CN113817833B - 一种基于荧光定量pcr技术的检测宫颈细胞基因甲基化的试剂盒与应用 - Google Patents

一种基于荧光定量pcr技术的检测宫颈细胞基因甲基化的试剂盒与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医学检验技术领域，具体涉及一种基于荧光定量PCR技术的检测宫颈细胞基因甲基化的试剂盒与应用。本发明通过检测样本中SOX1、PAX1、MSC三基因的启动子区域甲基化水平，用于判断样本是否发生癌变。其操作方便简易，检测灵敏度高，特异性好，对宫颈癌的检测具有十分积极的意义。

Description

一种基于荧光定量PCR技术的检测宫颈细胞基因甲基化的试 剂盒与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及基于荧光定量PCR技术的检测宫颈细胞基因甲基化的核酸组合及试剂盒与应用。
背景技术
宫颈癌是危害女性第二大常见癌症。虽然HPV疫苗接种和早期宫颈癌筛查已成为预防该病的有效策略，但依然存在着该病较高的发病率和死亡率。高危型人乳头瘤病毒(HPV)的持续感染，被认为是宫颈癌发生发展的主要原因。目前，临床上应用的宫颈癌筛查的主要方法是宫颈液基细胞学检查联合HPV病毒检测，但细胞学检测受到人为影响较大，漏诊几率较高，HPV检测的局限性表现在：(1)高危型HPV的终生感染风险为80％，HPV检测虽能提高灵敏度，但无法区分一过性HPV感染和致病性持续感染；(2)育龄期妇女，尤其是年龄小于30岁的女性HPV的感染率高，临床提示意义较弱。单一依赖HPV筛查，其较低的特异性易造成有限的社会、医疗资源的浪费及对患者的过度治疗。
近年来，随着对表观遗传学的研究，尤其是DNA甲基化检测技术的成熟，作为癌症发生的早期阶段，DNA甲基化检测逐步成为宫颈癌前病变检测的新兴诊断方法。大量甲基化基因如SOX1、PAX1、JAM3、EPB41L3、MSC等也被认为是宫颈癌筛查的生物标志物。其中SOX1(SRY-box transcription factor 1)、PAX1(paired box 1)、MSC(Homo sapiensmusculin)具有较好的灵敏度和特异性，荧光探针定量PCR检测技术融汇了PCR的灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术精确定量的优点，是目前临床检验中认同程度很高的一种检测技术，已广泛应用于科学研究和临床检测。但目前该技术平台上没有能够快速、简便、特异性的检测这些甲基化基因的技术性产品，为了进一步提高宫颈癌的筛查效能，探索和开发更特异有效、更便捷、更易应用于临床的分子检测产品具有重要意义。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的空白，本发明的目的在于提供一种基于荧光定量PCR技术的检测宫颈细胞基因甲基化的组合试剂盒及其应用。
本发明一方面提供了SOX1、PAX1、MSC三基因的启动子附近区域甲基化水平联合作为靶标在制备宫颈癌诊断药物中的用途。
所述将人SOX1、PAX1、MSC三基因的启动子附近区域序列甲基化联合作为靶标在制备宫颈癌诊断药物中的用途是指将上述三种基因的甲基化程度作为一项宫颈癌诊断指标应用于宫颈癌诊断药物的制备。
本发明的另一方面，提供了一种用于检测宫颈癌的组合物，所述组合物包括：
a.用于检测SOX1基因启动子区域中至少一个靶区域内的甲基化程度的制剂a；
b.用于检测PAX1基因启动子区域中至少一个靶区域内的甲基化程度的制剂b；
c.用于检测MSC基因启动子区域中至少一个靶区域内的甲基化程度的制剂c。
以上所述启动子区域并非严格限定为位于启动子片段内的区域，而是启动子附近区域的基因片段。
进一步地，所述组合物中还包含用于检测内参基因的引物和探针。
进一步地，所述制剂a包括引物对a和探针a，所述引物对a包括正向引物和反应引物，所述正向引物和反应引物分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；所述探针a碱基序列如SEQ ID No.3所示,所述探针的两端分别标记有荧光报告基团/荧光淬灭基团。
进一步地，所述制剂b包括引物对b和探针b，所述引物对b包括正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物分别如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示；所述探针b的碱基序列为SEQ ID No.6所示，所述探针b的两端分别标记有荧光报告基团/荧光淬灭基团。
进一步地，所述制剂c包括引物对c和探针c，所述引物对c包括正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物分别如SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示；所述探针c的碱基序列为SEQ ID No.12所示，所述探针c的两端分别标记有荧光报告基团/荧光淬灭基团。
进一步地，所述用于检测内参基因的引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物的的碱基序列分别如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示；所述用于检测内参基因的探针的碱基序列为SEQID No.9所示，所述探针的两端分别标记有荧光报告基团/荧光淬灭基团。
进一步地，所述制剂a,制剂b,制剂c均分别包括探针和引物，每个所述探针的两端分别标记有荧光报告基团/荧光淬灭基团，所述荧光报告基团/荧光淬灭基团选自选自FAM、VIC或HEX、ROX、NED、CY3或CY5荧光报告基团/BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1和Tamra且试剂盒中各个探针上荧光报告基团互不相同。
进一步地，所述试剂盒还包括以下组分中的任一种或几种：PCR反应液、酶混合液、阳性对照、阴性对照。
进一步地，所述PCR反应液包括10×缓冲液、25mM MgCl2、10mM dUTP和10mMdNTPs；所述酶混合液包括Taq酶和UNG酶，所述的Taq酶为热启动Taq酶，所述的UNG酶为尿嘧啶-N-糖基化酶。
进一步地，所述阳性对照选自以下任一种或几种：
含有SOX1或PAX1或MSC甲基化基因部分序列的假病毒、含有部分人β-actin基因序列的假病毒。例如，含有SOX1或PAX1或MSC甲基化基因的假病毒可以是的非复制型腺病毒，含有部分人β-actin基因序列的假病毒部分人β-actin基因序列的非复制型腺病毒。
进一步地，所述阴性对照为无菌水。
宫颈癌甲基化基因SOX1、PAX1、MSC的基因Gene ID分别为:6656、5075、9242。
本发明的另一方面提供了上述组合物在制备宫颈癌诊断产品中的用途。
其中基因PAX1、MSC、SOX1的部分启动子附近区域的位置分别为：
Homo sapiens chromosome 20,GRCh38.p13 Primary Assembly：21704664-21705714；
Homo sapiens chromosome 8,GRCh38.p13 Primary Assembly：71844912-71844179；
Homo sapiens chromosome 13,GRCh38.p13 Primary Assembly：112066149-112067660。
如上所述，本发明的一种基于荧光定量PCR技术的甲基化基因检测试剂盒，具有以下有益效果：。
(1)本发明的试剂盒能够同管、同时检测出宫颈癌甲基化基因SOX1或PAX1或MSC，填补了现有荧光定量PCR产品只能检测宫颈癌甲基化基因SOX1或PAX1或MSC的空白。
(2)本发明还具有灵敏度高、特异性好、可重复性强、检测结果快速客观、且可节约成本等优点，在宫颈癌甲基化的体外诊断领域具有极大的应用前景。
(3)本试剂盒操作简便且能有效防止污染，PCR荧光检测时间(从标本处理开始)仅为3-4小时，PCR荧光检测是全封闭操作，加入待测样本核酸提取物之后可以不再打开管盖，减少了污染产生的机会。反应液中加入了UNG酶，防止了扩增产物的污染。
附图说明
图1是本发明试剂盒参考品检测的曲线图。
图2是是本发明试剂盒检测的ROC曲线图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置。此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
实施例1检测试剂盒及其使用方法
试剂盒包括以下组分：
PCR反应液、酶混合液、检测反应液、阳性对照、阴性对照；
PCR反应液包括10×缓冲液、25mM MgCl2、10mM dUTP和10mM dNTPs；酶混合液包括Taq酶和UNG酶，检测反应液中的宫颈癌甲基化基因SOX1、PAX1、MSC上游下游引物、及探针的配比为：4:4:1；上游引物为400nM，下游引物为400nM，探针为100nM。
本实施例中使用的宫颈癌甲基化基因SOX1或PAX1或MSC的引物和探针的核苷酸序列可参见表1。
表1本发明中宫颈癌甲基化基因SOX1或PAX1或MSC的引物和探针的核苷酸序列表
SOX1-F ATAAACTACCCGCTACCTACCCG SEQ ID No.1
SOX1-R CGGCGCGTTTATTTAATGGTAGTTC SEQ ID No.2
SOX1-P X1-TTCGGCGTATGGTTGTTGGGTTTCGC-Y1 SEQ ID No.3
PAX1-F GGCGTAGTGACGGGAATTAATGA SEQ ID No.4
PAX1-R TTCGTCTAACCGAAAAACTACAACG SEQ ID No.5
PAX1-P X2-TCGGCGTGATTGTCGAGATTGACGTGGAGG-Y2 SEQ ID No.6
actin-F GCACTCTTCCAGCCTTCCTT SEQ ID No.7
actin-R CGGATGTCCACGTCACACTT SEQ ID No.8
actin-P X3-CCTGGGCATGGAGTCCTGTGGCATC-Y3 SEQ ID No.9
MSC-F GTATCGTCGGTAGGAATAAGATGTGTT SEQ ID No.10
MSC-R CGTCTCTACAAAACCGAAATTTAAACTCTA SEQ ID No.11
MSC-P X4-AACCCGACGACCCTTCAACATATCTACGCA-Y4 SEQ ID No.12
注：X1、X2、X3、X4为荧光报告基团，Y1、Y2、Y3、Y4为荧光淬灭基团。引物和探针由专业合成公司合成。
阳性对照：包括以下组分(均为已知基因序列)：
组分(1)：为含有目标序列的假病毒，是含SOX1基因甲基化部分序列的非复制型腺病毒；
组分(2)：为含有目标序列的假病毒，是含PAX1基因甲基化部分序列的非复制型腺病毒；
组分(3)：为含有目标序列的假病毒，是含MSC基因甲基化部分序列的非复制型腺病毒；
组分(4)：为含有部分人β-actin基因序列的假病毒，是部分人β-actin基因序列的非复制型腺病毒；
阴性对照为无菌水。
试剂盒的使用
一、样本的提取、处理与保存，要求如下：
1、对宫颈脱落细胞样本进行提取细胞DNA。在提取完成后，使用Nanodrop-300微量分光光度计对样本浓度和OD260/280进行测定，OD260/280在1.8～2.0之间。
2、细胞DNA提取完成，对提取好的DNA进行重亚硫酸盐转化，未甲基化的胞嘧啶(C)
转变为尿嘧啶(U)，而甲基化的胞嘧啶(C)不变。得到纯化好的bis-DNA。
样本处理后应及时检测，也可-20℃保存待测，保存期一般不超过4个月，长期保存请置于-70℃。样本避免反复冻融，采用干冰或冰袋低温运输。
二、检测方法
1.试剂准备(试剂准备区)
表2反应液配制1(样本检测)：
反应液组份 加量(μl/反应)
PCR反应液 5
检测多重反应液 5
酶混合液 5
总体积 15
表3反应液配制2(阴性对照)：
反应液组份 加量(μl)/每反应
PCR反应液 5
检测多重反应液 5
酶混合液 5
总体积 15
表4反应液配制3(阳性对照)：
反应液组份 加量(μl)/每反应
PCR反应液 5
检测多重反应液 5
酶混合液 5
总体积 15
2.加样
向PCR扩增管中加入5μL待测核酸样品,终体积为20μL每管，盖紧管盖，瞬时低速离心，在PCR仪上进行检测。
3 PCR扩增(扩增室)
表5荧光检测通道选择及扩增循环参数设定
Figure BDA0003321262440000061
注：不选ROX校正，淬灭基团选None。
设置完毕，保存文件，运行反应程序。
实施例2：试剂盒检测准确性检验
将目前已检测的308例临床样本与宫颈癌金标方法-阴道镜联合病理检测结果进行对比分析，病理诊断的正常样本50例，宫颈浸润癌样本共47例，原位癌CIS样本共55例，CIN3期样本有115例，CIN2及以下样本41例；采用实施例1提供的实施方法进行检测。具体不同分期的比较结果见表6。
表6宫颈癌多基因联合检测技术对宫颈癌和癌前病变不同分期的样本的检测结果对比
Figure BDA0003321262440000062
宫颈脱落细胞甲基化基因(SOX1、PAX1、MSC)DNA检测结果表明，实施例1提供的试剂盒对宫颈癌前病变CIN3和CIS的检测灵敏性分别为97.39％和100％；而对于宫颈浸润癌的灵敏性则为100％。
实施例3：癌前病变与宫颈癌的ROC曲线
本实验例提供脱落细胞DNA多靶点检测技术检测癌前病变与宫颈癌的ROC曲线。
本实验例通过利用实施例1提供的试剂盒和实验方法对癌前病变与宫颈癌进行实验检测。
图图所图2所示，宫颈脱落细胞DNA多基因检测技术可以明显的区分宫颈癌前病变和宫颈癌与正常对照，在对检测CIN3和CIS的ROC曲线的面积(AUC)为0.966(0.95～0.98，95％CI；P<0.0001)。
实施例4：逻辑回归分析
通过实验得到宫颈癌和癌前病变情况进行判断的逻辑回归方程：Y＝A0+A1*X1+A2*X2+A3*X3；其中A0、A1、A2、A3为临床系数，临床系数结果见表7；SOX1、PAX1、MSC基因与内参基因β-actin扩增循环数的差值分别为X1、X2、X3。
表7临床系数的权重关系
Figure BDA0003321262440000071
通过分析三个基因的甲基化拟合回归分析对宫颈癌和癌前病变的联合检测，灵敏度和特异度远高于SOX1、PAX1、MSC单个基因的检测分析结果。
综上所述，本发明提供的检测靶基因甲基化的核酸组合能灵敏的检测到基因的甲基化，结果准确可靠；应用该核酸组合制备的试剂盒，能方便快捷的帮助检测样本并沟通过新的计算方法，准确的判断出检测结果，使检测结果准确，使用方便，有利于实际应用和推广。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。
序列表
<110> 常州国药医学检验实验室有限公司
<120> 一种基于荧光定量PCR技术的检测宫颈细胞基因甲基化的试剂盒与应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ataaactacc cgctacctac ccg 23
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cggcgcgttt atttaatggt agttc 25
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttcggcgtat ggttgttggg tttcgc 26
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggcgtagtga cgggaattaa tga 23
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttcgtctaac cgaaaaacta caacg 25
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcggcgtgat tgtcgagatt gacgtggagg 30
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gcactcttcc agccttcctt 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cggatgtcca cgtcacactt 20
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cctgggcatg gagtcctgtg gcatc 25
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gtatcgtcgg taggaataag atgtgtt 27
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cgtctctaca aaaccgaaat ttaaactcta 30
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aacccgacga cccttcaaca tatctacgca 30

Claims (6)

1.一种用于检测宫颈细胞基因甲基化的组合物，其特征在于，所述组合物包括：
a.用于检测SOX1基因启动子区域中至少一个靶区域内的甲基化程度的制剂a；
b.用于检测PAX1基因启动子区域中至少一个靶区域内的甲基化程度的制剂b；
c.用于检测MSC基因启动子区域中至少一个靶区域内的甲基化程度的制剂c；
所述制剂a包括引物对a和探针a，所述引物对a包括碱基序列分别如SEQ ID No.1 和SEQ ID No.2 所示的正向引物和反向引物；所述探针a碱基序列如SEQ ID No. 3所示, 所述探针的两端分别标记有荧光报告基团、荧光淬灭基团；
所述制剂b包括引物对b和探针b，所述引物对b包括碱基序列分别如SEQ ID No.4 和SEQ ID No.5 所示的正向引物和反向引物；所述探针b的碱基序列为SEQ ID No.6所示，所述探针b的两端分别标记有荧光报告基团、荧光淬灭基团；所述制剂c包括引物对c和探针c，所述引物对c包括碱基序列分别如SEQ ID No.10和SEQ ID No.11 所示的正向引物和反向引物；所述探针c的碱基序列为SEQ ID No.12所示，所述探针c的两端分别标记有荧光报告基团、荧光淬灭基团；
每个所述探针上荧光报告基团互不相同。
2.根据权利要求1所述的用于检测宫颈细胞基因甲基化的组合物，其特征在于，所述组合物中还包含用于检测内参基因的引物和探针。
3.根据权利要求2所述的用于检测宫颈细胞基因甲基化的组合物，其特征在于，所述用于检测内参基因的引物包括碱基序列分别如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8 所示的正向引物和反向引物；所述用于检测内参基因的探针的碱基序列为SEQID No.9 所示，所述探针的两端分别标记有荧光报告基团、荧光淬灭基团。
4.根据权利要求1所述的用于检测宫颈细胞基因甲基化的组合物，其特征在于，所述荧光报告基团选自FAM、VIC或HEX、ROX、NED、CY3 或CY5，所述荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1 或Tamra。
5.根据权利要求1所述的用于检测宫颈细胞基因甲基化的组合物，其特征在于，所述组合物还包括以下组分中的任一种或几种：PCR 反应液、阳性对照、阴性对照。
6.如权利要求1-5任一项所述的组合物在制备宫颈癌诊断产品中的用途；所述宫颈癌为宫颈浸润癌、宫颈原位癌CIS和宫颈癌前病变CIN3期。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115807087A (zh) * 2022-11-04 2023-03-17 神州医疗科技股份有限公司 一种用于宫颈癌pax1-sox1-sfrp1基因甲基化检测的引物探针组合及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113136435A (zh) * 2021-05-25 2021-07-20 上海锐品生物科技有限公司 基于pcr技术的用于检测pax1基因甲基化的检测试剂盒及其应用
CN113502327A (zh) * 2012-08-28 2021-10-15 湖南宏雅基因技术有限公司 一种癌症筛检的检验套组

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL273432B (en) * 2017-09-22 2022-09-01 Kymera Therapeutics Inc Protein compounds and their uses
CN107760788B (zh) * 2017-12-05 2021-03-02 武汉艾米森生命科技有限公司 一种检测宫颈细胞基因甲基化的核酸组合及试剂盒与应用
JP7389980B2 (ja) * 2018-12-06 2023-12-01 国立大学法人 琉球大学 ヒト膵臓組織特異的幹／前駆細胞の人工作製方法
CN110499364A (zh) * 2019-07-30 2019-11-26 北京凯昂医学诊断技术有限公司 一种用于检测扩展型遗传病全外显子的探针组及其试剂盒和应用
CN110578001B (zh) * 2019-09-23 2023-04-11 广州滴纳生物科技有限公司 用于检测宫颈癌相关基因甲基化的检测试剂盒及其使用方法
CN112375824B (zh) * 2020-11-13 2022-07-05 山东大学齐鲁医院 Msc作为宫颈癌诊断、预后和/或治疗标志物的应用
CN112375825B (zh) * 2020-11-13 2022-07-05 山东大学齐鲁医院 一种宫颈癌诊断、预后判断试剂盒
CN113249485B (zh) * 2021-06-24 2021-09-28 深圳市巨东生物医学工程有限公司 一种用于宫颈癌相关基因甲基化检测的引物探针组合和试剂盒及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113502327A (zh) * 2012-08-28 2021-10-15 湖南宏雅基因技术有限公司 一种癌症筛检的检验套组
CN113136435A (zh) * 2021-05-25 2021-07-20 上海锐品生物科技有限公司 基于pcr技术的用于检测pax1基因甲基化的检测试剂盒及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PAX1基因甲基化特异性定量PCR检测在宫颈癌筛查中的意义;徐周敏等;《临床肿瘤学杂志》;20130115;第18卷(第01期);第10-14页 *
pax1蛋白在子宫颈癌中的表达及与预后的关系;杨文艳等;《实用妇产科杂志》;20200115;第36卷(第01期);第37-41页 *
SOX1 Promoter Hypermethylation as a Potential Biomarker for High-Grade Squamous Intraepithelial Neoplasia Lesion and Cervical Carcinoma: A Meta-Analysis With Trial Sequential Analysis;Jin Huang等;《Front Genet》;20201231;第11卷;第1-18页 *

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