CN113151519B - 用于同时检测幽门螺旋杆菌及其耐药基因的多重荧光pcr试剂及其应用 - Google Patents

用于同时检测幽门螺旋杆菌及其耐药基因的多重荧光pcr试剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于同时检测幽门螺旋杆菌及其耐药基因的多重荧光PCR试剂，所述试剂包括如下引物对和探针：由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的两个单链DNA组成的检测幽门螺旋杆菌的引物对A；由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的两个单链DNA组成的检测幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药基因引物对B；由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的两个单链DNA组成的检测幽门螺旋杆菌左氧氟沙星耐药基因引物对C。本发明PCR检测试剂可实现在一管中同时检测幽门螺旋杆菌和两个耐药基因(10个突变位点)及一管内参基因，有效改善多对引物和探针之间的干扰，有效提高了检测灵敏度和特异性，为临床治疗幽门螺旋杆菌耐药基因的检测提供快速、高效的方法。

Description

用于同时检测幽门螺旋杆菌及其耐药基因的多重荧光PCR试 剂及其应用
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种用于同时检测幽门螺旋杆菌及其耐药基因的多重荧光PCR试剂及其应用。
背景技术
目前，对幽门螺旋杆菌耐药检测的方法有很多种，有条件的医院可以开展体外药敏试验，该方法通过在不同种类的抗生素环境下幽门螺旋杆菌的培养情况来确定其最低抑菌浓度，从而判断是否对所测试抗生素具有耐药性。但是该方法有以下几个缺点：1)幽门螺旋杆菌培养要求条件较高，培养成功率低；2)培养耗时长。没有条件开展体外药敏试验的采用分子生物学的检测方式，现有的分子生物学检测幽门螺旋杆菌耐药突变的方法主要有：PCR-熔解曲线法、PCR-扩增线法、测序法、飞行时间质谱法、基因芯片(PCR-反向点杂交)等。中国发明专利申请CN 111850154 A为例采用的是PCR-熔解曲线法，通过熔解曲线峰值的Tm值来判定阴阳性，但该方法对于某些单碱基突变峰值很接近不容易区分野生型和突变型，并且检测时间比扩增曲线法耗时长，另外该方法对检测仪器的温控分辨率选择性较高，无法应用于目前临床主流的荧光PCR仪。目前研究明确与耐药表型正相关的抗生素只有两种克拉霉素和左氧氟沙星，过多的抗生素耐药基因检测只能作为基础研究用，不可能应用到临床诊断，容易给医生造成误导，另外该方法操作复杂，涉及到测序，整个流程耗时长，测序仪价格昂贵，对人员专业要求较高，很难在临床诊断上推行。
综上，现有的检测方法多重荧光PCR法因引物和探针相互竞争会导致多重PCR的扩增效率降低，影响检测灵敏度，检出率低和扩增效率低的缺陷，亟待进一步改进。
发明内容
为此，本发明提供一种用于同时检测幽门螺旋杆菌及其耐药基因的多重荧光PCR试剂及其应用。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明实施例提供一种用于同时检测幽门螺旋杆菌及其耐药基因的多重荧光PCR试剂，所述试剂包括如下引物对和探针：
由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的两个单链DNA组成的检测幽门螺旋杆菌的引物对A；
由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的两个单链DNA组成的检测幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药基因引物对B；
由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的两个单链DNA组成的检测幽门螺旋杆菌左氧氟沙星耐药基因引物对C；
由SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的两个单链DNA组成的引物对D；
以及与所述引物对A配合的探针A，所述探针A的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；
与所述引物B配合的探针B1、探针B2、探针B3，所述探针B1的核苷酸序列如SEQ IDNO.10所示，所述探针B2的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述探针B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；
与所述引物C配合的探针C1、探针C2、探针C3、探针C4、探针C5、探针C6、探针C7，所述探针C1的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，所述探针C2的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，所述探针C3的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，所述探针C4的核苷酸序列如SEQ IDNO.16所示，所述探针C5的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，所述探针C6的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，所述探针C7的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示；
与所述引物D配合的探针D，所述探针D的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。
优选地，所述探针A的5′端标记有报告荧光染料CY5，3′端标记有猝灭荧光染料BHQ3；
所述探针B1、探针B2、探针B3的5′端标记有报告荧光染料FAM，3′端标记有猝灭荧光染料MGB；
所述探针C1、探针C2、探针C3、探针C4、探针C5、探针C6、探针C7的5′端标记有报告荧光染料VIC，3′端标记有猝灭荧光染料MGB；
所述探针D的5′端标记有报告荧光染料ROX，3′端标记有猝灭荧光染料BHQ2。
优选地，所述多重荧光PCR试剂还包括Mega buffer、5％甘油，dN(U)TP Mix、3mMMgCl2、Mega TaqDNA聚合酶、UDG酶、BSA、Betaine、蔗糖。
优选地，所述BSA的浓度为0.3mg/ml、Betaine的浓度1.5M、蔗糖的浓度为2w/v％。
优选地，所述引物对A中每个引物、所述引物对B中每个引物、所述引物对C中每个引、所述引物对D中每个引物的摩尔比为(1-2)：(1-2)：(1-3)：(1-2)；
所述探针A、探针B1、探针B2、探针B3、探针C1、探针C2、探针C3、探针C4、探针C5、探针C6、探针C7、探针D摩尔比为5:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:5。
优选地，所述引物对A中每个引物的在多重荧光PCR试剂中的浓度为0.2μM；
所述引物对B中每个引物的在多重荧光PCR试剂中的浓度为0.2μM；
所述引物对C中每个引物的在多重荧光PCR试剂中的浓度为0.3μM；
所述引物对D中每个引物的在多重荧光PCR试剂中的浓度为0.2μM；
所述探针A在多重荧光PCR试剂中的浓度为0.2μM；
所述探针B1、探针B2、探针B3在多重荧光PCR试剂中的浓度分别为0.04μM；
所述探针C1、探针C2、探针C3、探针C4、探针C5、探针C6、探针C7在多重荧光PCR试剂中的浓度分别为0.04μM；
所述探针D在多重荧光PCR试剂中的浓度为0.2Mm。
本发明还提供用于同时检测幽门螺旋杆菌及其耐药基因的多重荧光PCR试剂盒，其包括上述所述的多重荧光PCR试剂。
上述所述试剂在制备同时检测待测样品中是否含有幽门螺旋杆菌及具耐克拉霉素和左氧氟沙星耐药性基因多个突变位点的幽门螺旋杆菌的产品中的应用，也属于本发明的保护范围
优选地，所述同时检测为用权利要求1所述的试剂或权利要求7所述的试剂对所述待测样品进行多重荧光PCR反应。
本发明具有如下优点：
本发明用于同时检测幽门螺旋杆菌及其耐药基因的多重荧光PCR试剂，使用MGB探针对各个突变型靶标进行结合，根据荧光信号的强弱区分野生和突变型，通过添加并调试多重PCR扩增体系中的促进剂，改善多重PCR体系的扩增效果。本发明PCR检测试剂可实现在一管中同时检测幽门螺旋杆菌和两个耐药基因(10个突变位点)及一管内参基因，有效改善多对引物和探针之间的干扰，有效提高了检测灵敏度和特异性，为临床治疗幽门螺旋杆菌耐药基因的检测提供快速、高效的方法。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
图1为本发明实施例提供的多重荧光PCR检测试剂检测幽门螺旋杆菌基因组(ATCC43504)的CY5荧光扩增信号；
图2为本发明实施例提供的的多重荧光PCR检测试剂检测A2142G、A2142C、A2143G、AAT87AAG、AAT87AAA、AAT87ATT、AAC87ATC、GAT91AAT、GAT91TAT、GAT91GGT突变型质粒DNA(擎科生物)的FAM和VIC荧光扩增信号；
图3为本发明实施例提供的多重荧光PCR反应体系中检测含有人管家基因GAPDH基因片段的质粒DNA(生物工程有限公司)的ROX荧光扩增信号；
图4为本发明实施例提供的添加促进剂的多重荧光PCR体系对4个1copies/μl浓度的幽门螺旋杆菌基因组的扩增效果图；
图5为本发明实施例提供的商业化试剂盒对4个1copies/μl浓度的幽门螺旋杆菌基因组(ATCC 43504)的扩增效果图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1、引物及探针设计
本实施例提供用于同时检测幽门螺旋杆菌及其耐药基因的多重荧光PCR试剂，该多重荧光定量PCR试剂包括PCR反应液、阳性对照试剂、阴性对照试剂。其中，阳性对照为幽门螺旋杆菌23S rRNA和gyrA基因突变型标准质粒(擎科生物)；阴性对照为幽门螺旋杆菌标准株(ATCC 43504)。
具体的，PCR反应体系包括1×Mega buffer(菲鹏生物，货号MD098)，甘油5％，0.3mM dN(U)TP Mix(菲鹏生物，货号MD016M)，3mM MgCl2(菲鹏生物，货号MD098)，0.05UMega TaqDNA聚合酶(菲鹏生物，货号MD098)，0.01U UDG酶(菲鹏生物，MD014)，BSA 0.3mg/ml(sigma，B2064)，1.5M Betaine(sigma，61962)；2％蔗糖(生物工程有限公司，NO.A100335)。引物组及探针的具体序列为：引物对A：SEQ ID NO.1：HP-F:5′-GAAGTGGAGCCAATCTTCAAAAC-3′；SEQ ID NO.2：HP-R:5′-CAACATGGCTGATTTGCGATTACTAG-3′；探针A：SEQ ID NO.9：HP-P:5′-CY5-TGCAACTCGCCTGCAT-BHQ3-3′；引物对B：SEQ ID NO.3：K-F:5′-GAGATTCAGTGAAATTGTAGTGGAGG-3′；SEQ ID NO.4：K-R:5′-GCAGTGCTAAGTTGTAGTAAAGGTCC-3′；探针B1：SEQ ID NO.10：A2142G-P:5′-FAM-CGGGAAGACCCCGTGG-MGB-3′；探针B2：SEQ ID NO.11：A2142C-P:5′-FAM-CGGCAAGACCCCGTG-MGB-3′；探针B3：SEQ ID NO.12：A2143G-P:5′-FAM-CGGCAAGACGGAGAG-MGB-3′。引物对C：SEQID NO.5：Z-F:5′-AATCTTGCGCCATTCTCACTAGC-3′；SEQ ID NO.6：Z-R:5′-GCCCATCCACTAATTCCAAACG-3′；探针C1：SEQ ID NO.13：AAT87AAA-P:5′-VIC-CGCATCATAAACCGCTTTA-MGB-3′；探针C2：SEQ ID NO.14：AAT87ATT-P:5′-VIC-CATAAACCGCAATATC-MGB-3′；探针C3：SEQ ID NO.15：AAC87ATC-P:5′-VIC-CGCATCATAAACCGCGATA-MGB-3′；探针C4：SEQ ID NO.16：AAT87AAG-P:5′-VIC-CCATCATAAACCGCCTTAT-MGB-3′；探针C5：SEQ ID NO.17：GAT91AAT-P:5′-VIC-CTCACTAGCGCATTATA-MGB-3′；探针C6：SEQ ID NO.18：GAT91TAT-P:5′-VIC-TTCTCACTAGCGCATAATA-MGB-3′；探针C7：SEQ ID NO.19：GAT91GGT-P:5′-VIC-CATTCTCACTAGCGCACCAT-MGB-3′；引物对D：SEQ ID NO.7：G-F:5′-GAAATGTGCTTTGGGGAGG-3′；SEQ ID NO.8：G-R:5′-CCAGTGGACTCCACGACGT-3′；探针D:SEQ ID NO.20：G-P:5′-ROX-GAGATCCCTCCAAAATCAAGTGG-BHQ2-3′。
本实施例的多重荧光PCR反应体系为0.2μM HP-F，0.2μM HP-R，0.2μM HP-P，0.2μMK-F，0.2μM K-R，0.04μM A2142G-P，0.04μM A2142C-P，0.04μM A2143G-P，0.3μM Z-F，0.3μMZ-R，0.04μM AAT87AAA-P，0.04μM AAT87ATT-P，0.04μM AAC87ATC-P，0.04μM AAT87AAG-P，0.04μM GAT91AAT-P，0.04μM GAT91TAT-P，0.04μM GAT91GGT-P，0.2μM G-F，0.2μM G-R，0.2μM G-P；1×buffer为50mM KCl，10mM Tris-HCl，pH＝8.6；所述dN(U)TP Mix为100m MdATP：dCTP：dGTP：dUTP；上述反应液、反应引物以及探针加到同一个反应管进行多重荧光PCR反应。
本实施例的同时检测幽门螺旋杆菌及其耐药基因的多重荧光PCR引物和探针，可实现通一反应管中，同时检测幽门螺旋杆菌和克拉霉素和左氧氟沙星两个耐药基因(10个突变位点)及一管内参基因，并且依靠MGB探针实现区分幽门螺旋杆菌野生型和耐药突变型。其中，探针B1、探针B2、探针B3用于检测克拉霉素耐药基因的3个突变位点；探针C1、探针C2、探针C3、探针C4、探针C5、探针C6、探针C7用于检测左氧氟沙星耐药基因的7个突变位点。
实施例2、多重荧光PCR检测试剂检测幽门螺旋杆菌及含有突变位点的耐药基因的幽门螺旋杆菌
本实施例PCR扩增采用的模板为含有A2142G，A2142C，A2143G，AAT87AAG，AAT87AAA，AAT87ATT，AAC87ATC，GAT91AAT，GAT91TAT，GAT91GGT突变位点标准质粒(即突变型)(擎科生物)或ATCC 43504幽门螺旋杆菌基因组(即野生型)和含有GAPDH基因的标准质粒(生物工程有限公司)。
上述突变型质粒和野生型基因组均经核酸测序，测序结果证实，用作模板的上述突变型质粒和野生型基因组为含有目标突变碱基或野生型基因组DNA。具体的，本发明实施例的PCR反应体系如表1所示。
表1
Figure GDA0003530189770000071
Figure GDA0003530189770000072
实时荧光定量PCR扩增：在ABI7500荧光定量PCR仪上进行荧光PCR检测；PCR反应程序如下：50℃2min；95℃10min；95℃15sec，63℃1min，50个循环。其中63℃1min为荧光采集步骤。检测结果分析与判断标准：如出现CY5扩增曲线，且Ct值小于40，则说明模板DNA中检出幽门螺旋杆菌，如出现FAM扩增曲线，且Ct值小于40，则说明模板DNA中23S rRNA基因存在点突变，如出现VIC扩增曲线，且Ct值小于40，则说明模板DNA中gyrA基因存在点突变，如出现ROX扩增曲线，且Ct值小于40，则说明模板DNA中内标扩增正常。
本实施例的实时荧光定量PCR检测结果如下：结果如图1所示，PCR扩增结果出现CY5荧光扩增信号，且Ct值均小于40，所述明本实施例的PCR反应体系中含有幽门螺旋杆菌基因。结果如图2所示，PCR扩增结果出现FAM荧光扩增信号，说明本实施例的PCR反应体系中含有A2142G或A2142C或A2143G突变型质粒DNA；
PCR扩增结果出现VIC荧光扩增信号，且Ct值均小于40，说明本发明实施例中含有AAT87AAG或AAT87AAA或AAT87ATT或AAC87ATC或GAT91AAT或GAT91TAT或GAT91GGT或GAT91GCT突变型质粒DNA的相关突变位点。结果如图3所示，PCR扩增结果出现ROX荧光扩增信号，本发明实施例的多重荧光PCR反应体系中含有人管家基因GAPDH基因片段的质粒DNA模板。
实施例3、促进剂对多重荧光PCR扩增效率的影响
本实施例将检测幽门螺旋杆菌和耐药基因实现一多重荧光PCR，PCR扩增体系中含有A2142G，A2142C，A2143G，GAT91AAT，GAT91TAT，GAT91GGT突变位点标准质粒(即突变型)(擎科生物)上述突变型质粒均经核酸测序，测序结果证实用作模板的上述突变型质粒为含有目标突变碱基的DNA。
促进剂的各成分在PCR体系中的终浓度为：BSA 0.3mg/ml、1.5M Betaine、2w/v％蔗糖。考察在不同组合方式对多重PCR的扩增效果的影响。不同的组合是指在PCR反应液含有不同组合物，如表2，其中“+”表示加入该组分，“-”表示未加入该组分。
表2
Figure GDA0003530189770000081
Figure GDA0003530189770000091
PCR反应体系如表3
表3
Figure GDA0003530189770000092
Figure GDA0003530189770000093
PCR反应程序如下：50℃2min；95℃10min；95℃15sec，63℃1min，50个循环。其中63℃1min为荧光采集。
试验结果如表4所示，不同组合下的多重PCR扩增结果比较，不同促进剂组合对多重PCR的扩增效率有一定影响，在添加全部组分的的组合2对样本扩增效果最优，Ct值相对于其他组合较小，Ct值越小说明扩增能力越强，反之越弱。添加了蔗糖比添加其他组分对多重PCR的扩增提升更大，因其他组分有保护聚合酶的功能作用，组合2为最佳促进剂。
表4
Figure GDA0003530189770000101
实施例4、不同浓度的蔗糖对多重PCR最低检测限的影响
本实施例将检测幽门螺旋杆菌和耐药基因实现一管多重荧光PCR，PCR扩增所用模板为含有A2142G，A2142C，A2143G，GAT91AAT，GAT91TAT，GAT91GGT突变位点标准质粒(即突变型)(擎科生物)上述突变型质粒均经核酸测序，测序结果证实用作模板的上述突变型质粒为含有目标突变碱基的DNA。验证添加不同浓度蔗糖对整个多重PCR的扩增效果的影响，以下是蔗糖在体系中的不同终浓度(w/v％)：0、1、2、3。考察在不同蔗糖浓度对多重PCR的扩增效果的影响。PCR反应体系如表5所示。
表5
Figure GDA0003530189770000111
PCR反应程序如下：50℃2min；95℃10min；95℃15sec，63℃1min，50个循环。其中63℃1min为荧光采集。
检测结果如表6所示，不同蔗糖浓度对多重PCR扩增效果对比，不同蔗糖浓度对多重PCR的扩增效率有一定影响，当PCR反应体系中，蔗糖的终浓度是2w/v％时，Ct值相对于其他浓度较小，Ct值越小说明扩增能力越强，反之越弱，该浓度的蔗糖对所有样本的扩增效果提升最大。
表6
Figure GDA0003530189770000121
实施例5、多重荧光PCR体系添加促进剂后与商业化上市产品单指标比较最低检测限效果
为了评价本实施例的添加促进剂后的试剂盒与已获NMPA批准上市的某商业化试剂盒的检测效果，以幽门螺旋杆菌16S rRNA特异基因的低浓度(1copies/μl)为模板。本实施例的PCR反应体系如表7所示
表7
Figure GDA0003530189770000122
Figure GDA0003530189770000131
PCR反应程序如下：50℃2min；95℃10min；95℃15sec，63℃1min，50个循环。其中63℃1min为荧光采集。
检测结果：如图4所示，本实施例的添加促进剂的试剂盒对4个1copies/μl浓度的幽门螺旋杆菌基因组的扩增效果；如图5所示，为商业化试剂盒对4个1copies/μl浓度的幽门螺旋杆菌基因组的扩增效果。图4和图5对比Ct值，可以看出图4的Ct值明显小于图5的Ct值，在荧光PCR实验中Ct值越小说明扩增能力越强，反之越弱，说明本实施例的试剂盒中，PCR多重反应体系中，添加了促进剂后，提高了检测能力，能提高临床弱阳性样本的检出率。
实施例6、含有促进剂的多重PCR体系对胃粘膜组织临床样本的检测效果
本实施例配制含有促进剂的PCR体系见表8，将从中日友好医院收集的胃粘膜组织临床样本用提取试剂盒(北京全式金生物，货号EE161-11)提取组织核酸，将核酸作为模板进行检测。
表8
Figure GDA0003530189770000132
Figure GDA0003530189770000141
PCR反应程序如下：50℃2min；95℃10min；95℃15sec，63℃1min，50个循环。其中63℃1min为荧光采集。检测结果如表9所示，10份胃粘膜组织检测幽门螺杆菌全部为阳性，其中有两例样本均为A2143G突变，一例样本是GAT91GGT突变。
表9
Figure GDA0003530189770000151
Figure GDA0003530189770000152
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 格物致和生物科技（北京）有限公司
<120> 用于同时检测幽门螺旋杆菌及其耐药基因的多重荧光PCR试剂及其应用
<130> GG21914142A
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gaagtggagc caatcttcaa aac 23
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
caacatggct gatttgcgat tactag 26
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
gagattcagt gaaattgtag tggagg 26
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
gcagtgctaa gttgtagtaa aggtcc 26
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
aatcttgcgc cattctcact agc 23
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
gcccatccac taattccaaa cg 22
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
gaaatgtgct ttggggagg 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
ccagtggact ccacgacgt 19
<210> 9
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
tgcaactcgc ctgcat 16
<210> 10
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
cgggaagacc ccgtgg 16
<210> 11
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
cggcaagacc ccgtg 15
<210> 12
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
cggcaagacg gagag 15
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
cgcatcataa accgcttta 19
<210> 14
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
cataaaccgc aatatc 16
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
cgcatcataa accgcgata 19
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
ccatcataaa ccgccttat 19
<210> 17
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
ctcactagcg cattata 17
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 18
ttctcactag cgcataata 19
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 19
cattctcact agcgcaccat 20
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 20
gagatccctc caaaatcaag tgg 23

Claims (9)

1.一种用于同时检测幽门螺旋杆菌及其耐药基因的多重荧光PCR试剂，其特征在于，所述试剂包括如下引物对和探针：
由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的两个单链DNA组成的检测幽门螺旋杆菌的引物对A；
由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的两个单链DNA组成的检测幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药基因引物对B；
由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的两个单链DNA组成的检测幽门螺旋杆菌左氧氟沙星耐药基因引物对C；
由SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的两个单链DNA组成的引物对D；
以及与所述引物对A配合的探针A，所述探针A的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；
与所述引物对B配合的探针B1、探针B2、探针B3，所述探针B1的核苷酸序列如SEQ IDNO.10所示，所述探针B2的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述探针B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；
与所述引物对C配合的探针C1、探针C2、探针C3、探针C4、探针C5、探针C6、探针C7，所述探针C1的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，所述探针C2的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，所述探针C3的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，所述探针C4的核苷酸序列如SEQ IDNO.16所示，所述探针C5的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，所述探针C6的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，所述探针C7的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示；
与所述引物对D配合的探针D，所述探针D的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。
2.如权利要求1所述的用于同时检测幽门螺旋杆菌及其耐药基因的多重荧光PCR试剂，其特征在于，
所述探针A的5′端标记有报告荧光染料CY5，3′端标记有猝灭荧光染料BHQ3；
所述探针B1、探针B2、探针B3的5′端标记有报告荧光染料FAM，3′端标记有猝灭荧光染料MGB；
所述探针C1、探针C2、探针C3、探针C4、探针C5、探针C6、探针C7的5′端标记有报告荧光染料VIC，3′端标记有猝灭荧光染料MGB；
所述探针D的5′端标记有报告荧光染料ROX，3′端标记有猝灭荧光染料BHQ2。
3.如权利要求1所述的用于同时检测幽门螺旋杆菌及其耐药基因的多重荧光PCR试剂，其特征在于，
所述多重荧光PCR试剂还包括Mega buffer、5％甘油，dN(U)TP Mix、3mM MgCl2、MegaTaqDNA聚合酶、UDG酶、BSA、Betaine、蔗糖。
4.如权利要求3所述的用于同时检测幽门螺旋杆菌及其耐药基因的多重荧光PCR试剂，其特征在于，
所述BSA的浓度为0.3mg/ml、Betaine的浓度1.5M、蔗糖的浓度为2％ w/v。
5.如权利要求2所述的用于同时检测幽门螺旋杆菌及其耐药基因的多重荧光PCR试剂，其特征在于，
所述引物对A中每个引物、所述引物对B中每个引物、所述引物对C中每个引物、所述引物对D中每个引物的摩尔比为(1-2)：(1-2)：(1-3)：(1-2)；
所述探针A、探针B1、探针B2、探针B3、探针C1、探针C2、探针C3、探针C4、探针C5、探针C6、探针C7、探针D摩尔比为5:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:5。
6.如权利要求5所述的用于同时检测幽门螺旋杆菌及其耐药基因的多重荧光PCR试剂，其特征在于，
所述引物对A中每个引物的在多重荧光PCR试剂中的浓度为0.2μM；
所述引物对B中每个引物的在多重荧光PCR试剂中的浓度为0.2μM；
所述引物对C中每个引物的在多重荧光PCR试剂中的浓度为0.3μM；
所述引物对D中每个引物的在多重荧光PCR试剂中的浓度为0.2μM；
所述探针A在多重荧光PCR试剂中的浓度为0.2μM；
所述探针B1、探针B2、探针B3在多重荧光PCR试剂中的浓度分别为0.04μM；
所述探针C1、探针C2、探针C3、探针C4、探针C5、探针C6、探针C7在多重荧光PCR试剂中的浓度分别为0.04μM；
所述探针D在多重荧光PCR试剂中的浓度为0.2μΜ。
7.用于同时检测幽门螺旋杆菌及其耐药基因的多重荧光PCR试剂盒，其包括权利要求1-6中任一项所述的多重荧光PCR试剂。
8.权利要求1-6中任一所述试剂在制备同时检测待测样品中是否含有幽门螺旋杆菌及具有耐克拉霉素和左氧氟沙星耐药性基因多个突变位点的幽门螺旋杆菌的产品中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，
所述同时检测为用权利要求1所述的试剂或权利要求7所述的试剂盒对所述待测样品进行多重荧光PCR反应。
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Denomination of invention: Multiple fluorescent PCR reagents for simultaneous detection of Helicobacter pylori and its resistance genes and their applications

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Pledgee: Zhongguancun Beijing technology financing Company limited by guarantee

Pledgor: Gewu Zhihe Biotechnology (Beijing) Co.,Ltd.

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