CN113136435A - 基于pcr技术的用于检测pax1基因甲基化的检测试剂盒及其应用 - Google Patents

基于pcr技术的用于检测pax1基因甲基化的检测试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

一种基于PCR技术的用于检测PAX1基因甲基化的检测试剂盒，包括检测引物对和检测探针；所述检测引物对包括用于检测PAX1基因甲基化的扩增引物对和通用引物对，所述扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.1‑3所示，所述通用引物对的碱基序列如SEQ ID NO.4‑5所示；所述检测探针的5’端标记有荧光基团，所述检测探针的3’端标记有淬灭基团；所述检测探针包括检测PAX1基因的探针，所述探针的碱基序列如SEQ ID NO.6‑7所示。本申请提供一种基于PCR技术的用于检测PAX1基因甲基化的检测试剂盒，具有极高的灵敏度，特异度高。

Description

基于PCR技术的用于检测PAX1基因甲基化的检测试剂盒及其 应用
技术领域
本发明涉及生物医学检测技术，具体涉及一种基于PCR技术的用于检测 PAX1基因甲基化的检测试剂盒及其应用。
背景技术
研究资料表明，宫颈癌的发病率和死亡率正逐年上升，已分别居女性恶性肿瘤发病率和死亡率的第3位和第4位。研究显示，我国宫颈癌每年的新发病例数由2010年的2.85万～13.75万上升为2015年的4.58万～18.85万。2008年，Lai等首次发现PAX1在宫颈癌中出现甲基化异常。其通过甲基化芯片筛选出6 个在宫颈癌组织中甲基化频率较高的基因，即SOX1、PAX1、LMX1A、NKX6-1、 WT1和ONECUT1。与正常对照组组织中PAX1甲基化频率(0％)相比，PAX1基因在宫颈癌组织中甲基化异常频率可高达94.4％(P＜0.0001)。Lim等的研究结果显示，PAX1基因的甲基化水平随着宫颈病变程度的加深而逐渐增加。在正常宫颈组织及低度鳞状上皮内病变(LSIL)中PAX1的甲基化水平是2％，高度鳞状上皮内病变(HSIL)中为41％，鳞状细胞癌(SCC)中是90％。Xu等研究显示，PAX1 在宫颈癌组织中的甲基化阳性率可达87.5％，且随病情的演变呈现明显的上升趋势。上述研究结果提示，PAX1在正常宫颈组织及宫颈病变组织中的甲基化程度存在很大的差异，宫颈病变组织中PAX1甲基化检测可能会成为一种宫颈癌临床诊断的分子标志物。
此前，病理组织学的检查是宫颈病变诊断的“金标准”，利用宫颈刮片行 HPV检测是最常用于筛查宫颈癌的方法。HPV检测具有较高的灵敏度和阴性预测值，然而一直存在较低的特异度和较高的假阳性率缺陷。
发明内容
为了解决上述现有技术中存在的问题，本申请的一目的是提供一种基于 PCR技术的用于检测PAX1基因甲基化的检测试剂盒，具有极高的灵敏度，特异度高。
为了实现上述技术效果，本发明的具体技术方案如下：
一种基于PCR技术的用于检测PAX1基因甲基化的检测试剂盒，包括检测引物对和检测探针；所述检测引物对包括用于检测PAX1基因甲基化的扩增引物对和通用引物对，所述扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.1-3所示，所述通用引物对的碱基序列如SEQ IDNO.4-5所示；所述检测探针的5’端标记有荧光基团，所述检测探针的3’端标记有淬灭基团；所述检测探针包括检测PAX1基因的探针，所述探针的碱基序列如SEQ ID NO.6-7所示。
进一步地，所述荧光基团为FAM、TET、HEX、CY5、ROX、VIC中的一种。
进一步地，所述淬灭基团为6-TAMRA、BHQ-1～3中的一种。
进一步地，还包括核酸提取液、PCR缓冲液和PCR反应液中的一种或多种。
进一步地，所述PCR反应液为Taq DNA聚合酶、dNTPs和Mg2+的一种或多种。
进一步地，还包括重亚硫酸盐。
本发明还提供上述的基于PCR技术的用于检测PAX1基因甲基化的检测试剂盒在检测宫颈癌中的应用。
依据上述技术方案，本申请提供的检测PAX1基因甲基化情况的检测试剂盒，其具有极高的灵敏度，且其特异度超过目前常用的HPV检测方法的特异度，在临床上筛查和早期诊断宫颈癌中极具应用价值。
具体实施方式
为使本实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本实施方式，对本实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本申请一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本申请保护的范围。
实施例
一种基于PCR技术的用于检测PAX1基因甲基化的检测试剂盒，包括检测引物对和检测探针；所述检测引物对包括用于检测PAX1基因甲基化的扩增引物对和通用引物对，所述扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.1-3所示，所述通用引物对的碱基序列如SEQ IDNO.4-5所示；所述检测探针的5’端标记有荧光基团，所述检测探针的3’端标记有淬灭基团；所述检测探针包括检测PAX1基因的探针，所述探针的碱基序列如SEQ ID NO.6-7所示。
其中，所述荧光基团为FAM、TET、HEX、CY5、ROX、VIC中的一种。
其中，所述淬灭基团为6-TAMRA、BHQ-1～3中的一种。
其中，本检测试剂盒还包括核酸提取液、PCR缓冲液和PCR反应液中的一种或多种。
其中，所述PCR反应液为Taq DNA聚合酶、dNTPs和Mg2+的一种或多种。
其中，本检测试剂盒还包括重亚硫酸盐。
其中，所述扩增引物对的碱基序列为：
gcgcatttga gtgtaagtac a
caagttctct acaaatatca
ggatcgtgtt tggtttcgtat tacc
所述通用引物对的碱基序列为：
cgatggacgt gtatt
taaagcgggg gatgcttga
所述探针的碱基序列为：
tattgatagg aggcttgtat
gaatcgtgtt tggttcgt
本检测试剂盒检测PAX1基因甲基化时，其包括以下具体步骤：
(1)扩增引物对对靶序列进行扩增捕获；
(2)检测探针，该探针中含有一段不与人类基因组形成互补的特异性序列，通过不对称连接探针与上述捕获到的靶序列特异性连接，形成环形产物；
(3)通用引物对，其不与人类基因组形成互补的通用引物，特异性的扩增上述环形产物中的互补序列；
(4)将扩增产物纯化后，即得所述高通量测序文库。
本发明的单管高通量测序文库的构建方法针对多个靶序列进行单管，快速完成文库的构建，结合高通量测序平台可以十分有效的解决目前对于临床上肿瘤、遗传病等疾病中在少量的临床样本基础上需要对体细胞多基因、多靶点检测这一难点，从而使得检测PAX1基因甲基化时具有极高的灵敏度，特异度高。
临床应用案例：取经过阴道镜和组织活检确认的宫颈癌患者和低级别病变癌患者宫颈刷夜各30份，用磁珠法提取宫颈刷液中的DNA，把DNA经过亚硫酸盐转化后，进行甲基化荧光定量PCR反应。荧光定量Ct≤45，定义为甲基化反应阳性；荧光定量Ct＞45，定义为甲基化反应阴性。比较利用本发明的检测方案和HPV检测方法在通过宫颈刷液诊断宫颈癌的灵敏度和特异度，结果见下表。
Figure BDA0003083676090000031
由此可见，通过本发明的检测试剂盒来检测PAX1基因甲基化，相比于现有的HPV检测方法，在灵敏度和特异度上都有较大提高。
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。
序列表
<110> 上海锐品生物科技有限公司
<120> 基于PCR技术的用于检测PAX1基因甲基化的检测试剂盒及其应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 1
gcgcatttga gtgtaagtac a 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 2
caagttctct acaaatatca 20
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 3
ggatcgtgtt tggttcgtat tacc 24
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 4
cgatggacgt gtatt 15
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 5
taaagcgggg gatgcttga 19
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 6
tattgatagg aggcttgtat 20
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 7
gaatcgtgtt tggttcgt 18

Claims (7)

1.一种基于PCR技术的用于检测PAX1基因甲基化的检测试剂盒，其特征在于，包括检测引物对和检测探针；所述检测引物对包括用于检测PAX1基因甲基化的扩增引物对和通用引物对，所述扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.1-3所示，所述通用引物对的碱基序列如SEQ ID NO.4-5所示；所述检测探针的5’端标记有荧光基团，所述检测探针的3’端标记有淬灭基团；所述检测探针包括检测PAX1基因的探针，所述探针的碱基序列如SEQ ID NO.6-7所示。
2.如权利要求1所述的基于PCR技术的用于检测PAX1基因甲基化的检测试剂盒，其特征在于，所述荧光基团为FAM、TET、HEX、CY5、ROX、VIC中的一种。
3.如权利要求1所述的基于PCR技术的用于检测PAX1基因甲基化的检测试剂盒，其特征在于，所述淬灭基团为6-TAMRA、BHQ-1～3中的一种。
4.如权利要求1所述的基于PCR技术的用于检测PAX1基因甲基化的检测试剂盒，其特征在于，还包括核酸提取液、PCR缓冲液和PCR反应液中的一种或多种。
5.如权利要求4所述的基于PCR技术的用于检测PAX1基因甲基化的检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液为Taq DNA聚合酶、dNTPs和Mg2+的一种或多种。
6.如权利要求1所述的基于PCR技术的用于检测PAX1基因甲基化的检测试剂盒，其特征在于，还包括重亚硫酸盐。
7.如权利要求1至6中任一项所述的基于PCR技术的用于检测PAX1基因甲基化的检测试剂盒在检测宫颈癌中的应用。
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