between the PNA probe and the microsatellite marker sequence is determined by adjusting the base sequence and length of the probe, As an example, it may be characterized by using a method of lowering the binding force by replacing some sequences and a method of controlling the binding force by using a modification of the backbone of the PNA monomer.
  • the replacement of the sequence may be performed using a base using a base that is not complementary to the target, and may be a natural such as adenine, guanine, cytosine, thymine, uracil, and the like.
  • a base that is not complementary to the target
  • a modification of the backbone of the PNA monomer may be characterized in that it comprises a gamma- or alpha-backbone modified PNA monomer as a method of controlling the binding force, in particular gamma- or alpha-backbone modified peptide nucleic acid monomer is electrically positive Lysine (Lysine, Lys, K), Arginine (Arginine, Arg, R), Histidine (Histidine, His, H), Diamino butyric acid (DAB), Ornithine (Ornithine, Orn) and an amino acid having one or more positive charges selected from the group consisting of amino acid analogues, characterized in that it comprises a gamma- or alpha-backbone modified PNA monomer glutamic acid (Glutamic) that can have a low negative binding force Amino acids such as acid, Glu, E) and aspartic acid (Asp, D) can be included in the backbone, and the binding of PNA such as
  • the present invention is a PNA (Peptide Nucleic Acid, selected from the group consisting of a sequence of the reporter and the quencher, the sequence represented by SEQ ID NOS: 11-23, and complementary thereto).
  • the present invention relates to a melting curve analysis method for diagnosing microsatellite instability (MSI) according to base mutation detection of microsatellite target nucleic acid using a peptide nucleic acid) probe.
  • MSI microsatellite instability
  • the 'base mutation' of the present invention is a mutation that occurs in the base sequence of the target nucleic acid, characterized in that not only single nucleotide polymorphism (SNP), but also includes a mutation occurred by substitution, deletion or insertion of the base
  • the PNA probe of the present invention may be analyzed by melting curve analysis in which mutations occur due to deletion of 2 to 14 bases of the target nucleic acid.
  • the melting curve analysis may be characterized by performing by FMCA (Fluorescence Melting Curve Analysis; fluorescence melting curve analysis) method, the amplification is performed by a real-time PCR (Real-Time Polymerase Chain Reaction) method It may be characterized by.
  • FMCA Fluorescence Melting Curve Analysis; fluorescence melting curve analysis
  • real-time PCR Real-Time Polymerase Chain Reaction
  • Hybridization' of the present invention is meant that complementary single stranded nucleic acids form a double-stranded nucleic acid.
  • Hybridization can occur when the complementarity between two nucleic acid strands is perfect or even when some mismatch base is present.
  • the degree of complementarity required for hybridization may vary depending on the hybridization conditions, and may be particularly controlled by temperature.
  • the fluorescent peptide nucleic acid probe including the reporter and quencher of the present invention hybridizes with the target nucleic acid and generates a fluorescence signal. As the temperature increases, the fluorescent peptide nucleic acid is rapidly fused with the target nucleic acid at an appropriate melting temperature of the probe to quench the fluorescent signal. The presence or absence of base denaturation (SNP, Indel, etc.) of the target nucleic acid can be detected through high resolution Fluorescence Melting Curve Analysis (FMCA) obtained from the fluorescence signal according to the temperature change.
  • FMCA Fluorescence Melting Curve Analysis
  • 'target nucleic acid' of the present invention means a nucleic acid sequence (including SNP) of genotype to be detected / identified, and includes a specific site of the nucleic acid sequence of 'target gene' encoding a protein having physiological and biochemical functions. Annealing or hybridizing with primers or probes under hybridization, annealing or amplification conditions. 'Target nucleic acid' is not different from the terms 'target nucleic acid', 'synthetic DNA' or 'synthetic oligo' as used herein and is used interchangeably herein.
  • the target nucleic acid is DNA or RNA, and the molecule may be a double stranded or single stranded form. If the nucleic acid is double stranded as a starting material, it is preferred to make the two strands single or stranded.
  • Methods known to separate strands include, but are not limited to, heat, alkali, formamide, urea and glycoxal treatment, enzymatic methods (eg helicase action) and binding proteins.
  • strand separation can be accomplished by heat treatment at a temperature of 80-105 ° C. A general method of such treatment is disclosed in Joseph Sambrook et al., Molecular Cloning, 2001.
  • the fluorescent PNA probe of the present invention is preferably designed such that the base mutation position of the target nucleic acid is at the center position of the fluorescent PNA probe for the difference in the melting temperature (Tm) of the target nucleic acid and the target nucleic acid having the base mutation.
  • Tm melting temperature
  • the binding force in the complete hybridization form with the target microsatellite sequence is formed higher than the polymerase extension reaction temperature, and the binding force in the hybridization form having one or more deletions is formed lower than the polymerase extension reaction temperature. It is preferable.
  • the fluorescent PNA probe is analyzed using a hybridization method different from the hydrolysis method of the TaqMan probe, and a probe having a similar role may include a molecular beacon probe, Scorpion probes.
  • the fluorescent PNA probe preferably has a reporter and a quencher at the sock end. That is, in the PNA probe according to the present invention, a reporter and a quencher capable of quenching the reporter fluorescence may be coupled to both ends.
  • the reporter in the group consisting of FAM (6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX (2 ', 4', 5 ', 7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein) and CY5 It may be at least one selected, the quencher may be at least one selected from the group consisting of TAMRA (6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 and Dabcyl, but is not limited thereto, preferably using Dabcyl It features.
  • the PNA probe has a perfect match with the target nucleic acid sequence of the mono-repeat type microsatellite and shows the expected melting temperature (Tm) value, and is incomplete with the target nucleic acid in which the base mutation is present.
  • Hybridization may be characterized by showing a lower melting temperature (Tm) value than expected.
  • microsatellite instability MSI
  • MSS microsatellite stability
  • Table 3 The standard cell lines (MSI) status and microsatellite stability (MSS) status (Table 3) were used to confirm that the deletion of the microsatellite markers can be either single or multiple analysis.
  • Bifunctional PNA probes have a high analytical sensitivity because they inhibit the polymerase chain reaction of normal microsatellite markers and enable the polymerase chain reaction of microsatellite markers with deletions. It confirmed through Example 4 of the present invention. In the above example, sensitivity analysis was performed using artificially prepared low proportion of microsatellite instability samples, and it was confirmed that the analysis of microsatellite instability included at 5% rate that the existing technique (Pentaplex sequencing) could not analyze was possible. It was.
  • the present invention (a) after separating the target nucleic acid from the sample sample, and represented by SEQ ID NO: 11 to 23 in BAT25, BAT26, NR21, NR24 or NR27, which is a microsatellite marker included in the target nucleic acid Mixing a PNA probe with a target nucleic acid by mixing a probe selected from the group consisting of a sequence consisting of and a sequence complementary thereto; (b) melting the hybridized product with varying temperature to obtain a melting curve; And (c) analyzing the obtained fusion curves to detect the presence or absence of base mutations and the number of base mutations of the microsatellite markers included in the target nucleic acid (microsatellite). instability (MSI) diagnostic method.
  • the diagnostic method can determine whether the microsatellite markers (BAT25, BAT26, NR21, NR24, and NR27) of Quasi loci of the target nucleic acid are deleted.
  • the specimen sample may be derived from a specific tissue or organ of an animal including a human.
  • tissues include connective, skin, muscle or neural tissue.
  • Representative examples of the organs include eyes, brain, lungs, liver, spleen, bone marrow, thymus, heart, lymph, blood, bone, cartilage, pancreas, kidney, gallbladder, stomach, small intestine, testicle, ovary, uterus, rectum, nervous system , Glands and internal vessels are included.
  • the sample sample contains any cells, tissues, fluids from biological sources, or any other medium that can be well analyzed by the present invention, which indicates the consumption of humans, animals, humans or animals.
  • Samples obtained from food prepared for the purpose are included.
  • the sample to be analyzed includes a bodily fluid sample, which includes sputum, blood, serum, plasma, lymph, breast milk, urine, feces, ocular fluid, saliva, semen, brain extracts (e.g., brain grinds), spinal fluid, appendix, Spleen and tonsil tissue extracts include, but are not limited to.
  • the PNA probe has a binding force in the complete hybridization form with the target microsatellite sequence higher than the polymerase extension reaction temperature, and the binding force in the hybridization form having one or more deletions is higher than the polymerase extension reaction temperature. It may be characterized by being formed low.
  • the PNA probe is in perfect hybridization with the target nucleic acid sequence to show the expected melting temperature (Tm) value, and incomplete hybridization (mismatch) with the target nucleic acid in which the base mutation is present. It may be characterized by showing a lower melting temperature (Tm) value.
  • the base mutation may be characterized in that the mutation occurs by deleting 2 to 14 bases of the target nucleic acid.
  • the fluorescent PNA probe preferably has a reporter and a quencher at the sock end. That is, in the PNA probe according to the present invention, a reporter and a quencher capable of quenching the reporter fluorescence may be coupled to both ends.
  • the reporter in the group consisting of FAM (6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX (2 ', 4', 5 ', 7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein) and CY5 It may be at least one selected, the quencher may be at least one selected from the group consisting of TAMRA (6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 and Dabcyl, but is not limited thereto, preferably using Dabcyl It features.
  • the method may be characterized by using two or more target nucleic acids and detecting the base mutation of two or more target nucleic acids by varying the reporter labeled on the PNA probe for each target nucleic acid.
  • the method can be used to analyze base variation of multiple target nucleic acids or a single target nucleic acid.
  • a PNA Peptide Nucleic Acid
  • a PNA Peptide Nucleic Acid
  • SEQ ID NOS: 11-23 complementary to the reporter and quencher.
  • Peptide nucleic acid probes and ii) SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8;
  • a primer set selected from the group consisting of a sequence represented by SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10, microsatellite instability (MSI) diagnostic kit according to the detection of the base mutation of the target nucleic acid using the melting curve analysis method It is about.
  • MSI microsatellite instability
  • the PNA probe has a binding force in the complete hybridization form with the target microsatellite sequence higher than the polymerase extension reaction temperature, and the binding force in the hybridization form having one or more deletions is higher than the polymerase extension reaction temperature. It may be characterized by being formed low.
  • the PNA probe is in perfect hybridization with the target nucleic acid sequence to show the expected melting temperature (Tm) value, and incomplete hybridization (mismatch) with the target nucleic acid in which the base mutation is present. It may be characterized by showing a lower melting temperature (Tm) value.
  • the base mutation may be characterized in that the mutation occurs by deleting 2 to 14 bases of the target nucleic acid.
  • the kit may be characterized by using two or more target nucleic acids and detecting a base mutation of two or more target nucleic acids by varying the reporter labeled on the PNA probe for each target nucleic acid.
  • the kit can be used to analyze base variation of multiple target nucleic acids or a single target nucleic acid.
  • the kit since the microsatellite instability (MSI) is caused by a mismatch repair gene and a malfunction of the proofreading gene, the kit is indirectly diagnosed as a mismatch multiple function and a proofreading malfunction. It can be used to diagnose the disease. In addition, the kit can also be used for indirect diagnosis of mutational burdens, as mutation burdens arise as a result of mismatched plural and proofreading gene dysfunctions (Palmieri, Giuseppe et al., J. Transl. Med. 15.1: 17, 2017).
  • the present invention provides a PNA (Peptide Nucleic Acid) selected from the group consisting of a sequence represented by SEQ ID NOS: 11-23 and complementary to the reporter and quencher
  • PNA Peptide Nucleic Acid
  • the present invention relates to a kit for detecting a malfunction of a gene involved in DNA mismatch repair due to base mutation detection of a microsatellite target nucleic acid using a peptide nucleic acid) probe.
  • genes involved in DNA mismatch repair include hMLH1 (human MutL homolog 1), hMSH2 (human MutS homolog 2), hMSH3 (human MutS homolog 3), hMSH6 (human MutS homolog 6), hMLH3 (human MutL homolog 3), PMS1 (PMS1 homolog 1), PMS2 (PMS1 homolog 2), EXO1 (Exonuclease 1), PCNA (Proliferating cell nuclear antigen), RFC (replication factor C), RPA (replication factor A), It is preferably one or more selected from the group consisting of Pol delta and Ligase1 (DNA ligase 1), but is not limited thereto.
  • the present invention provides a PNA (Peptide Nucleic Acid, peptide) selected from the group consisting of a sequence represented by SEQ ID NOS: 11-23 and a complementary sequence to which a reporter and a quencher are coupled
  • PNA Peptide Nucleic Acid, peptide
  • the present invention relates to a kit for detecting a malfunction of a gene involved in DNA proofreading according to base mutation detection of a microsatellite target nucleic acid using a nucleic acid) probe.
  • the gene involved in DNA proofing is preferably one or more selected from the group consisting of DNA polymerase epsilon (POLE) and polymerase delta 1 (POLD1), but is not limited thereto.
  • POLE DNA polymerase epsilon
  • POLD1 polymerase delta 1
  • the present invention provides a PNA (Peptide Nucleic Acid, peptide) selected from the group consisting of a sequence represented by SEQ ID NOS: 11-23 and a complementary sequence to which a reporter and a quencher are coupled
  • PNA Peptide Nucleic Acid, peptide
  • the present invention relates to a kit for detecting a mutation caused by a DNA mismatch repair or DNA proofreading function abnormality using a probe.
  • Kits of the present invention may optionally include reagents necessary to conduct target amplification PCR reactions (eg, PCR reactions) such as buffers, DNA polymerase cofactors and deoxyribonucleotide-5-triphosphates.
  • the kit may also include various polynucleotide molecules, reverse transcriptases, buffers and reagents, and antibodies that inhibit DNA polymerase activity.
  • the kit is an optimal amount of reagent used in a particular reaction, can be readily determined by those skilled in the art having learned the disclosure.
  • the kit can be made in a separate package or compartment containing the aforementioned components.
  • Primers for polymerase chain reaction of the five microsatellite markers of quarsi loci were NR21 (SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2), NR24 (SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4) , BAT26 (SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6), NR27 (SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8), and BAT25 (SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10) were prepared and used (Table 1).
  • bifunctional fluorescent PNA probes having both asymmetric instability (MSI) preferential amplification function and melting temperature analysis function
  • hybridization temperature with microsatellite stable sequence is higher than polymerase extension reaction temperature
  • Hybridization temperature with the asymmetric instability sequence was made lower than the polymerase extension temperature.
  • the fluorescence and quencher were then coupled to the ends of the probe to measure the temperature dropped after hybridization.
  • Each bifunctional fluorescent PNA probe was constructed to include a single base repeat of the microsatellite in the center and 3 to 8 specific sequences at each end to secure specificity (Table 2).
  • MSI microsatellite instability
  • MSS microsatellite stable
  • Real-time polymerase chain reaction conditions were used asymmetric PCR (asymmetric PCR) to generate a single stranded target nucleic acid.
  • the conditions of asymmetric PCR are as follows; 2X EyeBio Real-Time FMCA TM Buffer (SeaSunBio Real-Time FMCA TM Buffer, Eye Bio, Korea), 2.5mM MgCl2, 200 ⁇ M dNTPs, 1.0U Taq polymerase, 0.05 ⁇ M forward primer 1 ⁇ l standard cell line DNA (Table 3) was added to Table 1) and 0.5 ⁇ M reverse primer (Table 1) (asymmetric PCR), followed by real-time PCR, followed by 0.5 ⁇ L fluorescent PNA probe (Table 2). Melting curve analysis was performed by addition. The schematic of the experimental method is shown in Figures 2 and 3, the analysis was carried out under the conditions of FIG.
  • Real-time polymerase chain reaction conditions were used asymmetric PCR (asymmetric PCR) to generate a single stranded target nucleic acid.
  • the conditions of asymmetric PCR are as follows; 2X EyeBio Real-Time FMCA TM Buffer (SeaSunBio Real-Time FMCA TM Buffer, Eye Bio, Korea), 2.5mM MgCl2, 200 ⁇ M dNTPs, 1.0U Taq polymerase, 0.05 ⁇ M forward primer 1 ⁇ l standard cell line DNA (Table 3) was added to Table 1) and 0.5 ⁇ M reverse primer (Table 1) (asymmetric PCR), followed by real-time PCR, followed by 0.5 ⁇ L fluorescent PNA probe (Table 2). Melting curve analysis was performed by addition. Schematic of the experimental method is shown in Figures 2 and 3, the analysis was carried out under the conditions of FIG.
  • Real-time polymerase chain reaction conditions were used asymmetric PCR (asymmetric PCR) to generate a single-stranded target nucleic acid.
  • the conditions of asymmetric PCR are as follows; 2X EyeBio Real-Time FMCA TM Buffer (SeaSunBio Real-Time FMCA TM Buffer, Eye Bio, Korea), 2.5mM MgCl2, 200 ⁇ M dNTPs, 1.0U Taq polymerase, 0.05 ⁇ M forward primer 1 ⁇ l standard cell line DNA (Table 3) was added to Table 1) and 0.5 ⁇ M reverse primer (Table 1) (asymmetric PCR), followed by real-time PCR, followed by 0.5 ⁇ L fluorescent PNA probe (Table 2). Melting curve analysis was performed by addition. The schematic of the experimental method is shown in Figures 2 and 3, the analysis was carried out under the conditions of FIG.
  • the present invention is a diagnostic method and kit for diagnosing microsatellite instability (MSI) according to the analysis of the number of base mutations using a bifunctional PNA probe in which a reporter and a quencher are combined. Determination of the deletion of the microsatellite marker gene using high five quasi loci markers of high quasi loci can be analyzed with high sensitivity, reducing costs and reducing the test time compared to the existing MSI diagnostic method. There is this.
  • MSI microsatellite instability

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Abstract

본 발명은 양기능성 PNA 프로브를 이용한 융해곡선 분석방법, 및 이를 이용한 현미부수체 불안정성의 진단방법 및 현미부수체 불안정성의 진단용 키트에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 같은 염기가 반복되어 있는 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 형광 PNA 프로브를 이용하여 결실된 염기변이의 개수에 따라 각기 다른 결합력으로 결합하는 형광 PNA 프로브의 구조에 따른 융해곡선의 분석방법, 및 상기 분석방법에 의해 같은 염기가 반복되어 있는 부위의 염기 결실에 의해 발생되는 현미부수체 표지자의 유전자 변이를 검출하고, 그에 따른 염기변이의 개수를 분석함으로써 현미부수체 불안정성을 신속, 정확하게 판별할 수 있는 진단방법에 관한 것이다. 본 발명은 민감도와 특이도가 높은 Quasi loci의 5개 현미부수체 표지자를 이용하여 현미부수체 표지자 유전자의 결실여부를 고민감도로 분석할 수 있어, 기존의 MSI 진단방법에 비해 비용의 감소 및 검사 소요시간 단축 등의 장점이 있다.

Description

양기능성 PNA 프로브를 이용한 융해곡선 분석방법, 및 이를 이용한 현미부수체 불안정성의 진단방법 및 현미부수체 불안정성 진단용 키트
본 발명은 양기능성 PNA 프로브를 이용한 융해곡선 분석방법, 및 이를 이용한 현미부수체 불안정성의 진단방법 및 현미부수체 불안정성의 진단용 키트에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 같은 염기가 반복되어 있는 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 형광 PNA 프로브를 이용하여 결실된 염기변이의 개수에 따라 각기 다른 결합력으로 결합하는 형광 PNA 프로브의 구조에 따른 융해곡선의 분석방법, 및 상기 분석방법에 의해 같은 염기가 반복되어 있는 부위의 염기 결실에 의해 발생되는 현미부수체 표지자의 유전자 변이를 검출하고, 그에 따른 염기변이의 개수를 분석함으로써 현미부수체 불안정성을 신속, 정확하게 판별할 수 있는 진단방법에 관한 것이다.
현미부수체 (microsatellite)란 인체의 유전자 전체에 걸쳐 6개 이하의 짧은 DNA 염기서열이 순차적으로 반복하여 배열되어있는 형태를 말하는데 이들은 각 염색체 위에서 서로 다른 반복 횟수를 가지고 산재해있다.
현미부수체 불안정성 (microsatellite instability, MSI)은 현미부수체를 이루고 있는 단순 반복된 짧은 염기 배열(short tandem repeat sequence)이 증가하거나 감소하면서 나타나는 길이의 다양성으로, 이는 DNA 불일치복구유전자 (mismatch repair gene; MMR gene)의 복구 과정을 통하여 회복되는 과정을 거치게 된다. 그러나 DNA 불일치복구유전자의 종자선돌연변이 (germline mutation)나 프로모터 (promotor) 메틸화 등의 원인으로 복구에 기능이상이 발생하면 현미부수체의 길이에 변화가 일어나게 되며, 이러한 현미부수체의 불안정성을 검사하면 유전자 복구 이상의 발생을 진단할 수 있게 된다. 이러한 MSI는 유전성비용종성대장암 (hereditary nonpolyposis colorectal cancer, HNPCC) 증후군환자에게서 처음으로 발견되었는데 유전성비용종성대장암 환자의 약 90%가 이 MSI를 가지고 있다고 보고되어있으며, 이 외에도 다양한 종양에서 발견되는데 특히 유전성비용종성대장암증후군을 가진 환자에게 가장 자주 동반되는 자궁내막암에서 MSI(+)가 75%이상의 높은 빈도로 발현되고 있고, 유전성비용종성대장암의 가족력이 없는 산발성대장암과 산발성자궁내막암등에서도 MSI(+)가 존재하는 것으로 밝혀졌다. 특히 외국의 경우 산발성자궁내막암에서 MSI(+)를 가진 예가 약 10-40%의 빈도로 다양하게 보고되어 있으며 최근 한국인의 산발성자궁내막암종에서도 20-24%의 예가 보고된 바 있다. 최근 MSI 유형의 대장암 및 위암 환자가 면역치료제 (Immuno therapy)에 예후가 좋다는 연구 결과가 보고된바 있는 등 면역치료제의 바이오마커로써의 현미부수체 불안정성 검사의 필요성이 높아지고 있다(Le et al., N Engl J Med. 372.26:2509-2520, 2015; Cristescu et al., Nature Medicine 21.5:449-456, 2015).
MSI는 국제적 표준에 따르면 일반적으로 두 가지 유형으로 구분되는데 미국 국립 암연구소 (National Cancer Institute, NCI)에서는 1997년에 두 개의 모노뉴클레오티드 (mononucleotide)와 세 개의 다이뉴클레오티드 (dinucleotide)로 이루어진 다섯 개의 현미부수체 표지자 (BAT-25, BAT-26, D2S123, D17S250, D5S346)를 제시하였으며, 두 개 이상의 표지자에서 불안정성을 보이면 고도 현미부수체 불안정성 (high-level MSI, MSI-H)으로 측정한 현미부수체 표지자의 40% 이상에서 현미부수체 불안정성이 있는 경우로 복제오류양성 (replication error positive, RER＋)이라고도 하며, 한 개의 표지자에서만 불안정성을 보이면 저도현미부수체 불안정성 (low-level MSI, MSI-L)으로 측정한 현미부수체 표지자의 40% 이하에서 현미부수체 불안정성이 있는 경우를 말하며, 현미부수체 불안정성이 전혀 없는 경우는 현미부수체 안정성 (microsatellite stable, MSS)이라고 정의하였다 (Boland et al., Cancer Res., 58:5248-57, 1998; 김덕우, Journal of Genetic Medicine 7:24-36, 2010).
현재까지 MSI 진단을 위한 방법으로는 모세관 전기영동법을 이용하여 마커를 중합효소 연쇄반응으로 증폭한 산물의 길이 분포를 분석하여 진단하는 방법이 일반적으로 사용되고 있다. 특히 "Multiplex fluorescence PCR amplification and capillary electrophoresis" 분석법은 정상조직과 종양조직에서 DNA를 추출한 후, 미국 국립암 연구소에서 권장하는 5개의 현미부수체 마커를 표적으로 형광표시 중합효소 연쇄반응을 통하여 DNA을 증폭한 다음, 모세관 전기영동법 (capillary electrophoresis)을 이용하여 형광 표시된 DNA가 나타내는 형광을 분석하여 MSI를 진단하는 방법으로, 가장 널리 알려져 있다. 그러나 이는 고가의 모세관 전기영동 기계가 필요하며, 형광표시 중합효소 연쇄반응을 통한 DNA 증폭 후, 모세관 전기영동으로 옮겨서 측정해야 하는 2단계로 진행되는 불편함과 검사 소요일이 최소 7일이 걸리며, 전기영동법의 해상도가 낮아 모노뉴클레오티드 (mononucleotide)가 반복되는 마커를 사용하는데 한계가 있어 다이뉴클레오티드(dinucleotide)로 이루어진 마커의 사용이 고려될 수 있다. 그러나, 미국 국립암 연구소에서 권장하는 5개의 현미부수체 표지자 중 세 개의 다이뉴클레오티드 (dinucleotide)로 이루어진 D2S123, D17S250, 및 D5S346 바이오마커들의 민감도와 특이도가 두 개의 모노뉴클레오티드(mononucleotide)로 이루어진 BAT25와 BAT26 바이오마커에 비해 현저히 떨어지는 한계가 있다. 또한, MSI 검사의 경우 정상조직과 암조직을 분리하여 검사를 진행하지만, 암 조직 내에서도 세포간 다양성 (Cell-to-cell Heterogeneity)을 가지고 있어 10% 이하의 낮은 비율로 존재하는 MSI의 경우 현재의 진단 방법으로는 검사하기 어렵다는 단점을 가진다.
이에 최근 들어 민감도 높은 마커의 선정과 마커를 진단하는 기술에 대한 필요성이 높아지고 있으며, 최근 미국 국립암 연구소 (national cancer institute)를 시작으로 범용적으로 사용되었던 Bethesda loci (BAT25, BAT26, D2S123, D17S250, D5S346)가 아닌 통계 데이터베이스 (Database)를 통해 선정된 Quasi loci (BAT25, BAT26, NR21, NR24, NR27)를 사용함으로써 MSI 분석에 있어 기존의 Bethesda loci보다 높은 민감도와 정확도를 가진다 (Buhard et al., Disease Markers, 20:251-7, 2004; Deschoolmeester et al., J Mol Diagn, 10:154-159, 2008). Quasi loci의 경우 모노뉴클레오티드가 반복되는 마커로, 해당 마커의 분석을 위해서는 적은수의 염기결실 분석이 가능해야 하기 때문에 정확한 판정을 위해서는 분석해상도가 높아야 한다.
최근 들어 리포터 (reporter) 및 소광자 (quencher)가 결합된 PNA (Peptide Nucleic Acid, 펩티드핵산) 프로브를 이용하여 용해곡선 분석을 통해 표적핵산의 단일염기변이 및 염기의 결손 또는 삽입에 의한 변이를 효과적으로 검출할 수 있는 기술이 각광받고 있다. PNA는 DNA보다 열 및 생물학적 안정성과 타겟 DNA에 대한 인식능력 및 결합 능력이 뛰어나서, PNA 프로브를 이용한 융해곡선 분석법은 DNA 프로브보다 빠르고 강하게 타겟 DNA와 결합할 수 있으며, 강한 결합으로 인해 짧은 길이의 프로브를 사용할 수 있어 서로 인접하게 존재하는 단일염기서열변이를 검출할 수 있다는 장점을 가지는 반면, 융해곡선 분석을 통해 단일염기변이 및 염기의 결손 또는 삽입에 의한 변이를 정상적인 표적핵산과 비교하여 단순 구별만 할 수 있다는 한계가 있다. 또한, PNA 프로브는 중합효소연쇄반응 과정 중 중합효소의 신장반응 단계에서 결합을 유지할 경우 중합효소의 신장반응을 저해하는 역할을 할 수 있으며, 이러한 저해 효과와 단일염기변이 차이에 따른 결합력 변화를 이용하여 원하는 단일염기변이 선호적인 증폭이 가능한 특징을 가진다.
이러한 기술적 배경하에서, 본 발명자들은 리포터 (reporter) 및 소광자 (quencher)가 결합되고, 정상서열과의 상보적인 결합온도가 중합효소 연쇄반응의 신장반응 온도보다 높게 제작된 PNA 프로브를 이용하여 융해곡선 분석을 통한 결실 염기변이 개수의 분석에 따른 현미부수체 불안정성 (microsatellite instability, MSI)의 진단방법 및 진단용 키트를 개발하고자 예의 노력한 결과, 리포터 및 소광자가 결합되어 있고, 정상서열과 결합하는 온도는 중합효소의 신장반응 온도보다 높고, 1개 이상의 결실이 생긴 서열과 결합하는 온도는 중합효소의 신장반응 온도보다 낮게 제작된 PNA 프로브를 이용하여 표적핵산의 염기 결실에 특이적으로 결합하는 구조를 바탕으로 용해곡선 분석을 통해 염기의 결실 유무를 높은 민감도로 확인할 수 있으며, 이러한 방법을 기반으로 5% 수준으로 존재하는 낮은 비율의 Quasi loci 현미부수체 표지자의 염기 결실을 검출할 수 있는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 리포터 (reporter) 및 소광자 (quencher)가 결합되어 있고, 서열번호 11 내지 23으로 표시되는 서열로 구성된 군에서 선택되는 양기능성 PNA (Peptide Nucleic Acid, 펩티드핵산) 프로브를 이용하여 현미부수체 불안정성 (microsatellite instability, MSI)을 고민감도로 진단하기 위한 방법 및 키트를 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 리포터 (reporter) 및 소광자 (quencher)가 결합되어 있고, 서열번호 11 내지 23으로 표시되는 서열 및 이에 상보적인 서열로 구성된 군에서 선택되는 PNA (Peptide Nucleic Acid, 펩티드핵산) 프로브를 이용한 현미부수체 표적핵산의 염기변이 검출에 따른 현미부수체 불안정성 (microsatellite instability, MSI) 진단을 위한 융해곡선 분석방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 검체 시료로부터 표적핵산을 분리한 다음, 상기 표적핵산에 포함된 현미부수체 표지자인 BAT25, BAT26, NR21, NR24 또는 NR27에 서열번호 11 내지 23으로 표시되는 서열 및 이에 상보적인 서열로 구성된 군에서 선택되는 프로브를 혼합시켜, PNA 프로브와 표적핵산을 혼성화시키는 단계; (b) 온도를 변화시키면서 상기 혼성화된 산물을 융해시켜 융해곡선을 얻는 단계; 및 (c) 상기 얻어지는 융해곡선을 분석하여, 표적핵산에 포함된 현미부수체 표지자의 염기변이 유무 및 염기변이 개수를 검출하는 단계를 포함하는 표적핵산의 염기변이 검출에 따른 현미부수체 불안정성 (microsatellite instability, MSI) 진단방법을 제공한다.
본 발명은 또한, i) 리포터 (reporter) 및 소광자 (quencher)가 결합되어 있고, 서열번호 11 내지 23으로 표시되는 서열 및 이에 상보적인 서열로 구성된 군에서 선택되는 PNA (Peptide Nucleic Acid, 펩티드핵산) 프로브 및 ii) 서열번호 1과 서열번호 2; 서열번호 3과 서열번호 4; 서열번호 5와 서열번호 6; 서열번호 7과 서열번호 8; 및 서열번호 9와 서열번호 10으로 표시되는 서열로 구성된 군에서 선택되는 프라이머 세트를 포함하는, 융해곡선 분석법을 이용한 표적핵산의 염기변이 검출에 따른 현미부수체 불안정성(microsatellite instability, MSI) 진단용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한, 리포터 (reporter) 및 소광자 (quencher)가 결합되어 있고, 서열번호 11 내지 23으로 표시되는 서열 및 이에 상보적인 서열로 구성된 군에서 선택되는 PNA (Peptide Nucleic Acid, 펩티드핵산) 프로브를 이용하는 현미부수체 표적핵산의 염기변이 검출에 따른 DNA 불일치 보수 (mismatch repair)에 관여하는 유전자의 기능 이상 검출용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한, 리포터 (reporter) 및 소광자 (quencher)가 결합되어 있고, 서열번호 11 내지 23으로 표시되는 서열 및 이에 상보적인 서열로 구성된 군에서 선택되는 PNA (Peptide Nucleic Acid, 펩티드핵산) 프로브를 이용하는 현미부수체 표적핵산의 염기변이 검출에 따른 DNA 교정 (proofreading)에 관여하는 유전자의 기능 이상 검출용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한, 리포터 (reporter) 및 소광자 (quencher)가 결합되어 있고, 서열번호 11 내지 23으로 표시되는 서열 및 이에 상보적인 서열로 구성된 군에서 선택되는 PNA (Peptide Nucleic Acid, 펩티드핵산) 프로브를 이용하는 DNA 불일치 보수 (mismatch repair) 또는 DNA 교정 (proofreading) 기능 이상에 따른 돌연변이의 검출용 키트를 제공한다.
도 1은 표적 현미부수체 (BAT25, BAT26, NR21, NR24, 및 NR27)와 기존 분석 기법의 결과물을 나타낸 것이다.
도 2는 양기능성 PNA 프로브를 사용하여 현미부수체의 결실을 높은 민감도로 분석하는 모식도이다.
도 3은 형광 PNA 프로브를 이용한 현미부수체의 염기 결실 여부를 판별하기 위한 혼성화 단계와 융해곡선을 얻는 단계를 설명하기 위한 모식도이다.
도 4는 현미부수체의 결실 여부를 판별하기 위한 real-time PCR 반응 조건을 나타내는 도식이다.
도 5는 Quasi loci의 5개의 현미부수체 (BAT25, BAT26, NR21, NR24, 및 NR27)에 대한 MSI 및 MSS 세포주들을 이용하여 단일 분석방법에 의해 결실된 염기변이의 개수 및 유전형을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 고민감도 현미부수체 결실 진단키트를 사용한 민감도 분석 결과를 기존 분석 기법과 비교한 것으로, 현미부수체 불안정성 (MSI High)을 나타낸 것이다.
도 7은 고민감도 현미부수체 결실 진단키트를 사용한 대장암 샘플 분석 결과를 기존 분석 기법과 비교한 것으로, 현미부수체 불안정성 (MSI High)을 나타낸 것이다.
도 8은 고민감도 현미부수체 결실 진단키트를 사용한 대장암 샘플 분석 결과를 기존 분석 기법과 비교한 것으로, 현미부수체 안정성 (MSS)을 나타낸 것이다.
도 9는 고민감도 현미부수체 결실 진단키트를 사용한 위암 샘플 분석 결과를 기존 분석 기법과 비교한 것으로, 현미부수체 불안정성 (MSI High)을 나타낸 것이다.
도 10은 고민감도 현미부수체 결실 진단키트를 사용한 위암 샘플 분석 결과를 기존 분석 기법과 비교한 것으로, 현미부수체 안정성 (MSS)을 나타낸 것이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 리포터 (reporter) 및 소광자 (quencher)가 결합되어 있고, 현미부수체 불안정성을 가지는 표지자 선호적 증폭이 가능한 PNA (Peptide Nucleic Acid, 펩티드핵산) 프로브를 이용하여 고민감도 표지자 증폭 및 융해곡선 분석을 통한 현미부수체 결실의 유무를 확인함으로써, 고민감도로 현미부수체 불안정성(MSI)을 검사하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 현미부수체 불안정성 검사를 위한 마커로 Quasi loci의 5개 현미부수체 표지자 (NR21, NR24, BAT26, NR27 및 BAT25)를 선정하였으며, 상기 표지자의 결실 여부를 결정하는 형광 PNA 프로브 세트는 NR21의 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13 중 하나 이상과 NR24의 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16 중 하나 이상, BAT26의 서열번호 17과 BAT25의 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21 중 하나 이상 및 NR27의 서열번호 22, 서열번호 23 중 하나 이상을 포함하여 이루어진 것이 특징이다.
본 발명의 일 실시예에서는 현미부수체 표지자의 진단을 위하여 양기능성을 가지는 형광 PNA 프로브를 제작하고, 선별하였다 (도 4 참조). 상기 양기능성 PNA 프로브는 형광이 접합된 PNA 프로브로 상보적인 서열과 완전한 결합을 유지할 시 중합효소의 신장반응을 저해하는 기능과 형광을 분석 기능을 동시에 가지도록 제작된 프로브로 현미부수체 불안정성 (결실) 선호적인 증폭이 가능하도록 현미부수체 안정성 (정상) 서열과의 결합온도가 중합효소의 신장반응 온도보다 높은 것을 특징으로 하고, 결실서열이 포함된 현미부수체 표지자와의 결합력이 중합효소 신장반응 온도보다 낮은 것을 특징으로 하며, 이러한 특징을 가지도록 서열번호 11 내지 23의 서열을 사용하여 선별하였다.
바람직하게는 본 발명에 따른 PNA 프로브에 있어서, 상기 PNA 프로브 및 현미부수체 표지자 서열과의 결합력 (융해온도, melting temperature, Tm)은 프로브의 염기서열과 길이를 조절하여 결정하며 이외의 구체적인 방법의 예로서는, 일부 서열의 교체를 통하여 결합력을 낮추는 방법과 PNA 단량체의 backbone의 변형을 사용하여 결합력은 조절하는 방법을 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 서열의 교체는 일부 서열을 표적과 상보적이지 않는 염기를 사용하는 형태가 가능하며 아데닌 (adenine), 구아닌 (guanine), 사이토신 (cytosine), 티민 (thymine), 우라실 (Uracil) 등의 천연 염기와 선택성 없이 결합하고 상보적인 결합력보다 낮은 결합력을 가지는 염기인 이노신 PNA (inosine PNA), 인돌 PNA (indole PNA), 나이트로인돌 PNA (nitroindole PNA) 및 무염기 (abasic)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 사용할 수 있다. 또한, PNA 단량체의 backbone의 변형을 사용하여 결합력은 조절하는 방법으로 gamma- 또는 alpha-backbone 변형 PNA 단량체를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 특히 gamma- 혹은 alpha-backbone 변형 펩티드 핵산 단량체는 전기적 양성을 가져 결합력을 높일 수 있는 리신 (Lysine, Lys, K), 아르기닌 (Arginine, Arg, R), 히스티딘 (Histidine, His, H), 디아미노 부티르산 (Diamino butyric acid, DAB), 오르니틴 (Ornithine, Orn) 및 아미노산 유사체로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 양전하를 가지는 아미노산을 backbone에 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, gamma- 혹은 alpha-backbone 변형 PNA 단량체는 음전하를 가져 결합력은 낮출 수 있는 글루타민산 (Glutamic acid, Glu, E), 아스파트산 (Aspartic acid, Asp, D) 등의 아미노산을 backbone에 포함할 수 있으며 알라닌 (Alanine, Ala, A) 등의 PNA와 표적과의 결합력에 영향을 주는 변형 PNA의 사용이 가능한 것을 특징으로 할 수 있다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 리포터 (reporter) 및 소광자 (quencher)가 결합되어 있고, 서열번호 11 내지 23으로 표시되는 서열 및 이에 상보적인 서열로 구성된 군에서 선택되는 PNA (Peptide Nucleic Acid, 펩티드핵산) 프로브를 이용하는 현미부수체 표적핵산의 염기변이 검출에 따른 현미부수체 불안정성 (microsatellite instability, MSI) 진단을 위한 융해곡선 분석방법에 관한 것이다.
본 발명의 '염기변이'는 표적핵산의 염기서열에 변이가 일어난 것으로, 단일염기 다형성 (SNP; single nucleotide polymorphism)뿐만 아니라, 염기의 치환, 결실 또는 삽입되어 변이가 일어난 것을 포함하는 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 본 발명의 PNA 프로브는 표적핵산의 2개 내지 14개의 염기가 결실되어 변이가 일어난 것을 융해곡선 분석을 통해 분석할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융해곡선 분석은 FMCA (Fluorescence Melting Curve Analysis; 형광융해곡선분석) 방법으로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 증폭은 실시간 PCR (Real-Time Polymerase Chain Reaction) 방법으로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 '혼성화'는 상보적인 단일가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 2개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우 (perfect match) 일어나거나 또는 일부 부정합 (mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다.
본 발명의 리포터 및 소광자가 포함된 형광 펩티드핵산 프로브는 표적핵산과 혼성화된 후 형광 신호가 발생하며, 온도가 올라감에 따라 프로브의 적정 융해 온도에서 표적 핵산과 빠르게 융해되어 형광 신호가 소광되며, 이러한 온도 변화에 따른 상기 형광 신호로부터 얻어진 고해상도의 융해곡선 분석 (Fluorescence Melting Curve Analysis; FMCA)을 통하여 표적 핵산의 염기 변성 (SNP, Indel 등) 유무를 검출할 수 있다.
본 발명의 '표적핵산'은 검출/판별하고자 하는 유전자형의 핵산 서열 (SNP 포함)을 의미하며, 생리ㆍ생화학적 기능을 가지는 단백질을 코딩하는 '표적 유전자'의 핵산 서열의 특정 부위를 포함하고, 혼성화, 어닐링 또는 증폭 조건하에서 프라이머 또는 프로브와 어닐링 또는 혼성화된다. '표적핵산'은 본 명세서에서 사용되는 용어 '타겟 핵산', '합성 DNA' 또는 '인공합성 올리고'와 차이가 없으며, 본 명세서에서 혼용된다.
본 발명에 있어서, 상기 표적핵산은 DNA 또는 RNA이며, 상기 분자는 이중가닥 또는 단일가닥 형체일 수 있다. 초기물질로서 핵산이 이중가닥인 경우, 두 가닥을 단일 가닥으로, 또는 부분적인 단일-가닥 형태로 만드는 것이 바람직하다. 가닥들을 분리하는 것으로 알려진 방법들은, 열, 알카리, 포름아미드, 우레아 및 글리콕살 처리, 효소적 방법 (예: 헬리카아제 작용) 및 결합 단백질을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 가닥 분리는 80 내지 105℃의 온도로 열처리하여 달성될 수 있다. 상술한 처리의 일반적인 방법은 Joseph Sambrook et al,, Molecular Cloning, 2001에 개시되어 있다.
본 발명의 형광 PNA 프로브는 표적 핵산과 염기변이를 가지는 표적 핵산의 융해온도 (Tm) 차이를 위해, 표적핵산의 염기변이 위치가 형광 PNA 프로브의 가운데 부분 (center position)에 오도록 디자인하는 것이 바람직하다. 염기변이 부분이 프로브의 가운데 부분에 위치하면, 프로브의 구조적 차이를 만들게 되고, 형광 PNA 프로브는 루프 (loop)를 형성하면서 결합하게 되어, 이런 구조적 차이로 인해 융해온도(Tm)차이가 크게 나타난다.
본 발명의 PNA 프로브는 표적 현미부수체 서열과 완전 혼성화 형태에서의 결합력이 중합효소 신장반응 온도보다 높게 형성되고, 한 개 이상의 결실을 가지는 혼성화 형태에서의 결합력은 중합효소 신장반응 온도보다 낮게 형성되는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 형광 PNA 프로브는 TaqMan 프로브의 가수분해법 (hydrolysis method)과는 다른 혼성화 방법 (hybridization method)를 이용하여 분석하며, 유사한 역할을 하는 프로브로는 분자 비컨 프로브 (molecular beacon probe), 스코피온 프로브 (scorpion probe) 등이 있다.
본 발명에 있어서, 상기 형광 PNA 프로브는 양말단에 리포터 (reporter) 및 소광자 (quencher)를 가지는 것이 바람직하다. 즉, 본 발명에 따른 PNA 프로브는 양 말단에는 리포터 (reporter)와 리포터 형광을 소광 (quenching) 할 수 있는 소광자 (quencher)가 결합될 수 있다. 상기 리포터 (reporter)는 FAM (6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX (2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein) 및 CY5로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 상기 소광자는 TAMRA (6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 Dabcyl을 사용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, PNA 프로브는 mono-repeat 형태 현미부수체의 표적핵산 염기서열과 완전한 혼성화 (perfect match)를 이루어 예상된 융해온도(Tm) 값을 보이며, 염기변이가 존재하는 표적핵산과는 불완전한 혼성화 (mismatch)를 이루어 예상보다 낮은 융해온도 (Tm) 값을 보이는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서는, 민감도와 특이도가 높은 Quasi loci의 5개 현미부수체 표시자를 사용하여 현미부수체 불안정성 (MSI)와 현미부수체 안정성 (MSS)를 분석하기 위해 현미부수체 불안정성 (MSI) 상태 (status)와 현미부수체 안정성 (MSS) 상태의 표준세포주 (표 3)를 사용하여 현미부수체 표지자의 결실 여부를 단일분석 또는 다중분석 할 수 있음을 확인하였다.
양기능성 PNA 프로브는 정상 현미부수체 표지자의 중합효소연쇄반응을 억제하고, 결실을 가지는 현미부수체 표지자의 중합효소연쇄반응을 가능하게 하는 기능을 가지고 있어 분석 민감도가 높은 특징을 가지며, 이러한 민감도는 본 발명의 실시예 4를 통하여 확인하였다. 상기 실시예에서는 인공적으로 제조된 낮은 비율의 현미부수체 불안정성 샘플을 사용하여 민감도 분석을 하였으며, 기존 기법 (Pentaplex sequencing)이 분석하지 못하는 5% 비율로 포함된 현미부수체 불안정성의 분석이 가능함을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, (a) 검체 시료로부터 표적핵산을 분리한 다음, 상기 표적핵산에 포함된 현미부수체 표지자인 BAT25, BAT26, NR21, NR24 또는 NR27에 서열번호 11 내지 23으로 표시되는 서열 및 이에 상보적인 서열로 구성된 군에서 선택되는 프로브를 혼합시켜, PNA 프로브와 표적핵산을 혼성화시키는 단계; (b) 온도를 변화시키면서 상기 혼성화된 산물을 융해시켜 융해곡선을 얻는 단계; 및 (c) 상기 얻어지는 융해곡선을 분석하여, 표적핵산에 포함된 현미부수체 표지자의 염기변이 유무 및 염기변이 개수를 검출하는 단계를 포함하는 표적핵산의 염기변이 검출에 따른 현미부수체 불안정성(microsatellite instability, MSI) 진단방법에 관한 것이다.
여기서, 상기 진단방법을 이용하면 표적핵산의 Quasi loci의 현미부수체 표지자들 (BAT25, BAT26, NR21, NR24, 및 NR27)의 결실 여부를 확인할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 검체 시료는 인간을 포함하는 동물의 특정 조직 또는 기관으로부터 유래될 수 있다. 상기 조직의 대표적인 예로는, 결합, 피부, 근육 또는 신경 조직이 포함된다. 상기 기관의 대표적인 예로는, 눈, 뇌, 폐, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 담낭, 위, 소장, 고환, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 선 및 내부 혈관이 포함된다.
상기 검체 시료는 생물학적 근원으로부터 나온 어떠한 세포, 조직, 유체액 (fluid), 또는 본 발명에 의하여 잘 분석될 수 있는 어떠한 다른 매질 (medium)도 포함하며, 이는 인간, 동물, 인간 또는 동물의 소비를 위하여 제조된 음식으로부터 얻은 시료가 포함된다. 또한, 분석되는 시료는 체액 시료를 포함하며, 이는 객담, 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 모유, 소변, 분변, 안구 유액, 타액, 정액, 뇌 추출물 (예컨대, 뇌 분쇄물), 척수액, 충수, 비장 및 편도선 조직 추출물이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 PNA 프로브는 표적 현미부수체 서열과 완전 혼성화 형태에서의 결합력이 중합효소 신장반응 온도보다 높게 형성되고, 한 개 이상의 결실을 가지는 혼성화 형태에서의 결합력은 중합효소 신장반응 온도보다 낮게 형성되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 PNA 프로브는 표적핵산 염기서열과 완전한 혼성화 (perfect match)를 이루어 예상된 융해온도 (Tm) 값을 보이며, 염기변이가 존재하는 표적핵산과는 불완전한 혼성화 (mismatch)를 이루어 예상보다 낮은 융해온도 (Tm) 값을 보이는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 염기변이는 표적핵산의 2개 내지 14개의 염기가 결실되어 변이가 일어난 것을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 형광 PNA 프로브는 양말단에 리포터 (reporter) 및 소광자 (quencher)를 가지는 것이 바람직하다. 즉, 본 발명에 따른 PNA 프로브는 양 말단에는 리포터 (reporter)와 리포터 형광을 소광 (quenching) 할 수 있는 소광자 (quencher)가 결합될 수 있다. 상기 리포터 (reporter)는 FAM (6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX (2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein) 및 CY5로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 상기 소광자는 TAMRA (6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 Dabcyl을 사용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 방법은 2 이상의 표적핵산을 사용하고, PNA 프로브에 표지되는 리포터를 표적핵산별로 다르게 하여, 2 이상의 표적핵산의 염기변이를 검출하는 것을 특징으로 할 수 있다. 따라서, 상기 방법은 다중 표적핵산 또는 단일 표적핵산의 염기변이를 분석하는데 이용할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, i) 리포터 (reporter) 및 소광자 (quencher)가 결합되어 있고, 서열번호 11 내지 23으로 표시되는 서열 및 이에 상보적인 서열로 구성된 군에서 선택되는 PNA (Peptide Nucleic Acid, 펩티드핵산) 프로브 및 ii) 서열번호 1과 서열번호 2; 서열번호 3과 서열번호 4; 서열번호 5와 서열번호 6; 서열번호 7과 서열번호 8; 및 서열번호 9와 서열번호 10으로 표시되는 서열로 구성된 군에서 선택되는 프라이머 세트를 포함하는, 융해곡선 분석법을 이용한 표적핵산의 염기변이 검출에 따른 현미부수체 불안정성(microsatellite instability, MSI) 진단용 키트에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 PNA 프로브는 표적 현미부수체 서열과 완전 혼성화 형태에서의 결합력이 중합효소 신장반응 온도보다 높게 형성되고, 한 개 이상의 결실을 가지는 혼성화 형태에서의 결합력은 중합효소 신장반응 온도보다 낮게 형성되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 PNA 프로브는 표적핵산 염기서열과 완전한 혼성화 (perfect match)를 이루어 예상된 융해온도 (Tm) 값을 보이며, 염기변이가 존재하는 표적핵산과는 불완전한 혼성화 (mismatch)를 이루어 예상보다 낮은 융해온도 (Tm) 값을 보이는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 염기변이는 표적핵산의 2개 내지 14개의 염기가 결실되어 변이가 일어난 것을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 키트는 2 이상의 표적핵산을 사용하고, PNA 프로브에 표지되는 리포터를 표적핵산별로 다르게 하여, 2 이상의 표적핵산의 염기변이를 검출하는 것을 특징으로 할 수 있다. 따라서, 상기 키트는 다중 표적핵산 또는 단일 표적핵산의 염기변이를 분석하는데 이용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 현미부수체 불안정성 (microsatellite instability, MSI)은 불일치 보수유전자 (mismatch repair gene) 및 proofreading 유전자의 기능이상에 의하여 발생하기 때문에, 상기 키트는 미스매치 복수 기능이상의 간접 진단 및 Proofreading 기능이상을 진단하는데 이용할 수 있다. 또한, 불일치 복수유전자 및 proofreading 유전자의 기능이상의 결과물로 Mutation burden이 발생하기 때문에, 상기 키트는 Mutational burden 간접 진단의 용도로도 이용할 수 있다 (Palmieri, Giuseppe et al., J. Transl. Med. 15.1:17, 2017).
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 리포터 (reporter) 및 소광자 (quencher)가 결합되어 있고, 서열번호 11 내지 23으로 표시되는 서열 및 이에 상보적인 서열로 구성된 군에서 선택되는 PNA (Peptide Nucleic Acid, 펩티드핵산) 프로브를 이용하는 현미부수체 표적핵산의 염기변이 검출에 따른 DNA 불일치 보수 (mismatch repair)에 관여하는 유전자의 기능 이상 검출용 키트에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 DNA 불일치 보수 (mismatch repair)에 관여하는 유전자는 hMLH1 (human MutL homolog 1), hMSH2 (human MutS homolog 2), hMSH3 (human MutS homolog 3), hMSH6 (human MutS homolog 6), hMLH3 (human MutL homolog 3), PMS1 (PMS1 homolog 1), PMS2 (PMS1 homolog 2), EXO1 (Exonuclease 1), PCNA (Proliferating cell nuclear antigen), RFC (replication factor C), RPA (replication factor A), Pol delta 및 Ligase1 (DNA ligase 1)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 리포터 (reporter) 및 소광자 (quencher)가 결합되어 있고, 서열번호 11 내지 23으로 표시되는 서열 및 이에 상보적인 서열로 구성된 군에서 선택되는 PNA (Peptide Nucleic Acid, 펩티드핵산) 프로브를 이용하는 현미부수체 표적핵산의 염기변이 검출에 따른 DNA 교정 (proofreading)에 관여하는 유전자의 기능 이상 검출용 키트에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 DNA 교정 (proofreading)에 관여하는 유전자는 POLE (DNA polymerase epsilon) 및 POLD1 (polymerase delta 1)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 리포터 (reporter) 및 소광자 (quencher)가 결합되어 있고, 서열번호 11 내지 23으로 표시되는 서열 및 이에 상보적인 서열로 구성된 군에서 선택되는 PNA (Peptide Nucleic Acid, 펩티드핵산) 프로브를 이용하는 DNA 불일치 보수 (mismatch repair) 또는 DNA 교정 (proofreading) 기능 이상에 따른 돌연변이의 검출용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 키트는 버퍼, DNA 중합효소 조인자 및 데옥시리보뉴클레오타이드-5-트리포스페이트와 같은 타겟 증폭 PCR 반응 (예컨대, PCR 반응)을 실시하는데 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 역전사효소, 버퍼 및 시약, 및 DNA 중합효소 활성을 억제하는 항체를 포함할 수 있다. 아울러, 상기 키트는 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적량은, 본 명세서에 개시사항을 습득한 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 상기 키트는 앞서 언급된 구성성분들을 포함하는 별도의 포장 또는 컴파트먼트(compartment)로 제작될 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 현미부수체 유전자 증폭을 위한 프라이머의 제작
Quasi loci의 5개 현미부수체 표지자(NR21, NR24, BAT26, NR27 및 BAT25)들의 중합효소 연쇄반응을 위한 프라이머는 NR21 (서열번호 1과 서열번호 2), NR24 (서열번호 3과 서열번호 4), BAT26 (서열번호 5와 서열번호 6), NR27 (서열번호 7과 서열번호 8) 및 BAT25 (서열번호 9과 서열번호 10)으로 이루어진 염기서열을 제작하여 사용하였다 (표 1).
Figure PCTKR2017003168-appb-T000001
실시예 2: 양기능성 형광 PNA 프로브의 제작
현미부수체의 불안정성 (MSI) 선호적 증폭 기능과 및 융해온도 분석 기능을 동시에 가지는 양기능성 형광 PNA 프로브의 제작을 위하여, 현미부수체 안정 서열과의 혼성화 온도가 중합효소 신장반응 온도보다 높고, 현미부수체 불안정성 서열과의 혼성화 온도는 중합효소 신장반응 온도보다 낮게 제작하였다. 그 다음, 혼성화 후 떨어지는 온도를 측정하기 위하여 프로브의 말단에 형광과 소광자를 결합시켰다. 각각의 양기능성 형광 PNA 프로브는 현미부수체의 단일염기 반복서열을 가운데에 포함하고 각 말단에 특이적인 서열을 3개 내지 8개를 각각 포함하도록 제작하여 특이도를 확보하였다 (표 2).
Figure PCTKR2017003168-appb-T000002
* 표 2에서 O-는 링커 및 K는 라이신(lysine)을 의미한다.
실시예 3: 표준세포주를 사용한 양기능성 PNA 프로브 기반 MSI 판별 키트의 검증
현미부수체 불안정성 (microsatellite instability, MSI)과 현미부수체 안정성 (microsatellite stable, MSS)의 표준세포주 (표 3)를 사용하여 실시예 1에서 제작된 프라이머와 실시예 2에서 제작된 양기능성 PNA 형광 프로브를 사용하여 CFX96™ Real-Time 시스템 (BIO-RAD 사, 미국)에서 PCR을 수행하였다 (표3).
Figure PCTKR2017003168-appb-T000003
실시간중합효소연쇄반응 실험 조건은 단일가닥 표적핵산을 생성하기 위해 비대칭 PCR (asymmetric PCR)을 이용하였다. 비대칭 PCR의 조건은 다음과 같다; 총 볼륨이 20㎕이 되도록 2X 시선바이오 리얼타임 FMCA™ 버퍼 (SeaSunBio Real-Time FMCA™ buffer, 시선바이오, 한국), 2.5mM MgCl2, 200μM dNTPs, 1.0U Taq polymerase, 0.05μM 순방향 프라이머 (forward primer, 표 1) 및 0.5μM 역방향 프라이머 (reverse primer, 표 1)(asymmetric PCR)에 1㎕ 표준세포주 DNA (표 3)를 첨가한 다음 리얼타임 PCR을 실시한 후, 0.5㎕ 형광 PNA 프로브 (표 2)를 첨가하여 융해곡선 분석을 수행하였다. 실험 방법의 도식은 도 2와 도 3에 나타내었으며, 도 4의 조건으로 분석을 진행하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, MSI 세포주에서 현미부수체 표지자인 NR21, NR24, BAT26, NR27 및 BAT25를 표적하는 PNA 프로브의 결합온도가 MSS 표준세포주의 결합온도 보다 낮게 형성되는 것을 확인하였다
실시예 4: 양기능성 PNA 프로브 기반 MSI 판별 키트의 민감도 비교 분석
현미부수체 불안정성 (microsatellite instability, MSI) 표준 세포주 (표 3)에서 추출한 DNA를 5, 10, 20, 40, 100%의 비율로 현미부수체 안정성 (microsatellite stable, MSS) 표준 세포주에 혼합하여 민감도 분석의 샘플로 사용하였으며, 실시예 1과 2에서 제작된 프라이머와 양기능성 PNA 형광 프로브를 사용하여 CFX96™ Real-Time 시스템 (BIO-RAD 사, 미국)에서 PCR을 수행하였다.
실시간중합효소연쇄반응 실험 조건은 단일가닥 표적핵산을 생성하기 위해 비대칭 PCR (asymmetric PCR)을 이용하였다. 비대칭 PCR의 조건은 다음과 같다; 총 볼륨이 20㎕이 되도록 2X 시선바이오 리얼타임 FMCA™ 버퍼 (SeaSunBio Real-Time FMCA™ buffer, 시선바이오, 한국), 2.5mM MgCl2, 200μM dNTPs, 1.0U Taq polymerase, 0.05μM 순방향 프라이머 (forward primer, 표 1) 및 0.5μM 역방향 프라이머 (reverse primer, 표 1)(asymmetric PCR)에 1㎕ 표준세포주 DNA (표 3)를 첨가한 다음 리얼타임 PCR을 실시한 후, 0.5㎕ 형광 PNA 프로브 (표 2)를 첨가하여 융해곡선 분석을 수행하였다. 실험 방법의 도식은 도 2와 도 3에 나타내었으며, 도 4의 조건으로 분석을 진행하였다.
분석결과 기존기법인 pentaplex 기법이 확인하지 못한 5% 및 10%로 혼합된 현미부수체 불안정성의 분석이 가능한 것을 확인하였다 (도6).
실시예 5: 임상샘플을 사용한 양기능성 PNA 프로브 기반 MSI 판별 키트의 검증
대장암과 위암이 의심되는 임상조직과 그 주변부 정상 조직의 DNA를 추출하여 실시예 1과 2에서 제작된 프라이머와 양기능성 PNA 형광 프로브를 사용하여 CFX96™ Real-Time 시스템 (BIO-RAD 사, 미국)에서 PCR을 수행하였다.
실시간중합효소연쇄반응 실험 조건은 단일가닥 표적핵산을 생성하기 위해 비대칭 PCR(asymmetric PCR)을 이용하였다. 비대칭 PCR의 조건은 다음과 같다; 총 볼륨이 20㎕이 되도록 2X 시선바이오 리얼타임 FMCA™ 버퍼(SeaSunBio Real-Time FMCA™ buffer, 시선바이오, 한국), 2.5mM MgCl2, 200μM dNTPs, 1.0U Taq polymerase, 0.05μM 순방향 프라이머(forward primer, 표 1) 및 0.5μM 역방향 프라이머(reverse primer, 표 1)(asymmetric PCR)에 1㎕ 표준세포주 DNA (표 3)를 첨가한 다음 리얼타임 PCR을 실시한 후, 0.5㎕ 형광 PNA 프로브 (표 2)를 첨가하여 융해곡선 분석을 수행하였다. 실험 방법의 도식은 도 2와 도 3에 나타내었으며, 도 4의 조건으로 분석을 진행하였다.
암 조직과 그 주변부 정상 조직간 융해온도의 비교로 현미부수체 표지 유전자의 불안정성의 유무를 비교분석 하였으며, 최종 결과는 기존의 MSI 분석 기법인 Petaplex 기법과 비교하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 기존 분석법인 pentaplex에서 MSI-high (5개의 현미부수체 유전자 중 2개 이상의 표지 유전자의 결실이 확인된 상태)를 보이는 임상 조직에서 양기능성 PNA 형광프로브를 사용한 분석이 동일한 MSI-high 결과를 보여주었다. 또한, 도 8에 나타난 바와 같이, 기존 분석법에서 MSS를 보여주는 대장암 조직을 대상으로 한 양기능성 PNA 형광프로브를 사용한 분석이 동일한 MSS 결과를 보여주었으며, 위암이 의심되는 임상 조직과 그 주변부 정상 조직 분석 결과도 상기 결과와 동일한 결과를 얻을 수 있었다 (도 9 및 도 10).
그 외, 다수의 임상조직을 대상으로 pentaplex 분석법과 추가 비교분석 하였으며, 그 결과 기존 기법인 pentaplex와 양기능성 형광 PNA 프로브를 사용한 분석법의 결과가 일치하는 것을 확인하였다.
본 발명은 리포터(repoter) 및 소광자(quencher)가 결합된 양기능성 PNA 프로브를 이용한 염기변이 개수의 분석에 따른 현미부수체 불안정성(microsatellite instability, MSI)의 진단방법 및 진단용 키트로, 민감도와 특이도가 높은 Quasi loci의 5개 현미부수체 표지자를 이용하여 현미부수체 표지자 유전자의 결실여부를 고민감도로 분석할 수 있어, 기존의 MSI 진단방법에 비해 비용의 감소 및 검사 소요시간 단축 등의 장점이 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (23)

  1. 리포터 (reporter) 및 소광자 (quencher)가 결합되어 있고, 서열번호 11 내지 23으로 표시되는 서열 및 이에 상보적인 서열로 구성된 군에서 선택되는 PNA (Peptide Nucleic Acid, 펩티드핵산) 프로브를 이용하는 현미부수체 표적핵산의 염기변이 검출에 따른 현미부수체 불안정성 (microsatellite instability, MSI) 진단을 위한 융해곡선 분석방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 PNA 프로브는 표적 현미부수체 서열과 완전 혼성화 형태에서의 결합력이 중합효소 신장반응 온도보다 높게 형성되고, 한 개 이상의 결실을 가지는 혼성화 형태에서의 결합력은 중합효소 신장반응 온도보다 낮게 형성되는 것을 특징으로 하는 분석방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 PNA 프로브는 현미부수체 표적핵산의 염기서열과 완전히 혼성화 (perfect match)를 이루어 예상된 융해온도 (Tm) 값을 보이며, 염기변이를 가지는 표적핵산과는 불완전 혼성화 (mismatch)를 이루어 예상보다 낮은 융해온도 (Tm) 값을 보이는 것을 특징으로 하는 분석방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 염기변이는 표적핵산의 2개 내지 14개의 염기가 결실되어 변이가 일어난 것을 특징으로 하는 분석방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 리포터 (reporter)는 FAM (6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX (2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein) 및 CY5로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 분석방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 소광자 (quencher)는 TAMRA (6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl으로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 분석방법.
  7. 다음 단계를 포함하는 표적핵산의 염기변이 검출에 따른 현미부수체 불안정성 (microsatellite instability, MSI) 진단방법:
    (a) 검체 시료로부터 표적핵산을 분리한 다음, 상기 표적핵산에 포함된 현미부수체 표지자인 BAT25, BAT26, NR21, NR24 또는 NR27에 서열번호 11 내지 23으로 표시되는 서열 및 이에 상보적인 서열로 구성된 군에서 선택되는 프로브를 혼합시켜, PNA 프로브와 표적핵산을 혼성화시키는 단계;
    (b) 온도를 변화시키면서 상기 혼성화된 산물을 융해시켜 융해곡선을 얻는 단계; 및
    (c) 상기 얻어지는 융해곡선을 분석하여, 표적핵산에 포함된 현미부수체 표지자의 염기변이 유무 및 염기변이 개수를 검출하는 단계.
  8. 제7항에 있어서, 상기 PNA 프로브는 표적 현미부수체 서열과 완전 혼성화 형태에서의 결합력이 중합효소 신장반응 온도보다 높게 형성되고, 한 개 이상의 결실을 가지는 혼성화 형태에서의 결합력은 중합효소 신장반응 온도보다 낮게 형성되는 것을 특징으로 하는 진단방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 PNA 프로브는 표적핵산 염기서열과 완전히 혼성화 (perfect match)를 이루어 예상된 융해온도 (Tm) 값을 보이며, 염기변이를 가지는 표적핵산과는 불완전 혼성화 (mismatch)를 이루어 예상보다 낮은 융해온도 (Tm) 값을 보이는 것을 특징으로 하는 진단방법.
  10. 제7항에 있어서, 상기 염기변이는 표적핵산의 2개 내지 14개의 염기가 결실되어 변이가 일어난 것을 특징으로 하는 진단방법.
  11. 제7항에 있어서, 상기 리포터 (reporter)는 FAM (6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX (2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein) 및 CY5로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 진단방법.
  12. 제7항에 있어서, 상기 소광자 (quencher)는 TAMRA (6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl으로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 진단방법.
  13. 제7항에 있어서, 2 이상의 표적핵산을 사용하고, PNA 프로브에 표지되는 리포터를 표적핵산별로 다르게 하여, 2 이상의 표적핵산의 염기변이를 검출하는 것을 특징으로 하는 진단방법.
  14. i) 리포터 (reporter) 및 소광자 (quencher)가 결합되어 있고, 서열번호 11 내지 23으로 표시되는 서열 및 이에 상보적인 서열로 구성된 군에서 선택되는 PNA (Peptide Nucleic Acid, 펩티드핵산) 프로브 및 ii) 서열번호 1과 서열번호 2; 서열번호 3과 서열번호 4; 서열번호 5와 서열번호 6; 서열번호 7과 서열번호 8; 및 서열번호 9와 서열번호 10으로 표시되는 서열로 구성된 군에서 선택되는 프라이머 세트를 포함하는, 융해곡선 분석법을 이용한 표적핵산의 염기변이 검출에 따른 현미부수체 불안정성(microsatellite instability, MSI) 진단용 키트.
  15. 제14항에 있어서, 상기 PNA 프로브는 표적 현미부수체 서열과 완전 혼성화 형태에서의 결합력이 중합효소 신장반응 온도보다 높게 형성되고, 한 개 이상의 결실을 가지는 혼성화 형태에서의 결합력은 중합효소 신장반응 온도보다 낮게 형성되는 것을 특징으로 하는 키트.
  16. 제14항에 있어서, 상기 PNA 프로브는 표적핵산 염기서열과 완전히 혼성화 (perfect match)를 이루어 예상된 융해온도 (Tm) 값을 보이며, 염기변이를 가지는 표적핵산과는 불완전 혼성화 (mismatch)를 이루어 예상보다 낮은 융해온도 (Tm) 값을 보이는 것을 특징으로 하는 키트.
  17. 제14항에 있어서, 상기 염기변이는 표적핵산의 2개 내지 14개의 염기가 결실되어 변이가 일어난 것을 특징으로 하는 키트.
  18. 제14항에 있어서, 2 이상의 표적핵산을 사용하고, PNA 프로브에 표지되는 리포터를 표적핵산별로 다르게 하여, 2 이상의 표적핵산의 염기변이를 검출하는 것을 특징으로 하는 키트.
  19. 리포터 (reporter) 및 소광자 (quencher)가 결합되어 있고, 서열번호 11 내지 23으로 표시되는 서열 및 이에 상보적인 서열로 구성된 군에서 선택되는 PNA (Peptide Nucleic Acid, 펩티드핵산) 프로브를 이용하는 현미부수체 표적핵산의 염기변이 검출에 따른 DNA 불일치 보수 (mismatch repair)에 관여하는 유전자의 기능 이상 검출용 키트
  20. 제19항에 있어서, 상기 DNA 불일치 보수 (mismatch repair)에 관여하는 유전자는 hMLH1, hMSH2, hMSH3, hMSH6, hMLH3, PMS1, PMS2, EXO1, PCNA, RFC, RPA, Pol delta, 및 Ligase1으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 키트.
  21. 리포터 (reporter) 및 소광자 (quencher)가 결합되어 있고, 서열번호 11 내지 23으로 표시되는 서열 및 이에 상보적인 서열로 구성된 군에서 선택되는 PNA (Peptide Nucleic Acid, 펩티드핵산) 프로브를 이용하는 현미부수체 표적핵산의 염기변이 검출에 따른 DNA 교정 (proofreading)에 관여하는 유전자의 기능 이상 검출용 키트.
  22. 제21항에 있어서, 상기 DNA 교정 (proofreading)에 관여하는 유전자는 POLE 및 POLD1으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 키트.
  23. 리포터 (reporter) 및 소광자 (quencher)가 결합되어 있고, 서열번호 11 내지 23으로 표시되는 서열 및 이에 상보적인 서열로 구성된 군에서 선택되는 PNA (Peptide Nucleic Acid, 펩티드핵산) 프로브를 이용하는 DNA 불일치 보수 (mismatch repair) 또는 DNA 교정 (proofreading) 기능 이상에 따른 돌연변이의 검출용 키트.
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